RU2710854C1 - Вакцины на основе вирусоподобных частиц (vlp) собачьего парвовируса (cpv) и их применение - Google Patents

Abstract

Группа изобретений относится к иммунологии, а именно к получению комбинированной вакцины против собачьего парвовируса. Комбинированная вакцина, включающая компонент в виде вирусоподобной частицы (VLP) и компонент в виде модифицированного живого вируса (MLV), в которой как VLP, так и MLV направлены против одного и того же патогена или заболевания, где комбинированная вакцина преодолевает действие материнских антител (MDA), в которой VLP CPV включает полипептид CPV, имеющий последовательность, как представлено в SEQ ID NO: 1, 3, 4, 6, 8, 9 или 10; или в которой VLP CPV включает полипептид CPV, имеющий, по меньшей мере, 96% идентичности с последовательностью, как представлено в SEQ ID NO: 1, 3, 4, 6, 8, 9 или 10. Группа изобретений относится также к плазмиде, полезной для получения VLP CPV, очищенному пустому капсиду CPV и способу вызова иммунного ответа против CPV у животного. Использование данной группы изобретений позволяет вызывать иммунный ответ у вакцинированных животных вне зависимости от присутствия у указанных животных высоких уровней материнских антител против CPV. 4 н. и 14 з.п. ф-лы, 19 ил., 14 табл., 8 пр.

Description

Перекрестные ссылки на имеющие отношение заявки

Эта заявка претендует на все преимущества заявки USSN 62/234,196, зарегистрированной 29 сентября 2015, и включенной в настоящий документ путем отсылки во всей своей полноте. Все прочие ссылки, приведенные в настоящем документе, аналогично включены путем отсылки во всей их полноте.

Заявление в отношении списка последовательностей

Список последовательностей, связанный с данной заявкой, предоставлен в текстовом формате вместо бумажной копии, и включен в настоящий документ путем отсылки в описании. Имя текстового файла, содержащего список последовательностей: MER 14-252P_ST25.txt. Размер текстового файла 82 КБ; он был создан на 13 июля 2015; и представлен в электронном виде через EFS-Web, одновременно с подачей описания.

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к области вакцинологии, и более конкретно, к проблеме преодоления действия материнских антител (MDA). Более конкретно, изобретение относится к преодолению действия MDA путем введения животным, включая собак, комбинации вирусоподобных частиц и модифицированного живого вируса (MLV), в комбинации с одновременным введением, в последовательном введении или в режиме введения прайм-буст. Еще более конкретно, изобретение относится к композициям для индуцирования защитного иммунитета против парвовируса (CPV) у собак и щенков, независимо от присутствия CPV MDA в собаках и щенках.

Уровень техники

Собачий парвовирус (CPV), прежде всего, представляет собой кишечный патоген, который заражает собак, особенно молодых собак. Парвовирусная инфекция характеризуется острой диареей, лихорадкой и лейкопенией у собак и щенков, старше 4-5 недель, и в редких случаях заболеванием миокарда у более молодых щенков. Смертность от этого заболевания у невакцинированных собак очень высока. И хотя существует несколько вакцин против CPV, при наличии антител, полученных от матери (MDA), существует тенденция к блокированию способности в других случаях эффективных вакцин обеспечивать защитный иммунитет.

Новорожденные щенки приобретают пассивные иммунитеты против таких заболеваний, как инфекция CPV, при выкармливании их матерью, особенно в течение первых двух дней жизни. Щенок, который был вскормлен молозивом, молоком, которое производится в первую очередь, и (MDA) в молозиве передаются щенку. Для собак - и для многих других млекопитающих - уровень пассивного иммунитета, обеспечиваемый молозивом, постепенно уменьшается по мере катаболизма MDA. Как таковой, возраст, в котором щенок больше не защищен MDA, варьирует в широких пределах, в зависимости от потребления щенком молозива, количества содержавшихся в нем антител и ряд других факторов.

Особая проблема при вакцинации щенков заключается в том, чтобы вводить вакцины в соответствии с временными рамками, которые обеспечивают защиту, которая перекрывает защиту, обеспечиваемую материнскими антителами, и начинается, когда материнские антитела начинают ослабевать. В настоящее время, вакцинные схемы для щенков обычно начинаются примерно с 6-недельного возраста и после этого примерно каждые 3 недели проводятся бустер-инъекции, например, на 9, 12 и иногда на 15 неделе. Однако для того, чтобы этот режим обеспечивал полную защиту, первая доза вакцины должна немедленно вызвать защитный иммунный ответ. Это ожидание совершенно нереалистично, в частности, из-за незрелости иммунной системы щенка и периода времени, необходимого для установления иммунного ответа. Кроме того, ситуация осложняется тем, что остаточные MDA, которая могут сохраняться до возраста шести недель, нейтрализуют вакцины MLV. В настоящее время, все коммерчески доступные вакцины CPV представляют собой вакцины MLV.

Важно отметить, что в то время как щенок с MDA CPV может не реагировать на любые вакцины MLV CPV, он все еще может быть заражен вирулентным полевым штаммом CPV, и у него может развиться собачий парвовироз. Из-за вмешательства MDA, полная защита обычно не развивается до тех пор, пока не будет дан полный курс вакцинации. Как следствие, возрастная смертность из-за инфекции CPV достигает пика до завершения протоколов вакцинации. Соответственно, разработка вакцины, которая активно иммунизирует щенков после первой инъекции - и в присутствии MDA - является одной из самых важных неудовлетворенных потребностей в ветеринарии собак.

Еще одна проблема в ветеринарной медицине - это лечение рака, например, у собак. Существующие инструменты для лечения рака имеют множество ограничений, особенно, для гериатрических собак. Введение онколитических парвовирусов для уничтожения раковых клеток открывает большие перспективы в качестве эффективного лечения рака (Rommelaere et al, Cytokine & Growth Factor Reviews 21:185-195, 2010; и патент США № 7,179,456, принадлежащий Rommelaere et al, полное содержание которых включено в настоящем документе путем отсылки) и может применяться к собакам. Однако наличие ранее существовавших антител к парвовирусам (например, в результате вакцинации) делает этот метод неэффективным, поскольку парвовирус будет нейтрализован существующими антителами. Кроме того, генная терапия у собак редко проводится в настоящее время, но может стать перспективным методом лечения различных заболеваний, если подходящие векторы нуклеиновой кислоты будут идентифицированы. Соответственно, способы преодоления действия существующих антител были бы полезны для применения помимо вакцинации.

В свете вышесказанного, существует потребность в вакцинах с повышенной безопасностью и хорошей эффективностью, включая способность преодолевать действие MDA, включая вакцины, которые обеспечивают защиту от гетерологичных штаммов CPV.

Раскрытие изобретения

Настоящее изобретение обеспечивает фармацевтические композиции, включающие антигены вирусоподобных частиц CPV (VLP), вакцины модифицированного живого вируса CPV (MLV), способы вакцинации против CPV и наборы для применения с такими способами и композициями.

Обеспечиваются композиции или вакцины, включающие антигенный полипептид CPV и его фрагменты и варианты. Антигены CPV и их фрагменты и варианты обладают иммуногенными и защитными свойствами. Антигены CPV могут быть получены с помощью бакуловирусного вектора экспрессии в клетках насекомых, и собраны в капсиды, не содержащие CPV или VLPs CPV (вирусоподобные частицы).

Антигенные полипептиды и их фрагменты и варианты могут входить в состав вакцин с модифицированными живыми вирусами CPV или без них и/или в фармацевтические композиции. Такие вакцины или композиции могут быть применены для вакцинации животного и обеспечивают защиту от гомологичных и гетерологичных штаммов CPV.

Важно отметить, что авторы изобретения неожиданно и с удивлением обнаружили, что введение композиций, включающих как MLV, так и VLP (каждый антиген, соответствующий одному и тому же патогену, но не обязательно кодирующий или имеющий одну и ту же часть или ген или его субъединицу), способен преодолеть действие MDA для получения защитного иммунитета против последующего вирулентного заражения указанным патогеном. Соответственно, в конкретном воплощении, изобретение обеспечивает комбинацию вакцин, включающих как MLV CPV, так и VLP CPV, которые вызывают защитный иммунитет у щенков, независимо от того, имеют ли щенки циркулирующие MDA против CPV.

В другом воплощении, изобретение обеспечивает комбинацию вакцин, включающих как MLV, так и VLP, соответствующих другим патогенам, если вмешательство MDA представляет собой проблему. Например, молодые коровы, свиньи, кошки, козы, овцы, лошади и другие имеют циркулирующие MDA против различных патогенов. В каждом случае, присутствие данных MDA может влиять на эффективность вакцин. Теперь, когда это раскрытие было сделано, авторы изобретения предполагают, что введение комбинации обоих MLV + VLP преодолеет MDA независимо от патогена. Патогены могут включать, без ограничений: вирус ящура (FMDV), вирус свиного репродуктивного и респираторного синдрома (PRRSV), вирус собачьей чумы (CDV), вирус панлейкопении кошек FPL и вирус конского гриппа (EIV). Специалисту будет понятно, что этот подход, предусматривающий MLV + VLP, может быть применен в любом случае, где вмешательство MDA создает проблему.

Наборы, включающие, по меньшей мере, один антигенный полипептид или его фрагмент или вариант, и инструкции по применению также обеспечивают.

Краткое описание чертежей

Следующее подробное описание, приведенное в виде примеров, но не предназначенное для ограничения изобретения исключительно описанными конкретными вариантами осуществления, может быть лучше понято в сочетании с прилагаемыми чертежами, на которых:

фиг. 1 отображает таблицу, суммирующую последовательности ДНК и белка;

фиг. 2 изображает карту плазмиды pMEB072;

фиг. 3 изображает карту плазмиды pMEB073;

фиг. 4 представляет собой электронную микрофотографию VLP CPV, показывающую правильную форму и морфологию для парвовирусоподобных вирионов;

фиг. 5 представляет собой Вестерн-блот, показывающий уровни VLP CPV и сопутствующие данные;

фиг. 6 представляет собой Вестерн-блот, показывающий уровни VLP CPV и сопутствующие данные;

фиг. 7 представляет собой график, показывающий титры CPV, определенные с помощью ELISA после вакцинации;

фиг. 8 представляет собой график, показывающий титры CPV, определенные с помощью ELISA, после вакцинации штаммами Souriou & Bari (низкая доза, без адъюванта) или pMEB072-продуцированными VLP CPV. Появление происходит быстрее в группе, получавшей VLP;

фиг. 9 представляет собой график, показывающий титры CPV, определенные с помощью ELISA, после вакцинации штаммами Souriou & Bari (промежуточная доза, с адъювантом) или pMEB073-продуцированными VLP CPV (с Al(OH)₃+сапонин). Появление происходило еще быстрее в группе, получавшей VLP;

фиг. 10 представляет собой график, показывающий титры CPV, определенные с помощью ELISA, после вакцинации штаммами Souriou & Bari (высокая доза) или pMEB073-продуцированными VLP CPV (с Al(OH)₃+сапонин). Появление происходило быстро во всех трех группах;

фиг. 11 представляет собой ClustalW выравнивание SEQ ID NOs: 1, 3, 4 и 6;

фиг. 12 представляет собой график, показывающий индивидуальные титры анти-CPV антител (IHA), в соответствии с обработкой (MLV или MLV + VLP на D0) и днем. Каждая строка соответствует одному индивидууму, и размер точек соответствует числу значений в указанной комбинации дня и титра. Показаны данные только от собак, имевшие титр D0 IHA ≥ 40;

фиг. 13 представляет собой график, показывающий средние анти-CPV титры антител (IHA) в соответствии с обработкой (MLV или MLV + VLP на D0) и днем. «Ящики» представляют медианные, 25-й и 75-й процентили, и концы усов представляют значения в пределах 1,5-кратного межквартильного диапазона; каждый символ представляет одно значение;

фиг. 14 представляет собой график, показывающий средние анти-CPV титры антител (определенные с помощью ELISA log10 OD50) в зависимости от дня после вакцинации и группы (Gr A: VLP SC 500 мкл; Gr D VLP перорально; Gr E: Ad5 CPV 8,64 log10; Gr G: Ad5 CDV). Собак вакцинировали на D0 и D28. Средние значения представлены как +/- одна стандартная ошибка среднего; каждая точка представляет собой одно значение;

фиг. 15 представляет собой график, показывающий процент ответивших для исследования, раскрытого в примере 7;

фиг. 16 представляет собой график, показывающий титры HAI;

фиг. 17 представляет собой график, показывающий среднее геометрическое титра CPV-нейтрализующих антител;

фиг. 18 представляет собой график, показывающий процент отвечающих по группам и дням;

фиг. 19 представляет собой график, показывающий среднее геометрическое для титра антител к CPV по группам и дням.

Осуществление изобретения

Обеспечивают композиции, включающие полипептид CPV, антиген и его фрагменты и варианты, которые вызывают иммунный ответ у животного. Антигенные полипептиды или их фрагменты или варианты получают с помощью бакуловирусного экспрессионного вектора в клетках насекомых. Антигенные полипептиды или фрагменты или варианты могут быть составлены в вакцины или фармацевтические композиции с модифицированными живыми вирусами CPV или без них и применены для того, чтобы вызвать или стимулировать защитный ответ у животного. В одном из воплощений полипептидный антиген представляет собой полипептид капсиды CPV или его активный фрагмент или вариант. Антигены CPV могут быть собраны в пустые капсиды CPV или VLP CPV (вирусоподобные частицы).

Признано, что антигенные полипептиды изобретения могут представлять собой полноразмерные полипептиды или их активные фрагменты или варианты. Под «активными фрагментами» или «активными вариантами» подразумевают, что фрагменты или варианты сохраняют антигенную природу полипептида. Таким образом, настоящее изобретение охватывает любой полипептид, антиген, эпитоп или иммуноген CPV, который вызывает иммуногенный ответ у животного. Полипептид, антиген, эпитоп или иммуноген CPV может представлять собой любой полипептид, антиген, эпитоп или иммуноген CPV, такой как, но без ограничений, его белок, пептид или фрагмент или вариант, который вызывает, индуцирует или стимулирует ответ у животного, такого как овца, корова, коза или свинья.

Настоящее изобретение относится к вакцинам или композициям для собак, которые могут включать эффективное количество рекомбинантного антигена CPV. В некоторых воплощениях, вакцины или композиции представляют собой безадъювантные вакцины или композиции, и могут включать фармацевтически или ветеринарно-приемлемый носитель, наполнитель или разбавитель.

В некоторых воплощениях, ответ животного представляет собой защитный иммунный ответ.

Под «животным» подразумевают млекопитающих, птиц и т.п. Животное или хозяин включает млекопитающих и человека. Животное может быть выбрано из группы, состоящей из лошадиных (например, лошадь), собачьих (например, собаки, волки, лисы, койоты, шакалы), кошачьих (например, львы, тигры, домашние кошки, дикие кошки, другие большие кошки и другие кошачьи, включая гепардов и рысь), овец (например, овца), быков (например, крупный рогатый скот), свиней (например, свинья), козлов (например, козел), птиц (например, курица, утка, гусь, индейка, перепелка, фазан, попугай, зяблики, ястреб, ворона, страус, эму и казуар), приматов (например, полуобезьяна, долгопят, мартышка, гиббон, обезьяна) и рыб. Термин «животное» также включает индивидуальное животное на всех этапах развития, включая эмбриональные и фетальные стадии.

Если не указано иное, все технические и научные термины, примененные в настоящем документе, имеют такое же значение, как обычно понимается обычным специалистом в области, к которой относится это раскрытие. Термины в единственном числе включают в себя множественное число, если контекст явно не указывает на иное. Точно также слово «или» предназначено для включения «и», если контекст явно не указывает на иное.

Следует отметить, что в этом раскрытии и, в особенности, в формуле изобретения и/или пунктах, такие термины как «включает», «включенный», «включающий» и им подобные могут иметь значение, приписываемое ему в Патентным законодательством США; например, они могут означать «содержит», «содержащийся», «содержащий» и т.п., и такие термины как «состоящий в основном из» и «состоит в основном из» имеют значение, приписываемое им в Патентном законодательстве США, например, они допускают элементы, явно не указанные, но исключают элементы, которые обнаружены в известном уровне техники, или которые влияют на основные или новые характеристики изобретения.

Антигенные полипептиды изобретения способны защищать от CPV. То есть, они способны стимулировать иммунный ответ у животного. Под терминами «антиген» или «иммуноген» понимают вещество, которое индуцирует специфический иммунный ответ у животного-хозяина. Антиген может включать целый организм, убитый, аттенуированный или живой; субъединицу или часть организма; рекомбинантный вектор, содержащий вставку с иммуногенными свойствами; часть или фрагмент ДНК, способный индуцировать иммунный ответ при презентации животному-хозяину; полипептид, эпитоп, гаптен или любую их комбинацию. Альтернативно, иммуноген или антиген могут включать токсин или антитоксин.

Термин «иммуногенный белок, полипептид или пептид», как применен в настоящем документе, включает полипептиды, которые иммунологически активные в том смысле, что после введения хозяину, они способен вызывать иммунный ответ гуморального и/или клеточного типа, направленные против белка. Предпочтительно белковый фрагмент таков, что он обладает существенно такой же иммунологической активностью как полный белок. Таким образом, белковый фрагмент в соответствии с изобретением включает или состоит в основном из или состоит из, по меньшей мере, одного эпитопа или антигенной детерминанты. «Иммуногенный» белок или полипептид, как используется в настоящем документе, включает полноразмерную последовательность белка, его аналогов или его иммуногенных фрагментов. Термином «иммуногенный фрагмент» обозначают фрагмент белка, который включает один или несколько эпитопов и, таким образом, вызывает описанный выше иммунологический ответ. Такие фрагменты могут быть идентифицированы с применением любого числа методов картирования эпитопов, хорошо известных в данной области техники. Смотри, например, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996). Например, линейные эпитопы могут быть определены с помощью, например, одновременное синтезирование большого количества пептидов на твердых подложках, пептидов, соответствующих частям белковой молекулы, и проведение реакции пептидов с антителами, в то время как пептиды все еще остаются прикрепленными к подложкам. Такие методики известны в данной области техники и описаны, например, в патенте США № 4,708,871; Geysen et al., 1984; Geysen et al., 1986. По аналогии, конформационные эпитопы легко идентифицируют путем определения пространственной конформации аминокислот, например, с помощью, например, рентгеновской кристаллографии и 2-мерного ядерного магнитного резонанса. Смотри, например, Epitope Mapping Protocols, supra. Способы, особенно применимые к белкам T. parva, полностью описаны в PCT/US2004/022605, включенной в настоящем документе путем отсылки во всей своей полноте.

Как обсуждалось, изобретение охватывает активные фрагменты и варианты антигенного полипептида. Таким образом, термин «иммуногенный белок, полипептид или пептид» дополнительно рассматривает делеции, вставки и замены в последовательности, до тех пор, пока полипептид способен продуцировать иммунологический ответ, как определен в настоящем документе. Термин «консервативная вариация» означает замену аминокислотного остатка другим биологически подобным остатком или замену нуклеотида в последовательности нуклеиновой кислоты, так что кодируемый аминокислотный остаток не изменяется или представляет собой другой биологически подобный остаток. В этой связи, особенно предпочтительными заменами будут, как правило, консервативные по своей природе, т.е. это те замены, которые происходят в пределах семейства аминокислот. Например, аминокислоты обычно подразделяют на четыре семейства: (1) кислые - аспартат и глутамат; (2) основные - лизин, аргинин, гистидин; (3) неполярные - аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан; и (4) незаряженные полярные - глицин, аспарагин, глутамин, цистеин, серин, треонин, тирозин. Фенилаланин, триптофан и тирозин иногда классифицируют как ароматические аминокислоты. Примеры консервативных вариаций включают замену одного гидрофобного остатка, такого как изолейцин, валин, лейцин или метионин, другим гидрофобным остатком или замену одного полярного остатка на другой полярный остаток, такую как замену аргинина на лизин, глутаминовой кислоты на аспарагиновую кислоту или глутамина на аспарагин и т.п.; или аналогичную консервативную замену аминокислоты на структурно родственную аминокислоту, которая не будет оказывать существенного влияния на биологическую активность. Белки, имеющие существенно сходную аминокислотную последовательность как референсная молекула, но обладающие незначительными аминокислотными заменами, которые не влияют существенно на иммуногенность белка, находятся, следовательно, в пределах определения референсного полипептида. Все полипептиды, полученные в результате данных модификации, включены в настоящем документе. Термин «консервативная вариация» также включает применение замещенной аминокислоты вместо незамещенной исходной аминокислоты при условии, что антитела, возникающие в ответ на замещенный полипептид, также иммунореагируют с незамещенным полипептидом.

Термин «эпитоп» относится к сайту на антигене или гаптене, на которые отвечают специфические B-клетки и/или T-клетки. Термин также применяют взаимозаменяемо с терминами «антигенная детерминанта» или «сайт антигенной детерминанты». Антитела, которые распознают тот же эпитоп, могут быть идентифицированы в простом иммуноанализе, показывающем способность одного антитела блокировать связывание другого антитела с антигеном-мишенью.

«Иммунологический ответ» на композицию или вакцину представляет собой развитие в хозяине клеточного и/или опосредуемого антителами иммунного ответа на представляющую интерес композицию или вакцину. Как правило, «иммунологический ответ» включает, без ограничений, один или несколько из следующих эффектов: продукцию антител, B-клеток, T-клеток хелперов, и/или цитотоксических T-клеток, направленных специфически на антиген или антигены, включенные в представляющую интерес композицию или вакцину. Предпочтительно, хозяин покажет или терапевтический, или защитный иммунологический ответ, так что будет усилена устойчивость к новой инфекции и/или клиническая тяжесть заболевания будет снижена. Такая защита будет продемонстрирована либо снижением, либо отсутствием симптомов, обычно проявляемых инфицированным хозяином, более коротким временем восстановления и/или пониженным титром вируса у инфицированного хозяина.

Синтетические антигены также включены в рамки определения, например, полиэпитопы, фланкирующие эпитопы и другие рекомбинантные или синтетически полученные антигены. Смотри, например, Bergmann et al., 1993; Bergmann et al., 1996; Suhrbier, 1997; Gardner et al., 1998. Иммуногенные фрагменты, для целей настоящего изобретения, как правило, включают, по меньшей мере, примерно 3 аминокислоты, по меньшей мере, примерно 5 аминокислот, по меньшей мере, примерно 10-15 аминокислот или примерно 15-25 аминокислот или более аминокислот, от молекулы. Не существует критического верхнего предела длины фрагмента, который может включать практически полноразмерную белковую последовательность или даже слитый белок, включающий, по меньшей мере, один эпитоп белка.

Соответственно, минимальная структура эпитопа, экспрессирующего полинуклеотид, состоит в том, что она включает или состоит в основном из или состоит из нуклеотидов, кодирующих эпитоп или антигенную детерминанту полипептида CPV. Полинуклеотид, кодирующий фрагмент полипептида CPV, может включать или состоит в основном из или состоит из как минимум 15 нуклеотидов, примерно 30-45 нуклеотидов, примерно 45-75 или, по меньшей мере, 57, 87 или 150 последовательных или прилегающих нуклеотидов последовательности, кодирующей полипептид. Процедуры определения эпитопа, такие как, генерирование библиотек перекрывающихся пептидов (Hemmer et al., 1998), Pepscan (Geysen et al., 1984; Geysen et al., 1985; Van der Zee R. et al., 1989; Geysen, 1990; Multipin. RTM. Peptide Synthesis Kits de Chiron) и алгоритмы (De Groot et al., 1999; PCT/US2004/022605) могут быть применены в практике изобретения.

Термин «нуклеиновая кислота» и «полинуклеотид» относится к РНК или ДНК, которые представляют собой линейные или разветвленные, одно- или двухцепочечные молекулы или их гибрид. Термин также охватывает гибриды РНК/ДНК. Ниже приведены неограничивающие примеры полинуклеотидов: ген или фрагмент гена, экзоны, интроны, мРНК, тРНК, рРНК, рибозимы, кДНК, рекомбинантные полинуклеотиды, разветвленные полинуклеотиды, плазмиды, векторы, выделенная ДНК любой последовательности, выделенная РНК любой последовательности, зонды и праймеры из нуклеиновой кислоты. Полинуклеотид может включать модифицированные нуклеотиды, такие как метилированные нуклеотиды и аналоги нуклеотидов, урацил, другие сахара и связывающие группы, такие как фторрибозу и тиолат, и нуклеотидные ответвления. Последовательность нуклеотидов может быть дополнительно модифицирована после полимеризации, например, с помощью конъюгации, с метящим компонентом. Другие виды модификаций, включенные в данное определение, представляют собой кэпы, замену одного или нескольких природных нуклеотидов аналогом, и введение средств для прикрепления полинуклеотида к белкам, ионы металлов, метящие компоненты, другие полинуклеотиды или твердую подложку. Полинуклеотиды могут быть получены с помощью химического синтеза или получены из микроорганизма.

Термин «ген» широко применяют для обозначения любого сегмента полинуклеотида, связанного с биологической функцией. Таким образом, гены включают интроны и экзоны как в геномной последовательности или просто кодирующие последовательность, как в кДНК, и/или регуляторные последовательности, необходимые для их экспрессии. Например, понятие ген также относится к фрагменту нуклеиновой кислоты, которая экспрессирует мРНК или функциональную РНК или кодирует специфический белок, и которая включает регуляторную последовательности.

Изобретение дополнительно включает комплементарную цепь к полинуклеотиду, кодирующему антиген, эпитоп или иммуноген CPV. Комплементарная цепь может быть полимерной и иметь любую длину, и может содержать дезоксирибонуклеотиды, рибонуклеотиды и аналоги в любой комбинации.

Термины «белок», «пептид», «полипептид» и «полипептидный фрагмент» применяют взаимозаменяемо в настоящем документе для обозначения полимеров аминокислотных остатков любой длины. Полимер может быть линейным или разветвленным, он может включать модифицированные аминокислоты или аминокислотные аналоги, и он может прерываться химическими группами, отличными от аминокислот. Термины также охватывают полимер аминокислот, который был модифицирован в природных условиях или в результате вмешательства; например, образование дисульфидной связи, гликозилирование, липидация, ацетилирование, фосфорилирование или любые другие манипуляции или модификации, такие как конъюгация с метящим или биоактивным компонентом.

Термин «изолированный» биологический компонент (такой как нуклеиновая кислота или белок или органелла) относится к компоненту, который был существенно отделен или очищен от других биологических компонентов в клетке организма, в которой компонент существует в природе, например, другие хромосомные и экстра-хромосомные ДНК и РНК, белки и органеллы. Нуклеиновые кислоты и белки, которые были «изолированы», включают нуклеиновые кислоты и белки, очищенные с помощью стандартных способов очистки. Термин также охватывает нуклеиновые кислоты и белки, полученные с помощью рекомбинантных технологий, а также химическим синтезом.

Термин «очищенный», как применен в настоящем документе, не требует абсолютной чистоты; скорее, его применяют как относительный термин. Таким образом, например, препарат очищенного полипептида - это препарат, который в большей степени обогащен полипептидом, чем полипептид в своем естественном окружении. То есть полипептид отделяют от клеточных компонентов. Под «существенно очищенный» понимают, что полипептид представляет несколько воплощений, в которых, по меньшей мере, 60%, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95% или, по меньшей мере, 98% или более клеточных компонентов или материалов было удалено. Аналогично, полипептид может быть частично очищен. Под «частично очищенный» понимают, что удалили менее чем 60% клеточных компонентов или материала. То же самое относится к полинуклеотидам. Полипептиды, раскрытые в настоящем документе, могут быть очищены с помощью любого из способов, известных в данной области техники.

Как отмечено выше, антигенные полипептиды или их фрагменты или варианты представляют собой антигенные полипептиды CPV, которые получают с помощью бакуловирусного экспрессионного вектора в клетках насекомых. Фрагменты и варианты раскрытых полинуклеотидов и полипептидов, кодируемых таким образом, также охвачены настоящим изобретением. Термин «фрагмент» предназначен для обозначения части полинуклеотида или части антигенной аминокислотной последовательности, кодируемой таким образом. Фрагменты полинуклеотида могут кодировать белковые фрагменты, которые сохраняют биологическую активность природного белка и, следовательно, обладают иммуногенной активностью, как отмечено в других местах в настоящем документе. Фрагменты полипептидной последовательности сохраняют способность индуцировать защитный иммунный ответ у животного.

Термин «варианты» предназначен для обозначения существенно сходных последовательностей. Для полинуклеотидов вариант включает делецию и/или вставку одного или нескольких нуклеотидов в один или несколько сайтов внутри природного полинуклеотида и/или замену одного или нескольких нуклеотидов в одном или нескольких сайтах в природном полинуклеотиде. Как применен в настоящем документе, «природный» полинуклеотид или полипептид включает природную нуклеотидную последовательность или аминокислотную последовательность, соответственно. Варианты конкретного полинуклеотида изобретения (т.е. референсного полинуклеотида) также могут быть оценены путем сравнения процента идентичности последовательности между полипептидом, кодируемым вариантом полинуклеотида, и полипептидом, кодируемым референсным полинуклеотидом. Термин «вариант» белка предназначен для обозначения белка, полученного из природного белка делецией или вставкой одной или нескольких аминокислот в одном или нескольких сайтах в природный белок и/или заменой одной или нескольких аминокислот в одном или нескольких сайтах в природном белке. Варианты белков, охваченные настоящим изобретением, представляют собой биологически активные белки, т.е. способные вызывать иммунный ответ.

В одном из аспектов, настоящее изобретение обеспечивает полипептиды CPV из изолятов CPV. В другом аспекте, настоящее изобретение обеспечивает полипептид, имеющий последовательность, как указана в SEQ ID NOs: 1, 3, 4, 6, 8-10, и ее вариант или фрагмент.

В другом аспекте, изобретение относится к свободным капсидам CPV или VLP CPV (вирусоподобные частицы). Капсиды могут включать, состоять в основном из или состоять из полипептидов CPV VP2 или вариантов, включая их усеченные варианты.

Кроме того, гомологи полипептидов CPV предназначены для охвата настоящим изобретением. Термин «гомологи», как используется в настоящем документе, включает ортологи, аналоги и паралоги. Термин «аналоги» относится к двум полинуклеотидам или полипептидам, которые имеют одинаковую или сходную функцию, но которые развивались отдельно у неродственных организмов. Термин «ортологи» относится к двум полинуклеотидам или полипептидам от разных видов, но которые эволюционировали от общего предкового гена путем видообразования. Обычно, ортологи кодируют полипептиды, имеющие одинаковые или сходные функции. Термин «паралоги» относится к двум полинуклеотидам или полипептидам, которые связаны дублированием в геноме. Паралоги, как правило, имеют разные функции, но эти функции могут быть связаны. Аналоги, ортологи и паралоги полипептида CPV дикого типа могут отличаться от полипептида CPV дикого типа пост-трансляционными модификациями, различием в аминокислотной последовательности или и тем, и другим. В особенности, гомологи изобретения, в общем, будут проявлять, по меньшей мере, 80-85%, 85-90%, 90-95% или 95%, 96%, 97%, 98%, 99% идентичности последовательности, со всей или частью полинуклеотидной последовательности CPV дикого типа, и будут проявлять сходную функцию. Варианты включают аллельные варианты. Термин «аллельный вариант» относится к полинуклеотиду или полипептиду, содержащим полиморфизмы, которые приводят к изменениям в аминокислотных последовательностях белка и которые существуют в природной популяции (например, виды или разновидности вируса). Такие природные аллельные вариации, как правило, могут привести к 1-5% дисперсии в полинуклеотиде или полипептиде. Аллельные варианты могут быть определены секвенированием представляющей интерес последовательности нуклеиновой кислоты в ряде различных видов, которое может быть легко выполнено с применением зондов гибридизации для идентификации того же генетического локуса гена в данных видах. Любые и все такие вариации нуклеиновой кислоты и полученные аминокислотные полиморфизмы или вариации, которые представляют собой результат природных аллельных вариаций и которые не меняют функциональную активность представляющего интерес гена, предназначены для включения в объем изобретения.

Как применен в настоящем документе, термин «производное» или «вариант» относится к полипептиду или нуклеиновой кислоте, кодирующей полипептид, который имеет одну или несколько консервативных вариации аминокислот или другие минорные модификации, такие как (1) соответствующий полипептид имеет существенно эквивалентную функцию по сравнению с полипептидом дикого типа или (2) антитело, возникшее против этого полипептида, обладает иммунореактивностью с полипептидом дикого типа. Данные варианты или производные включают полипептиды, имеющие минорные модификации первичных аминокислотных последовательностей полипептида CPV, что может привести к пептидам, которые имеют существенно эквивалентную активность по сравнению с немодифицированным аналогом полипептида. Такие модификации могут быть специально полученными, например, полученными с помощью сайт-специфического мутагенеза, или могут быть спонтанными. Термин «вариант» дополнительно относится к делециям, вставкам и заменам в последовательность, пока полипептид функционирует, производя иммунологический ответ, как определен в настоящем документе.

Термин «консервативная вариация» обозначает замену аминокислотного остатка другим биологически сходным остатком или замену нуклеотида в последовательности нуклеиновой кислоты, такую, что кодируемый аминокислотный остаток не изменяется или представляет собой другой биологически похожий остаток. В этой связи, особенно предпочтительны замены, которые, в общем, консервативны по природе, как описано выше.

Полинуклеотиды раскрытия включают последовательности, которые вырождены в результате генетического кода, например, путем применения оптимизированного кодона для конкретного хозяина. Термин «оптимизированный», как используется в настоящем документе, относится к полинуклеотиду, который создан с помощью генно-инженерных методик для увеличения его экспрессия в данном виде. Для обеспечения оптимизированных полинуклеотидов, кодирующих полипептиды CPV, последовательность ДНК гена белка CPV может быть модифицирована для 1) включения кодонов, предпочитаемых генами с высоким уровнем экспрессии в определенном виде; 2) включения A+T или G+C содержания в композицию нуклеотидных оснований до величины, обнаруживаемой в существенной степени у указанных видов; 3) формирования инициирующей последовательности у указанных видов; или 4) устранения последовательностей, которые вызывают дестабилизацию, несоответствующее полиаденилирование, деградацию и терминацию РНК или которые образуют вторичные структуры типа шпилек, или сайтов сплайсинга РНК. Увеличенная экспрессия белка CPV в указанных видах может быть достигнута за счет учета частоты распределения использования кодона у эукариот и прокариот или у определенного вида. Термин «частота использования предпочтительного кодона» относится к предпочтению, проявляемому специфической клеткой-хозяином в использовании нуклеотидных кодонов для определения данной аминокислоты. Существует 20 природных аминокислот, большинство из которых определяются более чем одним кодоном. Следовательно, все вырожденные нуклеотидные последовательности включены в раскрытие до тех пор, пока аминокислотная последовательность полипептида CPV, кодируемая нуклеотидной последовательностью, функционально не меняется.

Идентичность последовательности между двумя аминокислотными последовательностями может быть установлена с помощью матриц попарного распределения и blosum62, применяя стандартные параметры (смотри, например, алгоритм BLAST или BLASTX, доступный на сервере «Национального центра биотехнологической информации» (NCBI, Bethesda, Md., США), а также в работе Altschul et al.; и, таким образом, в этом документе термин «распределяют» говорит о применении алгоритма или матрицы BLAST или BLASTX и BLOSUM62).

Термин «идентичность» в отношении последовательности может относиться к числу позиций с идентичными нуклеотидами или аминокислотами, деленному на число нуклеотидов или аминокислот в более короткой из двух последовательностей, в которой выравнивание двух последовательностей может быть определено в соответствии с алгоритмом Уилбера и Липмана (Wilbur и Lipman), например, применяя окно, размером в 20 нуклеотидов, длину слова, равную 4 нуклеотидам, и штраф за пропуск в последовательности, равный 4, и данные компьютерного анализа и интерпретации последовательности, включая выравнивание, могут быть удобно получены с помощью коммерчески доступные программ (например, Intelligenetics™ Suite, Intelligenetics Inc. CA). Если последовательности РНК называют сходными или они имеют степень идентичности или гомологии последовательности с последовательностями ДНК, тимидин (T) в последовательности ДНК считается равным урацилу (U) в последовательности РНК. Таким образом, последовательности РНК находятся в пределах объема изобретения и могут быть получены из последовательностей ДНК, считая тимидин (T) в последовательности ДНК равным урацилу (U) в последовательностях РНК.

Идентичность последовательностей или сходство последовательностей двух аминокислотных последовательностей или идентичность последовательностей между двумя нуклеотидными последовательностями может быть определена с помощью пакета программного обеспечения Vector NTI (Invitrogen, 1600 Faraday Ave., Carlsbad, CA).

Следующие документы обеспечивают алгоритмы для сравнения относительной идентичности или гомологии последовательностей, и дополнительно или альтернативно в отношении вышеизложенного, идеи в данных ссылках могут быть применены для определения процентов гомологии или идентичности: Needleman SB and Wunsch CD; Smith TF and Waterman MS; Smith TF, Waterman MS and Sadler JR; Feng DF and Dolittle RF; Higgins DG and Sharp PM; Thompson JD, Higgins DG and Gibson TJ; and, Devereux J, Haeberlie P and Smithies O. И, без излишнего экспериментирования, квалифицированный специалист может обратиться ко многим другим программам или ссылкам для определения процентов гомологии.

Реакция гибридизации может быть выполнена в условиях различной «строгости». Условия, которые увеличивают жесткость реакции гибридизации, хорошо известны. Смотри, например, «Molecular Cloning: A Laboratory Manual», второе издание (Sambrook et al., 1989).

Изобретение дополнительно охватывает полинуклеотиды CPV, которые содержатся в молекуле вектора или в векторе экспрессии и функционально связаны с промоторным элементом и, необязательно, с энхансером.

Термин «вектор» относится к рекомбинантной ДНК или РНК плазмиды или вируса, который включает гетерологичный полинуклеотид для доставки в целевую клетку, или in vitro, или in vivo. Гетерологичный полинуклеотид может включать последовательность, представляющую интерес для целей профилактики или терапии, и необязательно может быть представлен кассетой экспрессии. Как применен в настоящем документе, вектор не должен быть способен к репликации в конечной целевой клетке или субъекте. Термин включает клонирующие векторы и вирусные векторы.

Термин «рекомбинантный» означает полинуклеотид полусинтетического или синтетического происхождения, который или не встречается в природе, или связан с другим полинуклеотидом в расположении, не встречающемся в природе.

«Гетерологичный» означает полученный из объекта, генетически отличающегося от частей другого объекта, с которыми он сравнивается. Например, полинуклеотид может быть помещен с помощью генно-инженерной методики в плазмиду или вектор, полученный из другого источника, и представляет собой гетерологичный полинуклеотид. Промотор, удаленный из его нативной кодирующей последовательности и функционально связанный с кодирующей последовательностью, отличной от нативной последовательности, представляет собой гетерологичный промотор.

Настоящее изобретение относится к овечьим, коровьим, козьим и свиным вакцинам или фармацевтическим или иммунологическим композициям, которые могут включать эффективное количество рекомбинантных антигенов CPV и фармацевтически или ветеринарно приемлемый носитель, адъювант, наполнитель или разбавитель.

Объект изобретения, описанный в настоящем документе, направлен, частично, на композиции и способы, относящиеся к антигену CPV, полученному в системе экспрессии бакуловирус/клетки насекомых, которая высоко иммуногена и защищает животных от заражения гомологичными и гетерологичными штаммами CPV.

Композиции

Настоящее изобретение относится к вакцине или композиции CPV, которые могут включать эффективное количество рекомбинантного антигена CPV и фармацевтически или ветеринарно приемлемый носитель, наполнитель или разбавитель. В одном из воплощений, рекомбинантный антиген CPV экспрессируют с помощью бакуловирусного вектора экспрессии в клетках насекомых.

Одно из воплощений изобретения относится к вакцине или композиции, включающей пустые капсиды CPV или VLP (вирусоподобные частицы) CPV. Пустые капсиды CPV или VLP (вирусоподобные частицы) CPV получают экспрессией капсидного белка CPV.

Настоящее изобретение также относится к способам получения данных вакцин, применению антигенов для получения данных вакцин и способам вакцинации с их применением.

Настоящее изобретение также относится к нуклеотидным последовательностям, в особенности к кДНК, и к аминокислотным последовательностям, модифицированным по сравнению с природными последовательностями вируса. Изобретение также относится к продуктам экспрессии модифицированных нуклеотидных последовательностей и к антигенам CPV и вирусу, включающему данные модификации.

Настоящее изобретение охватывает любой полипептид, антиген, эпитоп или иммуноген CPV, который вызывает иммуногенный ответ у животного, такого как овца, корова, коза или свинья. Полипептид, антиген, эпитоп или иммуноген CPV может представлять собой любой полипептид, антиген, эпитоп или иммуноген CPV, такой как, но без ограничений, белок, пептид или его фрагмент, который вызывает, индуцирует или стимулирует ответ у животного, такого как собака.

В воплощении, в котором иммунологическая композиция или вакцина CPV представляет собой рекомбинантную иммунологическую композицию или вакцину, композиция или вакцина, включающая рекомбинантный вектор и представляющая собой безадъювантную композицию или вакцину, может необязательно включать фармацевтически или ветеринарно приемлемый наполнитель, носитель или разбавитель; рекомбинантный вектор представляет собой бакуловирусный вектор экспрессии, который может включать полинуклеотид, кодирующий полипептид, антиген, эпитоп или иммуноген CPV. Полипептид, антиген, эпитоп или иммуноген CPV может представлять собой капсидный белок и любой его фрагмент.

В одном из воплощений, молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая один или несколько антиген(антигенов) CPV представляет собой кДНК, кодирующую капсидный белок CPV. В другом воплощении, молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая один или несколько антиген(антигенов) CPV представляет собой кДНК, кодирующую фрагмент капсидного белка CPV.

В другом воплощении, антиген CPV может быть получен из штамма CPV 100869-1.

Настоящее изобретение относится к композиции или вакцине CPV, которые могут включать эффективное количество рекомбинантного антигена CPV. Композиция или вакцина CPV не содержит адъювант. Композиция или вакцина CPV может необязательно содержать фармацевтически или ветеринарно приемлемый носитель, наполнитель или разбавитель.

Изобретение дополнительно охватывает полинуклеотиды CPV, содержащиеся в молекуле вектора или в экспрессионном векторе и функционально связанные с элементом промотора и необязательно с энхансером.

В одном из аспектов, настоящее изобретение обеспечивает полипептиды CPV, имеющие последовательности, как указаны в SEQ ID NO: 1, 3, 4, 6 или 8-10, и их варианты или фрагменты.

В другом аспекте, настоящее изобретение обеспечивает полипептид, имеющий, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности с антигенным полипептидом изобретения, в особенности, с полипептидами, имеющими последовательности, как указаны в SEQ ID NO: 1, 3, 4, 6 или 8-10.

В еще одном аспекте, настоящее изобретение обеспечивает фрагменты и варианты полипептидов CPV, указанных выше (SEQ ID NO: 1, 3, 4, 6 или 8-10), которые могут быть легко получены специалистом в данной области техники с применением хорошо известных молекулярно-биологических методик.

Варианты представляют собой гомологичные полипептиды, имеющие идентичность аминокислотной последовательности, по меньшей мере, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% по сравнению с аминокислотной последовательностью, как указана в SEQ ID NO: 1, 3, 4, 6 или 8-10.

Иммуногенный фрагмент полипептида CPV включает, по меньшей мере, 8, 10, 15 или 20 последовательных аминокислот, по меньшей мере, 21 аминокислоту, по меньшей мере, 23 аминокислоты, по меньшей мере, 25 аминокислот или, по меньшей мере, 30 аминокислот полипептида CPV, имеющего последовательность, как указана в SEQ ID NO: 1, 3, 4, 6 или 8-10 или их варианты. В другом воплощении, фрагмент полипептида CPV включает специфический антигенный эпитоп, обнаруженный на полноразмерном полипептиде CPV. Однако специалисту понятно, что достаточная часть полипептида CPV должны присутствовать, чтобы позволить образование VLP CPV.

В другом аспекте, настоящее изобретение обеспечивает полинуклеотид, кодирующий полипептид CPV, такой как полинуклеотид, кодирующий полипептид, имеющий последовательность, как указана в SEQ ID NO: 1, 3, 4, 6 или 8-10. В еще одном аспекте, настоящее изобретение обеспечивает полинуклеотид, кодирующий полипептид, имеющий, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности с полипептидом, имеющим последовательность, как указана в SEQ ID NO: 1, 3, 4, 6 или 8-10 или консервативных вариант, аллельный вариант, гомолог или иммуногенный фрагмент, включающие, по меньшей мере, восемь или, по меньшей мере, десять последовательных аминокислот одного из данных полипептидов или комбинации данных полипептидов.

В другом аспекте, настоящее изобретение обеспечивает полинуклеотид, имеющий нуклеотидную последовательность, как указана в SEQ ID NO: 2, 5, 7, 11 или 12, или ее вариант. В еще одном аспекте, настоящее изобретение обеспечивает полинуклеотид, имеющий, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%, по меньшей мере, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности с одним полинуклеотидом, имеющим последовательность, как указана в SEQ ID NO: 2, 5, 7, 11 или 12, или ее вариант.

Полинуклеотиды изобретения могут включать дополнительные последовательности, такие как дополнительные кодирующие последовательности в пределах одной и той же единицы транскрипции, элементы управления, такие как промоторы, сайты связывания рибосом, 5’UTR, 3’UTR, терминаторы транскрипции, сайты полиаденилирования, дополнительные транскрипционные единицы под контролем того же или другого промотора, последовательности, которые позволяют клонирование, экспрессию, гомологичную рекомбинацию и трансформацию клетки-хозяина, и любые такие конструкты, какие могут быть желательны для обеспечения воплощений изобретения.

Элементы для экспрессии полипептида, антигена, эпитопа или иммуногена CPV преимущественно присутствуют в векторе изобретения. В минимальном порядке, они включают, состоят в основном из или состоят из инициирующего кодона (ATG), стоп-кодона и промотора, и, необязательно, также последовательности полиаденилирования для некоторых векторов, таких как плазмида и некоторых вирусных векторов, например, вирусных векторов, отличных от поксвирусов. Если полинуклеотид кодирует полибелковый фрагмент, например, пептид CPV, предпочтительно, в векторе, ATG помещают на 5' рамки считывания и стоп-кодон помещают на 3'. Могут присутствовать другие элементы для контроля экспрессии, такие как последовательности энхансера, стабилизирующие последовательности, такие как интрон, и сигнальные последовательности, позволяющие секретировать белки.

Настоящее изобретение также относится к препаратам, включающим векторы, такие как экспрессионные векторы, например, к терапевтическим композициям. Препараты могут включать один или несколько векторов, например, экспрессионные векторы экспрессии, такие как in vivo векторы экспрессии, включающие и экспрессирующие один или несколько полипептидов, антигенов, эпитопов или иммуногенов CPV. В одном из воплощений, вектор содержит и экспрессирует полинуклеотид, который включает, состоит в основном из или состоит из полинуклеотида, кодирующего (и предпочтительно экспрессирующего) антиген, эпитоп или иммуноген CPV, в фармацевтически или ветеринарно приемлемом носителе, наполнителе или разбавителе. Таким образом, в соответствии с воплощением изобретения, другие векторы или векторы в препарате включают, состоят в основном из или состоят из полинуклеотида, который кодирует, и в соответствующих условиях вектор экспрессирует один или несколько других белков полипептида CPV, его антигена, эпитопа или иммуногена или фрагмента.

В соответствии с еще одним воплощением вектор или векторы в препарате включают или состоят в основном из или состоят из полинуклеотида(полинуклеотидов), кодирующего(кодирующих) один или несколько белков полипептида, антигена, эпитопа или иммуногена CPV или его фрагмента(фрагментов), вектора или векторов, экспрессирующих полинуклеотид(полинуклеотиды). В другом воплощении, препарат включает один, два или более векторов, включающих полинуклеотиды, кодирующие и экспрессирующие, предпочтительно in vivo, полипептид, антиген, слитый белок CPV или его эпитоп.

В соответствии с еще одним дополнительным воплощением изобретения, экспрессионный вектор представляет собой плазмидный вектор или ДНК-плазмидный вектор, в особенности вектор экспрессии in vivo. В конкретном, неограничивающем примере, плазмида pVR1020 или 1012 (VICAL Inc.; Luke et al., 1997; Hartikka et al., 1996, смотри, например, патенты США №№ 5,846,946 и 6,451,769) может быть применена в качестве вектора для вставки полинуклеотидной последовательности. Плазмиду pVR1020 получали из pVR1012, и она содержала сигнальную последовательность человеческого tPA. В одном из воплощений сигнальные человеческие tPA включают от аминокислоты M(1) до аминокислоты S(23) в Genbank под номером доступа HUMTPA14. В другом конкретном, неограничивающем примере плазмида, примененная в качестве вектора для вставки полинуклеотидной последовательности, может содержать последовательность сигнального пептида лошади IGF1 от аминокислоты M(24) до аминокислоты A(48) в Genbank под номером доступа U28070. Дополнительную информацию о ДНК-плазмидах, которые могут быть приняты во внимание или применены на практике, можно найти, например, в патентах США №№ 6,852,705; 6,818,628; 6,586,412; 6,576,243; 6,558,674; 6,464,984; 6,451,770; 6,376,473 и 6,221,362.

Термин плазмида охватывает любые единицы транскрипции ДНК, включающие полинуклеотид в соответствии с изобретением и элементы, необходимые для его экспрессии in vivo в клетке или в клетках желаемого хозяина или мишени; и, в этой связи, следует отметить, что суперспирализованая или не-суперспирализованая, кольцевая плазмида, также как и линейная форма, предназначены для включения в пределы объема изобретения.

Каждая плазмида включает или содержит или состоит в основном из, в дополнение к полинуклеотиду, кодирующему антиген, эпитоп или иммуноген CPV, необязательно слитому с последовательностью, варианта, аналога или фрагмента гетерологичного пептида, функционально связанного с промотором или под контролем промотора или в зависимости от промотора. В общем, целесообразно применять сильный промотор, функциональный в эукариотических клетках. Сильный промотор может представлять собой, но без ограничений, немедленно-ранний цитомегаловирусный промотор (CMV-IE) человеческого или мышиного происхождения или необязательно имеющий другое происхождение, такое как из крысы или морской свинки, суперпромотор (Super promoter) (Ni, M. et al., Plant J. 7, 661-676, 1995). Промотор CMV-IE может включать фактическую промоторную часть, которая может быть связана или может быть не связана с энхансерной частью. Отсылка может быть сделана к EP-A-260 148, EP-A-323 597, патентам США №№ 5,1 68,062, 5,385,839, и 4,968,615, а также к заявке PCT № WO87/03905. Промотор CMV-IE предпочтительно представляет собой человеческий CMV-IE (Boshart et al., 1985) или мышиный CMV-IE.

В более общих терминах, промотор бывает вирусного, растительного или клеточного происхождения. Сильный вирусный промотор, отличный от CMV-IE, который может быть с пользой применен в практике изобретения, представляет собой ранний/поздний промотор вируса SV40 или промотор LTR вируса Rous sarcoma. Сильный клеточный промотор, который может быть с пользой применен в практике изобретения, представляет собой промотор гена цитоскелета, такой как, например, десминовый промотор (Kwissa et al., 2000) или актиновый промотор (Miyazaki et al., 1989).

Плазмиды могут включать другие элементы контроля экспрессии. Особенно выгодно включать стабилизирующую последовательность (стабилизирующие последовательности), например, последовательность(последовательности) интронов, например, интрон спиртовой дегидрогеназы кукурузы (Callis et al. Genes & Dev,1(10):1183-1200, Dec. 1987), первый интрон hCMV-IE (заявка PCT № WO1989/01036), интрон II гена кроличьего β-глобина (van Ooyen et al., 1979). В другом воплощении, плазмиды могут включать 3’ UTR. 3’ UTR может представлять собой, но без ограничений, 3’ UTR нопалинсинтазы (Nos) agrobacterium (Nopaline synthase: transcript mapping and DNA sequence. Depicker, A. et al. J. Mol. Appl. Genet., 1982; Bevan, NAR, 1984, 12(22): 8711-8721).

Что касается сигналов полиаденилирования (полиA) для плазмидных и вирусных векторов, отличных от поксвирусов, могут быть применены сигналы поли(A) гена бычьего гормона роста (bGH) (смотри U.S. 5,122,458) или сигналы поли(A) гена кроличьего β-глобина или сигналы поли(A)вируса SV40.

Термин «клетка-хозяин» означает прокариотическую или эукариотическую клетку, которая была генетически изменена или может быть генетически изменена введением экзогенного полинуклеотида, такого как рекомбинантная плазмида или вектор. Когда речь идет о генетически измененной клетке, термин относится как к исходно измененной клетке, так и к ее потомству.

В одном из воплощений, рекомбинантный антиген CPV экспрессируют в клетках насекомых.

В конкретном воплощении, антиген CPV экспрессируют в клетках SF9.

Способы применения

В воплощении, объект изобретения, раскрытый в настоящем документе, направлен на способ вакцинации овец, коров, коз или свиней, включающий введение овце, корове, козе или свинье эффективного количества вакцины, которая может включать эффективное количество рекомбинантного антигена CPV и фармацевтически или ветеринарно приемлемый носитель, наполнитель или разбавитель.

В одном из воплощений настоящего изобретения, способ включает однократное введение композиции вакцины, составленной в виде эмульсии в соответствии с изобретением. Например, в одном из воплощений, иммунологическая или вакцинная композиция включает бакуловирус-экспрессированные антигены CPV, включая полипептиды и VLP (вирусоподобные частицы) или пустые капсиды. По данным электронной микроскопии клетки насекомых, трансформированные бакуловирусными экспрессионными векторами, продуцируют VLP CPV или свободные капсиды CPV, и, таким образом, иммунологическая или вакцинная композиция в соответствии с настоящим изобретением охватывает иммунологическую или вакцинную композицию, включающую VLP CPV или пустые капсиды CPV.

В воплощении, объекты изобретения, раскрытые в настоящем документе, направлены на способ вакцинации овец, коров, коз или свиней, включающий введение овце, корове, козе или свинье антигена CPV, полученного с помощью бакуловирусного вектора в клетках насекомых.

В воплощении, объект изобретения, раскрытый в настоящем документе, направлен на способ вызова иммунного ответа, включающий введение овце, корове, козе или свинье вакцины, включающей антиген CPV, полученный с помощью бакуловирусного вектора в клетках насекомых.

В воплощении, объект изобретения, раскрытый в настоящем документе, направлен на способ получения вакцины или композиции, включающей изолированный антиген CPV, полученный с помощью бакуловирусного вектора в клетках насекомых, и необязательно комбинирования с фармацевтически или ветеринарно приемлемым носителем, наполнителем или разбавителем.

Как гомологичные, так и гетерологичные штаммы CPV применяют для заражения при проверке эффективности вакцины. Введение может быть подкожным или внутримышечным. Введение может быть безыгольным (например, Bioject).

В одном из воплощений изобретения, может быть применен режим прайм-буст, который включает, по меньшей мере, одно примирующее введение и, по меньшей мере, одно стимулирующее введение, с использованием, по меньшей мере, одного общего полипептида, антигена, эпитопа или иммуногена. Как правило, иммунологическая композиция или вакцина, примененная в примирующем введении, отличается по своей природе от примененной в качестве стимулирующей. Однако следует отметить, что та же самая композиция может быть применена в качестве примирующего введения и стимулирующего введения. Данный протокол введения называют «прайм-буст».

Прайм-буст в соответствии с настоящим изобретением может включать рекомбинантный вирусный вектор, применяемый для экспрессии кодирующей последовательности CPV или ее фрагментов, кодирующих антигенный полипептид или его фрагмент или вариант. Конкретно, вирусный вектор может экспрессировать ген CPV или его фрагмент, который кодирует антигенный полипептид. Вирусный вектор, предусмотренный настоящим документом, включает, но без ограничений, поксвирус [например, вирус осповакцины или ослабленный вирус осповакцины, вирус птичьей оспы или ослабленный вирус птичьей оспы (например, оспы канареек, оспы-дифтерита птиц, оспы горлиц, оспы голубей, перепелиной оспы, ALVAC, TROVAC; смотри, например, US 5,505,941, US 5,494,8070), вирус оспы енотов, вирус оспы свиней и т.п., аденовирус (например, человеческий аденовирус, собачий аденовирус), вирус герпеса (например, собачий вирус герпеса, вирус герпеса индеек, вирус болезни Марека, вирус инфекционного ларинготрахеита, вирус герпеса кошачьих, вирус ларинготрахеита (ILTV), вирус бычьего герпеса, вирус герпеса свиней), бакуловирус, ретровирус и т.п. В другом воплощении, вектор экспрессии на основе вируса птичьей оспы может представлять собой вектор на основе вируса оспы канареек, такой как, ALVAC. Еще в одном воплощении, вектор экспрессии на основе вируса птичьей оспы может представлять собой вектор на основе вируса оспы-дифтерита птиц, такой как, TROVAC. Антиген CPV изобретения, который нужно экспрессировать, вставляют под контролем специфического поксвирусного промотора, например, промотора энтомопоксвируса Amsacta moorei 42K (Barcena, Lorenzo et al. 2000), промотора вируса осповакцины 7,5 кДа (Cochran et al., 1985), промотора вируса осповакцины I3L (Riviere et al., 1992), промотора вируса осповакцины HA (Shida, 1986), промотора вируса коровьей оспы ATI (Funahashi et al., 1988), промотора вируса осповакцины H6 (Taylor et al., 1988b; Guo et al., 1989; Perkus et al., 1989), inter alia.

В другом аспекте прайм-буст протокола изобретения, композицию, включающую антиген CPV изобретения, вводят с последующим введением вакцины или композиции, включающей рекомбинантный вирусный вектор, который содержит и экспрессирует антиген CPV in vivo, или инактивированной вирусной вакцины или композиции, включающей антиген CPV или ДНК-плазмидную вакцину или композицию, которая содержит или экспрессирует антиген CPV. Аналогично, прайм-буст протокол может включать введение вакцины или композиции, включающей рекомбинантный вирусный вектор, который содержит и экспрессирует антиген CPV in vivo или инактивированную вирусную вакцину или композицию, включающую антиген CPV или ДНК-плазмидную вакцину или композицию, которая содержит или экспрессирует антиген CPV, с последующим введением композиции, включающей антиген CPV изобретения. Кроме того, следует отметить, что как примирующее, так и повторное введение может включать композицию, включающую антиген CPV изобретения.

Прайм-буст протокол включает, по меньшей мере, одно прайм-введение и, по меньшей мере, одно буст-введение с применением, по меньшей мере, одного общего полипептида и/или его вариантов или фрагментов. Вакцина, примененная в прайм-введение, может быть отличается по своей природе от тех, которые применяют в качестве второй стимулирующей вакцины. Прайм-введение может включать одно или несколько введений. По аналогии, буст-введение может включать одно или несколько введений.

Объем дозы композиций для целевых видов, которые представляют собой млекопитающих, основанных на вирусных векторах, например, композициях, основанных на не-поксвирус-вирусных-векторах, равен, в общем, примерно от 0,1 до примерно 5,0 мл, примерно от 0,1 до примерно 3,0 мл, и примерно от 0,5 мл до примерно 2,5 мл.

Эффективность вакцин может быть протестирована через примерно 2-4 недели после последней иммунизации путем заражения животных, таких как кошки или собаки, вирулентным штаммом CPV.

Дополнительную информацию о данных штаммах CPV можно обнаружить на веб-страницах сайта European Bioinformatics Information (EMBL-EBI), и все связанные нуклеотидные последовательности включены в настоящем документе путем отсылки. Авторы изобретения предполагают, что все штаммы CPV, как перечисленные в настоящем документе, так и те, которые еще должны быть определены, могут быть экспрессированы в соответствии с идеями настоящего раскрытия для получения, например, эффективных композиций вакцины. Как гомологичные, так и гетерологичные штаммы применяют для заражения для тестирования эффективности вакцин. Животное может быть заражено внутрикожно, подкожно, с помощью спрея, внутриносовым, внутриглазным, внутритрахеальным путем и/или перорально.

Прайм-буст введения могут быть предпочтительно осуществлены с разницей в 1-6 недель, например, примерно с разницей в 4 недели. В соответствии с одним из воплощений, стимулирование раз в полгода или ежегодное стимулирование, предпочтительно, с применением вирусной основанной на векторе вакцины, также предусматривается. Животные предпочтительно должны быть в возрасте, по меньшей мере, от 6 до 8 недель во время первого введения.

Композиции, включающие рекомбинантные антигенные полипептиды изобретения, примененные в прайм-буст протоколах, были безадъювантными, и могли, необязательно, содержаться в фармацевтически или ветеринарно приемлемом носителе, разбавителе или наполнителе. Протоколы изобретения защищают животное от CPV и/или предупреждают прогрессирование заболевания в инфицированном животном.

Специалисту в данной области техники должно быть понято, что раскрытие в настоящем документе обеспечивают путем примеров, и настоящее изобретение не ограничивается ими. Из раскрытия в настоящем документе и знаний в данной области техники, квалифицированный специалист может определить число введений, путь введения и дозы, которые будут применять для каждого протокола инъекции, без какого-либо неоправданного экспериментирования.

Настоящее изобретение предусматривает, по меньшей мере, одно введение животному эффективного количества терапевтической композиции, сделанной в соответствии с изобретением. Животное может представлять собой самца, самку, беременную самку и новорожденного. Данное введение может быть произведено различными путями, включая, но без ограничений, внутримышечную (IM), внутрикожную (ID) или подкожную (SC) инъекцию или путем интраназального или перорального введения. Терапевтическая композиция в соответствии с изобретение также может быть введена с помощью безыгольных устройств (как, например, с помощью Pigjet, Dermojet, Biojector, Avijet (Merial, GA, США), Vetjet или устройств Vitajet (Bioject, Oregon, США)). Другой подход к введению композиции плазмиды заключается в применении электропорации (смотри, например, Tollefsen et al., 2002; Tollefsen et al., 2003; Babiuk et al., 2002; заявка PCT № WO99/01158). В другом воплощении, терапевтическую композицию доставляют животному с помощью генной пушки или бомбардировки частицами золота.

В одном из воплощений, изобретение обеспечивает введение терапевтически эффективного количества композиции для доставки и экспрессии антигена или эпитопа CPV в клетку-мишень. Определение терапевтически эффективного количества представляет собой рутинную экспериментальную процедуру для обычного специалиста в данной области техники. В одном из воплощений, композиция включает вектор экспрессии, включающий полинуклеотид, которая экспрессирует антиген или эпитоп CPV и фармацевтически или ветеринарно приемлемый носитель, разбавитель или наполнитель. В другом воплощении, фармацевтически или ветеринарно приемлемый носитель, разбавитель или наполнитель облегчает трансфекцию, или другие пути переноса полинуклеотидов в животное-хозяина и/или улучшает сохранность вектора или белка в хозяине.

В одном из воплощений, объект изобретения, раскрытый в настоящем документе, обеспечивает способ обнаружения для различения инфицированного и вакцинированного животного (DIVA).

В настоящем документе раскрыто, что применение вакцины или композиции настоящего изобретения позволяет обнаруживать инфекцию CPV у животного. В настоящем документе раскрыто, что применение вакцины или композиции настоящего изобретения позволяет обнаруживать инфекцию у животных путем различения между инфицированными и вакцинированными животными (DIVA).

Изделие

В воплощении, объект изобретения, раскрытый в настоящем документе, направлен на набор для выполнения способа вызова или индуцирования иммунного ответа, который может включать любые из рекомбинантных иммунологических композиций или вакцин CPV или инактивированных иммунологических композиций или вакцин CPV, рекомбинантных вирусных композиций или вакцины CPV, и инструкции для осуществления данного способа.

Другое воплощение изобретения представляет собой набор для выполнения способа индуцирования иммунологического или защитного ответа против CPV у животного, включающий композицию или вакцину, включающие антиген CPV изобретения, и вирусную иммунологическую композицию или вакцину рекомбинантного CPV, и инструкции для выполнения способа доставки в эффективном количестве для вызова иммунного ответа у животного.

Другое воплощение изобретения представляет собой набор для выполнения способа индуцирования иммунологического или защитного ответа против CPV у животного, включающий композицию или вакцину, включающие антиген CPV изобретения и иммунологическую композицию или вакцину инактивированного CPV, и инструкции для выполнения способа доставки в эффективном количестве для вызывания иммунный ответ у животного.

Еще один аспект настоящего изобретения относится к набору для прайм-буст вакцинации в соответствии с настоящим изобретением, как описано выше. Набор может включать, по меньшей мере, два флакона: первый флакон, содержащий вакцину или композицию для прайм-вакцинации в соответствии с настоящим изобретением, и второй флакон, содержащий вакцину или композицию для буст-вакцинации в соответствии с настоящим изобретением. Набор может предпочтительно содержать дополнительные первый или второй флаконы для дополнительных прайм-вакцинаций или дополнительных буст-вакцинаций.

Следующие воплощения охвачены изобретением. В воплощении раскрыта композиция, включающая антиген CPV или его фрагмент или вариант и фармацевтически или ветеринарно приемлемый носитель, наполнитель или разбавитель. В другом воплощении раскрыта описанная выше композиция, в которой антиген CPV или его фрагмент или вариант включает иммуногенный фрагмент, включающий, по меньшей мере, 15 аминокислот антигена CPV. В воплощении раскрыты описанные выше композиции, в которых антиген CPV или его фрагмент или вариант частично очищены. В воплощении раскрыты описанные выше композиции, в которых антиген CPV или его фрагмент или вариант существенно очищены.

В воплощении раскрыты описанные выше композиции, в которых антиген CPV или его фрагмент или вариант представляет собой полипептид CPV. В воплощении раскрыты описанные выше композиции, в которых полипептид CPV представляет собой капсидный белок или его фрагмент. В воплощении раскрыты описанные выше композиции, в которых антиген CPV или его фрагмент или вариант имеет, по меньшей мере, 80% идентичности последовательности с последовательностью, как указана в SEQ ID NO: 1, 3, 4, 6 или 8-10. В одном из воплощений раскрыты описанные выше композиции, в которых антиген CPV кодируется полинуклеотидом, имеющим, по меньшей мере, 70% идентичности последовательности с последовательностью, как указана в SEQ ID NO: 2, 5, 7, 11 или 12. В другом воплощении раскрыт способ вакцинации животного, восприимчивого к CPV, включающие введение композиции вышеуказанному животному. В воплощении раскрыт способ вакцинации животного, восприимчивого к CPV, включающий прайм-буст режим. В воплощении раскрыт существенно очищенный антигенный полипептид, экспрессированный в клетках насекомых, в котором полипептид включает: аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 80% идентичности последовательности с полипептидом, имеющим последовательность, как указана в SEQ ID NO: 1, 3, 4, 6 или 8-10. В любом воплощении животное предпочтительно представляет собой кошку или собаку. В одном из воплощений раскрыт способ диагностики инфекции CPV у животного. Еще в одном воплощении раскрыт набор для прайм-буст вакцинации, включающий, по меньшей мере, два флакона, в котором первый флакон содержит композицию настоящего изобретения, и второй флакон содержит композицию для буст-вакцинация, включающий композицию, включающую рекомбинантный вирусный вектор, или композицию, включающую инактивированную вирусную композицию или ДНК-плазмидную композицию, которая содержит или экспрессирует антиген CPV.

Фармацевтически или ветеринарно приемлемые носители или разбавители или наполнители хорошо известны специалисту в данной области техники. Например, фармацевтически или ветеринарно приемлемый носитель или разбавитель или наполнитель может представлять собой раствор 0,9% NaCl (например, солевой раствор) или фосфатный буфер. Другой фармацевтически или ветеринарно приемлемый носитель или разбавитель или наполнители, которые могут быть применены для способов данного изобретения включают, без ограничений, поли-(L-глутамат) или поливинилпирролидон. Фармацевтически или ветеринарно приемлемый носитель или разбавитель или наполнители могут представлять собой любое соединение или комбинацию соединений, облегчающих введение вектора (или белка, экспрессированного из вектора изобретения in vitro); предпочтительно, носитель, разбавитель или наполнитель может облегчить трансфекцию и/или улучшить сохранение вектора (или белка). Дозы и объемы доз в настоящем документе обсуждаются в общем описании и также могут быть определены квалифицированным специалистом из этого раскрытия, прочитанного в сочетании со знаниями в данной области техники, без любого неоправданного экспериментирования.

Катионные липиды, содержащие соль четвертичного аммония, которые предпочтительно, но не исключительно, подходят для плазмиды, предпочтительно представляют собой липиды, имеющие следующую формулу:

в которой R₁ представляет собой насыщенный или ненасыщенный неразветвленный алифатический радикал, имеющий от 12 до 18 атомов углерода, R₂ представляет собой другой алифатический радикал, содержащий 2 или 3 атома углерода, и X представляет собой аминную или гидроксильную группу, например, DMRIE. В другом воплощении катионный липид может быть связан с нейтральным липидом, например, DOPE.

Среди данных катионных липидов, предпочтение отдают DMRIE (N-(2-гидроксиэтил)-N,N-диметил-2,3-бис(тетрадецикло)-1-пропан аммония; WO96/34109), предпочтительно связанному с нейтральным липидом, предпочтительно, с DOPE (диолеоил-фосфатидилэтаноламин; Behr, 1994), с образованием DMRIE-DOPE.

Предпочтительно, плазмиду, смешанную с адъювантом, формируют для немедленного приема и предпочтительно одновременно с введением препарата или незадолго до введения препарата; например, незадолго до введения или перед введением формируют смесь плазмида-адъювант, предпочтительно чтобы дать достаточно времени перед введением для того, чтобы смесь образовала комплекс, например, между примерно 10 и примерно 60 минутами перед введением, например, приблизительно, за 30 минут до введения.

Если присутствует DOPE, то молярное отношение DMRIE:DOPE равно предпочтительно от примерно 95: примерно 5 до примерно 5: примерно 95, более предпочтительно, примерно 1: примерно 1, например, 1:1.

Массовое соотношение DMRIE или DMRIE-DOPE адъювант:плазмида может быть между примерно 50: примерно 1 и примерно 1: примерно 10, такое как, примерно 10: примерно 1 и примерно 1: примерно 5, и примерно 1: примерно 1 и примерно 1: примерно 2, например, 1:1 и 1:2.

В другом воплощении, фармацевтически или ветеринарно приемлемый носитель, наполнитель, адъювант или разбавитель может представлять собой эмульсию вода-в-масле. Примеры подходящих эмульсий вода-в-масле включают вакцинные эмульсии на масляной основе вода-в-масле, которые стабильны и текучи при 4°C, содержащие: от 6 до 50% (объем/объем) , предпочтительно от 12 до 25% водной фазы, содержащей антиген (объем/объем), от 50 до 94% (объем/объем) масляной фазы, содержащей полностью или частично неметаболизируемое масло (например, минеральное масло, такое как парафиновое масло) и/или метаболизируемое масло (например, растительное масло или жирную кислоту, сложные эфиры полиолов или спиртов), от 0,2 до 20 p/v% поверхностно-активных веществ, предпочтительно, от 3 до 8 p/v%, последний в целом или частично или в смеси или с сложными эфирами полиглицерина, указанными полиглицерин сложными эфирами, предпочтительно представляющими собой (поли)рицинолеаты полиглицерина или полиоксиэтиленовые масла рицина или еще гидрогенизованные полиоксиэтиленовые масла рицина. Примеры поверхностно-активных веществ, которые могут быть применены в эмульсии вода-в-масле, включают сложные эфиры этоксилированного сорбитана (например, полиоксиэтилена (20) сорбитанмоноолеат (TWEEN 80®), доступный от компании AppliChem, Inc., Cheshire, CT) и сложные эфиры сорбитана (например, сорбитанмоноолеат (SPAN 80®), доступный о от компании Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Кроме того, в отношении эмульсии вода-в-масле, смотри также патент США № 6,919,084, например, пример 8 в нем, включенный в настоящем документе путем отсылки. В некоторых воплощениях, содержащая антиген водная фаза включает солевой раствор, включающий один или несколько буферных агентов. Фосфатный буферный солевой раствор представляет собой пример подходящего буферного раствора. В предпочтительном воплощении, эмульсия вода-в-масле может представлять собой тройную эмульсию вода/масло/вода (W/O/W) (патент США № 6,358,500). Примеры других подходящих эмульсий описаны в патенте США № 7,371,395.

Иммунологические композиции и вакцины в соответствии с изобретение могут включать или состоят в основном из одного или нескольких адъювантов. Подходящие адъюванты для применения в практике настоящего изобретения представляют собой (1) полимеры акриловой или метакриловой кислоты, малеинового ангидрида и алкенильные производные полимеров, (2) иммуностимулирующие последовательности (ISS), такие как олигодезоксирибонуклеотидные последовательности, имеющие один или несколько неметилированных CpG-единиц (Klinman et al., 1996; WO98/16247), (3) эмульсию масло в воде, такую как эмульсия SPT, описанная на странице 147 руководства «Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach”, опубликованного M. Powell, M. Newman, Plenum Press 1995, и эмульсия MF59, описанная на странице 183 той же работы, (4) катионные липиды, содержащие соль четвертичного аммония, например, DDA (5) цитокины, (6) гидроксид алюминия или фосфат алюминия, (7) сапонин или (8) другие адъюванты, обсуждаемые в любом из процитированных документах и включенных путем отсылки в настоящую заявку или (9) любые их комбинации или смеси.

Эмульсия масло-в-воде (3), которая особенно подходит для вирусных векторов, может быть на основе: легкое жидкое парафиновое масло (типа из Европейской фармакопеи), изопреноидное масло, такое как сквалан, сквален, масло, полученное в результате олигомеризации алкенов, например, изобутен или децен, сложные эфиры кислот или спиртов, имеющие неразветвленную алкильную группу, такие как растительные масла, этилолеат, пропиленгликоль, ди(каприлат/капрат), глицерина три(каприлат/капрат) и пропиленгликоля диолеат или сложные эфиры разветвленных жирных спиртов или кислот, особенно, сложные эфиры изостеариновой кислоты.

Масло применяют в комбинации с эмульгаторами для образования эмульсии. Эмульгаторы могут представлять собой неионные поверхностно-активные вещества, такие как: сложные эфиры, с одной стороны, сорбита, маннита (например, ангидроманитололеат), глицерина, полиглицерина или пропиленгликоля, и, с другой стороны, олеиновой, изостеариновой, рицинолевой или гидроксистеариновой кислот, указанные сложные эфиры необязательно бывают этоксилированными или представляют собой блоки сополимеров полиоксипропилен-полиоксиэтилен, такие как Pluronic, например, L121.

Среди типа (1) адъювантных полимеров, предпочтение отдают полимерам сшитых акриловой или метакриловой кислоты, особенно, сшитых посредством полиалкениловых простых эфиров сахаров или полиспиртов. Данные соединения известны под названием карбомер (Pharmeuropa, vol. 8, no. 2, June 1996). Специалист в данной области техники также может обратиться к патенту США № 2,909,462, который обеспечивает такие акриловые полимеры, сшитые с помощью полигидроксильного соединения, имеющего, по меньшей мере, три гидроксильные группы, предпочтительно, не более восьми таких групп, атомы водорода, по меньшей мере, трех гидроксильных групп замененные ненасыщенными, алифатическими радикалами, имеющими, по меньшей мере, два атома углерода. Предпочтительны те радикалы, которые содержат от 2 до 4 атомов углерода, например, винилы, аллилы и другие этиленовые ненасыщенные группы. Ненасыщенные радикалы также могут содержать другие заместители, такие как метил. Особенно подходят продукты, продаваемые под названием Carbopol (BF Goodrich, Ohio, США). Они сшиты с помощью аллилсахарозы или аллилпентаэритрита. Среди них делают отсылку на Carbopol 974P, 934P и 971P.

Что касается сополимеров малеинового ангидрида-алкенильного производного, то предпочтение отдают EMA (Monsanto), которые представляют собой неразветвленные или сшитые сополимеры этилена-малеинового ангидрида, и они, например, сшиты с помощью дивинилового эфира. Отсылку также можно сделать на J. Fields et al., 1960.

Что касается структуры, то полимеры акриловой или метакриловой кислоты и EMA предпочтительно формируются основными единицами, имеющими следующую формулу:

в которой: R₁ и R₂, которые может быть одинаковыми или разными, представляют собой H или CH₃; x = 0 или 1, предпочтительно x = 1; y = 1 или 2, с x + y = 2.

Для EMA, x = 0 и y = 2 и для карбомеров x = y = 1.

Данные полимеры растворимы в воде или физиологическом солевом растворе (20 г/л NaCl), и pH может быть доведен до от 7,3 до 7,4, например, содой (NaOH), для обеспечения раствора адъюванта, в котором вектор(вектора) экспрессии может(могут) быть включены. Концентрация полимера в конечной иммунологической или вакцинной композиции может изменяться от примерно 0,01 до примерно 1,5% масс./объем, от примерно 0,05 до примерно 1% масс./объем, и от примерно 0,1 до примерно 0,4% масс./объем.

Цитокин или цитокины (5) могут быть в белковой форме в иммунологической или вакцинной композиции или могут быть совместно экспрессированы в хозяине с иммуногеном или иммуногенами или его(их) эпитоп(эпитопами). Предпочтение отдают совместной экспрессии цитокина или цитокинов, либо тем же вектором, который экспрессирует иммуноген или иммуногены или его(их) эпитоп(эпитопы) или отдельным вектором для него.

Изобретение охватывает получение таких комбинаций композиций; например, путем смешивания активных компонентов, предпочтительно, вместе и с носителем, цитокином и/или разбавителем.

Цитокины, которые могут быть применены в настоящем изобретении, включают, без ограничений, гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF), гранулоцитарный/макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), интерферон α (IFNα), интерферон β (IFNβ), интерферон γ, (IFNγ), интерлейкин-1α (IL-1α), интерлейкин-1β (IL-1β), интерлейкин-2 (IL-2), интерлейкин-3 (IL-3), интерлейкин-4 (IL-4), интерлейкин-5 (IL-5), интерлейкин-6 (IL-6), интерлейкин-7 (IL-7), интерлейкин-8 (IL-8), интерлейкин-9 (IL-9), интерлейкин-10 (IL-10), интерлейкин-11 (IL-11), интерлейкин-12 (IL-12), фактор некроза опухолей α (TNFα), фактор некроза опухолей β (TNFβ), полиинозиновую кислоту и поли цитидиловую кислоту, цитидин-фосфат-гуанозин олигодезоксинуклеотиды (CpG ODN) и трансформирующий фактор роста β (TGFβ). Понятно, что цитокины могут быть введены совместно и/или введены последовательно с иммунологической или вакцинной композицией настоящего изобретения. Таким образом, например, вакцина настоящего изобретения также может содержать экзогенную молекулу нуклеиновой кислоты, которая экспрессирует in vivo подходящий цитокин, например, цитокин, соответствующий данному хозяину, которого предстоит вакцинировать или, в котором должен быть вызван иммунологический ответ (например, бычий цитокин для препаратов для введения коровам).

В случае иммунологической композиции и/или вакцины, основанной на полипептидах, экспрессированных в системе бакуловирус/клетки насекомых, доза может включать, от примерно 1 мкг до примерно 2000 мкг, от примерно 50 мкг до примерно 1000 мкг, и от примерно 100 мкг до примерно 500 мкг антигена, эпитопа или иммуногена CPV. Доза может включать от примерно 10² до примерно 10²⁰ VLPs, от примерно 10³ до примерно 10²⁰, от примерно 10⁴ до примерно 10²⁰. Объемы доз могут быть между примерно 0,1 и примерно 10 мл, между примерно 0,2 и примерно 5 мл. В общем, специалист знает много стратегий дозирования, и сможет оптимизировать дозирование без осуществления немаршрутизируемой работы.

В одном из аспектов, изобретение обеспечивает комбинированную вакцину, включающую компонент вирусоподобной частицы (VLP) и компонент модифицированного живого вируса (MLV), в которой как VLP, так и MLV направлены против одного и того же патогена или заболевания, и в которой комбинированная вакцина преодолевает действие материнских антител (MDA).

В некоторых воплощениях, комбинированная вакцина обеспечивает защитный иммунитет при однократном приеме.

В некоторых воплощениях, патоген или заболевание представляет собой собачий парвовирус (CPV).

В некоторых воплощениях, патоген или заболевание представляет собой вирус ящура (FMDV).

В некоторых воплощениях, компонент VLP комбинации включает, по меньшей мере, по меньшей мере, 10% VLPs CPV (масс./масс.) как функцию от общего содержания белка.

В некоторых воплощениях, компонент VLP включает, по меньшей мере, 20% VLPs CPV (масс./масс.).

В некоторых воплощениях, VLP CPV экспрессируется с помощью бакуловирусного вектора в клетках насекомых.

В некоторых воплощениях, VLP CPV включает, по меньшей мере, один CPV капсидный белок.

В некоторых воплощениях, VLP CPV включает полипептид CPV, имеющий последовательность, как указана в SEQ ID NO: 1, 3, 4, 6, 8, 9 или 10; или, VLP CPV включает полипептид CPV, имеющий, по меньшей мере, 90% идентичности последовательности, как указана в SEQ ID NO: 1, 3, 4, 6, 8, 9 или 10.

В некоторых воплощениях, VLP CPV включает полипептид CPV, кодируемый полинуклеотидом, имеющим последовательность, как указана в SEQ ID NO: 2, 5 или 7; или, VLP CPV включает полипептид CPV, кодируемый полинуклеотидом, имеющий, по меньшей мере, 90% идентичности с последовательностью, как указана в SEQ ID NO: 2, 5 или 7.

В некоторых воплощениях, комбинированная вакцина безадъювантна и необязательно включает фармацевтически или ветеринарно приемлемый носитель, наполнитель или разбавитель.

В другом аспекте, изобретение обеспечивает плазмиду, полезную для получения VLP CPV, включающую полинуклеотид, кодирующий антиген CPV, имеющий последовательность, как указана в SEQ ID NO: 1, 3, 4, 6 или 8-10, или полинуклеотидную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 90% идентичности с последовательностью, как указана в SEQ ID NO: 1, 3, 4, 6 или 8-10.

В некоторых воплощениях, полинуклеотид включает последовательность или состоит из последовательности, как указана в SEQ ID NO: 2, 5, 7, 11 или 12.

В некоторых воплощениях, плазмида состоит из последовательности, как указана в SEQ ID NO:11 или 12.

В некоторых воплощениях, плазмида стабильно трансформирована в клетку насекомых, которая экспрессирует VLPs CPV.

В другом аспекте, изобретение обеспечивает существенно очищенный пустой капсид CPV или VLP CPV, экспрессированную в клетках насекомых, в которой пустая капсида CPV или VLP включает полипептид, имеющий последовательность, как указана в SEQ ID NO: 1, 3, 4, 6 или 8-10; или, пустая капсида CPV или VLP включает полипептид, имеющий, по меньшей мере, 90% идентичности с последовательностью, как указана в SEQ ID NO: 1, 3, 4, 6 или 8-10.

В некоторых воплощениях, пустая капсида CPV или VLP состоит из полипептида, имеющего последовательность, как указана в SEQ ID NO: 1, 3, 4, 6 или 8-10.

В другом аспекте, изобретение обеспечивает способ вызова иммунного ответа против CPV у животного, включающий введение животному композиции, вакцины, комбинации вакцины и VLP, раскрытых в настоящем документе.

В некоторых воплощениях, иммунный ответ защищает вакцинированных от последующего воздействия вирулентным CPV. Воздействие может быть природным или экспериментальным.

В некоторых воплощениях, иммунный ответ вызывают у вакцинированных животных вне зависимости от присутствия у указанных животных высоких уровней материнских антител (MDA) против CPV. Термин «высокие уровни» имеет обычное значение, и, в общем, относится к уровням MDA, которые препятствуют способности вакцин предшествующего уровня техники вызывать сильный защитный ответ у MDA-позитивных животных.

Изобретение теперь будет дополнительно описано с помощью следующих неограничивающих примеров.

Примеры

Если не указано иное, конструирование ДНК-вставок, плазмид и рекомбинантных вирусных или бакуловирусных векторов осуществляли с применением стандартных молекулярно-биологических методик, описанных в руководстве J. Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989).

Пример 1. Конструкция и экспрессия антигенов капсиды CPV в системе бакуловирус/клетки насекомых

Задача: Генерировать основанную на pVL1393 плазмиду для переноса, кодирующую капсидный белок CPV (собачий парвовирус, серотип 2c штамма Souriou), оптимизированную для клеток насекомых, и генерировать рекомбинантный бакуловирус BacMEB072 для экспрессии вирусоподобных частиц (VLP). Референсная последовательность представляла собой штамм Souriou 2c (Merial), имеющий обозначение в Genbank BAD34656 / Swissprot P61826 (SEQ ID NO: 1).

Ген капсиды CPV (1755 bp) кодирует полипептид из 584 аминокислот (не содержащий сигнальный пептид). Последовательность, кодирующую белок CPV VP2 (SEQ ID NO: 1) клонировали, и оптимизировали кодоны соответствующей последовательности ДНК (SEQ ID NO: 5) для клеток насекомых. Потенциальные функциональные домены показаны в приведенной ниже таблице 1.

Таблица 1. Потенциальные функциональные домены были следующими

(в соответствии с обозначением по Swiss-prot на P61826)

Предполагаемые домены	от до (или положение)	Длина
Сигнальная последовательность	Нет
зрелая цепь VP2	1-584	584
N-гликозилирование	25-47-64-180-443-505-517
сайты N-гликозилирования	490-494

Генерация плазмиды pMEB072. Капсид CPV, оптимизированный для экспрессии в клетках насекомых (SEQ ID NO: 1), клонировали в коммерческую плазмиду pVL1393 (Pharmingen) с применением сайтов XbaI и Bam HI обоих вектора и вставки для генерации экспрессионной плазмиды pMEB072.

Генерация рекомбинантного бакуловируса BacMEB072. Примененный бакуловирусный вектор представлял собой AcNPV, модифицированный летальной делецией, которая нейтрализуется только через гомологичную рекомбинацию (BaculoGold DNA, Pharmingen). Плазмиду pMEB072 применяли для генерации рекомбинантного бакуловируса, кодирующего ген капсида CPV штамма Souriou серотип 2c под контролем полиэдринового промотора, путем гомологичной рекомбинации. Клетки насекомых Spodoptera frugiperda (Sf) 9 были совместно трансфицированы плазмидой pMEB072, и Bsu36I линеаризованную AcNPV ДНК с тройным разрывом, в соответствии с протоколом производителя (Baculogold, Pharmingen). Рекомбинантный бакуловирус из супернатанта совместной транфекции был дважды очищен методом бляшек. Пять клонов были амплифицированы (посев 1) при 28°C в монослойном флаконе25 см². Инфицированные клетки и супернатанты анализировали на экспрессию капсида CPV с помощью дот-блот с применением моноклональных антител, специфичных к антигену капсида CPV (CPV103B10A). Клон 1 показал правильный профиль Dot Blot. Данный клон был дополнительно амплифицирован (посев 2) при 28°C в 50 мл в колбе Эрленмейера (суспензия) при 105 оборотов в минуту. Третий пересев (посев 3) проводили в 200 мл для получения основного вирусного материала, примененного для экспрессии белок. Данный основной вирусный материал затем титровали путем анализа бляшек. Основной вирусный материал получали, применяя среду SF900II, дополненную 2% FCS. После титрования рекомбинантный бакуловирусный материал (посев 3) применяли для продукции белка в свободной от сыворотки среде.

Анализ экспрессии бакуловирусного BacMEB072

Таблица 2

Плазмида	Размер (AA)	PM (кДа)	Сигнальный пептид	Таг	N-гликозилирование	Дисульфидный мостик	локализация
pMEB062	545	59,2	нет	нет	10 потенциальных сайтов	нет	секреция

Клетки насекомых (Sf9) инфицировали BacMEB072 в множественности заражения (MOI), равном 1 БОЕ/мл. Клетки насекомых растили при 105 оборотов в минуту в среде Sf900II без FCS в течение 4-х дней при 28°C. Продукцию белка анализировали путем представления целых лизатов Sf9 и культурального супернатанта на SDS-PAGE (4-20%, Invitrogen), с последующим дот-блотом с моноклональным антителом (CPV103B10A). Растворимость экспрессированных белков исследовали, лизируя клеточные осадки в лизирующем буфере (50 мМ Трис-HCl pH 8, 500 мМ NaCl + антипротеаза), озвучивали 3X (15 сек при 20% мощности, 30 сек ожидания, 15 сек при 20% мощности; 5 мин лизис на льду). Растворимые белки отделяли от нерастворимого материала центрифугированием (30 мин при 11000 центробежного ускорения при 4°C).

Полосу, ожидаемого размера, экспрессировали в осадке инфицированных клеток, лизированных и осветленных, как наблюдали по окрашиванию кумасси. Белок накапливался в клетках, но его также обнаруживали в растворимой фракции после лизиса. Идентичность белка VP2 подтверждали с помощью дот-блота анализа, применяя специфическое моноклональное антитело против капсида CPV (CPV103B10A).

С помощью электронно-микроскопического (EM) анализа подтверждали правильную само-сборку капсидного белка в VLP, которые имели диаметр, равный 25-30 нм, и правильную морфологию парвовирус-подобных вирионов (фиг. 4). Оптимальные условия для продукции VLP заключались в применении MOI=0,1 и сборе клеток на 5-ый день после заражения. Хотя другие условия были предусмотрены, данные конкретные условия давали концентрацию, равную примерно 10¹¹ VLP на мл.

Пример 2. Продукция BacMEB073, содержащего укороченный VP2 CPV

Целью работы была генерация основанной на pVL1393 плазмиды для переноса, кодирующей укороченный капсидный белок VP2 CPV (собачий парвовирус, серотип 2c штамма Souriou), оптимизированной для млекопитающих, и затем генерировать соответствующий рекомбинантный бакуловирус BacMEB073, экспрессирующий VLP. 9 N-концевых аминокислот (-9AA) удаляли в целях повышения экспрессии VP2 без предотвращения образования VLP (Hurtado et al. Journal of Virology, August 1996). Кроме того, добавляли три аминокислоты (M, L и K) в целях улучшения структуры и формирования капсида (Gilbert et al., Journal of Nanobiotechnology, 2006). До этого раскрытия, было неизвестно, какое влияние оказывает введение как делеции, так и вставки на экспрессию VP2 CPV и последующее образование капсида.

Укороченный (делеция 9 аминокислот на N-конце, замещенных дополнительными MLK) и оптимизированный для млекопитающих (Geneart) ген VP2 был дополнительно клонирован в плазмиде pVL1393 с применением сайтов Bam HI и Xba I как вектора, так и вставки.

Генерация бакуловирусного вектора и экспрессия белка. Бакуловирусный вектор: AcNPV, модифицированный летальной делецией, которая нейтрализуется только через гомологичную рекомбинацию (BaculoGold DNA, Pharmingen).

Генерация рекомбинантного бакуловируса BacMEB073. Плазмиду pMEB073 применяли для генерации рекомбинантного бакуловируса, кодирующего укороченный ген капсиды CPV, серотип 2c штамма Souriou, под контролем полиэдринового промотора, путем гомологичной рекомбинации. Клетки насекомых Spodoptera frugiperda (Sf) 9 были совместно трансфицированы плазмидой pMEB073 и Bsu36I, линеаризованной AcNPV ДНК с тройным разрезом, в соответствии с протоколом производителя (Baculogold, Pharmingen). Рекомбинантный бакуловирус из супернатанта совместной трансфекции был дважды очищен способом бляшкообразования. Пять клонов амплифицировали (посев 1) при 28°C в 25 см² в монослое во флаконе. Инфицированные клетки и супернатанты анализировали на экспрессию капсида CPV способом дот-блот, применяя моноклональные антитела, специфические к антигену капсида CPV (CPV103B10A). Клон 1 показал правильный профиль дот-блота. Данный клон дополнительно амплифицировали (посев 2) при 28°C в 50 мл колбе Эрленмейера (суспензия) при 105 оборотов в минуту. Третий посев (посев 3) в 200 мл проводили для получения основного вирусного материала, примененного для экспрессии белка. Данный основной вирусный материал затем титровали, анализируя бляшкообразование. Основной вирусный материал получали, применяя среду SF900II, дополненную 2% FCS.

После титрования рекомбинантный основанный на бакуловирусе материал (посев 3) применяли для продукции белка в свободной от сыворотки среде.

Анализ экспрессии

Таблица 3. Ожидаемые рекомбинанты

Плазмида	Размер (AA)	PM (кДа)	сигнальный пептид	Сайт N-гликозилирования	Дисульфидный мостик	Субклеточная локализация
pMEB073	578	64,1	нет	11, 19, 40, 50, 58, 66, 72, 79, 80, 511	нет	секретируемый

Клетки насекомых (Sf9) инфицировали BacMEB073 при MOI = 1 БОЕ/мл. Клетки насекомых растили при 105 оборотов в минуту в среде Sf900II без FCS в течение 4 дней при 28°C. Продукцию белка анализировали путем нанесения целых лизатов Sf9 и культурального супернатанта на SDS-PAGE (4-20%, Invitrogen) с последующим дот-блотом с моноклональным антителом (CPV103B10A).

Растворимость экспрессированных белков исследовали, лизируя клеточные осадки в лизирующем буфере (50 мМ Трис-HСl pH 8, 500 мМ NaCl + антипротеаза), озвучивание 3X (15’’ при 20% мощности, 30’’ перерыв, 15’’ при 20% мощности, 5’ перерыв на льду). Растворимые белки отделяли от нерастворимого материала центрифугированием (30’ мин при 11 000 центробежного ускорения при 4°C).

Результаты и заключение. Полоса ожидаемого размера в 64 кДа экспрессируется в клеточном осадке инфицированных клеток, лизированных и осветленных, как видно по окрашиванию кумасси. Белок накапливался в клетках, но обнаруживался и в растворимой фракции после лизиса. Идентичность белка VP2 подтверждали с помощью дот-блот анализа, применяя специфическое к капсиду CPV mAb (CPV103B10A).

EM-анализ подтвердил самосборку капсидного белка в VLP с диаметром, равным 25-30 нм, а также правильную морфологию парвовирус-подобных вирионов при концентрации, равной 10¹² VLP на мл (фиг. 4). Продукция VLP была оптимальной при MOI=0,1 при сборе через 5 дней после инфекции, хотя другие условия также давали высокие уровни VLP.

Пример 3. Вакцинация собак бакуловирус-экспрессированным капсидным белком CPV

Первая задача исследования заключалась в оценке и сравнении безопасности и иммуногенности 2 вирусоподобных частиц (VLP) CPV2 штамма Souriou у щенков (т.е. BacMEB072 и BacMEB073, которые были описаны в примерах 1 и 2). Вторая задача заключалась в оценке эффектов адъюванта гидроксида алюминия/сапонин или Iscomatrix на иммуногенность VLP, полученных с помощью BacMEB072 и BacMEB073. Восемь недельных щенков были вакцинированы и обследованы, как показано на таблице 4.

Таблица 4. Экспериментальный дизайн исследования укороченного VP2 VLP CPV против полноразмерного VP2 MLV CPV

Группа	Антиген: VLP CPV2	Адъювант	Вакцинация	Клинический мониторинг	Сыворотки	Цельная кровь (гепарин натрия)
A (n=6)	BacME073 (укороченный)	Нет	D0 & D28 с помощью SC с 1 мл, содержавшем 25 мкг активного ингредиента	D0, D0+4-6 ч, D1, D2 D28, D28+4- 6 ч, D29, D30	D-7, D0*, D7, D28, D35, D42, D70	D35, D42
B (n=6)	BacME073 (укороченный)	Gel Al(OH)3 (1,7 мг) + Сапонин (12 гемолитических единиц)
C (n=6)	BacME072 (неукороченный)	Нет
D (n=6)	BacME072 (неукороченный)	Gel Al(OH)3 (1,7 мг) + Сапонин (12 гемолитических единиц)
E (n=6)	BacME072 (неукороченный)	Iscomatrix (75 мкг)
F (n=5)	Контроль		Контроль

* перед вакцинацией

В терминах безопасности, Al(OH)₃/сапонин не индуцирует ни общих реакций, ни каких-либо других признаков за исключением местного нагревания и набухания. Умеренный отек наблюдали через 3-4 дня после каждой вакцинации у большинства собак. Iscomatrix оказался очень безопасным адъювантом. В терминах иммуногенности, вакцинация щенков CPV2 VLP была способна индуцировать как гуморальный, так и клеточный иммунный ответ без существенных различий между укороченным или полноразмерным VP2, связанным с VLP. Примечательно, что постоянство гуморального иммунного ответа увеличивалось, если VLP применяли с адъювантом, или с Al(OH)₃/сапонин, или с Iscomatrix, без каких-либо существенных различий между двумя исследованными адъювантами. Кроме того, адъювант Iscomatrix увеличивал магнитуду ответа IFN-гамма не только по сравнению с группой без адъюванта, но также по сравнению с группой Al(OH)₃ и сапонина.

Пример 4. Вакцинация собак бакуловирус-экспрессированными VLP CPV или MLV CPV (штаммы Souriou или Bari)

Задача исследования заключалась в сравнении иммунного ответа у щенков, вакцинированных VLP CPV, Souriou MLV CPV или Bari MLV CPV. В первом эксперименте сравнивали 1,52 log10 TCID50/мл (IFI) Souriou; 1,0 log10 TCID50/мл (HA) Bari; и pMEB072 VLP (результаты на фиг. 8). Во втором эксперименте сравнивали 2,21 log10 TCID50/мл (IFI) Souriou; 2,0 log10 TCID50/мл (HA) Bari; и pMEB073-продуцированные VLP в адъюванте Al(OH)₃ + сапонин (результаты на фиг. 9). Наконец, в третьем эксперименте сравнивали 3,81 log10 TCID50/мл (IFI) Souriou; 3,0 log10 TCID50/мл (HA) Bari; и pMEB072-продуцированные VLP в адъюванте Al(OH)₃ + сапонин (результаты на фиг. 10). Вместе взятые, данные результаты показали, что VLP CPV, сделанный в соответствии с настоящим раскрытием, обеспечивает сопоставимый иммунный ответ по сравнению с типичным MLV CPV. Важно отметить, VLP были способны индуцировать более быстрый иммунный ответ по сравнению как с низкой, так и с промежуточной дозой любого штамма MLV.

Пример 5. Вакцинация собак MLV CPV или бакуловирус-экспрессированным капсидным белком CPV + MLV CPV

Задача исследования заключалась в оценки иммуногенности различных вакцин-кандидатов, введенных в различных дозах и подкожно щенкам с материнскими антителами. Перед данным исследованием не было известно, могут ли VLP CPV преодолевать действие материнских антител для индукции защитного иммунитета у щенков.

Таблица 5. Экспериментальный дизайн исследования VLP CPV против MLV CPV

Группа		Вакцина, введенная SC на день 0	Образец крови (6 мл /щенка)	Анализ
A	MLV CPV (n = 9)	CPV2 MLV 5,5log10 (1 мл)	D0*, D7, D14, D21, D28, D34, D42, D56	Определение анти-CPV антител (Ингибирование гемагглютинации и/или ELISA)
B	VLP CPV + MLV CPV (n= 10)	VLP CPV Целевая доза: 500 мкг (1 мл) + CPV2 MLV 5,5log10 (1 мл)

Как показано на фиг. 11, фиг. 12 и в таблице 6, титры антител CPV были значительно выше в группе MLV + VLP. Эти данные указывают, что добавление VLP CPV к композиции вакцины было достаточно для преодоления материнских антител, что дает удивительный и неожиданный результат. Авторы изобретения предполагают, что VLP захватывают значительную долю циркулирующих MDA CPV, что, в свою очередь, позволяет VLP и MLV CPV активно иммунизировать щенков.

Таблица 6. Анти-CPV титры антител (IHA) в соответствии с днями после вакцинации

Группа	ID	0	7	14	21
MLV	2252826	10	<5	2560	320
MLV	2253001	10	<5	1280	<5
MLV	2284928	80	<5	<5	<5
MLV	2284973	80	20	<5	20
MLV	2284975	80	20	<5	10
MLV	2285160	<5	<5	<5	5
MLV	2285360	160	40	<5	20
MLV	2285367	40	<5	<5	20
MLV	2285387	10	5	<5	<5
MLV+VLP	2252827	80	640	1280	320
MLV+VLP	2252828	5	160	5120	2560
MLV+VLP	2284818	10	640	2560	2560
MLV+VLP	2284843	10	640	2560	1280
MLV+VLP	2284861	20	1280	1280	1280
MLV+VLP	2284935	40	640	1280	320
MLV+VLP	2284941	80	640	1280	640
MLV+VLP	2284943	20	320	1280	1280
MLV+VLP	2284978	40	1280	1280	1280
MLV+VLP	2285000	80	320	640	640

MLV: Модифицированная живая вакцина (PRIMODOG^® 5,5log10/мл)

VLP: вирусоподобная частица, 500 мкг

Пример 6. Вакцинация собак бакуловирус-экспрессированным капсидным белком CPV, MLV CPV или CDV на основе аденовирусного вектора

Задача исследования заключалась в оценке иммуногенности нескольких доз различных вакцин-кандидатов, введенных разными путями. Различные кандидаты представляли собой VLP CPV и рекомбинантные аденовирусы, экспрессировавшие или гены CPV, или гены CDV (чумка собак).

Таблица 7. Экспериментальный дизайн исследования VLP CPV против Адено-CPV и против адено-CDV

Группа		Вакцина введена на D0 и D28** Доза и путь	Взятые образцы	Анализы
A	VLP+_1 (n=6)	VLP CPV Высокая доза (500 мкл основного раствора/доза) SC (1 мл)	Флаконы с кровью: D0, D7, D14, D21, D28, D35, D42, D56 и D63 Флаконы с кровью с гепарином: D7, D31, D35, D56	Определение анти-CDV антител (ELISA и/или ингибирование гемагглютинации)	Клеточный и/или иммунный ответ B-клеток памяти
B	VLP+_2 (n=6)
C	VLP-** (n=6)	VLP CPV Низкая доза (50 мкл основного раствора/доза) SC (1 мл)
D	VLP_Перорально (n=6)	VLP CPV 2 мл неразбавленного основного раствора Перорально
E	Ad5_CPV+ (n=6)	Адено-CPV vAD3032 высокая доза целевая доза (8,64 log 10 TCID50/мл *) SC (1 мл)
F	Ad5_CPV (n=6)	Адено-CPV vAD3032 низкая доза (целевая доза 7,64 log 10 TCID50/мл *) SC (1 мл)
G	Ad5_CDV- (n=6)	Адено-CDV vAD3031 низкая доза (целевая доза 7,34 log 10 TCID50/мл *) SC (1 мл)		Определение анти-CDV антител (серонейтрализация)
H	Ad5_CDV+ (n=6)	Адено-CDV vAD3031 высокая доза (целевая доза 8,34 log 10 TCID50/мл *) SC (1 мл)

Как показано на фиг. 13, группы A и E индуцируют у щенков защитные уровни титров антител против CPV.

Пример 7. Вакцинация собак бакуловирус-экспрессированым капсидным белком CPV (VLP), VLP + RECOMBITEK^® C4, один RECOMBITEK^® C4 или NOBIVAC^® 3

Задача исследования заключалась в оценке антительного ответа после введения различных экспериментальных композиций поливалентных вакцин, содержащих обычный CPV-2 MLV или бакуловирус-экспрессированную вакцину рекомбинантных вирусоподобных частиц (VLP) CPV-2c и одну конкурентную/коммерческую вакцину у собак с MDA CPV.

Сорок 6-7-недельных положительных по материнским антителам (MDAs) собак породы бигль от суки, ранее иммунизированной CPV во время беременности, были случайным образом разбиты на группы обработки (n=10 собак) с помощью помета и титра антител. Титрования образцов крови, собранные на день -27, применяли для рандомизации. Всех собак вакцинировали дважды, с промежутком в 21 день, назначенной вакциной в соответствии с приведенной ниже таблицей 8. Щенки имели материнские Ab (MDA) к CPV на D0.

Таблица 8. Экспериментальный дизайн исследования VLP CPV против RECOMBITEK^® C4 и NOBIVAC^®

Группы	Вакцинация на день 0 и день 21	Титры	№ собаки
1	VLP CPV Тестируемая вакцина #4 (1 мл) *VLPs CPV-2c	273,5 мкг общего белка 7,1 Log HA титр	10
2	VLP CPV #4 (0,5 мл) *VLPs CPV-2c + RECOMBITEK® C4 #1 (CDV- CAV-CPi, CPV2)*** (1 мл)	273,5 мкг общего белка 7,1 Log HA титр CPV: 6,9 TCID50/мл CDV: 7,1 TCID50/мл CPi: 5,8 TCID50/мл CAV2: 6,0 TCID50/мл	10
3	RECOMBITEK® C4 #1 (CDV- CAV-CPi, CPV2)*** (1 мл)	CPV: 6,9 TCID50/мл CDV: 7,1 TCID50/мл CPi: 5,8 TCID50/мл CAV2: 6,0 TCID50/мл	10
4	NOBIVAC® 3 (CDV- CAV2-CPV2) (1 мл)	Неизвестен	10

*Вирусоподобные частицы собачьего парвовируса VP2: VLPs CPV-2c

**Введена на той же стороне, что и одновременная вакцина, отступив приблизительно 3 см

***Вакцину CDV-CAV-CPi-CPV2 обозначили как C4

HA: Гемагглютинация в 0,5 мл

Кровь собирали от всех собак на дни 0, 7, 15, 21, 28, 35 и 42 и сыворотки тестировали на антитела к CPV с помощью анализов HAI и нейтрализации антителами сыворотки (SNA).

Титры CPV HAI регистрировали как обратные самому высокому разведению, предупреждающему гемагглютинацию, и величину <20 считали отрицательной.

За исключением 2-х собак в группе 3 (C4) все собаки в каждой протестированной группе были положительными в отношении CPV по данным HAI на день 0, перед вакцинацией. Сероконверсию после вакцинации определяли как увеличение в титре в 4 раза или более от дня 0. После первой вакцинация, 6 из 10 собак, вакцинированных VLP-CPV2c (группа 1), и 6 из 10 собак, вакцинированных VLP-CPV2c-C4 (группа 2), претерпевали сероконверсию ко дню 7. На день 7 в группах 3 и 4 (т.е. в группах несодержавших VLPs) не было отвечающих на вакцинацию. Ко дню 21, 5 из 10 собак из группы 2 (VLP-CPV2c- C4), 4 из 10 из группы 1 (VLP-CPV2c), 3 из 10 из группы 4 (NOBIVAC3^®) и 2 из 10 из группы 3 (C4) претерпевали сероконверсию (фиг. 15).

После второй вакцинации, ко дню 35 (2 недели после вакцинации) сероконверсию наблюдали у всех собак из группы 2 (VLP-CPV2c- C4) и 4 (NOBIVAC3^®) с последующими 9 в группе 3 (C4) и 8 в группе 1 (VLP-CPV2c). Обработка VLP + C4 (группа 2) индуцировала самое высокое среднее геометрическое титра антител на протяжении всего исследования. Смотри фиг. 17. Через семь дней после V2, на день 28, GMT данной группы был в -7,5 раз выше, чем с одним VLP (GMT= 520), в -9 раз выше, чем с одним C4 (GMT =422) и в -28 раз выше, чем в группе NOBIVAC3® (GMT=139).

Таблица 9. Титры IHA по ID и дню для VLP CPV v.

Исследование RECOMBITEK^® C4 и NOBIVAC^®

Таблица 10. Сводная статистика для VLP CPV v.

Исследование RECOMBITEK^® C4 и NOBIVAC^®

Пример 8. Вакцинация собак бакуловирус-экспрессированным капсидным белком CPV (VLP), VLP + RECOMBITEK^® C4, только RECOMBITEK^® C4 или NOBIVAC^® 3

Задача данного исследования заключалась в оценке антительного ответа на CPV после введения экспериментальных вирусоподобных частиц, сделанных из капсидного белка VP2 собачьего парвовируса типа 2c (VLPs CPV-2c) в различных титрах в комбинации с композицией поливалентной вакцины CPV-2 MLV и с одной коммерческой вакциной у собак с MDA к CPV.

Пятьдесят 6-7-недельных положительных по материнским антителам (MDAs) собак породы бигль от сук, ранее иммунизированных CPV во время беременности, были случайным образом разбиты на пять групп обработки (n=10 собак на группу) с учетом помета и титра антител. Титрования от образцов крови, собранных на день -15, применяли для рандомизации.

Вакцины получали с помощью регидратации лиофилизированного компонента компонентом разбавителя. Лиофилизированная серия, примененная для тестируемых вакцин #1, #2, #3 и #5, была одной и той же экспериментальной 4-направленной (C4) вакциной. Титры для каждого компонента были следующими: CPV:6,1 Log TCID50/мл (~0,2 мл культуры 1X), CDV: 7,3 Log TCID50/мл, CPi: 5,5 Log TCID50/мл и CAV2:6,0 Log TCID50/мл. Всех собак вакцинировали дважды, через 21 день назначенной вакциной в соответствии с приведенной ниже таблицей 11.

Таблица 11. Экспериментальный дизайн исследования VLP CPV против RECOMBITEK^® C4 и NOBIVAC^®

ГРУППА (n=10)	Лиофилизованный компонент вакцины	Компонент разбавителя вакцины
1 C4 + Высокая доза VLP-CPV2c	CDV-CAV2-CPi-CPV	VLPs CPV-2c; lot #: 14Дек15 Неразбавленный 7,0 Log aHA/мл ~10 мл культуры 1X
2 C4 + Средняя доза VLP-CPV2c	CDV-CAV2-CPi-CPV	VLPs CPV-2c; lot #: 14Дек15 Разбавленный 1:5 в воде 6,3 Log aHA / мл ~2 мл культуры 1X
3 C4 + Низкая доза VLP- CPV2c	CDV-CAV2-CPi-CPV	VLPs CPV-2c; lot #: 14Дек15 Разбавленный 1:25 в воде 5,7 Log aHA / мл ~0,4 мл культуры 1X
4 Nobivac® 3 DAPv	Nobivac® Собачий 3 (CDV-CAV2-CPV2) (1 мл)	Неизвестен
5 C4 Нет VLP- CPV2c	CDV-CAV2-CPi-CPV	Вода

Кровь собирали от всех собак на дни 0, 7, 15, 21, 28, 34 и 42, и сыворотки тестировали на антитела к CPV с помощью анализа реакции торможения гемагглютинации (HAI).

Титры CPV HAI регистрировали как обратные самому высокому разведению, предупреждающему гемагглютинацию, и величину <20 считали отрицательной. Все собаки в каждой группе были положительными по CPV согласно анализу HAI на день 0, перед вакцинацией (средние титры GMT для всех групп между 42.87 и 80). Сероконверсию после вакцинации определяли как увеличение в титре в 4 раза или более от дня 0. Сероконвертирование собак характеризовали как отвечающих на вакцинацию (фиг. 18). Через семь дней после первой вакцинации, 5 из 10 собак, вакцинированных самой высокой дозой VLP-CPV2c- C4 (группа 1), и 1 из 10 собак, вакцинированных средней дозой VLP-CPV2c-C4 (группа 2), претерпевали сероконверсию. В группах 3, 4 и 5 (т.е. в группах, содержавших низкую дозу или не содержавших VLP) на день 7 не было отвечающих на вакцинацию. Через двадцать один день после первой вакцинации, все собаки из группы 1 (высокая доза VLP-CPV2c- C4), 3 из 10 из группы 2 (средняя доза VLP-CPV2c- C4), 1 из 10 из группы 3 (низкая доза VLP-CPV2c- C4). Не было отвечающих на вакцинацию в группах 4 и 5 (т.е. в группах, не содержавших VLP) (фиг. 18).

На день 34, через 13 дней после второй вакцинации, сероконверсию наблюдали у всех собак из группы 1 (высокая доза VLP-CPV2c-C4) и 4 (NOBIVAC3®) с последующими 9 в группе 2 (средняя доза VLP-CPV2c-C4), 6 в группе 3 (низкая доза VLP-CPV2c-C4) и 1 в группе 5 (C4, нет VLP).

Как показано на фиг. 19, обработка в высокой дозе VLP + C4 (группа 1) индуцирует самое высокое среднее геометрическое титра антител на протяжении всего исследования. Через тринадцать дней после V2, на день 34, GMT данной группы был равен 4457,22, затем следовала группа со средней дозой VLP-CPV2c-C4 и группы NOBIVAC3^®; (GMT=1470,33), с низкой дозой VLP-CPV2c-C4 (GMT =298,57) и только C4 (GMT =45,95).

Таблица 12. Результаты исследования HI по группам, ID и дню второй VLP CPV против RECOMBITEK^® C4 и NOBIVAC^®

			День
			0	7	15	21	28	34	42
Группа	*Вакцина	ID
1	Тестируемая вакцина #1 (rDAPP; C4) + VLPs CPV-2c 7,1 Log HA	PFE6	40	320	640	1280	5120	5120	2560
		PRD6	40	5120	5120	2560	5120	5120	2560
		QFC6	40	5120	5120	5120	10240	10240	5120
		QOE6	20	160	2560	2560	10240	5120	5120
		RIE6	80	80	40	20	1280	2560	2560
		RKD6	80	320	1280	640	10240	5120	2560
		SPF6	160	80	2560	1280	10240	10240	5120
		TAF6	80	160	1280	640	10240	5120	5120
		VAF6	80	160	80	80	640	1280	1280
		VCE6	40	80	80	40	5120	2560	2560
		GMT	56,57	298,57	735,17	519,84	5120,00	4457,22	3151,73
2	Тестируемая вакцина #2 (rDAPP; C4) + VLPs CPV-2c 6,4 Log HA	PWF6	40	160	320	160	2560	2560	1280
		QBF6	160	160	80	40	640	640	320
		QLE6	40	80	1280	2560	10240	10240	5120
		RJD6	80	80	320	160	2560	1280	1280
		RWE6	80	80	20	<20	80	2560	1280
		RXE6	40	80	20	20	320	640	640
		STE6	80	40	20	20	40	640	320
		SUF6	40	40	40	20	160	5120	2560
		TBF6	80	40	40	40	320	2560	1280
		VDE6	80	40	40	20	40	160	160
		GMT	64,98	69,64	74,64	56,57	393,97	1470,33	905,10
3	Тестируемая вакцина #3 (rDAPP; C4) + VLPs CPV-2c 5,7 Log HA	QDE6	80	40	20	20	40	80	80
		QED6	40	40	320	320	2560	2560	1280
		QKE6	40	20	<20	<20	40	160	160
		RGF6	40	80	40	20	40	1280	640
		RPD6	40	40	20	20	40	1280	640
		RTF6	40	40	20	<20	80	1280	1280
		SCE6	20	20	<20	<20	1280	1280	1280
		SQF6	80	40	40	20	40	160	160
		UOE6	40	20	20	<20	40	20	<20
		UXF6	40	40	20	20	20	<20	<20
		GMT	42,87	34,82	30,31	26,39	85,74	298,57	242,51
4	Nobivac® Собачий 3-DAPv	PCE6	20	<20	<20	<20	40	640	640
		QCF6	80	40	20	<20	<20	2560	640
		RFF6	160	40	20	20	20	1280	640
		RLD6	160	160	20	<20	<20	2560	1280
		ROD6	160	40	20	<20	<20	1280	1280
		SDE6	40	40	20	<20	40	1280	1280
		SWE6	40	20	<20	<20	<20	640	320
		SXE6	40	20	20	<20	<20	1280	1280
		TCE6	160	40	<20	20	<20	2560	1280
		UYF6	160	160	40	40	<20	2560	1280
		GMT	80,00	42,87	21,44	21,44	22,97	1470,33	905,10
5	Тестируемая вакцина #5 (rDAPP; C4)	PBE6	20	<20	<20	<20	80	1280	640
		REF6	80	40	20	<20	<20	<20	<20
		RHE6	160	20	<20	<20	<20	<20	<20
		RUE6	80	80	40	20	<20	<20	<20
		SVF6	160	<20	<20	<20	<20	<20	<20
		TDE6	160	160	40	<20	<20	<20	<20
		ULF6	20	20	<20	<20	<20	320	320
		UPE6	80	20	<20	<20	<20	80	320
		UZF6	160	160	40	20	20	<20	<20
		VBF6	80	20	20	20	<20	<20	<20
		GMT	80,00	37,32	24,62	20,00	22,97	45,95	49,25

* Для целей примера 8, приведенные ниже названия будут применены в следующих таблицах и графиках.

* C4 + Высокая доза VLP-CPV2c = Тестируемая вакцина #1

* C4 + Средняя доза VLP-CPV2c = Тестируемая вакцина #2

* C4 + Низкая доза VLP-CPV2c = Тестируемая вакцина #3

* C4 + Нет VLP-CPV2c = Тестируемая вакцина #5

Таблица 13. Сводная статистика* исследования по группам для второй VLP CPV против RECOMBITEK^® C4 и NOBIVAC^®

День		Группа		Вакцина	N	Среднее геометрическое	Среднее арифметическое	Медиа- на	Мин	Макс
0		1		C4 + Высокая доза VLP-CPV2c	10	56,57	66,00	60	20,0	160,0
		2		C4 + Средняя доза VLP-CPV2c	10	64,98	72,00	80	40,0	160,0
		3		C4 + низкая доза VLP-CPV2c	10	42,87	46,00	40	20,0	80,0
		4		Nobivac® Собачий 3-DAPv	10	80,00	102,00	120	20,0	160,0
		5		C4 + No VLP-CPV2c	10	80,00	100,00	80	20,0	160,0
7		1		C4 + Высокая доза VLP-CPV2c	10	298,57	1160,00	160	80,0	5120,0
		2		C4 + Средняя доза VLP-CPV2c	10	69,64	80,00	80	40,0	160,0
		3		C4 + низкая доза VLP-CPV2c	10	34,82	38,00	40	20,0	80,0
		4		Nobivac® Собачий 3-DAPv	10	42,87	58,00	40	20,0	160,0
		5		C4 + No VLP-CPV2c	10	37,32	56,00	20	20,0	160,0
15		1		C4 + Высокая доза VLP-CPV2c	10	735,17	1876,00	1280	40,0	5120,0
		2		C4 + Средняя доза VLP-CPV2c	10	74,64	218,00	40	20,0	1280,0
		3		C4 + низкая доза VLP-CPV2c	10	30,31	54,00	20	20,0	320,0
		4		Nobivac® Собачий 3-DAPv	10	21,44	22,00	20	20,0	40,0
		5		C4 + No VLP-CPV2c	10	24,62	26,00	20	20,0	40,0
21		1		C4 + Высокая доза VLP-CPV2c	10	519,84	1422,00	960	20,0	5120,0
		2		C4 + Средняя доза VLP-CPV2c	10	56,57	306,00	30	20,0	2560,0
		3		C4 + низкая доза VLP-CPV2c	10	26,39	50,00	20	20,0	320,0
		4		Nobivac® Собачий 3-DAPv	10	21,44	22,00	20	20,0	40,0
		5		C4 + No VLP-CPV2c	10	20,00	20,00	20	20,0	20,0
28	1		C4 + Высокая доза VLP-CPV2c		10	5120,00	6848,00	7680	640,0	10240,0
	2		C4 + Средняя доза VLP-CPV2c		10	393,97	1696,00	320	40,0	10240,0
	3		C4 + низкая доза VLP-CPV2c		10	85,74	418,00	40	20,0	2560,0
	4		Nobivac® Собачий 3-DAPv		10	22,97	24,00	20	20,0	40,0
	5		C4 + No VLP-CPV2c		10	22,97	26,00	20	20,0	80,0
34	1		C4 + Высокая доза VLP-CPV2c		10	4457,22	5248,00	5120	1280,0	10240,0
	2		C4 + Средняя доза VLP-CPV2c		10	1470,33	2640,00	1920	160,0	10240,0
	3		C4 + низкая доза VLP-CPV2c		10	298,57	812,00	720	20,0	2560,0
	4		Nobivac® Собачий 3-DAPv		10	1470,33	1664,00	1280	640,0	2560,0
	5		C4 + No VLP-CPV2c		10	45,95	182,00	20	20,0	1280,0
42	1		C4 + Высокая доза VLP-CPV2c		10	3151,73	3456,00	2560	1280,0	5120,0
	2		C4 + Средняя доза VLP-CPV2c		10	905,10	1424,00	1280	160,0	5120,0
	3		C4 + низкая доза VLP-CPV2c		10	242,51	556,00	400	20,0	1280,0
	4		Nobivac® Собачий 3-DAPv		10	905,10	992,00	1280	320,0	1280,0
	5		C4 + No VLP-CPV2c		10	49,25	142,00	20	20,0	640,0

Таблица 14. Число отвечающих на вакцинацию (сероконверсия) по группам и дням; 1=Yes, 0=No; сероконверсию определяли как 4-кратное или более увеличение в титре от базовой линии.

			День
			0	7	15	21	28	34	42
Группа	Вакцина	ID	0	1	1	1	1	1	1
1	C4 + Высокая доза VLP-CPV2c	PFE6
		PRD6	0	1	1	1	1	1	1
		QFC6	0	1	1	1	1	1	1
		QOE6	0	1	1	1	1	1	1
		RIE6	0	0	0	0	1	1	1
		RKD6	0	1	1	1	1	1	1
		SPF6	0	0	1	1	1	1	1
		TAF6	0	0	1	1	1	1	1
		VAF6	0	0	0	0	1	1	1
		VCE6	0	0	0	0	1	1	1
		Total	0	5	7	7	10	10	10
2	C4 + Средняя доза VLP-CPV2c	ID	0	1	1	1	1	1	1
		PWF6
		QBF6	0	0	0	0	1	1	1
		QLE6	0	0	1	1	1	1	1
		RJD6	0	0	1	1	1	1	1
		RWE6	0	0	0	0	0	1	1
		RXE6	0	0	0	0	1	1	1
		STE6	0	0	0	0	0	1	1
		SUF6	0	0	0	0	1	1	1
		TBF6	0	0	0	0	1	1	1
		VDE6	0	0	0	0	0	0	0
		Total	0	1	3	3	7	9	9
3	C4 + низкая доза VLP-CPV2c	ID	0	0	0	0	0	0	0
		QDE6
		QED6	0	0	1	1	1	1	1
		QKE6	0	0	0	0	0	1	1
		RGF6	0	0	0	0	0	1	1
		RPD6	0	0	0	0	0	1	1
		RTF6	0	0	0	0	0	1	1
		SCE6	0	0	0	0	1	1	1
		SQF6	0	0	0	0	0	0	0
		UOE6	0	0	0	0	0	0	0
		UXF6	0	0	0	0	0	0	0
		Total	0	0	1	1	2	6	6
4	Nobivac® Собачий 3-DAPv	ID	0	0	0	0	0	1	1
		PCE6
		QCF6	0	0	0	0	0	1	1
		RFF6	0	0	0	0	0	1	1
		RLD6	0	0	0	0	0	1	1
		ROD6	0	0	0	0	0	1	1
		SDE6	0	0	0	0	0	1	1
		SWE6	0	0	0	0	0	1	1
		SXE6	0	0	0	0	0	1	1
		TCE6	0	0	0	0	0	1	1
		UYF6	0	0	0	0	0	1	1
		Total	0	0	0	0	0	10	10
5	C4 + Нет VLP-CPV2c	ID	0	0	0	0	1	1	1
		PBE6
		REF6	0	0	0	0	0	0	0
		RHE6	0	0	0	0	0	0	0
		RUE6	0	0	0	0	0	0	0
		SVF6	0	0	0	0	0	0	0
		TDE6	0	0	0	0	0	0	0
		ULF6	0	0	0	0	0	1	1
		UPE6	0	0	0	0	0	0	1
		UZF6	0	0	0	0	0	0	0
		VBF6	0	0	0	0	0	0	0
		Total	0	0	0	0	1	2	3

Соответственно, VLP CPV способствовали более раннему возникновению иммунитета (OOI) по сравнению с одной MLV в MDA+ щенках, и VLP CPV обладали синергическим эффектом с MLV C4 в MDA+ щенках. Заявитель утверждает, что данные результаты были неожиданными и чрезвычайно благоприятными. Преодоление материнских антител уже давно было вызовом для биологов, работающих в области вакцинации, и эти данные указывают на то, что подход VLP + MLV, раскрытый в настоящем документе, может быть широко применен для решения проблемы обеспечения MDA+ потомства с защитным иммунитетом.

--->

SEQUENCE LISTING

<110> Merial, Inc.

David, Frederic

Hannas-Djebbara, Zahia

Poulet, Herve

Minke, Jules

<120> Canine Parvovirus (CPV) Virus-like Particle (VLP) Vaccines and

uses thereof

<130> MER 14-252

<150> 62/234,196

<151> 2015-09-29

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 584

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VP2 of Canine parvovirus - GenBank BAD34656.1

<400> 1

Met Ser Asp Gly Ala Val Gln Pro Asp Gly Gly Gln Pro Ala Val Arg

1 5 10 15

Asn Glu Arg Ala Thr Gly Ser Gly Asn Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly

20 25 30

Gly Gly Ser Gly Gly Val Gly Ile Ser Thr Gly Thr Phe Asn Asn Gln

35 40 45

Thr Glu Phe Lys Phe Leu Glu Asn Gly Trp Val Glu Ile Thr Ala Asn

50 55 60

Ser Ser Arg Leu Val His Leu Asn Met Pro Glu Ser Glu Asn Tyr Arg

65 70 75 80

Arg Val Val Val Asn Asn Leu Asp Lys Thr Ala Val Asn Gly Asn Met

85 90 95

Ala Leu Asp Asp Thr His Ala Gln Ile Val Thr Pro Trp Ser Leu Val

100 105 110

Asp Ala Asn Ala Trp Gly Val Trp Phe Asn Pro Gly Asp Trp Gln Leu

115 120 125

Ile Val Asn Thr Met Ser Glu Leu His Leu Val Ser Phe Glu Gln Glu

130 135 140

Ile Phe Asn Val Val Leu Lys Thr Val Ser Glu Ser Ala Thr Gln Pro

145 150 155 160

Pro Thr Lys Val Tyr Asn Asn Asp Leu Thr Ala Ser Leu Met Val Ala

165 170 175

Leu Asp Ser Asn Asn Thr Met Pro Phe Thr Pro Ala Ala Met Arg Ser

180 185 190

Glu Thr Leu Gly Phe Tyr Pro Trp Lys Pro Thr Ile Pro Thr Pro Trp

195 200 205

Arg Tyr Tyr Phe Gln Trp Asp Arg Thr Leu Ile Pro Ser His Thr Gly

210 215 220

Thr Ser Gly Thr Pro Thr Asn Ile Tyr His Gly Thr Asp Pro Asp Asp

225 230 235 240

Val Gln Phe Tyr Thr Ile Glu Asn Ser Val Pro Val His Leu Leu Arg

245 250 255

Thr Gly Asp Glu Phe Ala Thr Gly Thr Phe Phe Phe Asp Cys Lys Pro

260 265 270

Cys Arg Leu Thr His Thr Trp Gln Thr Asn Arg Ala Leu Gly Leu Pro

275 280 285

Pro Phe Leu Asn Ser Leu Pro Gln Ala Glu Gly Gly Thr Asn Phe Gly

290 295 300

Tyr Ile Gly Val Gln Gln Asp Lys Arg Arg Gly Val Thr Gln Met Gly

305 310 315 320

Asn Thr Asn Tyr Ile Thr Glu Ala Thr Ile Met Arg Pro Ala Glu Val

325 330 335

Gly Tyr Ser Ala Pro Tyr Tyr Ser Phe Glu Ala Ser Thr Gln Gly Pro

340 345 350

Phe Lys Thr Pro Ile Ala Ala Gly Arg Gly Gly Ala Gln Thr Asp Glu

355 360 365

Asn Gln Ala Ala Asp Gly Asp Pro Arg Tyr Ala Phe Gly Arg Gln His

370 375 380

Gly Gln Lys Thr Thr Thr Thr Gly Glu Thr Pro Glu Arg Phe Thr Tyr

385 390 395 400

Ile Ala His Gln Asp Thr Gly Arg Tyr Pro Glu Gly Asp Trp Ile Gln

405 410 415

Asn Ile Asn Phe Asn Leu Pro Val Thr Glu Asp Asn Val Leu Leu Pro

420 425 430

Thr Asp Pro Ile Gly Gly Lys Thr Gly Ile Asn Tyr Thr Asn Ile Phe

435 440 445

Asn Thr Tyr Gly Pro Leu Thr Ala Leu Asn Asn Val Pro Pro Val Tyr

450 455 460

Pro Asn Gly Gln Ile Trp Asp Lys Glu Phe Asp Thr Asp Leu Lys Pro

465 470 475 480

Arg Leu His Val Asn Ala Pro Phe Val Cys Gln Asn Asn Cys Pro Gly

485 490 495

Gln Leu Phe Val Lys Val Ala Pro Asn Leu Thr Asn Glu Tyr Asp Pro

500 505 510

Asp Ala Ser Ala Asn Met Ser Arg Ile Val Thr Tyr Ser Asp Phe Trp

515 520 525

Trp Lys Gly Lys Leu Val Phe Lys Ala Lys Leu Arg Ala Ser His Thr

530 535 540

Trp Asn Pro Ile Gln Gln Met Ser Ile Asn Val Asp Asn Gln Phe Asn

545 550 555 560

Tyr Val Pro Ser Asn Ile Gly Gly Met Lys Ile Val Tyr Glu Lys Ser

565 570 575

Gln Leu Ala Pro Arg Lys Leu Tyr

580

<210> 2

<211> 9632

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pVL1393 - 9632 bp baculovirus transfer vector from Invitrogen

<400> 2

aagctttact cgtaaagcga gttgaaggat catatttagt tgcgtttatg agataagatt 60

gaaagcacgt gtaaaatgtt tcccgcgcgt tggcacaact atttacaatg cggccaagtt 120

ataaaagatt ctaatctgat atgttttaaa acacctttgc ggcccgagtt gtttgcgtac 180

gtgactagcg aagaagatgt gtggaccgca gaacagatag taaaacaaaa ccctagtatt 240

ggagcaataa tcgatttaac caacacgtct aaatattatg atggtgtgca ttttttgcgg 300

gcgggcctgt tatacaaaaa aattcaagta cctggccaga ctttgccgcc tgaaagcata 360

gttcaagaat ttattgacac ggtaaaagaa tttacagaaa agtgtcccgg catgttggtg 420

ggcgtgcact gcacacacgg tattaatcgc accggttaca tggtgtgcag atatttaatg 480

cacaccctgg gtattgcgcc gcaggaagcc atagatagat tcgaaaaagc cagaggtcac 540

aaaattgaaa gacaaaatta cgttcaagat ttattaattt aattaatatt atttgcattc 600

tttaacaaat actttatcct attttcaaat tgttgcgctt cttccagcga accaaaacta 660

tgcttcgctt gctccgttta gcttgtagcc gatcagtggc gttgttccaa tcgacggtag 720

gattaggccg gatattctcc accacaatgt tggcaacgtt gatgttacgt ttatgctttt 780

ggttttccac gtacgtcttt tggccggtaa tagccgtaaa cgtagtgccg tcgcgcgtca 840

cgcacaacac cggatgtttg cgcttgtccg cggggtattg aaccgcgcga tccgacaaat 900

ccaccacttt ggcaactaaa tcggtgacct gcgcgtcttt tttctgcatt atttcgtctt 960

tcttttgcat ggtttcctgg aagccggtgt acatgcggtt tagatcagtc atgacgcgcg 1020

tgacctgcaa atctttggcc tcgatctgct tgtccttgat ggcaacgatg cgttcaataa 1080

actcttgttt tttaacaagt tcctcggttt tttgcgccac caccgcttgc agcgcgtttg 1140

tgtgctcggt gaatgtcgca atcagcttag tcaccaactg tttgctctcc tcctcccgtt 1200

gtttgatcgc gggatcgtac ttgccggtgc agagcacttg aggaattact tcttctaaaa 1260

gccattcttg taattctatg gcgtaaggca atttggactt cataatcagc tgaatcacgc 1320

cggatttagt aatgagcact gtatgcggct gcaaatacag cgggtcgccc cttttcacga 1380

cgctgttaga ggtagggccc ccattttgga tggtctgctc aaataacgat ttgtatttat 1440

tgtctacatg aacacgtata gctttatcac aaactgtata ttttaaactg ttagcgacgt 1500

ccttggccac gaaccggacc tgttggtcgc gctctagcac gtaccgcagg ttgaacgtat 1560

cttctccaaa tttaaattct ccaattttaa cgcgagccat tttgatacac gtgtgtcgat 1620

tttgcaacaa ctattgtttt ttaacgcaaa ctaaacttat tgtggtaagc aataattaaa 1680

tatgggggaa catgcgccgc tacaacactc gtcgttatga acgcagacgg cgccggtctc 1740

ggcgcaagcg gctaaaacgt gttgcgcgtt caacgcggca aacatcgcaa aagccaatag 1800

tacagttttg atttgcatat taacggcgat tttttaaatt atcttattta ataaatagtt 1860

atgacgccta caactccccg cccgcgttga ctcgctgcac ctcgagcagt tcgttgacgc 1920

cttcctccgt gtggccgaac acgtcgagcg ggtggtcgat gaccagcggc gtgccgcacg 1980

cgacgcacaa gtatctgtac accgaatgat cgtcgggcga aggcacgtcg gcctccaagt 2040

ggcaatattg gcaaattcga aaatatatac agttgggttg tttgcgcata tctatcgtgg 2100

cgttgggcat gtacgtccga acgttgattt gcatgcaagc cgaaattaaa tcattgcgat 2160

tagtgcgatt aaaacgttgt acatcctcgc ttttaatcat gccgtcgatt aaatcgcgca 2220

atcgagtcaa gtgatcaaag tgtggaataa tgttttcttt gtattcccga gtcaagcgca 2280

gcgcgtattt taacaaacta gccatcttgt aagttagttt catttaatgc aactttatcc 2340

aataatatat tatgtatcgc acgtcaagaa ttaacaatgc gcccgttgtc gcatctcaac 2400

acgactatga tagagatcaa ataaagcgcg aattaaatag cttgcgacgc aacgtgcacg 2460

atctgtgcac gcgttccggc acgagctttg attgtaataa gtttttacga agcgatgaca 2520

tgacccccgt agtgacaacg atcacgccca aaagaactgc cgactacaaa attaccgagt 2580

atgtcggtga cgttaaaact attaagccat ccaatcgacc gttagtcgaa tcaggaccgc 2640

tggtgcgaga agccgcgaag tatggcgaat gcatcgtata acgtgtggag tccgctcatt 2700

agagcgtcat gtttagacaa gaaagctaca tatttaattg atcccgatga ttttattgat 2760

aaattgaccc taactccata cacggtattc tacaatggcg gggttttggt caaaatttcc 2820

ggactgcgat tgtacatgct gttaacggct ccgcccacta ttaatgaaat taaaaattcc 2880

aattttaaaa aacgcagcaa gagaaacatt tgtatgaaag aatgcgtaga aggaaagaaa 2940

aatgtcgtcg acatgctgaa caacaagatt aatatgcctc cgtgtataaa aaaaatattg 3000

aacgatttga aagaaaacaa tgtaccgcgc ggcggtatgt acaggaagag gtttatacta 3060

aactgttaca ttgcaaacgt ggtttcgtgt gccaagtgtg aaaaccgatg tttaatcaag 3120

gctctgacgc atttctacaa ccacgactcc aagtgtgtgg gtgaagtcat gcatctttta 3180

atcaaatccc aagatgtgta taaaccacca aactgccaaa aaatgaaaac tgtcgacaag 3240

ctctgtccgt ttgctggcaa ctgcaagggt ctcaatccta tttgtaatta ttgaataata 3300

aaacaattat aaatgctaaa tttgtttttt attaacgata caaaccaaac gcaacaagaa 3360

catttgtagt attatctata attgaaaacg cgtagttata atcgctgagg taatatttaa 3420

aatcattttc aaatgattca cagttaattt gcgacaatat aattttattt tcacataaac 3480

tagacgcctt gtcgtcttct tcttcgtatt ccttctcttt ttcatttttc tcctcataaa 3540

aattaacata gttattatcg tatccatata tgtatctatc gtatagagta aattttttgt 3600

tgtcataaat atatatgtct tttttaatgg ggtgtatagt accgctgcgc atagtttttc 3660

tgtaatttac aacagtgcta ttttctggta gttcttcgga gtgtgttgct ttaattatta 3720

aatttatata atcaatgaat ttgggatcgt cggttttgta caatatgttg ccggcatagt 3780

acgcagcttc ttctagttca attacaccat tttttagcag caccggatta acataacttt 3840

ccaaaatgtt gtacgaaccg ttaaacaaaa acagttcacc tcccttttct atactattgt 3900

ctgcgagcag ttgtttgttg ttaaaaataa cagccattgt aatgagacgc acaaactaat 3960

atcacaaact ggaaatgtct atcaatatat agttgctgat atcatggaga taattaaaat 4020

gataaccatc tcgcaaataa ataagtattt tactgttttc gtaacagttt tgtaataaaa 4080

aaacctataa atattccgga ttattcatac cgtcccacca tcgggcgcgg atcccgggta 4140

ccttctagaa ttccggagcg gccgctgcag atctgatcct ttcctgggac ccggcaagaa 4200

ccaaaaactc actctcttca aggaaatccg taatgttaaa cccgacacga tgaagcttgt 4260

cgttggatgg aaaggaaaag agttctacag ggaaacttgg acccgcttca tggaagacag 4320

cttccccatt gttaacgacc aagaagtgat ggatgttttc cttgttgtca acatgcgtcc 4380

cactagaccc aaccgttgtt acaaattcct ggcccaacac gctctgcgtt gcgaccccga 4440

ctatgtacct catgacgtga ttaggatcgt cgagccttca tgggtgggca gcaacaacga 4500

gtaccgcatc agcctggcta agaagggcgg cggctgccca ataatgaacc ttcactctga 4560

gtacaccaac tcgttcgaac agttcatcga tcgtgtcatc tgggagaact tctacaagcc 4620

catcgtttac atcggtaccg actctgctga agaggaggaa attctccttg aagtttccct 4680

ggtgttcaaa gtaaaggagt ttgcaccaga cgcacctctg ttcactggtc cggcgtatta 4740

aaacacgata cattgttatt agtacattta ttaagcgcta gattctgtgc gttgttgatt 4800

tacagacaat tgttgtacgt attttaataa ttcattaaat ttataatctt tagggtggta 4860

tgttagagcg aaaatcaaat gattttcagc gtctttatat ctgaatttaa atattaaatc 4920

ctcaatagat ttgtaaaata ggtttcgatt agtttcaaac aagggttgtt tttccgaacc 4980

gatggctgga ctatctaatg gattttcgct caacgccaca aaacttgcca aatcttgtag 5040

cagcaatcta gctttgtcga tattcgtttg tgttttgttt tgtaataaag gttcgacgtc 5100

gttcaaaata ttatgcgctt ttgtatttct ttcatcactg tcgttagtgt acaattgact 5160

cgacgtaaac acgttaaata aagcttggac atatttaaca tcgggcgtgt tagctttatt 5220

aggccgatta tcgtcgtcgt cccaaccctc gtcgttagaa gttgcttccg aagacgattt 5280

tgccatagcc acacgacgcc tattaattgt gtcggctaac acgtccgcga tcaaatttgt 5340

agttgagctt tttggaatta tttctgattg cgggcgtttt tgggcgggtt tcaatctaac 5400

tgtgcccgat tttaattcag acaacacgtt agaaagcgat ggtgcaggcg gtggtaacat 5460

ttcagacggc aaatctacta atggcggcgg tggtggagct gatgataaat ctaccatcgg 5520

tggaggcgca ggcggggctg gcggcggagg cggaggcgga ggtggtggcg gtgatgcaga 5580

cggcggttta ggctcaaatg tctctttagg caacacagtc ggcacctcaa ctattgtact 5640

ggtttcgggc gccgtttttg gtttgaccgg tctgagacga gtgcgatttt tttcgtttct 5700

aatagcttcc aacaattgtt gtctgtcgtc taaaggtgca gcgggttgag gttccgtcgg 5760

cattggtgga gcgggcggca attcagacat cgatggtggt ggtggtggtg gaggcgctgg 5820

aatgttaggc acgggagaag gtggtggcgg cggtgccgcc ggtataattt gttctggttt 5880

agtttgttcg cgcacgattg tgggcaccgg cgcaggcgcc gctggctgca caacggaagg 5940

tcgtctgctt cgaggcagcg cttggggtgg tggcaattca atattataat tggaatacaa 6000

atcgtaaaaa tctgctataa gcattgtaat ttcgctatcg tttaccgtgc cgatatttaa 6060

caaccgctca atgtaagcaa ttgtattgta aagagattgt ctcaagctcg ccgcacgccg 6120

ataacaagcc ttttcatttt tactacagca ttgtagtggc gagacacttc gctgtcgtcg 6180

acgtacatgt atgctttgtt gtcaaaaacg tcgttggcaa gctttaaaat atttaaaaga 6240

acatctctgt tcagcaccac tgtgttgtcg taaatgttgt ttttgataat ttgcgcttcc 6300

gcagtatcga cacgttcaaa aaattgatgc gcatcaattt tgttgttcct attattgaat 6360

aaataagatt gtacagattc atatctacga ttcgtcatgg ccaccacaaa tgctacgctg 6420

caaacgctgg tacaatttta cgaaaactgc aaaaacgtca aaactcggta taaaataatc 6480

aacgggcgct ttggcaaaat atctatttta tcgcacaagc ccactagcaa attgtatttg 6540

cagaaaacaa tttcggcgca caattttaac gctgacgaaa taaaagttca ccagttaatg 6600

agcgaccacc caaattttat aaaaatctat tttaatcacg gttccatcaa caaccaagtg 6660

atcgtgatgg actacattga ctgtcccgat ttatttgaaa cactacaaat taaaggcgag 6720

ctttcgtacc aacttgttag caatattatt agacagctgt gtgaagcgct caacgatttg 6780

cacaagcaca atttcataca caacgacata aaactcgaaa atgtcttata tttcgaagca 6840

cttgatcgcg tgtatgtttg cgattacgga ttgtgcaaac acgaaaactc acttagcgtg 6900

cacgacggca cgttggagta ttttagtccg gaaaaaattc gacacacaac tatgcacgtt 6960

tcgtttgact ggtacgcggc gtgttaacat acaagttgct aacgtaatca tggtcatagc 7020

tgtttcctgt gtgaaattgt tatccgctca caattccaca caacatacga gccggaagca 7080

taaagtgtaa agcctggggt gcctaatgag tgagctaact cacattaatt gcgttgcgct 7140

cactgcccgc tttccagtcg ggaaacctgt cgtgccagct gcattaatga atcggccaac 7200

gcgcggggag aggcggtttg cgtattgggc gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc 7260

tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt 7320

tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg 7380

ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg 7440

agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat 7500

accaggcgtt tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta 7560

ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct 7620

gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc 7680

ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa 7740

gacacgactt atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg 7800

taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaaggacag 7860

tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt 7920

gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta 7980

cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc 8040

agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca 8100

cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa 8160

cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat 8220

ttcgttcatc catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat aactacgata cgggagggct 8280

taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaccc acgctcaccg gctccagatt 8340

tatcagcaat aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat 8400

ccgcctccat ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta 8460

atagtttgcg caacgttgtt gccattgcta caggcatcgt ggtgtcacgc tcgtcgtttg 8520

gtatggcttc attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga tcccccatgt 8580

tgtgcaaaaa agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt tgtcagaagt aagttggccg 8640

cagtgttatc actcatggtt atggcagcac tgcataattc tcttactgtc atgccatccg 8700

taagatgctt ttctgtgact ggtgagtact caaccaagtc attctgagaa tagtgtatgc 8760

ggcgaccgag ttgctcttgc ccggcgtcaa tacgggataa taccgcgcca catagcagaa 8820

ctttaaaagt gctcatcatt ggaaaacgtt cttcggggcg aaaactctca aggatcttac 8880

cgctgttgag atccagttcg atgtaaccca ctcgtgcacc caactgatct tcagcatctt 8940

ttactttcac cagcgtttct gggtgagcaa aaacaggaag gcaaaatgcc gcaaaaaagg 9000

gaataagggc gacacggaaa tgttgaatac tcatactctt cctttttcaa tattattgaa 9060

gcatttatca gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt tgaatgtatt tagaaaaata 9120

aacaaatagg ggttccgcgc acatttcccc gaaaagtgcc acctgacgtc taagaaacca 9180

ttattatcat gacattaacc tataaaaata ggcgtatcac gaggcccttt cgtctcgcgc 9240

gtttcggtga tgacggtgaa aacctctgac acatgcagct cccggagacg gtcacagctt 9300

gtctgtaagc ggatgccggg agcagacaag cccgtcaggg cgcgtcagcg ggtgttggcg 9360

ggtgtcgggg ctggcttaac tatgcggcat cagagcagat tgtactgaga gtgcaccata 9420

tgcggtgtga aataccgcac agatgcgtaa ggagaaaata ccgcatcagg cgccattcgc 9480

cattcaggct gcgcaactgt tgggaagggc gatcggtgcg ggcctcttcg ctattacgcc 9540

agctggcgaa agggggatgt gctgcaaggc gattaagttg ggtaacgcca gggttttccc 9600

agtcacgacg ttgtaaaacg acggccagtg cc 9632

<210> 3

<211> 584

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CPV Souriou (serotype 2c)

<400> 3

Met Ser Asp Gly Ala Val Gln Pro Asp Gly Gly Gln Pro Ala Val Arg

1 5 10 15

Asn Glu Arg Ala Thr Gly Ser Gly Asn Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly

20 25 30

Gly Gly Ser Gly Gly Val Gly Ile Ser Thr Gly Thr Phe Asn Asn Gln

35 40 45

Thr Glu Phe Lys Phe Leu Glu Asn Gly Trp Val Glu Ile Thr Ala Asn

50 55 60

Ser Ser Arg Leu Val His Leu Asn Met Pro Glu Ser Glu Asn Tyr Arg

65 70 75 80

Arg Val Val Val Asn Asn Leu Asp Lys Thr Ala Val Asn Gly Asn Met

85 90 95

Ala Leu Asp Asp Thr His Ala Gln Ile Val Thr Pro Trp Ser Leu Val

100 105 110

Asp Ala Asn Ala Trp Gly Val Trp Phe Asn Pro Gly Asp Trp Gln Leu

115 120 125

Ile Val Asn Thr Met Ser Glu Leu His Leu Val Ser Phe Glu Gln Glu

130 135 140

Ile Phe Asn Val Val Leu Lys Thr Val Ser Glu Ser Ala Thr Gln Pro

145 150 155 160

Pro Thr Lys Val Tyr Asn Asn Asp Leu Thr Ala Ser Leu Met Val Ala

165 170 175

Leu Asp Ser Asn Asn Thr Met Pro Phe Thr Pro Ala Ala Met Arg Ser

180 185 190

Glu Thr Leu Gly Phe Tyr Pro Trp Lys Pro Thr Ile Pro Thr Pro Trp

195 200 205

Arg Tyr Tyr Phe Gln Trp Asp Arg Thr Leu Ile Pro Ser His Thr Gly

210 215 220

Thr Ser Gly Thr Pro Thr Asn Ile Tyr His Gly Thr Asp Pro Asp Asp

225 230 235 240

Val Gln Phe Tyr Thr Ile Glu Asn Ser Val Pro Val His Leu Leu Arg

245 250 255

Thr Gly Asp Glu Phe Ala Thr Gly Thr Phe Phe Phe Asp Cys Lys Pro

260 265 270

Cys Arg Leu Thr His Thr Trp Gln Thr Asn Arg Ala Leu Gly Leu Pro

275 280 285

Pro Phe Leu Asn Ser Leu Pro Gln Ala Glu Gly Gly Thr Asn Phe Gly

290 295 300

Tyr Ile Gly Val Gln Gln Asp Lys Arg Arg Gly Val Thr Gln Met Gly

305 310 315 320

Asn Thr Asn Tyr Ile Thr Glu Ala Thr Ile Met Arg Pro Ala Glu Val

325 330 335

Gly Tyr Ser Ala Pro Tyr Tyr Ser Phe Glu Ala Ser Thr Gln Gly Pro

340 345 350

Phe Lys Thr Pro Ile Ala Ala Gly Arg Gly Gly Ala Gln Thr Asp Glu

355 360 365

Asn Gln Ala Ala Asp Gly Asp Pro Arg Tyr Ala Phe Gly Arg Gln His

370 375 380

Gly Gln Lys Thr Thr Thr Thr Gly Glu Thr Pro Glu Arg Phe Thr Tyr

385 390 395 400

Ile Ala His Gln Asp Thr Gly Arg Tyr Pro Glu Gly Asp Trp Ile Gln

405 410 415

Asn Ile Asn Phe Asn Leu Pro Val Thr Glu Asp Asn Val Leu Leu Pro

420 425 430

Thr Asp Pro Ile Gly Gly Lys Thr Gly Ile Asn Tyr Thr Asn Ile Phe

435 440 445

Asn Thr Tyr Gly Pro Leu Thr Ala Leu Asn Asn Val Pro Pro Val Tyr

450 455 460

Pro Asn Gly Gln Ile Trp Asp Lys Glu Phe Asp Thr Asp Leu Lys Pro

465 470 475 480

Arg Leu His Val Asn Ala Pro Phe Val Cys Gln Asn Asn Cys Pro Gly

485 490 495

Gln Leu Phe Val Lys Val Ala Pro Asn Leu Thr Asn Glu Tyr Asp Pro

500 505 510

Asp Ala Ser Ala Asn Met Ser Arg Ile Val Thr Tyr Ser Asp Phe Trp

515 520 525

Trp Lys Gly Lys Leu Val Phe Lys Ala Lys Leu Arg Ala Ser His Thr

530 535 540

Trp Asn Pro Ile Gln Gln Met Ser Ile Asn Val Asp Asn Gln Phe Asn

545 550 555 560

Tyr Val Pro Ser Asn Ile Gly Gly Met Lys Ile Val Tyr Glu Lys Ser

565 570 575

Gln Leu Ala Pro Arg Lys Leu Tyr

580

<210> 4

<211> 584

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Non-Truncated CPV VP2 in pMEB072

<400> 4

Met Ser Asp Gly Ala Val Gln Pro Asp Gly Gly Gln Pro Ala Val Arg

1 5 10 15

Asn Glu Arg Ala Thr Gly Ser Gly Asn Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly

20 25 30

Gly Gly Ser Gly Gly Val Gly Ile Ser Thr Gly Thr Phe Asn Asn Gln

35 40 45

Thr Glu Phe Lys Phe Leu Glu Asn Gly Trp Val Glu Ile Thr Ala Asn

50 55 60

Ser Ser Arg Leu Val His Leu Asn Met Pro Glu Ser Glu Asn Tyr Arg

65 70 75 80

Arg Val Val Val Asn Asn Leu Asp Lys Thr Ala Val Asn Gly Asn Met

85 90 95

Ala Leu Asp Asp Thr His Ala Gln Ile Val Thr Pro Trp Ser Leu Val

100 105 110

Asp Ala Asn Ala Trp Gly Val Trp Phe Asn Pro Gly Asp Trp Gln Leu

115 120 125

Ile Val Asn Thr Met Ser Glu Leu His Leu Val Ser Phe Glu Gln Glu

130 135 140

Ile Phe Asn Val Val Leu Lys Thr Val Ser Glu Ser Ala Thr Gln Pro

145 150 155 160

Pro Thr Lys Val Tyr Asn Asn Asp Leu Thr Ala Ser Leu Met Val Ala

165 170 175

Leu Asp Ser Asn Asn Thr Met Pro Phe Thr Pro Ala Ala Met Arg Ser

180 185 190

Glu Thr Leu Gly Phe Tyr Pro Trp Lys Pro Thr Ile Pro Thr Pro Trp

195 200 205

Arg Tyr Tyr Phe Gln Trp Asp Arg Thr Leu Ile Pro Ser His Thr Gly

210 215 220

Thr Ser Gly Thr Pro Thr Asn Ile Tyr His Gly Thr Asp Pro Asp Asp

225 230 235 240

Val Gln Phe Tyr Thr Ile Glu Asn Ser Val Pro Val His Leu Leu Arg

245 250 255

Thr Gly Asp Glu Phe Ala Thr Gly Thr Phe Phe Phe Asp Cys Lys Pro

260 265 270

Cys Arg Leu Thr His Thr Trp Gln Thr Asn Arg Ala Leu Gly Leu Pro

275 280 285

Pro Phe Leu Asn Ser Leu Pro Gln Ala Glu Gly Gly Thr Asn Phe Gly

290 295 300

Tyr Ile Gly Val Gln Gln Asp Lys Arg Arg Gly Val Thr Gln Met Gly

305 310 315 320

Asn Thr Asn Tyr Ile Thr Glu Ala Thr Ile Met Arg Pro Ala Glu Val

325 330 335

Gly Tyr Ser Ala Pro Tyr Tyr Ser Phe Glu Ala Ser Thr Gln Gly Pro

340 345 350

Phe Lys Thr Pro Ile Ala Ala Gly Arg Gly Gly Ala Gln Thr Asp Glu

355 360 365

Asn Gln Ala Ala Asp Gly Asp Pro Arg Tyr Ala Phe Gly Arg Gln His

370 375 380

Gly Gln Lys Thr Thr Thr Thr Gly Glu Thr Pro Glu Arg Phe Thr Tyr

385 390 395 400

Ile Ala His Gln Asp Thr Gly Arg Tyr Pro Glu Gly Asp Trp Ile Gln

405 410 415

Asn Ile Asn Phe Asn Leu Pro Val Thr Glu Asp Asn Val Leu Leu Pro

420 425 430

Thr Asp Pro Ile Gly Gly Lys Thr Gly Ile Asn Tyr Thr Asn Ile Phe

435 440 445

Asn Thr Tyr Gly Pro Leu Thr Ala Leu Asn Asn Val Pro Pro Val Tyr

450 455 460

Pro Asn Gly Gln Ile Trp Asp Lys Glu Phe Asp Thr Asp Leu Lys Pro

465 470 475 480

Arg Leu His Val Asn Ala Pro Phe Val Cys Gln Asn Asn Cys Pro Gly

485 490 495

Gln Leu Phe Val Lys Val Ala Pro Asn Leu Thr Asn Glu Tyr Asp Pro

500 505 510

Asp Ala Ser Ala Asn Met Ser Arg Ile Val Thr Tyr Ser Asp Phe Trp

515 520 525

Trp Lys Gly Lys Leu Val Phe Lys Ala Lys Leu Arg Ala Ser His Thr

530 535 540

Trp Asn Pro Ile Gln Gln Met Ser Ile Asn Val Asp Asn Gln Phe Asn

545 550 555 560

Tyr Val Pro Ser Asn Ile Gly Gly Met Lys Ile Val Tyr Glu Lys Ser

565 570 575

Gln Leu Ala Pro Arg Lys Leu Tyr

580

<210> 5

<211> 1752

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pMEB072 Codon-optimized nucleic acid encoding CPV VP2 (SEQ ID

NO:4)

<400> 5

atgtccgacg gtgctgtgca gcccgacggt ggccagcccg ctgtgcgtaa cgagcgtgct 60

accggttccg gtaacggttc aggcggaggt ggaggtggtg gttccggcgg tgtgggcatc 120

tccaccggca ccttcaacaa ccagaccgag ttcaagttcc tcgagaacgg ttgggtggag 180

atcaccgcta actcctcccg tctggtgcac ctgaacatgc ccgagtccga gaactaccgt 240

cgtgtggtgg tgaacaacct ggacaagacc gctgtgaacg gtaacatggc tctggacgac 300

acccacgctc agatcgtgac cccctggtcc ctggtggacg ctaacgcttg gggcgtgtgg 360

ttcaaccccg gtgactggca gctgatcgtg aacaccatgt ccgagctgca cctggtgtcc 420

ttcgagcaag agatcttcaa cgtcgtcctc aagaccgtgt ccgagtccgc tacccagccc 480

cccaccaagg tgtacaacaa cgacctgacc gcttccctga tggtcgctct ggactccaac 540

aacaccatgc ccttcacccc cgctgctatg cgttccgaga ccctgggctt ctacccctgg 600

aagcccacca tccccacccc ctggcgttac tacttccagt gggaccgtac cctgatcccc 660

tcccacaccg gtacttccgg cacccccacc aacatctacc acggcaccga ccccgacgac 720

gtgcagttct acaccatcga gaactccgtg cccgtgcacc tgctgcgtac cggtgacgag 780

ttcgctaccg gaaccttctt cttcgactgc aagccctgcc gtctgaccca cacctggcag 840

accaaccgtg ctctgggtct gcctcccttc ctgaactccc tgccccaggc tgagggtggc 900

accaacttcg gttacatcgg tgtgcagcag gacaagcgtc gtggtgtgac ccagatgggt 960

aacaccaact acatcaccga ggctaccatc atgcgtcccg ctgaggtcgg ctactccgct 1020

ccctactact ccttcgaggc ttccacccag ggccccttca agacccccat cgctgctggt 1080

cgtggtggtg ctcagaccga cgagaaccag gctgctgacg gtgacccccg ttacgctttc 1140

ggtcgtcagc acggccaaaa gaccaccacc accggcgaga cccccgagcg tttcacctac 1200

atcgctcacc aggacaccgg tcgttacccc gagggcgact ggattcagaa catcaacttc 1260

aacctgcccg tgaccgagga caacgtgctg ctgcccaccg accccatcgg tggcaagacc 1320

ggtatcaact acactaacat cttcaacacc tacggtcctc tgaccgctct gaacaacgtg 1380

ccccccgtgt accccaacgg ccagatctgg gacaaggagt tcgacaccga cctgaagccc 1440

cgtctgcacg tgaacgctcc cttcgtgtgc cagaacaact gccctggcca gctgttcgtc 1500

aaggtggccc ccaacctgac caacgagtac gaccctgacg cttccgctaa catgtcccgt 1560

atcgtgacct actccgactt ctggtggaag ggcaagctgg tgttcaaggc caagctgcgt 1620

gcttctcaca cctggaaccc catccagcag atgtccatca acgtggacaa ccagttcaac 1680

tacgtgccct ccaacatcgg tggaatgaag atcgtgtacg agaagtccca gctggctccc 1740

cgtaagctgt ac 1752

<210> 6

<211> 578

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Truncated CPV VP2 in pMEB073

<400> 6

Met Leu Lys Gly Gly Gln Pro Ala Val Arg Asn Glu Arg Ala Thr Gly

1 5 10 15

Ser Gly Asn Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Val

20 25 30

Gly Ile Ser Thr Gly Thr Phe Asn Asn Gln Thr Glu Phe Lys Phe Leu

35 40 45

Glu Asn Gly Trp Val Glu Ile Thr Ala Asn Ser Ser Arg Leu Val His

50 55 60

Leu Asn Met Pro Glu Ser Glu Asn Tyr Arg Arg Val Val Val Asn Asn

65 70 75 80

Leu Asp Lys Thr Ala Val Asn Gly Asn Met Ala Leu Asp Asp Thr His

85 90 95

Ala Gln Ile Val Thr Pro Trp Ser Leu Val Asp Ala Asn Ala Trp Gly

100 105 110

Val Trp Phe Asn Pro Gly Asp Trp Gln Leu Ile Val Asn Thr Met Ser

115 120 125

Glu Leu His Leu Val Ser Phe Glu Gln Glu Ile Phe Asn Val Val Leu

130 135 140

Lys Thr Val Ser Glu Ser Ala Thr Gln Pro Pro Thr Lys Val Tyr Asn

145 150 155 160

Asn Asp Leu Thr Ala Ser Leu Met Val Ala Leu Asp Ser Asn Asn Thr

165 170 175

Met Pro Phe Thr Pro Ala Ala Met Arg Ser Glu Thr Leu Gly Phe Tyr

180 185 190

Pro Trp Lys Pro Thr Ile Pro Thr Pro Trp Arg Tyr Tyr Phe Gln Trp

195 200 205

Asp Arg Thr Leu Ile Pro Ser His Thr Gly Thr Ser Gly Thr Pro Thr

210 215 220

Asn Ile Tyr His Gly Thr Asp Pro Asp Asp Val Gln Phe Tyr Thr Ile

225 230 235 240

Glu Asn Ser Val Pro Val His Leu Leu Arg Thr Gly Asp Glu Phe Ala

245 250 255

Thr Gly Thr Phe Phe Phe Asp Cys Lys Pro Cys Arg Leu Thr His Thr

260 265 270

Trp Gln Thr Asn Arg Ala Leu Gly Leu Pro Pro Phe Leu Asn Ser Leu

275 280 285

Pro Gln Ala Glu Gly Gly Thr Asn Phe Gly Tyr Ile Gly Val Gln Gln

290 295 300

Asp Lys Arg Arg Gly Val Thr Gln Met Gly Asn Thr Asn Tyr Ile Thr

305 310 315 320

Glu Ala Thr Ile Met Arg Pro Ala Glu Val Gly Tyr Ser Ala Pro Tyr

325 330 335

Tyr Ser Phe Glu Ala Ser Thr Gln Gly Pro Phe Lys Thr Pro Ile Ala

340 345 350

Ala Gly Arg Gly Gly Ala Gln Thr Asp Glu Asn Gln Ala Ala Asp Gly

355 360 365

Asp Pro Arg Tyr Ala Phe Gly Arg Gln His Gly Gln Lys Thr Thr Thr

370 375 380

Thr Gly Glu Thr Pro Glu Arg Phe Thr Tyr Ile Ala His Gln Asp Thr

385 390 395 400

Gly Arg Tyr Pro Glu Gly Asp Trp Ile Gln Asn Ile Asn Phe Asn Leu

405 410 415

Pro Val Thr Glu Asp Asn Val Leu Leu Pro Thr Asp Pro Ile Gly Gly

420 425 430

Lys Thr Gly Ile Asn Tyr Thr Asn Ile Phe Asn Thr Tyr Gly Pro Leu

435 440 445

Thr Ala Leu Asn Asn Val Pro Pro Val Tyr Pro Asn Gly Gln Ile Trp

450 455 460

Asp Lys Glu Phe Asp Thr Asp Leu Lys Pro Arg Leu His Val Asn Ala

465 470 475 480

Pro Phe Val Cys Gln Asn Asn Cys Pro Gly Gln Leu Phe Val Lys Val

485 490 495

Ala Pro Asn Leu Thr Asn Glu Tyr Asp Pro Asp Ala Ser Ala Asn Met

500 505 510

Ser Arg Ile Val Thr Tyr Ser Asp Phe Trp Trp Lys Gly Lys Leu Val

515 520 525

Phe Lys Ala Lys Leu Arg Ala Ser His Thr Trp Asn Pro Ile Gln Gln

530 535 540

Met Ser Ile Asn Val Asp Asn Gln Phe Asn Tyr Val Pro Ser Asn Ile

545 550 555 560

Gly Gly Met Lys Ile Val Tyr Glu Lys Ser Gln Leu Ala Pro Arg Lys

565 570 575

Leu Tyr

<210> 7

<211> 1536

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pMEB073 codon-optimized nucleic acid sequence encoding CPV VP2

(SEQ ID NO:6)

<400> 7

atgcccgaga gcgagaacta ccggagagtg gtggtgaaca acctggacaa gaccgccgtg 60

aacggcaata tggccctgga tgacacccac gcccagatcg tgaccccctg gagcctggtg 120

gacgccaacg cctggggagt gtggttcaac cctggcgact ggcagctgat cgtgaacacc 180

atgagcgagc tgcacctggt gtccttcgag caggagattt tcaacgtggt gctgaaaacc 240

gtgtccgaga gcgccaccca gccccccacc aaagtgtaca acaacgacct gaccgcctcc 300

ctgatggtgg ccctggacag caacaacacc atgcccttca cccctgccgc catgagaagc 360

gagaccctgg gcttctaccc ttggaagccc accatcccca ccccttggcg gtactacttc 420

cagtgggaca ggaccctgat ccccagccac accggcacca gcggcacccc taccaatatc 480

taccacggca ccgaccctga tgacgtgcag ttctacacca tcgagaacag cgtgcctgtg 540

cacctgctga gaaccggcga cgagttcgcc accggcacat tcttcttcga ctgcaagccc 600

tgcagactga cccacacctg gcagaccaac agagccctgg gcctgcctcc tttcctgaac 660

agcctgcccc aggccgaggg cggcaccaac ttcggctaca tcggcgtgca gcaggacaag 720

agaagaggcg tgacccagat gggcaacacc aactacatca ccgaggccac catcatgaga 780

cccgccgaag tgggctacag cgccccctac tacagcttcg aggccagcac ccagggcccc 840

ttcaagaccc ccatcgccgc tggcagaggc ggagcccaga ccgacgagaa ccaggccgcc 900

gacggcgacc ccagatacgc cttcggcaga cagcacggcc agaaaaccac caccaccggc 960

gagacccccg agagattcac ctacatcgcc caccaggaca ccggcagata ccccgagggc 1020

gactggattc agaacatcaa cttcaacctg cccgtgaccg aggataatgt gctgctgccc 1080

accgacccca tcggcggcaa gaccggcatc aactacacca acatcttcaa cacctacggc 1140

cccctgaccg ccctgaataa cgtgcccccc gtgtacccca acggccagat ttgggacaag 1200

gagttcgaca ccgacctgaa gcctaggctg cacgtgaatg cccccttcgt gtgtcagaac 1260

aactgccctg gccagctgtt tgtgaaagtg gcccccaacc tgaccaacga gtacgatcct 1320

gacgccagcg ccaacatgag ccggatcgtg acctacagcg acttctggtg gaagggcaag 1380

ctggtgttca aggccaagct gagagccagc cacacatgga accccatcca gcagatgagc 1440

atcaacgtgg acaaccagtt caactacgtg cccagcaata tcggcggcat gaagatcgtg 1500

tacgagaaga gccagctggc ccccagaaag ctgtac 1536

<210> 8

<211> 584

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> GenBank: AHW47988.1

<400> 8

Met Ser Asp Gly Ala Val Gln Pro Asp Gly Gly Gln Pro Ala Val Arg

1 5 10 15

Asn Glu Arg Ala Thr Gly Ser Gly Asn Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly

20 25 30

Gly Gly Ser Gly Gly Val Gly Ile Ser Thr Gly Thr Phe Asn Asn Gln

35 40 45

Thr Glu Phe Lys Phe Leu Glu Asn Gly Trp Val Glu Ile Thr Ala Asn

50 55 60

Ser Ser Arg Leu Val His Leu Asn Met Pro Glu Ser Glu Asn Tyr Lys

65 70 75 80

Arg Val Val Val Asn Asn Met Asp Lys Thr Ala Val Lys Gly Asn Met

85 90 95

Ala Leu Asp Asp Thr His Val Gln Ile Val Thr Pro Trp Ser Leu Val

100 105 110

Asp Ala Asn Ala Trp Gly Val Trp Phe Asn Pro Gly Asp Trp Gln Leu

115 120 125

Ile Val Asn Thr Met Ser Glu Leu His Leu Val Ser Phe Glu Arg Glu

130 135 140

Ile Phe Asn Val Val Leu Lys Thr Val Ser Glu Ser Ala Thr Gln Pro

145 150 155 160

Pro Thr Lys Val Tyr Asn Asn Asp Leu Thr Ala Ser Leu Met Val Ala

165 170 175

Leu Asp Ser Asn Asn Thr Met Pro Phe Thr Pro Ala Ala Met Arg Ser

180 185 190

Glu Thr Leu Gly Phe Tyr Pro Trp Lys Pro Thr Ile Pro Thr Pro Trp

195 200 205

Arg Tyr Tyr Phe Gln Trp Asp Arg Thr Leu Ile Pro Ser His Thr Gly

210 215 220

Thr Ser Gly Thr Pro Thr Asn Val Tyr His Gly Ser Asp Pro Asp Asp

225 230 235 240

Val Gln Phe Tyr Thr Ile Glu Asn Ser Val Pro Val His Leu Leu Arg

245 250 255

Thr Gly Asp Glu Phe Ala Thr Gly Thr Phe Phe Phe Asp Cys Lys Pro

260 265 270

Cys Arg Leu Thr His Thr Trp Gln Thr Asn Arg Ala Leu Gly Leu Pro

275 280 285

Pro Phe Leu Asn Ser Leu Pro Gln Ser Glu Gly Ile Thr Asn Phe Gly

290 295 300

Asp Ile Gly Val Gln Gln Asp Lys Arg Arg Gly Val Thr Gln Met Gly

305 310 315 320

Asn Thr Asp Tyr Ile Thr Glu Ala Thr Ile Met Arg Pro Ala Glu Val

325 330 335

Gly Tyr Ser Ala Pro Tyr Tyr Ser Phe Glu Ala Ser Thr Gln Gly Pro

340 345 350

Phe Lys Thr Pro Ile Ala Ala Gly Arg Gly Gly Ala Gln Thr Asp Glu

355 360 365

Asn Gln Ala Ala Asp Gly Asp Pro Lys Tyr Ala Phe Gly Arg Gln His

370 375 380

Gly Gln Lys Thr Thr Thr Thr Gly Glu Thr Pro Glu Arg Phe Thr Tyr

385 390 395 400

Ile Ala His Gln Asp Thr Gly Arg Tyr Pro Glu Gly Asp Trp Ile Gln

405 410 415

Asn Ile Asn Phe Asn Leu Pro Val Thr Lys Asp Asn Val Leu Leu Pro

420 425 430

Thr Asp Pro Ile Gly Gly Lys Thr Gly Ile Asn Tyr Thr Asn Ile Phe

435 440 445

Asn Thr Tyr Gly Pro Leu Thr Ala Leu Asn Asn Val Pro Pro Val Tyr

450 455 460

Pro Asn Gly Gln Ile Trp Asp Lys Glu Phe Asp Thr Asp Leu Lys Pro

465 470 475 480

Arg Leu His Val Asn Ala Pro Phe Val Cys Gln Asn Asn Cys Pro Gly

485 490 495

Gln Leu Phe Val Lys Val Ala Pro Asn Leu Thr Asn Glu Tyr Asp Pro

500 505 510

Asp Ala Ser Ala Asn Met Ser Arg Ile Val Thr Tyr Ser Asp Phe Trp

515 520 525

Trp Lys Gly Lys Leu Val Phe Lys Ala Lys Leu Arg Ala Ser His Thr

530 535 540

Trp Asn Pro Ile Gln Gln Met Ser Ile Asn Val Asp Asn Gln Phe Asn

545 550 555 560

Tyr Val Pro Asn Asn Ile Gly Ala Met Lys Ile Val Tyr Glu Lys Ser

565 570 575

Gln Leu Ala Pro Arg Lys Leu Tyr

580

<210> 9

<211> 584

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> GenBank: AHW47989.1

<400> 9

Met Ser Asp Gly Ala Val Gln Pro Asp Gly Gly Gln Pro Ala Val Arg

1 5 10 15

Asn Glu Arg Ala Thr Gly Ser Gly Asn Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly

20 25 30

Gly Gly Ser Gly Gly Val Gly Ile Ser Thr Gly Thr Phe Asn Asn Gln

35 40 45

Thr Glu Phe Lys Phe Leu Glu Asn Gly Trp Val Glu Ile Thr Ala Asn

50 55 60

Ser Ser Arg Leu Val His Leu Asn Met Pro Glu Ser Glu Asn Tyr Lys

65 70 75 80

Arg Val Val Val Asn Asn Met Asp Lys Thr Ala Val Lys Gly Asn Met

85 90 95

Ala Leu Asp Asp Thr His Val Gln Ile Val Thr Pro Trp Ser Leu Val

100 105 110

Asp Ala Asn Ala Trp Gly Val Trp Phe Asn Pro Gly Asp Trp Gln Leu

115 120 125

Ile Val Asn Thr Met Ser Glu Leu His Leu Val Ser Phe Glu Gln Glu

130 135 140

Ile Phe Asn Val Val Leu Lys Thr Val Ser Glu Ser Ala Thr Gln Pro

145 150 155 160

Pro Thr Lys Val Tyr Asn Asn Asp Leu Thr Ala Ser Leu Met Val Ala

165 170 175

Leu Asp Ser Asn Asn Thr Met Pro Phe Thr Pro Ala Ala Met Arg Ser

180 185 190

Glu Thr Leu Gly Phe Tyr Pro Trp Lys Pro Thr Ile Pro Thr Pro Trp

195 200 205

Arg Tyr Tyr Phe Gln Trp Asp Arg Thr Leu Ile Pro Ser His Thr Gly

210 215 220

Thr Ser Gly Thr Pro Thr Asn Val Tyr His Gly Ser Asp Pro Asp Asp

225 230 235 240

Val Gln Phe Tyr Thr Ile Glu Asn Ser Val Pro Val His Leu Leu Arg

245 250 255

Thr Gly Asp Glu Phe Ala Thr Gly Thr Phe Phe Phe Asp Cys Lys Pro

260 265 270

Cys Arg Leu Thr His Thr Trp Gln Thr Asn Arg Ala Leu Gly Leu Pro

275 280 285

Pro Phe Leu Asn Ser Leu Pro Gln Ser Glu Gly Ile Thr Asn Phe Gly

290 295 300

Asp Ile Gly Val Gln Gln Asp Lys Arg Arg Gly Val Thr Gln Met Gly

305 310 315 320

Asn Thr Asp Tyr Ile Thr Glu Ala Thr Ile Met Arg Pro Ala Glu Val

325 330 335

Gly Tyr Ser Ala Pro Tyr Tyr Ser Phe Glu Ala Ser Thr Gln Gly Pro

340 345 350

Phe Lys Thr Pro Ile Ala Ala Gly Arg Gly Gly Ala Gln Thr Asp Glu

355 360 365

Asn Gln Ala Ala Asp Gly Asp Pro Lys Tyr Ala Phe Gly Arg Gln His

370 375 380

Gly Gln Lys Thr Thr Thr Thr Gly Glu Thr Pro Glu Arg Phe Thr Tyr

385 390 395 400

Ile Ser His Gln Asp Thr Gly Arg Tyr Pro Glu Gly Asp Trp Ile Gln

405 410 415

Asn Ile Asn Phe Asn Leu Pro Val Thr Lys Asp Asn Val Leu Leu Pro

420 425 430

Thr Asp Pro Ile Gly Gly Lys Thr Gly Ile Asn Tyr Thr Asn Ile Phe

435 440 445

Asn Thr Tyr Gly Pro Leu Thr Ala Leu Asn Asn Val Pro Pro Val Tyr

450 455 460

Pro Asn Gly Gln Ile Trp Asp Lys Glu Phe Asp Thr Asp Leu Lys Pro

465 470 475 480

Arg Leu His Val Asn Ala Pro Phe Val Cys Gln Asn Asn Cys Pro Gly

485 490 495

Gln Leu Phe Val Lys Val Ala Pro Asn Leu Thr Asn Glu Tyr Asp Pro

500 505 510

Asp Ala Ser Ala Asn Met Ser Arg Ile Val Thr Tyr Ser Asp Phe Trp

515 520 525

Trp Lys Gly Lys Leu Val Phe Lys Ala Lys Leu Arg Ala Ser His Thr

530 535 540

Trp Asn Pro Ile Gln Gln Met Ser Ile Asn Val Asp Asn Gln Phe Asn

545 550 555 560

Tyr Val Pro Asn Asn Ile Gly Ala Met Lys Ile Val Tyr Glu Lys Ser

565 570 575

Gln Leu Ala Pro Arg Lys Leu Tyr

580

<210> 10

<211> 584

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> GenBank: ADA61118.1

<400> 10

Met Ser Asp Gly Ala Val Gln Pro Asp Gly Gly Gln Pro Ala Val Arg

1 5 10 15

Asn Glu Arg Ala Thr Gly Ser Gly Asn Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly

20 25 30

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ile Ser Thr Gly Ala Phe Asn Asn Gln

35 40 45

Thr Glu Phe Lys Phe Leu Glu Asn Gly Trp Val Glu Ile Thr Ala Asn

50 55 60

Ser Ser Arg Leu Val His Leu Asn Met Pro Glu Ser Glu Asn Tyr Arg

65 70 75 80

Arg Val Val Val Asn Asn Met Asp Lys Thr Ala Val Asn Gly Asn Met

85 90 95

Ala Leu Asp Asp Ile His Ala Gln Ile Val Thr Pro Trp Ser Leu Val

100 105 110

Asp Ala Asn Ala Trp Gly Val Trp Phe Asn Pro Gly Asp Trp Gln Leu

115 120 125

Ile Val Asn Thr Met Ser Glu Leu His Leu Val Ser Phe Glu Gln Glu

130 135 140

Ile Phe Asn Val Val Leu Lys Thr Val Ser Glu Ser Ala Thr Gln Pro

145 150 155 160

Pro Thr Lys Val Tyr Asn Asn Asp Leu Thr Ala Ser Leu Met Val Ala

165 170 175

Leu Asp Ser Asn Asn Thr Met Pro Phe Thr Pro Ala Ala Met Arg Ser

180 185 190

Glu Thr Leu Gly Phe Tyr Pro Trp Lys Pro Thr Ile Pro Thr Pro Trp

195 200 205

Arg Tyr His Phe Gln Trp Asp Arg Thr Leu Ile Pro Ser His Thr Gly

210 215 220

Thr Ser Gly Thr Pro Thr Asn Ile Tyr His Gly Thr Asp Pro Asp Asp

225 230 235 240

Val Gln Phe Tyr Thr Ile Glu Asn Ser Val Pro Val His Leu Leu Arg

245 250 255

Thr Gly Asp Glu Phe Ala Thr Gly Thr Phe Phe Phe Asp Cys Thr Pro

260 265 270

Cys Arg Leu Thr His Thr Trp Gln Thr Asn Arg Ala Leu Gly Leu Pro

275 280 285

Pro Phe Leu Asn Ser Leu Pro Gln Ser Glu Gly Ala Thr Asn Phe Gly

290 295 300

Asp Ile Gly Val Gln Gln Asp Lys Arg Arg Gly Val Thr Gln Met Gly

305 310 315 320

Asn Thr Asn Tyr Ile Thr Glu Ala Thr Ile Met Arg Pro Ala Glu Val

325 330 335

Gly Tyr Ser Ala Pro Tyr Tyr Ser Phe Glu Ala Ser Thr Gln Gly Pro

340 345 350

Phe Lys Thr Pro Ile Ala Ala Gly Arg Gly Gly Ala Gln Thr Asp Glu

355 360 365

Asn Gln Ala Ala Asp Gly Glu Pro Arg Tyr Ala Phe Gly Arg Gln His

370 375 380

Gly Gln Lys Thr Thr Thr Thr Gly Glu Thr Pro Glu Arg Phe Thr Tyr

385 390 395 400

Ile Ala His Gln Asp Thr Gly Arg Tyr Pro Glu Gly Asp Trp Ile Gln

405 410 415

Asn Ile Asn Phe Asn Leu Pro Val Thr Asn Asp Asn Val Leu Leu Pro

420 425 430

Thr Asp Pro Ile Gly Gly Lys Thr Gly Ile Asn Tyr Thr Asn Ile Phe

435 440 445

Asn Thr Tyr Gly Pro Leu Thr Ala Leu Asn Asn Val Pro Pro Val Tyr

450 455 460

Pro Asn Gly Gln Ile Trp Asp Lys Glu Phe Asp Thr Asp Leu Lys Pro

465 470 475 480

Arg Leu His Val Asn Ala Pro Phe Val Cys Gln Asn Asn Cys Pro Gly

485 490 495

Gln Leu Phe Val Lys Val Ala Pro Asn Leu Thr Asn Glu Tyr Asp Pro

500 505 510

Asp Ala Ser Ala Asn Met Ser Arg Ile Val Thr Tyr Ser Asp Phe Trp

515 520 525

Trp Lys Gly Lys Leu Val Phe Lys Ala Lys Leu Arg Ala Ser His Thr

530 535 540

Trp Asn Pro Ile Gln Gln Met Ser Ile Asn Val Asp Asn Gln Phe Asn

545 550 555 560

Tyr Val Pro Ser Asn Ile Gly Gly Met Lys Ile Val Phe Glu Lys Ser

565 570 575

Gln Leu Ala Pro Arg Lys Leu Tyr

580

<210> 11

<211> 11387

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pMEB072

<400> 11

aagctttact cgtaaagcga gttgaaggat catatttagt tgcgtttatg agataagatt 60

gaaagcacgt gtaaaatgtt tcccgcgcgt tggcacaact atttacaatg cggccaagtt 120

ataaaagatt ctaatctgat atgttttaaa acacctttgc ggcccgagtt gtttgcgtac 180

gtgactagcg aagaagatgt gtggaccgca gaacagatag taaaacaaaa ccctagtatt 240

ggagcaataa tcgatttaac caacacgtct aaatattatg atggtgtgca ttttttgcgg 300

gcgggcctgt tatacaaaaa aattcaagta cctggccaga ctttgccgcc tgaaagcata 360

gttcaagaat ttattgacac ggtaaaagaa tttacagaaa agtgtcccgg catgttggtg 420

ggcgtgcact gcacacacgg tattaatcgc accggttaca tggtgtgcag atatttaatg 480

cacaccctgg gtattgcgcc gcaggaagcc atagatagat tcgaaaaagc cagaggtcac 540

aaaattgaaa gacaaaatta cgttcaagat ttattaattt aattaatatt atttgcattc 600

tttaacaaat actttatcct attttcaaat tgttgcgctt cttccagcga accaaaacta 660

tgcttcgctt gctccgttta gcttgtagcc gatcagtggc gttgttccaa tcgacggtag 720

gattaggccg gatattctcc accacaatgt tggcaacgtt gatgttacgt ttatgctttt 780

ggttttccac gtacgtcttt tggccggtaa tagccgtaaa cgtagtgccg tcgcgcgtca 840

cgcacaacac cggatgtttg cgcttgtccg cggggtattg aaccgcgcga tccgacaaat 900

ccaccacttt ggcaactaaa tcggtgacct gcgcgtcttt tttctgcatt atttcgtctt 960

tcttttgcat ggtttcctgg aagccggtgt acatgcggtt tagatcagtc atgacgcgcg 1020

tgacctgcaa atctttggcc tcgatctgct tgtccttgat ggcaacgatg cgttcaataa 1080

actcttgttt tttaacaagt tcctcggttt tttgcgccac caccgcttgc agcgcgtttg 1140

tgtgctcggt gaatgtcgca atcagcttag tcaccaactg tttgctctcc tcctcccgtt 1200

gtttgatcgc gggatcgtac ttgccggtgc agagcacttg aggaattact tcttctaaaa 1260

gccattcttg taattctatg gcgtaaggca atttggactt cataatcagc tgaatcacgc 1320

cggatttagt aatgagcact gtatgcggct gcaaatacag cgggtcgccc cttttcacga 1380

cgctgttaga ggtagggccc ccattttgga tggtctgctc aaataacgat ttgtatttat 1440

tgtctacatg aacacgtata gctttatcac aaactgtata ttttaaactg ttagcgacgt 1500

ccttggccac gaaccggacc tgttggtcgc gctctagcac gtaccgcagg ttgaacgtat 1560

cttctccaaa tttaaattct ccaattttaa cgcgagccat tttgatacac gtgtgtcgat 1620

tttgcaacaa ctattgtttt ttaacgcaaa ctaaacttat tgtggtaagc aataattaaa 1680

tatgggggaa catgcgccgc tacaacactc gtcgttatga acgcagacgg cgccggtctc 1740

ggcgcaagcg gctaaaacgt gttgcgcgtt caacgcggca aacatcgcaa aagccaatag 1800

tacagttttg atttgcatat taacggcgat tttttaaatt atcttattta ataaatagtt 1860

atgacgccta caactccccg cccgcgttga ctcgctgcac ctcgagcagt tcgttgacgc 1920

cttcctccgt gtggccgaac acgtcgagcg ggtggtcgat gaccagcggc gtgccgcacg 1980

cgacgcacaa gtatctgtac accgaatgat cgtcgggcga aggcacgtcg gcctccaagt 2040

ggcaatattg gcaaattcga aaatatatac agttgggttg tttgcgcata tctatcgtgg 2100

cgttgggcat gtacgtccga acgttgattt gcatgcaagc cgaaattaaa tcattgcgat 2160

tagtgcgatt aaaacgttgt acatcctcgc ttttaatcat gccgtcgatt aaatcgcgca 2220

atcgagtcaa gtgatcaaag tgtggaataa tgttttcttt gtattcccga gtcaagcgca 2280

gcgcgtattt taacaaacta gccatcttgt aagttagttt catttaatgc aactttatcc 2340

aataatatat tatgtatcgc acgtcaagaa ttaacaatgc gcccgttgtc gcatctcaac 2400

acgactatga tagagatcaa ataaagcgcg aattaaatag cttgcgacgc aacgtgcacg 2460

atctgtgcac gcgttccggc acgagctttg attgtaataa gtttttacga agcgatgaca 2520

tgacccccgt agtgacaacg atcacgccca aaagaactgc cgactacaaa attaccgagt 2580

atgtcggtga cgttaaaact attaagccat ccaatcgacc gttagtcgaa tcaggaccgc 2640

tggtgcgaga agccgcgaag tatggcgaat gcatcgtata acgtgtggag tccgctcatt 2700

agagcgtcat gtttagacaa gaaagctaca tatttaattg atcccgatga ttttattgat 2760

aaattgaccc taactccata cacggtattc tacaatggcg gggttttggt caaaatttcc 2820

ggactgcgat tgtacatgct gttaacggct ccgcccacta ttaatgaaat taaaaattcc 2880

aattttaaaa aacgcagcaa gagaaacatt tgtatgaaag aatgcgtaga aggaaagaaa 2940

aatgtcgtcg acatgctgaa caacaagatt aatatgcctc cgtgtataaa aaaaatattg 3000

aacgatttga aagaaaacaa tgtaccgcgc ggcggtatgt acaggaagag gtttatacta 3060

aactgttaca ttgcaaacgt ggtttcgtgt gccaagtgtg aaaaccgatg tttaatcaag 3120

gctctgacgc atttctacaa ccacgactcc aagtgtgtgg gtgaagtcat gcatctttta 3180

atcaaatccc aagatgtgta taaaccacca aactgccaaa aaatgaaaac tgtcgacaag 3240

ctctgtccgt ttgctggcaa ctgcaagggt ctcaatccta tttgtaatta ttgaataata 3300

aaacaattat aaatgctaaa tttgtttttt attaacgata caaaccaaac gcaacaagaa 3360

catttgtagt attatctata attgaaaacg cgtagttata atcgctgagg taatatttaa 3420

aatcattttc aaatgattca cagttaattt gcgacaatat aattttattt tcacataaac 3480

tagacgcctt gtcgtcttct tcttcgtatt ccttctcttt ttcatttttc tcctcataaa 3540

aattaacata gttattatcg tatccatata tgtatctatc gtatagagta aattttttgt 3600

tgtcataaat atatatgtct tttttaatgg ggtgtatagt accgctgcgc atagtttttc 3660

tgtaatttac aacagtgcta ttttctggta gttcttcgga gtgtgttgct ttaattatta 3720

aatttatata atcaatgaat ttgggatcgt cggttttgta caatatgttg ccggcatagt 3780

acgcagcttc ttctagttca attacaccat tttttagcag caccggatta acataacttt 3840

ccaaaatgtt gtacgaaccg ttaaacaaaa acagttcacc tcccttttct atactattgt 3900

ctgcgagcag ttgtttgttg ttaaaaataa cagccattgt aatgagacgc acaaactaat 3960

atcacaaact ggaaatgtct atcaatatat agttgctgat atcatggaga taattaaaat 4020

gataaccatc tcgcaaataa ataagtattt tactgttttc gtaacagttt tgtaataaaa 4080

aaacctataa atattccgga ttattcatac cgtcccacca tcgggcgcgg atccgccacc 4140

atgtccgacg gtgctgtgca gcccgacggt ggccagcccg ctgtgcgtaa cgagcgtgct 4200

accggttccg gtaacggttc aggcggaggt ggaggtggtg gttccggcgg tgtgggcatc 4260

tccaccggca ccttcaacaa ccagaccgag ttcaagttcc tcgagaacgg ttgggtggag 4320

atcaccgcta actcctcccg tctggtgcac ctgaacatgc ccgagtccga gaactaccgt 4380

cgtgtggtgg tgaacaacct ggacaagacc gctgtgaacg gtaacatggc tctggacgac 4440

acccacgctc agatcgtgac cccctggtcc ctggtggacg ctaacgcttg gggcgtgtgg 4500

ttcaaccccg gtgactggca gctgatcgtg aacaccatgt ccgagctgca cctggtgtcc 4560

ttcgagcaag agatcttcaa cgtcgtcctc aagaccgtgt ccgagtccgc tacccagccc 4620

cccaccaagg tgtacaacaa cgacctgacc gcttccctga tggtcgctct ggactccaac 4680

aacaccatgc ccttcacccc cgctgctatg cgttccgaga ccctgggctt ctacccctgg 4740

aagcccacca tccccacccc ctggcgttac tacttccagt gggaccgtac cctgatcccc 4800

tcccacaccg gtacttccgg cacccccacc aacatctacc acggcaccga ccccgacgac 4860

gtgcagttct acaccatcga gaactccgtg cccgtgcacc tgctgcgtac cggtgacgag 4920

ttcgctaccg gaaccttctt cttcgactgc aagccctgcc gtctgaccca cacctggcag 4980

accaaccgtg ctctgggtct gcctcccttc ctgaactccc tgccccaggc tgagggtggc 5040

accaacttcg gttacatcgg tgtgcagcag gacaagcgtc gtggtgtgac ccagatgggt 5100

aacaccaact acatcaccga ggctaccatc atgcgtcccg ctgaggtcgg ctactccgct 5160

ccctactact ccttcgaggc ttccacccag ggccccttca agacccccat cgctgctggt 5220

cgtggtggtg ctcagaccga cgagaaccag gctgctgacg gtgacccccg ttacgctttc 5280

ggtcgtcagc acggccaaaa gaccaccacc accggcgaga cccccgagcg tttcacctac 5340

atcgctcacc aggacaccgg tcgttacccc gagggcgact ggattcagaa catcaacttc 5400

aacctgcccg tgaccgagga caacgtgctg ctgcccaccg accccatcgg tggcaagacc 5460

ggtatcaact acactaacat cttcaacacc tacggtcctc tgaccgctct gaacaacgtg 5520

ccccccgtgt accccaacgg ccagatctgg gacaaggagt tcgacaccga cctgaagccc 5580

cgtctgcacg tgaacgctcc cttcgtgtgc cagaacaact gccctggcca gctgttcgtc 5640

aaggtggccc ccaacctgac caacgagtac gaccctgacg cttccgctaa catgtcccgt 5700

atcgtgacct actccgactt ctggtggaag ggcaagctgg tgttcaaggc caagctgcgt 5760

gcttctcaca cctggaaccc catccagcag atgtccatca acgtggacaa ccagttcaac 5820

tacgtgccct ccaacatcgg tggaatgaag atcgtgtacg agaagtccca gctggctccc 5880

cgtaagctgt actaataatc tagaattccg gagcggccgc tgcagatctg atcctttcct 5940

gggacccggc aagaaccaaa aactcactct cttcaaggaa atccgtaatg ttaaacccga 6000

cacgatgaag cttgtcgttg gatggaaagg aaaagagttc tacagggaaa cttggacccg 6060

cttcatggaa gacagcttcc ccattgttaa cgaccaagaa gtgatggatg ttttccttgt 6120

tgtcaacatg cgtcccacta gacccaaccg ttgttacaaa ttcctggccc aacacgctct 6180

gcgttgcgac cccgactatg tacctcatga cgtgattagg atcgtcgagc cttcatgggt 6240

gggcagcaac aacgagtacc gcatcagcct ggctaagaag ggcggcggct gcccaataat 6300

gaaccttcac tctgagtaca ccaactcgtt cgaacagttc atcgatcgtg tcatctggga 6360

gaacttctac aagcccatcg tttacatcgg taccgactct gctgaagagg aggaaattct 6420

ccttgaagtt tccctggtgt tcaaagtaaa ggagtttgca ccagacgcac ctctgttcac 6480

tggtccggcg tattaaaaca cgatacattg ttattagtac atttattaag cgctagattc 6540

tgtgcgttgt tgatttacag acaattgttg tacgtatttt aataattcat taaatttata 6600

atctttaggg tggtatgtta gagcgaaaat caaatgattt tcagcgtctt tatatctgaa 6660

tttaaatatt aaatcctcaa tagatttgta aaataggttt cgattagttt caaacaaggg 6720

ttgtttttcc gaaccgatgg ctggactatc taatggattt tcgctcaacg ccacaaaact 6780

tgccaaatct tgtagcagca atctagcttt gtcgatattc gtttgtgttt tgttttgtaa 6840

taaaggttcg acgtcgttca aaatattatg cgcttttgta tttctttcat cactgtcgtt 6900

agtgtacaat tgactcgacg taaacacgtt aaataaagct tggacatatt taacatcggg 6960

cgtgttagct ttattaggcc gattatcgtc gtcgtcccaa ccctcgtcgt tagaagttgc 7020

ttccgaagac gattttgcca tagccacacg acgcctatta attgtgtcgg ctaacacgtc 7080

cgcgatcaaa tttgtagttg agctttttgg aattatttct gattgcgggc gtttttgggc 7140

gggtttcaat ctaactgtgc ccgattttaa ttcagacaac acgttagaaa gcgatggtgc 7200

aggcggtggt aacatttcag acggcaaatc tactaatggc ggcggtggtg gagctgatga 7260

taaatctacc atcggtggag gcgcaggcgg ggctggcggc ggaggcggag gcggaggtgg 7320

tggcggtgat gcagacggcg gtttaggctc aaatgtctct ttaggcaaca cagtcggcac 7380

ctcaactatt gtactggttt cgggcgccgt ttttggtttg accggtctga gacgagtgcg 7440

atttttttcg tttctaatag cttccaacaa ttgttgtctg tcgtctaaag gtgcagcggg 7500

ttgaggttcc gtcggcattg gtggagcggg cggcaattca gacatcgatg gtggtggtgg 7560

tggtggaggc gctggaatgt taggcacggg agaaggtggt ggcggcggtg ccgccggtat 7620

aatttgttct ggtttagttt gttcgcgcac gattgtgggc accggcgcag gcgccgctgg 7680

ctgcacaacg gaaggtcgtc tgcttcgagg cagcgcttgg ggtggtggca attcaatatt 7740

ataattggaa tacaaatcgt aaaaatctgc tataagcatt gtaatttcgc tatcgtttac 7800

cgtgccgata tttaacaacc gctcaatgta agcaattgta ttgtaaagag attgtctcaa 7860

gctcgccgca cgccgataac aagccttttc atttttacta cagcattgta gtggcgagac 7920

acttcgctgt cgtcgacgta catgtatgct ttgttgtcaa aaacgtcgtt ggcaagcttt 7980

aaaatattta aaagaacatc tctgttcagc accactgtgt tgtcgtaaat gttgtttttg 8040

ataatttgcg cttccgcagt atcgacacgt tcaaaaaatt gatgcgcatc aattttgttg 8100

ttcctattat tgaataaata agattgtaca gattcatatc tacgattcgt catggccacc 8160

acaaatgcta cgctgcaaac gctggtacaa ttttacgaaa actgcaaaaa cgtcaaaact 8220

cggtataaaa taatcaacgg gcgctttggc aaaatatcta ttttatcgca caagcccact 8280

agcaaattgt atttgcagaa aacaatttcg gcgcacaatt ttaacgctga cgaaataaaa 8340

gttcaccagt taatgagcga ccacccaaat tttataaaaa tctattttaa tcacggttcc 8400

atcaacaacc aagtgatcgt gatggactac attgactgtc ccgatttatt tgaaacacta 8460

caaattaaag gcgagctttc gtaccaactt gttagcaata ttattagaca gctgtgtgaa 8520

gcgctcaacg atttgcacaa gcacaatttc atacacaacg acataaaact cgaaaatgtc 8580

ttatatttcg aagcacttga tcgcgtgtat gtttgcgatt acggattgtg caaacacgaa 8640

aactcactta gcgtgcacga cggcacgttg gagtatttta gtccggaaaa aattcgacac 8700

acaactatgc acgtttcgtt tgactggtac gcggcgtgtt aacatacaag ttgctaacgt 8760

aatcatggtc atagctgttt cctgtgtgaa attgttatcc gctcacaatt ccacacaaca 8820

tacgagccgg aagcataaag tgtaaagcct ggggtgccta atgagtgagc taactcacat 8880

taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa cctgtcgtgc cagctgcatt 8940

aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat tgggcgctct tccgcttcct 9000

cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa 9060

aggcggtaat acggttatcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa 9120

aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc 9180

tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga 9240

caggactata aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc 9300

cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt 9360

ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct 9420

gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg 9480

agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt aacaggatta 9540

gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct aactacggct 9600

acactagaag gacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa 9660

gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt 9720

gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta 9780

cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atgagattat 9840

caaaaaggat cttcacctag atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa 9900

gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtt accaatgctt aatcagtgag gcacctatct 9960

cagcgatctg tctatttcgt tcatccatag ttgcctgact ccccgtcgtg tagataacta 10020

cgatacggga gggcttacca tctggcccca gtgctgcaat gataccgcga gacccacgct 10080

caccggctcc agatttatca gcaataaacc agccagccgg aagggccgag cgcagaagtg 10140

gtcctgcaac tttatccgcc tccatccagt ctattaattg ttgccgggaa gctagagtaa 10200

gtagttcgcc agttaatagt ttgcgcaacg ttgttgccat tgctacaggc atcgtggtgt 10260

cacgctcgtc gtttggtatg gcttcattca gctccggttc ccaacgatca aggcgagtta 10320

catgatcccc catgttgtgc aaaaaagcgg ttagctcctt cggtcctccg atcgttgtca 10380

gaagtaagtt ggccgcagtg ttatcactca tggttatggc agcactgcat aattctctta 10440

ctgtcatgcc atccgtaaga tgcttttctg tgactggtga gtactcaacc aagtcattct 10500

gagaatagtg tatgcggcga ccgagttgct cttgcccggc gtcaatacgg gataataccg 10560

cgccacatag cagaacttta aaagtgctca tcattggaaa acgttcttcg gggcgaaaac 10620

tctcaaggat cttaccgctg ttgagatcca gttcgatgta acccactcgt gcacccaact 10680

gatcttcagc atcttttact ttcaccagcg tttctgggtg agcaaaaaca ggaaggcaaa 10740

atgccgcaaa aaagggaata agggcgacac ggaaatgttg aatactcata ctcttccttt 10800

ttcaatatta ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcat gagcggatac atatttgaat 10860

gtatttagaa aaataaacaa ataggggttc cgcgcacatt tccccgaaaa gtgccacctg 10920

acgtctaaga aaccattatt atcatgacat taacctataa aaataggcgt atcacgaggc 10980

cctttcgtct cgcgcgtttc ggtgatgacg gtgaaaacct ctgacacatg cagctcccgg 11040

agacggtcac agcttgtctg taagcggatg ccgggagcag acaagcccgt cagggcgcgt 11100

cagcgggtgt tggcgggtgt cggggctggc ttaactatgc ggcatcagag cagattgtac 11160

tgagagtgca ccatatgcgg tgtgaaatac cgcacagatg cgtaaggaga aaataccgca 11220

tcaggcgcca ttcgccattc aggctgcgca actgttggga agggcgatcg gtgcgggcct 11280

cttcgctatt acgccagctg gcgaaagggg gatgtgctgc aaggcgatta agttgggtaa 11340

cgccagggtt ttcccagtca cgacgttgta aaacgacggc cagtgcc 11387

<210> 12

<211> 11385

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pMEB073

<400> 12

ctagaattcc ggagcggccg ctgcagatct gatcctttcc tgggacccgg caagaaccaa 60

aaactcactc tcttcaagga aatccgtaat gttaaacccg acacgatgaa gcttgtcgtt 120

ggatggaaag gaaaagagtt ctacagggaa acttggaccc gcttcatgga agacagcttc 180

cccattgtta acgaccaaga agtgatggat gttttccttg ttgtcaacat gcgtcccact 240

agacccaacc gttgttacaa attcctggcc caacacgctc tgcgttgcga ccccgactat 300

gtacctcatg acgtgattag gatcgtcgag ccttcatggg tgggcagcaa caacgagtac 360

cgcatcagcc tggctaagaa gggcggcggc tgcccaataa tgaaccttca ctctgagtac 420

accaactcgt tcgaacagtt catcgatcgt gtcatctggg agaacttcta caagcccatc 480

gtttacatcg gtaccgactc tgctgaagag gaggaaattc tccttgaagt ttccctggtg 540

ttcaaagtaa aggagtttgc accagacgca cctctgttca ctggtccggc gtattaaaac 600

acgatacatt gttattagta catttattaa gcgctagatt ctgtgcgttg ttgatttaca 660

gacaattgtt gtacgtattt taataattca ttaaatttat aatctttagg gtggtatgtt 720

agagcgaaaa tcaaatgatt ttcagcgtct ttatatctga atttaaatat taaatcctca 780

atagatttgt aaaataggtt tcgattagtt tcaaacaagg gttgtttttc cgaaccgatg 840

gctggactat ctaatggatt ttcgctcaac gccacaaaac ttgccaaatc ttgtagcagc 900

aatctagctt tgtcgatatt cgtttgtgtt ttgttttgta ataaaggttc gacgtcgttc 960

aaaatattat gcgcttttgt atttctttca tcactgtcgt tagtgtacaa ttgactcgac 1020

gtaaacacgt taaataaagc ttggacatat ttaacatcgg gcgtgttagc tttattaggc 1080

cgattatcgt cgtcgtccca accctcgtcg ttagaagttg cttccgaaga cgattttgcc 1140

atagccacac gacgcctatt aattgtgtcg gctaacacgt ccgcgatcaa atttgtagtt 1200

gagctttttg gaattatttc tgattgcggg cgtttttggg cgggtttcaa tctaactgtg 1260

cccgatttta attcagacaa cacgttagaa agcgatggtg caggcggtgg taacatttca 1320

gacggcaaat ctactaatgg cggcggtggt ggagctgatg ataaatctac catcggtgga 1380

ggcgcaggcg gggctggcgg cggaggcgga ggcggaggtg gtggcggtga tgcagacggc 1440

ggtttaggct caaatgtctc tttaggcaac acagtcggca cctcaactat tgtactggtt 1500

tcgggcgccg tttttggttt gaccggtctg agacgagtgc gatttttttc gtttctaata 1560

gcttccaaca attgttgtct gtcgtctaaa ggtgcagcgg gttgaggttc cgtcggcatt 1620

ggtggagcgg gcggcaattc agacatcgat ggtggtggtg gtggtggagg cgctggaatg 1680

ttaggcacgg gagaaggtgg tggcggcggt gccgccggta taatttgttc tggtttagtt 1740

tgttcgcgca cgattgtggg caccggcgca ggcgccgctg gctgcacaac ggaaggtcgt 1800

ctgcttcgag gcagcgcttg gggtggtggc aattcaatat tataattgga atacaaatcg 1860

taaaaatctg ctataagcat tgtaatttcg ctatcgttta ccgtgccgat atttaacaac 1920

cgctcaatgt aagcaattgt attgtaaaga gattgtctca agctccgcac gccgataaca 1980

agccttttca tttttactac agcattgtag tggcgagaca cttcgctgtc gtcgacgtac 2040

atgtatgctt tgttgtcaaa aacgtcgttg gcaagcttta aaatatttaa aagaacatct 2100

ctgttcagca ccactgtgtt gtcgtaaatg ttgtttttga taatttgcgc ttccgcagta 2160

tcgacacgtt caaaaaattg atgcgcatca attttgttgt tcctattatt gaataaataa 2220

gattgtacag attcatatct acgattcgtc atggccacca caaatgctac gctgcaaacg 2280

ctggtacaat tttacgaaaa ctgcaaaaac gtcaaaactc ggtataaaat aatcaacggg 2340

cgctttggca aaatatctat tttatcgcac aagcccacta gcaaattgta tttgcagaaa 2400

acaatttcgg cgcacaattt taacgctgac gaaataaaag ttcaccagtt aatgagcgac 2460

cacccaaatt ttataaaaat ctattttaat cacggttcca tcaacaacca agtgatcgtg 2520

atggactaca ttgactgtcc cgatttattt gaaacactac aaattaaagg cgagctttcg 2580

taccaacttg ttagcaatat tattagacag ctgtgtgaag cgctcaacga tttgcacaag 2640

cacaatttca tacacaacga cataaaactc gaaaatgtct tatatttcga agcacttgat 2700

cgcgtgtatg tttgcgatta cggattgtgc aaacacgaaa actcacttag cgtgcacgac 2760

ggcacgttgg agtattttag tccggaaaaa attcgacaca caactatgca cgtttcgttt 2820

gactggtacg cggcgtgtta acatacaagt tgctaaccgg cggttcgtaa tcatggtcat 2880

agctgtttcc tgtgtgaaat tgttatccgc tcacaattcc acacaacata cgagccggaa 2940

gcataaagtg taaagcctgg ggtgcctaat gagtgagcta actcacatta attgcgttgc 3000

gctcactgcc cgctttccag tcgggaaacc tgtcgtgcca gctgcattaa tgaatcggcc 3060

aacgcgcggg gagaggcggt ttgcgtattg ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact 3120

cgctgcgctc ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac 3180

ggttatccac agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa 3240

aggccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg 3300

acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa 3360

gataccaggc gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc 3420

ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac 3480

gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac 3540

cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg 3600

taagacacga cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt 3660

atgtaggcgg tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagga 3720

cagtatttgg tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct 3780

cttgatccgg caaacaaacc accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga 3840

ttacgcgcag aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg 3900

ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat gagattatca aaaaggatct 3960

tcacctagat ccttttaaat taaaaatgaa gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt 4020

aaacttggtc tgacagttac caatgcttaa tcagtgaggc acctatctca gcgatctgtc 4080

tatttcgttc atccatagtt gcctgactcc ccgtcgtgta gataactacg atacgggagg 4140

gcttaccatc tggccccagt gctgcaatga taccgcgaga cccacgctca ccggctccag 4200

atttatcagc aataaaccag ccagccggaa gggccgagcg cagaagtggt cctgcaactt 4260

tatccgcctc catccagtct attaattgtt gccgggaagc tagagtaagt agttcgccag 4320

ttaatagttt gcgcaacgtt gttgccattg ctacaggcat cgtggtgtca cgctcgtcgt 4380

ttggtatggc ttcattcagc tccggttccc aacgatcaag gcgagttaca tgatccccca 4440

tgttgtgcaa aaaagcggtt agctccttcg gtcctccgat cgttgtcaga agtaagttgg 4500

ccgcagtgtt atcactcatg gttatggcag cactgcataa ttctcttact gtcatgccat 4560

ccgtaagatg cttttctgtg actggtgagt actcaaccaa gtcattctga gaatagtgta 4620

tgcggcgacc gagttgctct tgcccggcgt caatacggga taataccgcg ccacatagca 4680

gaactttaaa agtgctcatc attggaaaac gttcttcggg gcgaaaactc tcaaggatct 4740

taccgctgtt gagatccagt tcgatgtaac ccactcgtgc acccaactga tcttcagcat 4800

cttttacttt caccagcgtt tctgggtgag caaaaacagg aaggcaaaat gccgcaaaaa 4860

agggaataag ggcgacacgg aaatgttgaa tactcatact cttccttttt caatattatt 4920

gaagcattta tcagggttat tgtctcatga gcggatacat atttgaatgt atttagaaaa 4980

ataaacaaat aggggttccg cgcacatttc cccgaaaagt gccacctgac gtctaagaaa 5040

ccattattat catgacatta acctataaaa ataggcgtat cacgaggccc tttcgtctcg 5100

cgcgtttcgg tgatgacggt gaaaacctct gacacatgca gctcccggag acggtcacag 5160

cttgtctgta agcggatgcc gggagcagac aagcccgtca gggcgcgtca gcgggtgttg 5220

gcgggtgtcg gggctggctt aactatgcgg catcagagca gattgtactg agagtgcacc 5280

atatgcggtg tgaaataccg cacagatgcg taaggagaaa ataccgcatc aggcgccatt 5340

cgccattcag gctgcgcaac tgttgggaag ggcgatcggt gcgggcctct tcgctattac 5400

gccagctggc gaaaggggga tgtgctgcaa ggcgattaag ttgggtaacg ccagggtttt 5460

cccagtcacg acgttgtaaa acgacggcca gtgccaagct ttactcgtaa agcgagttga 5520

aggatcatat ttagttgcgt ttatgagata agattgaaag cacgtgtaaa atgtttcccg 5580

cgcgttggca caactattta caatgcggcc aagttataaa agattctaat ctgatatgtt 5640

ttaaaacacc tttgcggccc gagttgtttg cgtacgtgac tagcgaagaa gatgtgtgga 5700

ccgcagaaca gatagtaaaa caaaacccta gtattggagc aataatcgat ttaaccaaca 5760

cgtctaaata ttatgatggt gtgcattttt tgcgggcggg cctgttatac aaaaaaattc 5820

aagtacctgg ccagactttg ccgcctgaaa gcatagttca agaatttatt gacacggtaa 5880

aagaatttac agaaaagtgt cccggcatgt tggtgggcgt gcactgcaca cacggtatta 5940

atcgcaccgg ttacatggtg tgcagatatt taatgcacac cctgggtatt gcgccgcagg 6000

aagccataga tagattcgaa aaagccagag gtcacaaaat tgaaagacaa aattacgttc 6060

aagatttatt aatttaatta atattatttg cattctttaa caaatacttt atcctatttt 6120

caaattgttg cgcttcttcc agcgaaccaa aactatgctt cgcttgctcc gtttagcttg 6180

tagccgatca gtggcgttgt tccaatcgac ggtaggatta ggccggatat tctccaccac 6240

aatgttggca acgttgatgt tacgtttatg cttttggttt tccacgtacg tcttttggcc 6300

ggtaatagcc gtaaacgtag tgccgtcgcg cgtcacgcac aacaccggat gtttgcgctt 6360

gtccgcgggg tattgaaccg cgcgatccga caaatccacc actttggcaa ctaaatcggt 6420

gacctgcgcg tcttttttct gcattatttc gtctttcttt tgcatggttt cctggaagcc 6480

ggtgtacatg cggtttagat cagtcatgac gcgcgtgacc tgcaaatctt tggcctcgat 6540

ctgcttgtcc ttgatggcaa cgatgcgttc aataaactct tgttttttaa caagttcctc 6600

ggttttttgc gccaccaccg cttgcagcgc gtttgtgtgc tcggtgaatg tcgcaatcag 6660

cttagtcacc aactgtttgc tctcctcctc ccgttgtttg atcgcgggat cgtacttgcc 6720

ggtgcagagc acttgaggaa ttacttcttc taaaagccat tcttgtaatt ctatggcgta 6780

aggcaatttg gacttcataa tcagctgaat cacgccggat ttagtaatga gcactgtatg 6840

cggctgcaaa tacagcgggt cgcccctttt cacgacgctg ttagaggtag ggcccccatt 6900

ttggatggtc tgctcaaata acgatttgta tttattgtct acatgaacac gtatagcttt 6960

atcacaaact gtatatttta aactgttagc gacgtccttg gccacgaacc ggacctgttg 7020

gtcgcgctct agcacgtacc gcaggttgaa cgtatcttct ccaaatttaa attctccaat 7080

tttaacgcga gccattttga tacacgtgtg tcgattttgc aacaactatt gttttttaac 7140

gcaaactaaa cttattgtgg taagcaataa ttaaatatgg gggaacatgc gccgctacaa 7200

cactcgtcgt tatgaacgca gacggcgccg gtctcggcgc aagcggctaa aacgtgttgc 7260

gcgttcaacg cggcaaacat cgcaaaagcc aatagtacag ttttgatttg catattaacg 7320

gcgatttttt aaattatctt atttaataaa tagttatgac gcctacaact ccccgcccgc 7380

gttgactcgc tgcacctcga gcagttcgtt gacgccttcc tccgtgtggc cgaacacgtc 7440

gagcgggtgg tcgatgacca gcggcgtgcc gcacgcgacg cacaagtatc tgtacaccga 7500

atgatcgtcg ggcgaaggca cgtcggcctc caagtggcaa tattggcaaa ttcgaaaata 7560

tatacagttg ggttgtttgc gcatatctat cgtggcgttg ggcatgtacg tccgaacgtt 7620

gatttgcatg caagccgaaa ttaaatcatt gcgattagtg cgattaaaac gttgtacatc 7680

ctcgctttta atcatgccgt cgattaaatc gcgcaatcga gtcaagtgat caaagtgtgg 7740

aataatgttt tctttgtatt cccgagtcaa gcgcagcgcg tattttaaca aactagccat 7800

cttgtaagtt agtttcattt aatgcaactt tatccaataa tatattatgt atcgcacgtc 7860

aagaattaac aatgcgcccg ttgtcgcatc tcaacacgac tatgatagag atcaaataaa 7920

gcgcgaatta aatagcttgc gacgcaacgt gcacgatctg tgcacgcgtt ccggcacgag 7980

ctttgattgt aataagtttt tacgaagcga tgacatgacc cccgtagtga caacgatcac 8040

gcccaaaaga actgccgact acaaaattac cgagtatgtc ggtgacgtta aaactattaa 8100

gccatccaat cgaccgttag tcgaatcagg accgctggtg cgagaagccg cgaagtatgg 8160

cgaatgcatc gtataacgtg tggagtccgc tcattagagc gtcatgttta gacaagaaag 8220

ctacatattt aattgatccc gatgatttta ttgataaatt gaccctaact ccatacacgg 8280

tattctacaa tggcggggtt ttggtcaaaa tttccggact gcgattgtac atgctgttaa 8340

cggctccgcc cactattaat gaaattaaaa attccaattt taaaaaacgc agcaagagaa 8400

acatttgtat gaaagaatgc gtagaaggaa agaaaaatgt cgtcgacatg ctgaacaaca 8460

agattaatat gcctccgtgt ataaaaaaaa tattgaacga tttgaaagaa aacaatgtac 8520

cgcgcggcgg tatgtacagg aagaggttta tactaaactg ttacattgca aacgtggttt 8580

cgtgtgccaa gtgtgaaaac cgatgtttaa tcaaggctct gacgcatttc tacaaccacg 8640

actccaagtg tgtgggtgaa gtcatgcatc ttttaatcaa atcccaagat gtgtataaac 8700

caccaaactg ccaaaaaatg aaaactgtcg acaagctctg tccgtttgct ggcaactgca 8760

agggtctcaa tcctatttgt aattattgaa taataaaaca attataaatg ctaaatttgt 8820

tttttattaa cgatacaaac caaacgcaac aagaacattt gtagtattat ctataattga 8880

aaacgcgtag ttataatcgc tgaggtaata tttaaaatca ttttcaaatg attcacagtt 8940

aatttgcgac aatataattt tattttcaca taaactagac gccttgtcgt cttcttcttc 9000

gtattccttc tctttttcat ttttctcctc ataaaaatta acatagttat tatcgtatcc 9060

atatatgtat ctatcgtata gagtaaattt tttgttgtca taaatatata tgtctttttt 9120

aatggggtgt atagtaccgc tgcgcatagt ttttctgtaa tttacaacag tgctattttc 9180

tggtagttct tcggagtgtg ttgctttaat tattaaattt atataatcaa tgaatttggg 9240

atcgtcggtt ttgtacaata tgttgccggc atagtacgca gcttcttcta gttcaattac 9300

accatttttt agcagcaccg gattaacata actttccaaa atgttgtacg aaccgttaaa 9360

caaaaacagt tcacctccct tttctatact attgtctgcg agcagttgtt tgttgttaaa 9420

aataacagcc attgtaatga gacgcacaaa ctaatatcac aaactggaaa tgtctatcaa 9480

tatatagttg ctgatatcat ggagataatt aaaatgataa ccatctcgca aataaataag 9540

tattttactg ttttcgtaac agttttgtaa taaaaaaacc tataaatatt ccggattatt 9600

cataccgtcc caccatcggg cgcggatccc gggtcgacgc caccatgctg aagggcggcc 9660

agcctgctgt gagaaacgag agagccaccg gcagcggcaa tggcagcggc ggagggggcg 9720

gaggaggatc tggcggagtg ggcatcagca ccggcacctt caacaaccag accgagttca 9780

agttcctgga gaacggctgg gtggagatca ccgccaacag cagcagactg gtgcacctga 9840

acatgcccga gagcgagaac taccggagag tggtggtgaa caacctggac aagaccgccg 9900

tgaacggcaa tatggccctg gatgacaccc acgcccagat cgtgaccccc tggagcctgg 9960

tggacgccaa cgcctgggga gtgtggttca accctggcga ctggcagctg atcgtgaaca 10020

ccatgagcga gctgcacctg gtgtccttcg agcaggagat tttcaacgtg gtgctgaaaa 10080

ccgtgtccga gagcgccacc cagcccccca ccaaagtgta caacaacgac ctgaccgcct 10140

ccctgatggt ggccctggac agcaacaaca ccatgccctt cacccctgcc gccatgagaa 10200

gcgagaccct gggcttctac ccttggaagc ccaccatccc caccccttgg cggtactact 10260

tccagtggga caggaccctg atccccagcc acaccggcac cagcggcacc cctaccaata 10320

tctaccacgg caccgaccct gatgacgtgc agttctacac catcgagaac agcgtgcctg 10380

tgcacctgct gagaaccggc gacgagttcg ccaccggcac attcttcttc gactgcaagc 10440

cctgcagact gacccacacc tggcagacca acagagccct gggcctgcct cctttcctga 10500

acagcctgcc ccaggccgag ggcggcacca acttcggcta catcggcgtg cagcaggaca 10560

agagaagagg cgtgacccag atgggcaaca ccaactacat caccgaggcc accatcatga 10620

gacccgccga agtgggctac agcgccccct actacagctt cgaggccagc acccagggcc 10680

ccttcaagac ccccatcgcc gctggcagag gcggagccca gaccgacgag aaccaggccg 10740

ccgacggcga ccccagatac gccttcggca gacagcacgg ccagaaaacc accaccaccg 10800

gcgagacccc cgagagattc acctacatcg cccaccagga caccggcaga taccccgagg 10860

gcgactggat tcagaacatc aacttcaacc tgcccgtgac cgaggataat gtgctgctgc 10920

ccaccgaccc catcggcggc aagaccggca tcaactacac caacatcttc aacacctacg 10980

gccccctgac cgccctgaat aacgtgcccc ccgtgtaccc caacggccag atttgggaca 11040

aggagttcga caccgacctg aagcctaggc tgcacgtgaa tgcccccttc gtgtgtcaga 11100

acaactgccc tggccagctg tttgtgaaag tggcccccaa cctgaccaac gagtacgatc 11160

ctgacgccag cgccaacatg agccggatcg tgacctacag cgacttctgg tggaagggca 11220

agctggtgtt caaggccaag ctgagagcca gccacacatg gaaccccatc cagcagatga 11280

gcatcaacgt ggacaaccag ttcaactacg tgcccagcaa tatcggcggc atgaagatcg 11340

tgtacgagaa gagccagctg gcccccagaa agctgtactg ataat 11385

<---

Claims (20)

1. Комбинированная вакцина, включающая компонент в виде вирусоподобной частицы (VLP) и компонент в виде модифицированного живого вируса (MLV), в которой как VLP, так и MLV направлены против одного и того же патогена или заболевания, где комбинированная вакцина преодолевает действие материнских антител (MDA), в которой VLP CPV включает полипептид CPV, имеющий последовательность, как представлено в SEQ ID NO: 1, 3, 4, 6, 8, 9 или 10; или в которой VLP CPV включает полипептид CPV, имеющий, по меньшей мере, 96% идентичности с последовательностью, как представлено в SEQ ID NO: 1, 3, 4, 6, 8, 9 или 10.

2. Комбинированная вакцина по п. 1, которая обеспечивает защитный иммунитет при однократном приеме.

3. Комбинированная вакцина по п. 1, в которой патоген или заболевание представляет собой собачий парвовирус (CPV).

4. Комбинированная вакцина по п. 3, в которой компонент VLP комбинации включает по меньшей мере 10% VLP CPV (масс./масс.) в зависимости от общего содержания белка.

5. Комбинированная вакцина по п. 4, в которой компонент VLP включает по меньшей мере 20% VLP CPV (масс./масс.).

6. Комбинированная вакцина по п. 3, в которой VLP CPV экспрессируют с помощью бакуловирусного вектора в клетках насекомых.

7. Комбинированная вакцина по п. 3, в которой VLP CPV включает по меньшей мере один капсидный белок CPV.

8. Комбинированная вакцина по п. 1, в которой VLP CPV включает полипептид CPV, кодируемый полинуклеотидом, имеющим последовательность, как представлено в SEQ ID NO: 2, 5 или 7; или,

в которой VLP CPV включает полипептид CPV, кодируемый полинуклеотидом, имеющим, по меньшей мере, 90% идентичности с последовательностью, как представлено в SEQ ID NO: 2, 5 или 7.

9. Комбинированная вакцина по п. 1, в которой композиция или вакцина не содержит адъюванта и необязательно включает фармацевтически или ветеринарно приемлемый носитель, наполнитель или разбавитель.

10. Плазмида, полезная для получения VLP CPV, включающая полинуклеотид, кодирующий антиген CPV, имеющий последовательность, как представлено в SEQ ID NO: 1, 3, 4, 6 или 8-10, или полинуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичности с последовательностью полинуклеотида, кодирующего антиген CPV, имеющий последовательность, как представлено в SEQ ID NO: 1, 3, 4, 6 или 8-10.

11. Плазмида по п. 9, в которой полинуклеотид включает последовательность или состоит из последовательности, как представлено в SEQ ID NO: 2, 5, 7, 11 или 12.

12. Плазмида по п. 9, в которой плазмида состоит из последовательности, как представлено в SEQ ID NO:11 или 12.

13. Плазмида по п. 9, которая стабильно трансформирована в клетку насекомого, которая экспрессирует VLP CPV.

14. Существенно очищенный пустой капсид CPV, где по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 98% или более клеточных компонентов или материалов было удалено, или VLP CPV, экспрессируемый в клетках насекомых, где пустой капсид CPV или VLP включает полипептид, имеющий последовательность, как представлено в SEQ ID NO: 1, 3, 4, 6 или 8-10; или,

в которой пустой капсид CPV или VLP включает полипептид, имеющий, по меньшей мере, 96% идентичности с последовательностью, как представлено в SEQ ID NO: 1, 3, 4, 6 или 8-10.

15. Очищенный пустой капсид CPV или VLP CPV по п. 14, где пустой капсид CPV или VLP состоит из полипептида, имеющего последовательность, как представлено в SEQ ID NO: 1, 3, 4, 6 или 8-10.

16. Способ вызова иммунного ответа против CPV у животного, включающий введение животному композиции по любому из пп. 1-6 или пустых капсидов CPV или VLP по п. 14.

17. Способ по п. 16, в котором иммунный ответ представляет собой защитный иммунный ответ и в котором защитный иммунный ответ защищает вакцинированных от последующего воздействия вирулентных CPV.

18. Способ по п. 17, в котором защитный иммунный ответ вызывают у вакцинированных животных вне зависимости от присутствия у указанных животных высоких уровней материнских антител (MDA) против CPV.

Images