CN108348594A - 犬科动物细小病毒(cpv)病毒样颗粒(vlp)疫苗及其用途 - Google Patents

犬科动物细小病毒(cpv)病毒样颗粒(vlp)疫苗及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明包括犬科动物细小病毒(CPV)疫苗或组合物。疫苗或组合物可以是含有CPV病毒样颗粒(VLP)的疫苗或组合物，及其制备方法和用途。由本发明提供的CPV VLP由CPV VP2蛋白形成。此外，本发明广义地涵盖包含MLV和VLP的组合的疫苗，其能够克服MDA，对抗感染各种不同的物种的各种病原体。

Description

犬科动物细小病毒(CPV)病毒样颗粒(VLP)疫苗及其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求2015年9月29日递交的USSN 62/234,196的优先权，并且其通过引用整体并入本文。本文引用的所有其他参考文献类似地通过引用整体并入本文。
有关序列表的声明
与本申请相关的序列表以文本格式提供以代替纸质副本，并且特此通过引用并入本说明书中。含有序列表的文本文件的名称是MER14-252P_ST25.txt。该文本文件为82KB；它创建于2015年7月13日；并且它通过EFS-Web与说明书的递交一起电子提交。
发明领域
本发明涉及疫苗学领域，更具体地涉及克服母源抗体(MDA)的挑战。更具体地，本发明涉及通过向动物(包括犬)施用病毒样颗粒和修饰的活病毒(MLV)的组合，以同时组合、顺序施用或通过初免-加强施用方案来克服MDA。甚至更具体地，本发明涉及用于在犬和幼犬中引发针对细小病毒(CPV)的保护性免疫的组合物，无论CPV MDA是否存在于犬和幼犬中。
发明背景
犬科动物细小病毒(CPV)主要是感染犬、特别是年幼的犬的肠道病原体。细小病毒感染的特征在于超过4至5周龄的犬和幼犬的急性腹泻、发热和白细胞减少症，并且在罕见的情况下为更年幼的幼犬中的心肌病。未接种疫苗的犬的疾病死亡率非常高。虽然有几种CPV疫苗存在，但母源抗体(MDA)的存在往往会阻断其他有效疫苗提供保护性免疫的能力。
新生幼犬通过母亲的哺乳获得针对疾病如CPV感染的被动免疫，特别是在生命的头两天。哺乳的幼犬摄入首先产生的乳中的初乳，初乳中的(MDA)被传递给幼犬。对于犬(以及许多其他哺乳动物)而言，随着MDA分解代谢，初乳提供的被动免疫水平逐渐降低。因此，幼犬不再受MDA保护的年龄变化很大，这取决于幼犬的初乳摄入量、其中包含的抗体量以及其他几个因素。
接种幼犬时的一个特别挑战是根据提供保护的时间框架来施用疫苗，该保护与母源抗体提供的保护重叠并且在母源抗体减少时开始。目前，用于幼犬的疫苗方案通常在约6周龄时开始，并且随后每3周给予加强剂，例如，在9、12和有时15周。但是，为了使该方案提供全面保护，第一次疫苗剂量将必须立即引发保护性免疫应答。这种期望完全不现实，(部分)原因是幼犬免疫系统的不成熟和进入免疫应答所需的时间。此外，情况更加复杂，因为可能持续至多6周龄左右的残留MDA中和MLV疫苗。目前，所有市售的CPV疫苗都是MLV疫苗。
重要的是，虽然具有CPV MDA的幼犬可能对任何MLV CPV疫苗都没有反应，但它仍然可能被CPV野强毒株感染，并发展成犬科动物细小病毒病。由于MDA的干扰，在给予疫苗的整个过程之前通常不会产生全面保护。因此，由于CPV感染引起的基于年龄的死亡率在完成接种方案之前达到峰值。因此，开发一种能在第一次注射之后主动免疫幼犬(并在MDA存在下)的疫苗是犬科医学中最重要的未满足需求之一。
兽医学中的另一个挑战是治疗癌症，例如在犬中治疗癌症。现有的癌症治疗工具存在很多限制，特别是对于老年病犬。施用溶瘤细小病毒以杀死癌细胞显示出作为有效的癌症治疗的巨大前景(Rommelaere et al,Cytokine&Growth Factor Reviews 21:185-195,2010；和Rommelaere等人的美国专利号7,179,456,其完整内容通过引用并入本文)并且可以应用于犬科动物。然而，细小病毒的预先存在的抗体(例如作为接种疫苗的结果)的存在将使该方法无效，因为细小病毒会被现有抗体中和。另外，目前很少进行犬的基因治疗，但是如果鉴定了合适的核酸载体(vector)，则将是用于治疗几种疾病的有前途的方法。因此，克服现有抗体的方法可用于疫苗接种以外的应用。
鉴于上述情况，需要具有改善的安全性和良好功效的疫苗，包括克服MDA的能力，包括提供针对异源CPV株的保护的疫苗。
发明概述
本发明提供了包含CPV病毒样颗粒(VLP)抗原、CPV修饰的活病毒(MLV)疫苗的药物组合物，针对CPV的疫苗接种方法以及与这些方法和组合物一起使用的试剂盒。
本发明提供了包含抗原性CPV多肽及其片段和变体的组合物或疫苗。CPV抗原及其片段和变体具有免疫原性和保护性质。CPV抗原可以通过昆虫细胞中的杆状病毒表达载体产生，并组装成CPV空衣壳或CPVVLP(病毒样颗粒)。
可以将抗原性多肽及其片段和变体配制成含有或不含有CPV修饰的活病毒和/或药物组合物的疫苗。这样的疫苗或组合物可用于接种动物并提供针对同源和异源CPV毒株的保护。
重要的是，本发明人已经令人惊讶地和出乎意料地发现，包含MLV和VLP(各自对应于相同病原体但不一定编码或提供相同部分或基因或亚单位的抗原)的组合物的施用能够克服MDA以引发针对所述病原体的后续强毒攻击的保护性免疫。因此，在具体的实施方案中，本发明提供了包含MLV CPV和CPV VLP的组合疫苗，其在幼犬中具有保护性免疫，不管幼犬是否具有针对CPV的循环MDA。
在另一实施方案中，本发明提供了包含对应于其他病原体的MLV和VLP的组合疫苗，其中涉及MDA干扰。例如，年幼的牛科动物、猪类动物、猫科动物、山羊类动物、绵羊类动物、马科动物和其他动物都有针对各种病原体的循环MDA。在每种情况下，这些MDA的存在可能干扰疫苗的功效。既然已经完成了本公开，本发明人考虑到，无论病原体如何，施用MLV+VLP的组合都将克服MDA。病原体可以包括但不限于：口蹄疫病毒(FMDV)，猪类动物繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)，犬科动物瘟热病毒(CDV)，猫科动物泛白细胞减少症FPL和马科动物流感病毒(EIV)。本领域技术人员将会理解，提供MLV+VLP的这种方法可以应用于任何情况下，其中MDA的干扰是一个挑战。
还提供了包含至少一种抗原性多肽或其片段或变体和使用说明的试剂盒。
附图简要说明
下面通过举例给出的详细描述，但并非旨在将本发明仅限于所描述的特定实施方案，可以结合附图来最好地理解，其中：
图1描述了总结DNA和蛋白质序列的表格；
图2描述了pMEB072的质粒图；
图3描述了pMEB073的质粒图；
图4是CPV VLP的电子显微照片，显示细小病毒样病毒体的正确形状和形态；
图5是显示CPV VLP水平的蛋白质印迹和伴随数据；
图6是显示CPV VLP水平的蛋白质印迹和伴随数据；
图7是显示接种疫苗后ELISA测定的CPV效价的图；
图8是显示用Souriou&Bari株(低剂量，无佐剂)或pMEB072产生的CPV VLP接种疫苗后ELISA测定的CPV效价的图。接受VLP的组中开始(onset)更快；
图9是显示用Souriou&Bari株(中等剂量，有佐剂)或pMEB073产生的CPV VLP(有Al(OH)3+皂苷)接种疫苗后ELISA测定的CPV效价的图。接受VLP的组中开始仍然更快；
图10是显示用Souriou&Bari株(高剂量)或pMEB073产生的CPV VLP(有Al(OH)3+皂苷)接种疫苗后ELISA测定的CPV效价的图。所有三个组的开始都很快；
图11是SEQ ID NO:1、3、4和6的ClustalW比对；
图12是显示根据处理(D0的MLV或MLV+VLP)和天数的个体抗CPV抗体效价(IHA)的图。每条线对应于一个个体，并且点的大小对应于指示的天数和效价组合处的值的数量。仅显示D0IHA效价≥40的犬的数据；
图13是显示根据处理(D0的MLV或MLV+VLP)和天数的平均抗CPV抗体效价(IHA)的图。箱代表中位数、第25和第75百分位数，须(whisker)的末端代表四分位距离的1.5倍以内的值；每个符号代表一个值；
图14是显示根据接种疫苗后天数和组(Gr A：VLP SC500μl；Gr D VLP口服；Gr EAd5CPV 8.64log10；Gr G Ad5CDV)的平均抗CPV抗体效价(通过ELISA log10OD50测定)。在D0和D28对犬进行疫苗接种。平均值表示为+/-平均值的一个标准误差；每个点代表一个值；
图15是显示实施例7中公开的研究的应答者百分比(percent responders)的图；
图16是显示HAI效价的图；
图17是显示CPV中和抗体的几何平均效价的图
图18是按组和天数显示应答者百分比的图；
图19是按组和天数显示CPV几何平均抗体效价的图。
详述
本发明提供了包含引发动物的免疫原性应答的CPV多肽、抗原及其片段和变体的组合物。通过昆虫细胞中的杆状病毒表达载体产生抗原性多肽或其片段或变体。可以将抗原性多肽或片段或变体配制成含或不含CPV修饰的活病毒或药物组合物的疫苗，并用于引发或刺激动物的保护性应答。在一个实施方案中，多肽抗原是CPV衣壳多肽或其活性片段或变体。CPV抗原可组装成CPV空衣壳或CPV VLP(病毒样颗粒)。
认识到本发明的抗原性多肽可以是全长多肽或其活性片段或变体。“活性片段”或“活性变体”是指片段或变体保留多肽的抗原性质。因此，本发明涵盖引发动物的免疫原性应答的任何CPV多肽、抗原、表位或免疫原。CPV多肽、抗原、表位或免疫原可以是引发、诱导或刺激动物如绵羊类动物、牛科动物、山羊类动物或猪类动物的应答的任何CPV多肽、抗原、表位或免疫原，例如但不限于蛋白质、肽或其片段或变体。
本发明涉及可包含有效量的重组CPV抗原的犬科动物疫苗或组合物。在一些实施方案中，疫苗或组合物是没有佐剂化的，并且可以包含药学上或兽医上可接受的承载体(carrier)、赋形剂或媒介物(vehicle)。
在一些实施方案中，动物的应答是保护性免疫应答。
“动物”意指哺乳动物、鸟类等。动物或宿主包括哺乳动物和人。动物可以选自由以下组成的组：马科动物(例如马)，犬科动物(例如犬，狼，狐，丛林狼，豺)，猫科动物(例如狮，虎，家猫，野猫，其他大型猫科动物，和其它猫科动物，包括猎豹和猞猁)，绵羊类动物(例如绵羊)，牛科动物(例如牛)，猪类动物(例如猪)，山羊类动物(例如山羊)，禽类(例如鸡，鸭，鹅，火鸡，鹌鹑，雉鸡，鹦鹉，雀类，鹰，乌鸦，鸵鸟，鸸鹋和食火鸡)，灵长类动物(例如，原猴类，眼镜猴，猴，长臂猿，猿)和鱼。术语“动物”还包括处于所有发育阶段包括胚胎期和胎儿期的个体动物。
除非另有解释，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本公开内容所属技术领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。除非上下文另有明确指示，否则单数术语“a”、“an”和“the”包括复数指代物。类似地，除非上下文另有明确指示，否则词语“或”旨在包括“和”。
应注意，在本公开内容中，特别是在权利要求和/或段落中，诸如“包含”(“comprises”、“comprised”、“comprising”等)的术语可以具有在美国专利法中赋予它的含义；例如它们可以意指“包括”(“includes”、“included”、“including”等)；并且诸如“基本上由...组成”(“consisting essentially of”和“consists essentially of”)的术语具有美国专利法中赋予它们的含义，例如它们允许未明确列举的元件，但排除现有技术中发现的或影响本发明的基本或新颖特征的元件。
本发明的抗原性多肽能够保护免受CPV的侵害。即，它们能够刺激动物的免疫应答。“抗原”或“免疫原”是指诱导宿主动物的特异性免疫应答的物质。抗原可包含被杀死的、减毒的或活的完整生物；生物体的亚单位或部分；含有具有免疫原性特性的插入物的重组载体；在呈递给宿主动物后能够诱导免疫应答的DNA的小片段(piece)或片段(fragment)；多肽、表位、半抗原或其任何组合。或者，免疫原或抗原可以包含毒素或抗毒素。
如本文所用，术语“免疫原性蛋白质、多肽或肽”包括在以下意义上具有免疫活性的多肽，一旦施用于宿主，其能够引起针对蛋白质的体液和/或细胞类型的免疫应答。蛋白质片段优选具有与总蛋白质基本相同的免疫活性。因此，根据本发明的蛋白质片段包含至少一个表位或抗原决定簇或基本上由其组成或由其组成。如本文所用，“免疫原性”蛋白质或多肽包括蛋白质的全长序列、其类似物或其免疫原性片段。“免疫原性片段”是指包含一个或多个表位并由此引发上述免疫学应答的蛋白质片段。可以使用本领域众所周知的任何数量的表位作图技术来鉴定这样的片段。参见例如Epitope Mapping Protocols inMethods in Molecular Biology,Vol.66(Glenn E.Morris,Ed.,1996)。例如，线性表位可以通过例如在固体支持物上同时合成大量肽来确定，所述肽对应于蛋白质分子的部分，并且在肽仍然连接到支持物的同时使肽与抗体反应。这样的技术是本领域已知的,并且描述于例如美国专利号4,708,871；Geysen et al.,1984；Geysen et al.,1986。类似地，通过例如通过X射线晶体学和2维核磁共振确定氨基酸的空间构象可以容易地鉴定构象表位。参见例如Epitope Mapping Protocols，同上。特别适用于T.parva的蛋白的方法充分描述于PCT/US2004/022605，其整体通过引用并入本文。
如所讨论的，本发明包括抗原性多肽的活性片段和变体。因此，术语“免疫原性蛋白质、多肽或肽”进一步涵盖对序列的缺失、添加和置换，只要该多肽起到产生如本文所定义的免疫学应答的作用即可。术语“保守变异”表示用另一种生物学相似残基置换氨基酸残基，或置换核酸序列中的核苷酸使得编码的氨基酸残基不变或是另一种生物学相似的残基。就此而言，特别优选的置换通常本质上是保守的，即发生在氨基酸家族内的那些置换。例如，氨基酸一般分为四个家族：(1)酸性——天冬氨酸和谷氨酸；(2)碱性——赖氨酸，精氨酸，组氨酸；(3)非极性——丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，甲硫氨酸，色氨酸；和(4)不带电的极性——甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，半胱氨酸，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时被分类为芳香族氨基酸。保守变异的例子包括用一个疏水残基如异亮氨酸，缬氨酸，亮氨酸或甲硫氨酸置换另一个疏水残基，或用一个极性残基置换另一个极性残基，例如精氨酸置换赖氨酸，谷氨酸置换天冬氨酸或谷氨酰胺置换天冬酰胺等；或用结构上相关的氨基酸对氨基酸进行类似的保守置换，其对生物活性不会产生重大影响。因此，与参考分子具有基本上相同的氨基酸序列但具有基本上不影响蛋白质免疫原性的微小氨基酸置换的蛋白质在参考多肽的定义范围内。本文包括由这些修饰产生的所有多肽。术语“保守变异”还包括使用置换的氨基酸置换未置换的亲本氨基酸，条件是用置换的多肽产生的抗体也与未置换的多肽发生免疫反应。
术语“表位”是指特定B细胞和/或T细胞应答的抗原或半抗原上的位点。该术语也可与“抗原决定簇”或“抗原决定簇位点”互换使用。识别相同表位的抗体可以在显示一种抗体阻断另一种抗体与靶抗原结合的能力的简单免疫测定中鉴定。
对组合物或疫苗的“免疫学应答”是宿主对感兴趣的组合物或疫苗的细胞和/或抗体介导的免疫应答的发展。通常，“免疫学应答”包括但不限于一种或多种以下作用：特异性针对包含在感兴趣的组合物或疫苗中的抗原的抗体，B细胞，辅助性T细胞和/或细胞毒性T细胞的产生。优选地，宿主将显示治疗性或保护性免疫学应答，使得对新感染的抗性将增强和/或疾病的临床严重性降低。这样的保护将通过感染宿主正常显示的症状减轻或缺乏、恢复时间更快和/或感染宿主病毒效价降低来证明。
定义中还包括合成抗原，例如多表位、侧翼表位和其他重组或合成衍生的抗原。参见例如Bergmann et al.,1993；Bergmann et al.,1996；Suhrbier,1997；Gardner et al.,1998。针对本发明的目的，免疫原性片段通常包括分子的至少约3个氨基酸、至少约5个氨基酸、至少约10-15个氨基酸或约15-25个氨基酸或更多个氨基酸。片段的长度没有严格的上限，其可以包含几乎全长的蛋白质序列，或者甚至包含含有蛋白质的至少一个表位的融合蛋白质。
因此，表达表位的多核苷酸的最小结构是它包含编码CPV多肽的表位或抗原决定簇的核苷酸或基本上由其组成或由其组成。编码CPV多肽片段的多核苷酸可包含编码该多肽的序列的最少15个核苷酸、约30-45个核苷酸、约45-75或至少57、87或150个连续(consecutive或contiguous)核苷酸或基本上由其组成或由其组成。可以用于本发明的实践的表位确定方法例如产生重叠肽文库(Hemmer et al.,1998)，Pepscan(Geysen et al.,1984；Geysen et al.,1985；Van der Zee R.et al.,1989；Geysen,1990；Multipin.RTM.Peptide Synthesis Kits de Chiron)和算法(De Groot et al.,1999；PCT/US2004/022605)。
术语“核酸”和“多核苷酸”是指直链或支链的、单链或双链的RNA或DNA或其杂交体。该术语还涵盖RNA/DNA杂交体。以下是多核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段，外显子，内含子，mRNA，tRNA，rRNA，核酶，cDNA，重组多核苷酸，支链多核苷酸，质粒，载体，任何序列的分离的DNA，任何序列的分离的RNA，核酸探针和引物。多核苷酸可以包含修饰的核苷酸，例如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物，尿嘧啶，其他糖和连接基团如氟核糖和硫醇盐，以及核苷酸分支。核苷酸序列可以在聚合后用标记组分(例如缀合)进一步修饰。该定义中包括的其他类型的修饰是帽，用类似物置换一个或多个天然存在的核苷酸，以及引入用于将多核苷酸连接到蛋白质、金属离子、标记组分、其他多核苷酸或固体支持物的手段。多核苷酸可以通过化学合成获得或衍生自微生物。
术语“基因”广泛地用于指与生物功能相关的任何多核苷酸区段。因此，基因包括基因组序列中的内含子和外显子，或者仅仅是cDNA中的编码序列和/或其表达所需的调控序列。例如，基因也指表达mRNA或功能性RNA或编码特定蛋白质的核酸片段并且其包含调控序列。
本发明进一步包含编码CPV抗原、表位或免疫原的多核苷酸的互补链。互补链可以是聚合的并且具有任何长度，并且可以以任何组合包含脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和类似物。
术语“蛋白质”、“肽”、“多肽”和“多肽片段”在本文中可互换使用以指任何长度的氨基酸残基的聚合物。聚合物可以是直链或支链的，它可以包含修饰的氨基酸或氨基酸类似物，并且可以被除氨基酸以外的化学部分中断。这些术语还包括已被天然或通过干预修饰的氨基酸聚合物；例如二硫键形成，糖基化，脂化，乙酰化，磷酸化或任何其他操作或修饰，例如与标记或生物活性组分缀合。
“分离的”生物组分(例如核酸或蛋白质或细胞器)是指已经基本上从其中天然存在该组分的生物细胞中的其他生物组分分离或纯化的组分，例如其他染色体和染色体外DNA和RNA、蛋白质和细胞器。已经“分离”的核酸和蛋白质包括通过标准纯化方法纯化的核酸和蛋白质。该术语还包括通过重组技术以及化学合成制备的核酸和蛋白质。
如本文所用，术语“纯化的”不需要绝对的纯度；相反，它只是一个相对术语。因此，例如，纯化的多肽制品是其中多肽比其天然环境中的多肽更富集的制品。即多肽是从细胞组分中分离出来的。所谓“基本上纯化的”是指多肽代表多个实施方案中至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或至少98％或更多细胞组分或材料已被除去。同样，该多肽可以是部分纯化的。“部分纯化的”意指少于60％的细胞组分或材料被除去。这同样适用于多核苷酸。本文公开的多肽可以通过本领域已知的任何方式纯化。
如上所述，抗原性多肽或其片段或变体是由昆虫细胞中的杆状病毒表达载体产生的CPV抗原性多肽。所公开的多核苷酸的片段和变体以及由其编码的多肽也包括在本发明中。“片段”意指多核苷酸的一部分或由其编码的抗原性氨基酸序列的一部分。多核苷酸的片段可编码保留天然蛋白质的生物学活性并因此具有免疫原性活性的蛋白质片段，如本文其他地方所述。多肽序列的片段保留了诱导动物的保护性免疫应答的能力。
“变体”旨在表示基本上相似的序列。对于多核苷酸，变体包含在天然多核苷酸内的一个或多个位点处缺失和/或添加一个或多个核苷酸和/或在天然多核苷酸中的一个或多个位点处置换一个或多个核苷酸。如本文所用，“天然”多核苷酸或多肽分别包含天然存在的核苷酸序列或氨基酸序列。也可通过比较由变体多核苷酸编码的多肽与由参考多核苷酸编码的多肽之间的序列同一性百分比来评估本发明的特定多核苷酸(即参考多核苷酸)的变体。“变体”蛋白旨在表示通过在天然蛋白中的一个或多个位点缺失或添加一个或多个氨基酸和/或在天然蛋白中的一个或多个位点处置换一个或多个氨基酸而衍生自天然蛋白的蛋白。本发明涵盖的变体蛋白质具有生物活性，即它们引发免疫应答的能力。
一方面，本发明提供来自CPV分离物的CPV多肽。另一方面，本发明提供具有SEQ IDNO：1、3、4、6、8-10中所示的序列的多肽及其变体或片段。
另一方面，本发明涉及CPV空衣壳或CPV VLP(病毒样颗粒)。衣壳可包含CPV VP2多肽或其变体(包括其截短形式)基本上由其组成或由其组成。
而且，CPV多肽的同源物意欲在本发明的范围内。如本文所用，术语“同源物”包括直系同源物、类似物和旁系同源物。术语“类似物”是指两种多核苷酸或多肽，它们具有相同或相似的功能，但在不相关的生物中分别进化。术语“直系同源物”是指来自不同物种的两种多核苷酸或多肽，但是它们已经通过物种分化(speciation)从共同的祖先基因进化而来。通常，直系同源物编码具有相同或相似功能的多肽。术语“旁系同源物”是指通过基因组内复制而相关的两种多核苷酸或多肽。旁系同源物通常具有不同的功能，但这些功能可能是相关的。野生型CPV多肽的类似物、直系同源物和旁系同源物可以通过翻译后修饰、氨基酸序列差异或两者而与野生型CPV多肽不同。具体而言，本发明的同源物将通常与野生型CPV多核苷酸序列的全部或部分具有至少80-85％,85-90％,90-95％,或95％,96％,97％,98％,99％的序列同一性，并将表现出相似的功能。变体包括等位基因变体。术语“等位基因变体”是指含有多态性的多核苷酸或多肽，所述多态性导致氨蛋白质基酸序列的改变并且该多态性存在于天然群体中(例如病毒种或变种)。这样的天然等位基因变异通常可以导致多核苷酸或多肽的1-5％的变异。可以通过测序多种不同物种中感兴趣的核酸序列来鉴定等位基因变异体，这可以通过使用杂交探针来鉴定这些物种中相同的基因遗传基因座而容易地进行。任何和所有这些核酸变异和由此引起的氨基酸多态性或变异是天然等位基因变异的结果，并且不会改变感兴趣基因的功能活性，都属于本发明的范围。
如本文所用，术语“衍生物”或“变体”是指具有一个或多个保守氨基酸变异或其他微小修饰的多肽或编码多肽的核酸，使得(1)相应的多肽与野生型多肽相比具有基本上等同的功能，或(2)针对多肽产生的抗体与野生型多肽具有免疫反应性。这些变体或衍生物包括具有对CPV多肽一级氨基酸序列进行微小修饰的多肽，其可产生与未修饰的对应多肽相比具有基本上相同活性的肽。这样的修饰可以是故意的，如通过定点诱变，或可以是自发的。术语“变体”进一步涵盖对序列的缺失、添加和置换，只要该多肽起到产生如本文所定义的免疫学应答的作用即可。
术语“保守变异”表示用另一种生物学相似残基置换氨基酸残基，或置换核酸序列中的核苷酸使得编码的氨基酸残基不变或是另一种生物学相似的残基。就此而言，如上所述，特别优选的置换通常本质上是保守的。
本公开内容的多核苷酸包括由于遗传密码而简并的序列，例如针对特定宿主优化的密码子使用。如本文所用，“优化的”是指经遗传工程改造以增加其在给定物种中的表达的多核苷酸。为了提供编码CPV多肽的优化的多核苷酸，可以将CPV蛋白质基因的DNA序列修饰为：1)包含特定物种中优选高度表达基因的密码子；2)在核苷酸碱基组成中包含基本上在所述物种中发现的A+T或G+C含量；3)形成所述物种的起始序列；或4)消除引起去稳定化、不合适的多腺苷酸化、RNA降解和终止或形成二级结构发夹结构或RNA剪接位点的序列。通过利用真核生物和原核生物或特定物种中密码子使用的分布频率可以实现所述物种中CPV蛋白表达的增加。术语“优选密码子使用频率”是指特定宿主细胞在使用核苷酸密码子来指定给定氨基酸时显示的偏好。存在20种天然氨基酸，其中大多数由多于一种密码子指定。因此，只要由核苷酸序列编码的CPV多肽的氨基酸序列在功能上不变，所有简并核苷酸序列都包括在本公开内容中。
两个氨基酸序列之间的序列同一性可以通过NCBI(美国国家生物技术信息中心)成对blast和blosum62矩阵，使用标准参数建立(参见例如可在“National Center forBiotechnology Information”(NCBI，Bethesda，MD，USA)服务器上以及在Altschul等人中获得的BLAST或BLASTX算法信息；因此，该文件谈到了使用算法或BLAST或BLASTX和BLOSUM62矩阵的术语“blast”)。
“同一性”关于序列而言可以指具有相同核苷酸或氨基酸的位置的数量除以两个序列中较短的一个中的核苷酸或氨基酸的数量，其中两个序列的比对可以根据Wilbur和Lipman算法(Wilbur和Lipman)来确定，例如使用20个核苷酸的窗口大小、4个核苷酸的字长和4的空位罚分，并且包括比对的序列数据的计算机辅助分析和解释可以使用市售程序(例如，IntelligeneticsSuite,Intelligenetics Inc.CA)方便地进行。当RNA序列被认为与DNA序列是相似的，或具有一定程度的序列同一性或同源性时，DNA序列中的胸苷(T)被认为与RNA序列中的尿嘧啶(U)相同。因此，RNA序列在本发明的范围内，并且可以通过DNA序列中的胸苷(T)被认为与RNA序列中的尿嘧啶(U)相同而衍生自DNA序列。
两个氨基酸序列的序列同一性或序列相似性或两个核苷酸序列之间的序列同一性可以使用Vector NTI软件包(Invitrogen,1600 Faraday Ave.,Carlsbad,CA)来确定。
以下文献提供了用于比较序列的相对同一性或同源性的算法，并且附加地或可选地关于前述内容，这些参考文献中的教导可以用于确定同源性或同一性百分比：NeedlemanSB and Wunsch CD；Smith TF and Waterman MS；Smith TF,Waterman MS and Sadler JR；Feng DF and Dolittle RF；Higgins DG and Sharp PM；Thompson JD,Higgins DG andGibson TJ；以及Devereux J,Haeberlie P and Smithies O。并且，在没有过度实验的情况下，本领域技术人员可以参考许多其他程序或参考文献来确定同源性百分比。
杂交反应可以在不同的“严格性”条件下进行。增加杂交反应严格性的条件是众所周知的。参见例如，“Molecular Cloning:A Laboratory Manual”，第二版(Sambrook etal.,1989)。
本发明进一步涵盖包含在载体分子或表达载体中并且与启动子元件和任选地与增强子可操作连接的CPV多核苷酸。
“载体”是指包含待体外或体内递送至靶细胞的异源多核苷酸的重组DNA或RNA质粒或病毒。异源多核苷酸可以包含用于预防或治疗目的的感兴趣的序列，并且可以任选地以表达盒的形式。如本文所用，载体需要不能在最终靶细胞或受试者中复制。该术语包括克隆载体和病毒载体。
术语“重组”是指半合成或合成来源的多核苷酸，其或者不是天然存在的，或者是以不是天然存在的排列与另一个多核苷酸连接。
“异源”是指从与其进行比较的实体的其他部分遗传上不同的实体而衍生的。例如，多核苷酸可以通过基因工程技术被置于衍生自不同来源的质粒或载体中，并且该多核苷酸是异源多核苷酸。从其天然编码序列中取出并且可操作地连接到除天然序列以外的编码序列的启动子是异源启动子。
本发明涉及可包含有效量的重组CPV抗原和药学上或兽医上可接受的承载体、佐剂、赋形剂或媒介物的绵羊类动物、牛科动物、山羊类动物和猪类动物的疫苗或药物或免疫学组合物。
本文描述的主题部分地涉及与在杆状病毒/昆虫细胞表达系统中制备的CPV抗原相关的组合物和方法，所述CPV抗原具有高免疫原性并且受保护的动物免受来自同源和异源CPV毒株的攻击。
组合物
本发明涉及可包含有效量的重组CPV抗原和药学上或兽医上可接受的承载体、赋形剂或媒介物的CPV疫苗或组合物。在一个实施方案中，重组CPV抗原由昆虫细胞的杆状病毒表达载体表达。
本发明的一个实施方案涉及包含CPV空衣壳或CPV VLP(病毒样颗粒)的疫苗或组合物。通过CPV衣壳蛋白的表达获得CPV空衣壳或CPV VLP(病毒样颗粒)。
本发明还涉及制备这些疫苗的方法，抗原用于生产这些疫苗的用途和使用它们的疫苗接种方法。
本发明还涉及与病毒的天然序列相比被修饰的核苷酸序列、特别是cDNA并且涉及氨基酸序列。本发明还涉及修饰的核苷酸序列的表达产物并且涉及并入这些修饰的CPV抗原和病毒。
本发明涵盖引发动物如绵羊类动物、牛科动物、山羊类动物或猪类动物的免疫原性应答的任何CPV多肽、抗原、表位或免疫原。CPV多肽、抗原、表位或免疫原可以是引发、诱导或刺激动物如犬科动物的应答的任何CPV多肽、抗原、表位或免疫原，例如但不限于蛋白质、肽或其片段。
在其中CPV免疫组合物或疫苗是重组免疫组合物或疫苗的实施方案中，所述组合物或疫苗包含重组载体并且是没有佐剂化的，并且可以任选地包含药物或兽医学可接受的赋形剂、承载体或媒介物；重组载体是可包含编码CPV多肽、抗原、表位或免疫原的多核苷酸的杆状病毒表达载体。CPV多肽、抗原、表位或免疫原可以是衣壳蛋白及其任何片段。
在一个实施方案中，编码一种或多种CPV抗原的核酸分子是编码CPV衣壳蛋白的cDNA。在另一实施方案中，编码一种或多种CPV抗原的核酸分子是编码CPV衣壳蛋白片段的cDNA。
在另一实施方案中，CPV抗原可以衍生自CPV毒株100869-1。
本发明涉及可包含有效量的重组CPV抗原的CPV组合物或疫苗。CPV组合物或疫苗不含有佐剂。CPV组合物或疫苗可任选含有药学上或兽医上可接受的承载体、赋形剂或媒介物。
本发明进一步涵盖包含在载体分子或表达载体中并且与启动子元件和任选地与增强子可操作连接的CPV多核苷酸。
一方面，本发明提供具有SEQ ID NO：1、3、4、6或8-10中所示的序列的CPV多肽及其变体或片段。
另一方面，本发明提供与本发明的抗原性多肽、特别是与具有SEQ ID NO:1、3、4、6或8-10中所示的序列的多肽具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的多肽。
又一方面,本发明提供上文中鉴定的CPV多肽(SEQ ID NO：1、3、4、6或8-10)的片段和变体，其可以由本领域技术人员使用众所周知的分子生物学技术容易地制备。
变体是具有与SEQ ID NO：1、3、4、6或8-10中所示的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的同源多肽。
CPV多肽的免疫原性片段包括具有SEQ ID NO：1、3、4、6或8-10中所示的序列的CPV多肽或其变体的至少8、10、15或20个连续氨基酸，至少21个氨基酸，至少23个氨基酸，至少25个氨基酸或至少30个氨基酸。在另一实施方案中，CPV多肽的片段包括全长CPV多肽中发现的特定抗原表位。然而，本领域技术人员将理解的是，必须存在足够的CPV多肽部分以使得能够形成CPV VLP。
另一方面，本发明提供编码CPV多肽的多核苷酸，例如编码具有SEQ ID NO：1、3、4、6或8-10中所示的序列的多肽的多核苷酸。又一方面,本发明提供编码以下多肽的多核苷酸：与具有SEQ ID NO：1、3、4、6或8-10中所示的序列的多肽具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的多肽，或其包含这些多肽之一的至少八个或至少十个连续氨基酸的保守性变体、等位变体、同源物或免疫原性片段，或这些多肽的组合。
另一方面，本发明提供具有SEQ ID NO：2、5、7、11或12中所示的序列的多核苷酸或其变体。又一方面，本发明提供与具有SEQ ID NO:2、5、7、11或12中所示的序列的多核苷酸或其变体之一具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的多核苷酸。
本发明的多核苷酸可包含额外的序列，例如在相同转录单元内的额外编码序列，控制元件如启动子，核糖体结合位点，5'UTR，3'UTR，转录终止子，多腺苷酸化位点，相同或不同的启动子控制下的额外转录单元，允许宿主细胞克隆、表达、同源重组和转化的序列，以及可能需要提供本发明实施方案的任何此类构建体。
用于表达CPV多肽、抗原、表位或免疫原的元件有利地存在于本发明的载体中。在最小的方式中，这包括用于某些载体例如质粒和某些病毒载体(例如除痘病毒之外的病毒载体)的起始密码子(ATG)，终止密码子和启动子，以及任选的多腺苷酸化序列，基本上由其组成或由其组成。当多核苷酸编码多聚蛋白片段时，例如CPV肽，有利地，在载体中，ATG置于阅读框的5'，而终止密码子置于3'。可以存在用于控制表达的其他元件，例如增强子序列，稳定化序列，如允许蛋白质分泌的内含子和信号序列。
本发明还涉及包含载体例如表达载体的制品(preparation)例如治疗性组合物。制剂可以包含一种或多种载体，例如包含并表达一种或多种CPV多肽、抗原、表位或免疫原的表达载体，例如体内表达载体。在一个实施方案中，在药学上或兽医上可接受的承载体、赋形剂或媒介物中，载体含有并表达多核苷酸，所述多核苷酸包含编码(并有利地表达)CPV抗原、表位或免疫原的多核苷酸，基本上由其组成或由其组成。因此，根据本发明的实施方案，制品中的其它载体包含多核苷酸，基本上由其组成或由其组成，所述多核苷酸编码且在适当的情况下，所述载体表达CPV多肽、抗原、表位或免疫原或其片段的一种或多种其他蛋白。
根据另一个实施方案，制品中的载体包含编码CPV多肽、抗原、表位或免疫原的一种或多种蛋白质或其片段的多核苷酸，或基本上由其组成或由其组成，所述载体表达所述多核苷酸。在另一实施方案中，制品包含一种、两种或更多种载体，所述载体包含编码并(有利地体内)表达CPV多肽、抗原、融合蛋白或其表位的多核苷酸。
根据本发明的又一个实施方案，表达载体是质粒载体或DNA质粒载体，特别是体内表达载体。在具体的非限制性实例中，pVR1020或1012质粒(VICAL Inc.；Luke et al.,1997；Hartikka et al.,1996,参见例如美国专利号5,846,946和6,451,769)可用作载体用于插入多核苷酸序列。pVR1020质粒衍生自PVR1012并且含有人tPA信号序列。在一个实施方案中，人tPA信号细胞包含Genbank登录号HUMTPA14的氨基酸M(1)至氨基酸S(23)。在另一具体的非限制性实例中，用作载体用于插入多核苷酸序列的质粒可以含有马科动物IGF1的信号肽序列Genbank登录号U28070氨基酸M(24)至氨基酸A(48)。可以在实践中查阅或使用的DNA质粒的其他信息可见于例如美国专利号6,852,705；6,818,628；6,586,412；6,576,243；6,558,674；6,464,984；6,451,770；6,376,473和6,221,362。
术语质粒涵盖包含根据本发明的多核苷酸和其在所希望的宿主或靶的细胞中体内表达所必需的元件的任何DNA转录单元；并且就此而言，应注意的是，超螺旋或非超螺旋的环状质粒以及线性形式意图在本发明的范围内。
除了编码CPV抗原、表位或免疫原的多核苷酸之外，每个质粒还包含或含有或基本上由其组成，任选地与异源肽序列、变体、类似物或片段融合，任选地与启动子可操作连接或在启动子控制下或依赖于启动子。一般而言，有利的是利用真核细胞中有用的强启动子。强启动子可以是但不限于人或鼠起源或任选地具有其他起源如大鼠或豚鼠的立即早期巨细胞病毒启动子(CMV-IE)，超级启动子(Ni,M.et al.,Plant J.7,661-676,1995.)。CMV-IE启动子可以包含实际启动子部分，其可以与增强子部分结合或不结合。可以参考EP-A-260148,EP-A-323 597,美国专利号5,168,062、5,385,839和4,968,615，以及参考PCT申请号WO87/03905。CMV-IE启动子有利的是人CMV-IE(Boshart et al.,1985)或鼠CMV-IE。
更一般术语中，启动子具有病毒、植物或细胞起源。可用于实施本发明的CMV-IE以外的强病毒启动子是SV40病毒的早/晚启动子或劳斯肉瘤病毒的LTR启动子。可用于实施本发明的强细胞启动子是细胞骨架基因的启动子，例如结蛋白启动子(Kwissa et al.,2000)或肌动蛋白启动子(Miyazaki et al.,1989)。
质粒可以包含其他表达控制元件。特别有利的是并入稳定化序列例如内含子序列，例如玉米醇脱氢酶内含子(Callis et al.Genes&Dev.1(10):1183-1200，1987年12月)，hCMV-IE的第一内含子(PCT申请号WO1989/01036)，兔β-球蛋白基因的内含子II(van Ooyenet al.,1979)。在另一实施方案中，质粒可以包含3’UTR。3’UTR可以是但不限于农杆菌(agrobacterium)胭脂碱合酶(Nos)3’UTR(Nopaline synthase:transcript mapping andDNA sequence.Depicker,A.et al.J.Mol.Appl.Genet.,1982；Bevan,NAR,1984,12(22):8711-8721)。
关于质粒和除痘病毒以外的病毒载体的多腺苷酸化信号(多A)，可以更多地使用牛科动物生长激素(bGH)基因的多(A)信号(参见US 5,122,458)，或兔β-球蛋白基因的多(A)信号或SV40病毒的多(A)信号。
“宿主细胞”是指已经遗传改变或能够通过施用外源多核苷酸(例如重组质粒或载体)而遗传改变的原核或真核细胞。当提到遗传改变的细胞时，该术语既指最初改变的细胞，也指其后代。
在一个实施方案中，重组CPV抗原在昆虫细胞中表达。
在一个具体实施方案中，CPV抗原在SF9细胞中表达。
使用方法
在实施方案中，本文公开的主题涉及为绵羊类动物、牛科动物、山羊类动物或猪类动物接种疫苗的方法，所述方法包括向绵羊类动物、牛科动物、山羊类动物或猪类动物施用有效量的疫苗，所述疫苗可以包含有效量的重组CPV抗原和药学上或兽医上可接受的承载体、赋形剂或媒介物。
在本发明的一个实施方案中，该方法包括用根据本发明的乳剂配制的疫苗组合物的单次施用。例如，在一个实施方案中，免疫学或疫苗组合物包含杆状病毒表达的CPV抗原，包括多肽和VLP(病毒样颗粒)或空衣壳。电子显微镜观察表明，用杆状病毒表达载体转化的昆虫细胞产生CPV VLP或CPV空衣壳，并因此根据本发明的免疫学或疫苗组合物涵盖包含CPV VLP或CPV空衣壳的那些免疫学或疫苗组合物。
在实施方案中，本文公开的主题涉及为绵羊类动物、牛科动物、山羊类动物或猪类动物接种疫苗的方法，所述方法包括向绵羊类动物、牛科动物、山羊类动物或猪类动物施用由昆虫细胞的杆状病毒载体产生的CPV抗原。
在实施方案中，本文公开的主题涉及引发免疫应答的方法，所述方法包括向绵羊类动物、牛科动物、山羊类动物或猪类动物施用包含由昆虫细胞的杆状病毒载体产生的CPV抗原的疫苗。
在实施方案中,本文公开的主题涉及制备疫苗或组合物的方法，所述方法包括分离由昆虫细胞的杆状病毒载体产生的CPV抗原和任选地与药学上或兽医上可接受的承载体、赋形剂或媒介物组合。
同源和异源CPV毒株二者均用于攻击以测试疫苗的功效。可以皮下或肌内施用。可以进行无针施用(例如，Bioject)。
在本发明的一个实施方案中，可以采用初免-加强方案，其包括使用至少一种常见多肽、抗原、表位或免疫原的至少一次初次施用和至少一次加强施用。通常，初次施用中使用的免疫组合物或疫苗在性质上与用作加强剂的那些免疫组合物或疫苗不同。但是，应该注意的是，相同的组合物可以用作初次施用和加强施用。这个施用方案被称为“初免-加强”。
根据本发明的初免-加强可以包括重组病毒载体用于表达编码其抗原多肽或片段或变体的CPV编码序列或其片段。具体地，病毒载体可以表达编码抗原多肽的CPV基因或其片段。本文考虑的病毒载体包括但不限于痘病毒[例如痘苗病毒或减毒痘苗病毒，禽痘病毒或减毒禽痘病毒(例如金丝雀痘病毒，鸡痘病毒，鸽痘(dovepox)病毒，鸽痘(pigeonpox)病毒，鹌鹑痘病毒，ALVAC，TROVAC；参见例如US 5,505,941，US 5,494,8070)，浣熊痘病毒，猪痘病毒等]，腺病毒(例如人腺病毒，犬科动物腺病毒)，疱疹病毒(例如犬科动物疱疹病毒，火鸡疱疹病毒，马立克氏病病毒，传染性喉气管炎病毒，猫科动物疱疹病毒，喉气管炎病毒(ILTV)，牛科动物疱疹病毒，猪类动物疱疹病毒)，杆状病毒，反转录病毒等。在另一实施方案中，禽痘表达载体可以是金丝雀痘载体，例如ALVAC。在又一实施方案中，禽痘表达载体可以是鸡痘载体，例如TROVAC。将待表达的本发明的CPV抗原插入特定痘病毒启动子的控制之下，所述痘病毒启动子特别是例如昆虫痘病毒Amsacta moorei 42K启动子(Barcena,Lorenzo et al.2000),痘苗启动子7.5kDa(Cochran et al.,1985),痘苗启动子I3L(Riviere et al.,1992),痘苗启动子HA(Shida,1986),牛痘启动子ATI(Funahashi etal.,1988),痘苗启动子H6(Taylor et al.,1988b；Guo et al.,1989；Perkus et al.,1989)。
本发明的初免-加强方案的另一方面，施用包含本发明的CPV抗原的组合物，接着施用包含含有并体内表达CPV抗原的重组病毒载体，或包含CPV抗原的灭活病毒疫苗或组合物，或含有或表达CPV抗原的组合物的DNA质粒疫苗或组合物。同样，初免-加强方案可以包括施用包含含有并体内表达CPV抗原的重组病毒载体，或包含CPV抗原的灭活病毒疫苗或组合物，或含有或表达CPV抗原的组合物的DNA质粒疫苗或组合物，接着施用包含本发明的CPV抗原的组合物。进一步注意到，初次施用和二次施用都可以包括包含本发明的CPV抗原的组合物。
初免-加强方案包括使用至少一种常见多肽和/或其变体或片段的至少一次初次施用和至少一次加强施用。用于初免施用的疫苗的性质可能与后来用作加强疫苗的疫苗的性质不同。初免施用可包括一次或多次施用。类似地，加强施用可包括一次或多次施用。
基于病毒载体用于其为哺乳动物的靶物种的组合物、例如基于非痘病毒病毒载体的组合物的给药体积通常为约0.1至约5.0ml、约0.1至约3.0ml和约0.5ml至约2.5ml。
可以在最后一次免疫接种后约2至4周用CPV的强毒株攻击动物如猫科动物或犬科动物测试疫苗的功效。
这些CPV毒株的进一步细节可以在欧洲生物信息学信息(EMBL-EBI)网页上找到，并且所有相关核苷酸序列通过引用并入本文。本发明人考虑到，本文列出的所有CPV毒株以及尚待鉴定的所有CPV毒株均可根据本公开的教导来表达，以产生例如有效的疫苗组合物。同源和异源毒株二者均用于攻击以测试疫苗的功效。可以对动物进行皮内、皮下、喷雾、鼻内、眼内、气管内和/或口服攻击。
可以有利地分开1至6周、例如分开约4周进行初免-加强施用。根据一个实施方案，还考虑了有利地使用基于病毒载体的疫苗的半年一次的加强剂或一年一次的加强剂。在第一次施用时动物有利地为至少6至8周龄。
用于初免-加强方案的包含本发明的重组抗原多肽的组合物是没有佐剂化的，并且可以任选包含于药学上或兽医上可接受的媒介物、稀释剂或赋形剂中。本发明的方案保护动物免受CPV侵害和/或阻止感染的动物中疾病进展。
本领域技术人员应该理解的是，本文中的公开内容是作为示例提供的，并且本发明不限于此。根据本文的公开内容和本领域的知识，本领域技术人员可以确定用于每个注射方案的施用次数、施用途径和剂量，而无需任何过度的实验。
本发明考虑了给动物至少一次施用有效量的根据本发明制备的治疗组合物。该动物可以是雄性、雌性、怀孕雌性和新生儿。该施用可以通过各种途径进行，包括但不限于肌内(IM)、皮内(ID)或皮下(SC)注射或经鼻内或口服施用。还可以通过无针设备(例如用Pigjet、Dermojet、Biojector、Avijet(Merial，GA，USA)，Vetjet或Vitajet设备(Bioject，Oregon，USA))施用根据本发明的治疗组合物。施用治疗组合物的另一方法是使用电穿孔(参见例如Tollefsen et al.,2002；Tollefsen et al.,2003；Babiuk et al.,2002；PCT申请号WO99/01158)。在另一实施方案中，通过基因枪或金颗粒轰击将治疗组合物递送至动物。
在一个实施方案中，本发明提供了治疗有效量的用于递送和在靶细胞中表达CPV抗原或表位的制剂的施用。对于本领域普通技术人员来说，治疗有效量的确定是常规实验。在一个实施方案中，该制剂包含表达载体，该表达载体包含表达CPV抗原或表位的多核苷酸和药学上或兽医上可接受的承载体、媒介物或赋形剂。在另一实施方案中，药学上或兽医上可接受的承载体、媒介物或赋形剂促进多核苷酸向宿主动物的转染或其他转移方式和/或改善载体或蛋白质在宿主中的保留(preservation)。
在一个实施方案中，本文公开的主题提供了用于区分感染和接种疫苗的动物(DIVA)的检测方法。
本文公开了使用本发明的疫苗或组合物可以检测动物中的CPV感染。本文公开了使用本发明的疫苗或组合物可以通过区分感染和接种疫苗的动物(DIVA)检测动物中的感染。
制品
在实施方案中，本文公开的主题涉及用于进行引发或诱导免疫应答的方法的试剂盒，其可以包含任何一种重组CPV免疫组合物或疫苗，或者灭活的CPV免疫组合物或疫苗，重组CPV病毒组合物或疫苗，和进行该方法的说明。
本发明的另一实施方案是用于进行诱导动物的针对CPV的免疫或保护性应答的方法的试剂盒，其包含含有本发明的CPV抗原和重组CPV病毒免疫组合物或疫苗的组合物或疫苗，和以有效量用于引发动物免疫应答的进行递送方法的说明。
本发明的另一实施方案是用于进行诱导动物的针对CPV的免疫或保护性应答的方法的试剂盒，其包含含有本发明的CPV抗原和灭活CPV免疫组合物或疫苗的组合物或疫苗，和以有效量用于引发动物免疫应答的进行递送方法的说明。
本发明的又一方面涉及用于根据如上所述的本发明的初免-加强疫苗接种的试剂盒。试剂盒可以包含至少两个小瓶：第一小瓶含有用于根据本发明的初免疫苗接种的疫苗或组合物，第二小瓶含有用于根据本发明的加强疫苗接种的疫苗或组合物。试剂盒可以有利地含有额外的第一或第二小瓶用于额外的初免疫苗接种或额外的加强疫苗接种。
本发明涵盖以下实施方案。在实施方案中，公开了包含CPV抗原或其片段或变体和药学上或兽医上可接受的承载体、赋形剂或媒介物的组合物。在另一实施方案中，公开了上述组合物，其中CPV抗原或其片段或变体包含含有CPV抗原的至少15个氨基酸的免疫原性片段。在实施方案中，公开了上述组合物，其中CPV抗原或其片段或变体是部分纯化的。在实施方案中，公开了上述组合物，其中CPV抗原或其片段或变体是基本上纯化的。
在实施方案中，公开了上述组合物，其中CPV抗原或其片段或变体是CPV多肽。在实施方案中，公开了上述组合物，其中CPV多肽是衣壳蛋白或其片段。在实施方案中，公开了上述组合物，其中CPV抗原或其片段与SEQ ID NO：1、3、4、6或8-10所示序列具有至少80％序列同一性。在一个实施方案中，公开了上述组合物，其中CPV抗原由与SEQ ID NO：2、5、7、11或12中所示的序列具有至少70％序列同一性的多核苷酸编码。在另一实施方案中，公开了向易感CPV的动物进行疫苗接种的方法，所述方法包括向动物施用上述组合物。在实施方案中，公开了向易感CPV的动物进行疫苗接种的方法，所述方法包括初免-加强方案。在实施方案中，公开了昆虫细胞中表达的基本上纯化的抗原多肽，其中多肽包含具有与具有SEQ IDNO：1、3、4、6或8-10所示序列的多肽具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。在任何实施方案中，动物优选为猫科动物或犬科动物。在一个实施方案中，公开了诊断动物的CPV感染的方法。在又一实施方案中，公开了用于初免-加强疫苗接种的试剂盒，其包含至少两个小瓶，其中第一小瓶含有本发明的组合物，第二小瓶含有用于加强疫苗接种的组合物，其包含包含重组病毒载体的组合物，或包含灭活病毒组合物的组合物，或含有或表达CPV抗原的DNA质粒组合物。
药学上或兽医上可接受的承载体或媒介物或赋形剂是本领域技术人员众所周知的。例如药学上或兽医上可接受的承载体或媒介物或赋形剂可以是0.9％NaCl(例如盐水)溶液或磷酸盐缓冲液。可用于本发明方法的其他药学上或兽医学上可接受的承载体或媒介物或赋形剂包括但不限于聚(L-谷氨酸)或聚乙烯吡咯烷酮。药学上或兽医学上可接受的承载体或媒介物或赋形剂可以是促进载体(或体外本发明的载体表达的蛋白质)施用的任何化合物或化合物的组合；有利地，承载体、媒介物或赋形剂可以促进转染和/或改善载体(或蛋白质)的保留。本文在一般性描述中讨论了剂量和剂量体积，并且也可由本领域技术人员根据本公开内容阅读并结合本领域的知识来确定，而无需任何过度实验。
有利地但非唯一地适用于质粒的含有季铵盐的阳离子脂质，有利地是具有下式的那些：
其中R1是具有12-18个碳原子的饱和或不饱和直链脂族基团，R2是含有2或3个碳原子的另一脂族基团，X是胺或羟基，例如DMRIE。在另一实施方案中，阳离子脂质可以与中性脂质例如DOPE结合。
在这些阳离子脂质中，优选DMRIE(N-(2-羟乙基)-N，N-二甲基-2,3-双(十四烷氧基)-1-丙烷铵；WO96/34109)，其有利地与中性脂质有利地为DOPE(二油酰-磷脂酰乙醇胺；Behr，1994)结合，以形成DMRIE-DOPE。
有利的是，含有佐剂的质粒混合物临时且有利地与制品施用同时形成或在制品施用之前立即形成；例如在施用之前或之前不久，形成质粒-佐剂混合物，有利地是为了在施用混合物之前给出足够的时间以形成复合物，例如，在施用之前约10至约60分钟，例如施用之前约30分钟。
当存在DOPE时，DMRIE:DOPE摩尔比有利地为约95:约5至约5:约95，更有利地约1:约1，例如1:1。
DMRIE或DMRIE-DOPE佐剂:质粒重量比可以在约50:约1至约1:约10之间，例如约10:约1至约1:约5，以及约1:约1至约1:约2，例如1:1和1:2。
在另一个实施方案中，药学上或兽医学上可接受的承载体、赋形剂、佐剂或媒介物可以是油包水乳剂。合适的油包水乳剂的实例包括在4℃下稳定且流体的基于油的油包水型疫苗乳剂，其包含：6-50v/v％的含抗原的水相，优选12-25v/v％、50-94v/v％的含有全部或部分非可代谢油(例如矿物油如石蜡油)和/或可代谢油(例如植物油或脂肪酸，多元醇或醇酯)的油相，0.2至20p/v％的表面活性剂，优选3至8p/v％，后者全部或部分或者混合物形式的聚甘油酯，所述聚甘油酯优选为聚甘油(聚)蓖麻油酸酯或聚氧乙烯蓖麻油或氢化聚氧乙烯蓖麻油。可用于油包水乳剂的表面活性剂的实例包括乙氧基失水山梨醇酯(例如聚氧乙烯(20)失水山梨醇单油酸酯(TWEEN)，可获得自AppliChem,Inc.,Cheshire,CT)和失水山梨醇酯(例如失水山梨醇单油酸酯(SPAN)，可获得自Sigma Aldrich,St.Louis,MO)。此外，对于油包水乳剂，还可参见美国专利号6,919,084，例如其实施例8，其通过引用并入本文。在一些实施方案中，含抗原的水相包含含有一种或多种缓冲剂的盐溶液。合适的缓冲溶液的例子是磷酸盐缓冲盐水。在有利的实施方案中，油包水乳剂可以是水/油/水(W/O/W)三重乳剂(美国专利号6,358,500)。其它合适乳剂的实例描述于美国专利号7,371,395中。
根据本发明的免疫学组合物和疫苗可以包含一种或多种佐剂或基本上由其组成。可用于本发明的实践的合适佐剂是：(1)丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物，马来酸酐和烯基衍生物聚合物，(2)免疫刺激序列(ISS)，如具有一个或多个非甲基化CpG单元的寡脱氧核糖核苷酸序列(Klinman et al.,1996；WO98/16247)，(3)水包油乳剂，例如M.Powell,M.Newman,Plenum Press 1995出版的“Vaccine Design,The Subunit and Adjuvant Approach”的第147页所述的SPT乳剂，和同一作品的第183页所述的乳剂MF59，(4)含有季铵盐的阳离子脂质，例如DDA，(5)细胞因子，(6)氢氧化铝或磷酸铝，(7)皂苷或(8)在引用并引入本申请中的任何文献中讨论的其他佐剂，或(9)其任何组合或混合物。
特别适用于病毒载体的水包油乳剂(3)可以基于轻质液体石蜡油(欧洲药典类型),异戊二烯油例如角鲨烷，角鲨烯,由烯烃例如异丁烯或癸烯低聚产生的油，具有直链烷基的酸或醇的酯，例如植物油，油酸乙酯，丙二醇，二(辛酸酯/癸酸酯)，甘油三(辛酸酯/癸酸酯)和丙二醇二油酸酯，或支链脂肪醇或酸的酯，特别是异硬脂酸酯。
油与乳化剂结合使用形成乳剂。乳化剂可以是非离子表面活性剂，例如：一方面为失水山梨糖醇，甘露醇(例如脱水甘露醇油酸酯)，甘油，聚甘油或丙二醇，另一方面为油酸，异硬脂酸，蓖麻油酸或羟基硬脂酸的酯，所述酯任选乙氧基化，或聚氧丙烯-聚氧乙烯共聚物嵌段如Pluronic，例如L121。
在(1)型佐剂聚合物中,优选交联的丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物，特别是由糖或多元醇的聚链烯基醚交联的聚合物。这些化合物以名称卡波姆为人所知(Pharmeuropa,vol.8,no.2,June 1996)。本领域技术人员还可以参考美国专利号2,909,462，其提供了由具有至少三个羟基，优选不多于八个这种基团的多羟基化合物交联的丙烯酸类聚合物，至少三个羟基的氢原子被具有至少两个碳原子的不饱和脂族基团取代。优选的基团是含有2至4个碳原子的基团，例如乙烯基，烯丙基和其他烯键式不饱和基团。不饱和基团还可以含有其他取代基，例如甲基。以名称Carbopol(BF Goodrich，Ohio，USA)出售的产品特别合适。它们通过烯丙基蔗糖或通过烯丙基季戊四醇交联。其中，参考了Carbopol 974P、934P和971P。
至于马来酸酐-链烯基衍生物共聚物，优选EMA(Monsanto)，它们是直链或交联的乙烯-马来酸酐共聚物，它们例如通过二乙烯基醚交联。还参考了J.Fields et al.,1960。
关于结构，丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物和EMA优选由具有下式的碱性单元形成：
其中：R1和R2(其可以相同或不同)表示H或CH3；x＝0或1，优选x＝1；y＝1或2，其中x+y＝2。对于EMA，x＝0且y＝2，而对于卡波姆，x＝y＝1。
这些聚合物可溶于水或生理盐溶液(20g/l NaCl)中，并且可通过例如苏打(NaOH)将pH调节至7.3至7.4，以提供其中表达载体可以在并入其中的佐剂溶液。最终免疫学或疫苗组合物中的聚合物浓度可以在约0.01至约1.5％w/v，约0.05至约1％w/v和约0.1至约0.4％w/v的范围内。
细胞因子(5)可以蛋白质的形式存在于免疫学或疫苗组合物中，或者可以在宿主中与其免疫原或表位共表达。优选通过与表达其免疫原或表位相同的载体或通过其分开的载体进行细胞因子的共表达。
本发明包括制备这种组合组合物；例如通过混合活性组分，有利地一起混合并与承载体、细胞因子和/或稀释剂混合。
可用于本发明的细胞因子包括但不限于粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，干扰素α(IFNα)，干扰素β(IFNβ),干扰素γ,(IFNγ),白介素-1α(IL-1α),白介素-1β(IL-1β),白介素-2(IL-2),白介素-3(IL-3),白介素-4(IL-4),白介素-5(IL-5),白介素-6(IL-6),白介素-7(IL-7),白介素-8(IL-8),白介素-9(IL-9),白介素-10(IL-10),白介素-11(IL-11),白介素-12(IL-12),肿瘤坏死因子α(TNFα),肿瘤坏死因子β(TNFβ),多肌胞苷酸和胞苷酸,胞苷磷酸-鸟苷寡脱氧核苷酸(CpG ODN),和转化生长因子β(TGFβ)。应该理解细胞因子可以与本发明的免疫学或疫苗组合物共同施用和/或相继施用。因此，例如，本发明的疫苗还可以含有体外表达合适的细胞因子的外源性核酸分子，例如与待接种疫苗的宿主相匹配的细胞因子或其中引发免疫应答的细胞因子(例如，用于施用于牛科动物的制品的牛科动物细胞因子)。
在基于杆状病毒/昆虫细胞表达的多肽的免疫组合物和/或疫苗的情况下，剂量可以包括约1μg至约2000μg，约50μg至约1000μg和约100μg至约500μg的CPV抗原、表位或免疫原。剂量可以包括约102至约1020个VLP，约103至约1020，约104至约1020。剂量体积可以为约0.1至约10ml，约0.2至约5ml。总之，本领域技术人员知道许多给药策略，并且将能够优化给药而不需要进行非常规工作。
一个方面，本发明提供包含病毒样颗粒(VLP)组分和修饰的活病毒(MLV)组分的组合疫苗，其中VLP和MLV都针对相同的病原体或疾病，并且其中组合疫苗克服母源抗体(MDA)。
在一些实施方案中，组合疫苗用单剂量提供保护性免疫。
在一些实施方案中，病原体或疾病是犬科动物细小病毒(CPV)。
在一些实施方案中，病原体或疾病是口蹄疫病毒(FMDV)。
在一些实施方案中，该组合的VLP组分包含作为总蛋白质含量的函数的至少10％CPV VLP(w/w)。
在一些实施方案中，VLP组分包含至少20％CPV VLP(w/w)。
在一个实施方案中，CPV VLP由昆虫细胞的杆状病毒载体表达。
在一些实施方案中，CPV VLP包含至少一种CPV衣壳蛋白。
在一些实施方案中，CPV VLP包含具有SEQ ID NO：1、3、4、6、8、9或10中所示的序列的CPV多肽；或者，CPV VLP包含与SEQ ID NO：1、3、4、6、8、9或10中所示的序列具有至少90％同一性的CPV多肽。
在一些实施方案中，CPV VLP包含由具有SEQ ID NO：2、5或7中所示的序列的多核苷酸编码的CPV多肽；或者，CPV VLP包含由与SEQ ID NO：2、5或7中所示的序列具有至少90％同一性的多核苷酸编码的CPV多肽。
在一些实施方案中，组合疫苗是没有佐剂化的，并且任选包含药学上或兽医上可接受的承载体、赋形剂或媒介物。
另一方面，本发明提供了用于产生CPV VLP的质粒，其包含编码具有SEQ ID NO：1、3、4、6或8-10中所示的序列的CPV抗原的多核苷酸，或与SEQ ID NO：1、3、4、6或8-10中所示的序列具有至少90％的同一性的多核苷酸序列。
在一些实施方案中，多核苷酸包含SEQ ID NO:2、5、7、11或12中所示的序列或由其组成。
在一些实施方案中，质粒由SEQ ID NO:11或12中所示的序列组成。
在一些实施方案中，质粒稳定转化进入昆虫细胞，从而表达CPV VLP。
另一方面，本发明提供了在昆虫细胞中表达的基本上纯化的CPV空衣壳或CPVVLP，其中CPV空衣壳或VLP包含具有SEQ ID NO：1、3、4、6或8-10中所示的序列的多肽；或者，CPV空衣壳或VLP包含与SEQ ID NO：1、3、4、6或8-10中所示的序列具有至少90％同一性的多肽。
在一些实施方案中，CPV空衣壳或VLP由具有SEQ ID NO:1、3、4、6或8-10中所示的序列的多肽组成。
另一方面，本发明提供引发动物的针对CPV的免疫应答的方法，其包括向动物施用本文所公开的组合物、疫苗、组合疫苗和VLP。
在一些实施方案中，免疫应答保护疫苗接种者对抗后续暴露于强毒CPV。暴露可以是天然的或实验性的。
在一些实施方案中，无论所述动物中存在高水平的抗CPV的母源抗体(MDA)与否，均在接种的动物中引发免疫应答。“高水平”具有通常的含义，并且通常是指妨碍现有技术疫苗引发MDA阳性动物的强烈的保护性应答的能力的MDA水平。
现在将通过以下非限制性实施例进一步描述本发明。
实施例
除非另有描述，否则使用由J.Sambrook等人(Molecular Cloning:A LaboratoryManual,2nd Edi t ion,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NewYork,1989)描述的标准分子生物学技术进行DNA插入物、质粒和重组病毒或杆状病毒载体的构建。
实施例1杆状病毒/昆虫细胞系统中CPV衣壳抗原的构建与表达
目的：产生编码针对昆虫细胞和产生重组杆状病毒BacMEB072优化的CPV(犬科动物细小病毒，Souriou毒株血清型2c)的CPV衣壳蛋白的基于pVL1393的转移质粒以表达病毒样颗粒(VLP)。参考序列是毒株Souriou 2c(Merial),命名为Genbank BAD34656/SwissprotP61826(SEQ ID NO:1)。
CPV衣壳基因(1755bp)编码584个氨基酸的多肽(不含信号肽)。克隆编码CPV VP2蛋白的序列(SEQ ID NO:1)，其相应的DNA序列针对昆虫细胞进行密码子优化(SEQ ID NO:5)。潜在的功能结构域如下表1所示。
表1潜在功能结构域如下(根据P61826的Swiss-prot注释)
推定结构域 从...至...(或位置) 长度
信号序列 无
成熟链VP2 1-584 584
N-糖基化 25-47-64-180-443-505-517
N-糖基化位点 490-494
产生质粒pMEB072。使用载体和插入物两者的XbaI和Bam HI位点将针对昆虫表达优化的CPV衣壳(SEQ ID NO：1)克隆到商业质粒pVL1393(Pharmingen)中以产生表达质粒pMEB072。
产生重组杆状病毒BacMEB072。所用的杆状病毒载体是通过仅通过同源重组拯救的致死缺失修饰的AcNPV(BaculoGold DNA，Pharmingen)。使用质粒pMEB072通过同源重组产生编码在多角体蛋白启动子控制下的CPV衣壳基因毒株Souriou血清型2c的重组杆状病毒。根据制造商的方案(Baculogold，Pharmingen)，用质粒pMEB072和Bsu36I三切割线性化AcNPV DNA共转染草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)(Sf)9昆虫细胞。将来自共转染上清液的重组杆状病毒噬斑纯化两次。5个克隆在28℃下以25cm2单层瓶规模扩增(第1代)。使用特异于CPV衣壳抗原的单克隆(CPV103B10A)通过斑点印迹(Dot Blot)分析感染的细胞和上清液的CPV衣壳表达。克隆1显示正确的斑点印迹轮廓。该克隆在28℃以105rpm在Erlenmeyer(悬浮液)中以50mL规模进一步扩增(第2代)。以200mL规模进行第三次传代(第3代)以获得用于蛋白质表达的病毒原种(stock)。该病毒原种然后通过噬斑测定(plaqueassay)进行滴定。使用补充有2％FCS的SF900II培养基获得病毒原种。滴定后，将重组杆状病毒原种(第3代)用于无血清培养基中的蛋白质生产。
杆状病毒BacMEB072的表达分析
表2
质粒 大小(AA) PM(kDa) 信号肽 标签 N-糖基化 二硫桥 定位
pMEB062 545 59.2 无 无 10个潜在位点 无 分泌
昆虫细胞(Sf9)用BacMEB072以1pfu/ml的感染复数(MOI)感染。昆虫细胞在28℃下在不含FCS的Sf900II培养基中以105rpm培养4天。通过将全部Sf9裂解物和培养物上清液上样至SDS-PAGE(4-20％，Invitrogen)，然后用单克隆抗体(CPV103B10A)进行斑点印迹来分析蛋白质产量。通过将裂解缓冲液(50mM Tris-Hcl pH8,500mM NaCl+抗蛋白酶)裂解细胞沉淀、超声处理3X(20％功率15秒，等待30秒,20％功率15秒；在冰上裂解5分钟)研究表达蛋白的溶解度。通过离心(在4℃以11,000rcf 30分钟)从不溶性材料中分离可溶性蛋白质。
通过考马斯染色观察到在裂解并澄清的感染细胞的细胞沉淀中预期大小的条带。蛋白质在细胞中积累，但也在裂解后的可溶性级分中检测到。使用针对CPV衣壳的特异性单克隆抗体(CPV103B10A)通过斑点印迹证实VP2蛋白的身份。
电子显微镜(EM)分析证实衣壳蛋白正确自动组装成VLP，其具有25-30nm的直径和细小病毒样病毒体的正确形态(图4)。VLP生产的最佳条件是使用MOI＝0.1并在感染后5天收获。尽管可以考虑其他条件，但这些特定条件产生了约1011个VLP/ml的浓度。
实施例2-生产含有截短的CPV VP2的BacMEB073
目的是产生编码针对哺乳动物优化的CPV(犬科动物细小病毒，毒株Souriou血清型2c)的截短的VP2衣壳蛋白的基于pVL1393的转移质粒，然后产生表达VLP的相应重组杆状病毒BacMEB073。为了增强VP2表达而不阻止VLP形成，缺失9个N-末端氨基酸(-9AA)(Hurtado et al.Journal of Virology,August 1996)。另外，为了改善衣壳结构和形成，添加了三种氨基酸(M、L和K)(Gilbert et al.,Journal of Nanobiotechnology,2006)。在本公开之前，不知道导入缺失和插入二者对CPV VP2表达和随后的衣壳形成会产生什么影响。
使用载体和插入物的Bam HI和Xba I位点将截短的VP2基因(在N-末端9个氨基酸的缺失由另外的MLK代替)并且针对哺乳动物优化(Geneart)进一步克隆到质粒pVL1393中。
杆状病毒载体的产生和蛋白质的表达。杆状病毒载体：通过仅通过同源重组拯救的致死缺失修饰的AcNPV(BaculoGold DNA，Pharmingen)。
产生重组杆状病毒BacMEB073。使用质粒pMEB073通过同源重组产生编码在多角体蛋白启动子控制下毒株Souriou血清型2c的截短的CPV衣壳基因的重组杆状病毒。根据制造商的方案(Baculogold，Pharmingen)，用质粒pMEB073和Bsu36I三切割线性化AcNPV DNA共转染草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)(Sf)9昆虫细胞。将来自共转染上清液的重组杆状病毒噬斑纯化两次。5个克隆在28℃下以25cm2单层瓶规模扩增(第1代)。使用特异于CPV衣壳抗原的单克隆(CPV103B10A)通过斑点印迹(Dot Blot)分析感染的细胞和上清液的CPV衣壳表达。克隆1显示正确的斑点印迹轮廓。该克隆在28℃以105rpm在Erlenmeyer(悬浮液)中以50mL规模进一步扩增(第2代)。以200mL规模进行第三次传代(第3代)以获得用于蛋白质表达的病毒原种。该病毒原种然后通过噬斑测定进行滴定。使用补充有2％FCS的SF900II培养基获得病毒原种。
滴定后，将重组杆状病毒原种(第3代)用于无血清培养基中的蛋白质生产。
表达分析
表3.预期的重组物
昆虫细胞(Sf9)用BacMEB073以MOI＝1pfu/ml感染。昆虫细胞在28℃下在不含FCS的Sf900II培养基中以105rpm培养4天。通过将全部Sf9裂解物和培养物上清液上样至SDS-PAGE(4-20％，Invitrogen)，然后用单克隆抗体(CPV103B10A)进行斑点印迹来分析蛋白质产量。
通过将裂解缓冲液(50mM Tris-Hcl pH8,500mM NaCl+抗蛋白酶)裂解细胞沉淀、超声处理3X(20％功率(potency)15秒，等待30秒,20％功率15秒；在冰上破碎5分钟)研究表达蛋白的溶解度。通过离心(在4℃以11000rcf 30分钟)从不溶性材料中分离可溶性蛋白质。
结果和结论。通过考马斯染色观察到在裂解并澄清的感染细胞的细胞沉淀中64kDa预期大小的条带。蛋白质在细胞中积累，但也可在裂解后的可溶性级分中检测到。使用特异性CPV衣壳mAb(CPV103B10A)通过斑点印迹确认VP2蛋白的身份。
EM分析证实衣壳蛋白自动组装成直径为25-30nm的VLP，以及在每毫升1012个VLP的浓度下细小病毒样病毒体的正确形态(图4)。在感染后5天收获时，VLP产量在MOI＝0.1时是最佳的，但其他条件也可产生高水平的VLP。
实施例3用杆状病毒表达的CPV衣壳蛋白疫苗接种犬科动物
该研究的主要目的是评估和比较CPV2c毒株Souriou的2种病毒样颗粒(VLP)在幼犬中的安全性和免疫原性(即实施例1和2中描述的BacMEB072和BacMEB073)。次要目的是评估氢氧化铝/皂角苷或Iscomatrix对BacMEB072和BacMEB073产生的VLP的免疫原性的佐剂作用。八周龄大的幼犬如表4中所示接种疫苗并进行研究.
表4.截短的CPV VP2VLP v.全长CPV VP2MLV研究的实验设计
*接种疫苗前
在安全性方面，Al(OH)3/皂苷没有诱导一般反应，除局部炎热和肿胀外，没有引起任何一般反应或任何其他症状。在大多数犬的每次接种疫苗后观察到3至4天轻度肿胀。Iscomatrix似乎是非常安全的佐剂。在免疫原性方面，用VLP CPV2接种幼犬能够诱导体液和细胞免疫应答，但在VLP中的相关性方面截短型或全长型VP2没有显著区别。值得注意的是，当VLP用Al(OH)3/皂苷或Iscomatrix进行佐剂化时，体液免疫应答的持续时间增加，两种研究的佐剂之间无显著差异。此外，不仅与没有佐剂化的组，而且与Al(OH)3/皂苷组相比，Iscomatrix佐剂均增加了IFNγ应答的量级。
实施例4用杆状病毒表达的CPV VLP或MLV CPV(毒株Souriou或Bari)接种犬科动物
该研究的目的是比较用CPV VLP、Souriou CPV MLV或Bari CPV MLV 接种的幼犬的免疫应答。第一个实验比较1.52log10TCID50/mL(IFI)Souriou；1.0log10TCID50/mL(HA)Bari；和pMEB072VLP(结果见图8)。第二项实验比较2.21log10TCID50/mL(IFI)Souriou；2.0log10TCID50/mL(HA)Bari；和Al(OH)3+皂苷佐剂中的pMEB073产生的VLP(结果见图9)。最后，第三项实验比较3.81log10TCID50/mL(IFI)Souriou；3.0log10TCID50/mL(HA)Bari；和Al(OH)3+皂苷佐剂中的pMEB072产生的VLP(结果见图10)。总之，这些结果显示，与示例性CPV MLV相比，根据本公开制备的CPV VLP提供了可比较的免疫应答。重要的是，与任一MLV毒株的低剂量和中剂量相比，VLP能够诱导更快的免疫应答。
实施例5用CPV MLV或杆状病毒表达的CPV衣壳蛋白+MLV CPV接种犬科动物
该研究的目的是评估不同疫苗候选物以不同剂量和皮下在具有母体抗体的幼犬中的免疫原性。在此研究之前，尚不清楚CPV VLP是否可克服母体抗体诱导幼犬的保护性免疫。
表5.CPV VLP v.CPV MLV研究的实验设计
如图11、图12和表6所示，MLV+VLP组的CPV抗体效价显著较高。这些数据表明向疫苗制剂中加入CPV VLP足以克服母体抗体，这是令人惊讶且出乎意料的结果。本发明人设想VLP捕获显著比例的循环CPV MDA，其继而使VLP和CPV MLV主动免疫幼犬。
表6.根据接种后数天的抗CPV抗体效价(IHA)
组 ID 0 7 14 21
MLV 2252826 10 <5 2560 320
MLV 2253001 10 <5 1280 <5
MLV 2284928 80 <5 <5 <5
MLV 2284973 80 20 <5 20
MLV 2284975 80 20 <5 10
MLV 2285160 <5 <5 <5 5
MLV 2285360 160 40 <5 20
MLV 2285367 40 <5 <5 20
MLV 2285387 10 5 <5 <5
MLV+VLP 2252827 80 640 1280 320
MLV+VLP 2252828 5 160 5120 2560
MLV+VLP 2284818 10 640 2560 2560
MLV+VLP 2284843 10 640 2560 1280
MLV+VLP 2284861 20 1280 1280 1280
MLV+VLP 2284935 40 640 1280 320
MLV+VLP 2284941 80 640 1280 640
MLV+VLP 2284943 20 320 1280 1280
MLV+VLP 2284978 40 1280 1280 1280
MLV+VLP 2285000 80 320 640 640
MLV:修饰的活疫苗(5.5log10/ml)
VLP:病毒样颗粒,500μg
实施例6用杆状病毒表达的CPV衣壳蛋白、MLV CPV或腺病毒载体化的CDV接种犬科动物
该研究的目的是评估通过不同途径施用的几剂不同疫苗候选物的免疫原性。不同的候选者是CPV VLP，和表达CPV或CDV(犬瘟热)基因的重组腺病毒。
表7.CPV VLP v.Adeno CPV v.Adeno CDV研究的实验设计
如图13中，组A和E诱导幼犬的保护水平的CPV抗体效价。
实施例7用杆状病毒表达的CPV衣壳蛋白(VLP)、 C4、单独的 C4或接种犬科动物
该研究的目的是评估在施用含有常规CPV-2MLV或杆状病毒表达的CPV-2c重组病毒样颗粒疫苗(VLP)的多种实验性多价疫苗制剂和一种竞争者/商业疫苗后具有CPV MDA的犬中的抗体应答。
使用窝产物(litter)和抗体效价将来自先前在妊娠期间针对CPV免疫的母犬的四十只6-7周龄母源抗体(MDA)阳性比格犬随机分配至四个处理组(n＝10只犬)。将第-27天收集的血液样品滴定用于随机化。用根据下表8分配的疫苗间隔21天将所有犬接种两次。幼犬在D0具有CPV母源抗体(MDA)。
表8.CPV VLP v. C4和研究的实验设计
*犬科动物细小病毒VP2的病毒样颗粒：VLP CPV-2c
**在约3厘米远的同时接种疫苗的同一侧施用
***CDV-CAV-CPi-CPV2疫苗被称为C4
HA:0.5毫升中的血凝
在第0、7、15、21、28、35和42天从所有犬收集血液，并通过HAI和血清中和性抗体(SNA)测定测试血清的CPV抗体。
报道CPV HAI效价为阻止血凝的最高稀释度的倒数，并且值<20被认为是阴性。
除第3组中的2只犬(C4)外，在接种疫苗之前的第0天，各组中的所有犬都通过HAI测试为CPV阳性。接种疫苗后的血清转化定义为从第0天开始效价增加4倍或更多。第一次接种疫苗后，到第7天10只接种VLP-CPV2c的犬(第1组)中有6只和10只接种了VLP-CPV2c-C4的犬(第2组)中有6只发生血清转化。在第7天第3组和第4组(即不含VLP的组)没有应答者。到第21天，第2组(VLP-CPV2c-C4)中10只犬中有5只，第1组(VLP-CPV2c)中10只犬中有4只，第4组中10只犬中有3只和第3组(C4)中10只犬中有2只发生血清转化(图15)。
在第二次接种疫苗后，到第35天(接种后(post-vax)2周)，第2组(VLP-CPV2c-C4)和第4组的所有犬中均观察到血清转化，然后第3组(C4)中有9只和第1组(VLP-CPV2c)中有8只。在整个研究中，VLP+C4(第2组)处理诱导了最高的几何平均抗体效价。参见图17。在V2后7天，在第28天，该组的GMT是单独VLP(GMT＝520)的-7.5倍，是单独C4(GMT＝422)的-9倍，是组(GMT＝139)的-28倍。
表9.CPV VLP v. C4和研究的按ID和天的IHA效价
表10.CPV VLP v. C4和研究的汇总统计数据
*为了计算汇总统计数据，从这些值中删除了'<'标记。
实施例8用杆状病毒表达的CPV衣壳蛋白(VLP)、 C4、单独的 C4或接种犬科动物
本研究的目的是评估结合CPV-2MLV多价疫苗配方和一种商业疫苗以不同效价施用由犬细小病毒2c型(VLP CPV-2c)的VP2衣壳蛋白制成的实验病毒样颗粒后在具有CPVMDA的犬中的CPV抗体应答。
使用窝产物和抗体效价将来自先前在妊娠期间针对CPV免疫的母犬的五十只6-7周龄母源抗体(MDA)阳性比格犬随机分配至四个处理组(n＝10只犬/组)。将第-15天收集的血液样品滴定用于随机化。
通过用稀释剂组分再水化冻干组分来制备疫苗。用于测试疫苗#1、#2、#3和#5的冻干系列是相同的实验性4路(C4)疫苗。每种组分的效价如下：CPV:6.1Log TCID50/ml(约0.2ml的1X培养物),CDV:7.3Log TCID50/ml,CPi:5.5Log TCID50/ml和CAV2:6.0LogTCID50/ml。用根据下表11分配的疫苗间隔21天将所有犬接种两次。
表11.CPV VLP v. C4和研究的实验设计
在第0、7、15、21、28、34和42天从所有犬收集血液，并通过HAI测定测试血清的CPV抗体。
报道CPV HAI效价为阻止血凝的最高稀释度的倒数，并且值<20被认为是阴性。在接种疫苗之前的第0天，每组中的所有犬都通过HAI检测CPV阳性(所有组的GMT平均效价为42.87至80)。接种疫苗后的血清转化定义为从第0天开始效价增加4倍或更多。犬血清转化被归类为应答者(图18)。第一次接种疫苗后7天，用高剂量VLP-CPV2c-C4(第1组)接种的10只犬中有5只，用中剂量VLP-CPV2c-C4(第2组)接种的10只犬中有1只发生血清转化。在第7天第3、4组和第5组没有应答者(即含低VLP或不含VLP的组)。第一次接种疫苗后21天，来自第1组(高剂量VLP-CPV2c-C4)的所有犬，第2组(中剂量VLP-CPV2c-C4)中的10只犬中有3只，第3组(低剂量VLP-CPV2c-C4)中的10只犬中有1只。第4组和第5组(即不含VLP的组)没有应答者(图18)。
在第34天，第二次接种疫苗后13天，第1组(高剂量VLP-CPV2c-C4)和第4组中的所有犬，然后第2组(中剂量VLP-CPV2c-C4)9只犬，第3组(低剂量VLP-CPV2c-C4)中的6只犬和第5组(C4无VLP)中的1只犬都观察到血清转化。
如图19所示，高剂量VLP+C4(第1组)处理诱导了最高的几何平均抗体效价。V2后13天，在第34天，该组的GMT为4457.22，随后是中剂量VLP-CPV2c-C4和组；(GMT＝1470.33)，低剂量VLP-CPV2c-C4(GMT＝298.57)和单独C4(GMT＝45.95)。
表12.第二CPV VLP v.C4和研究的按组、ID和天的HI结果
*出于实施例8的目的，下面的表格和图表中将使用以下名称。
*C4+高剂量VLP-CPV2c＝测试疫苗#1
*C4+中剂量VLP-CPV2c＝测试疫苗#2
*C4+低剂量VLP-CPV2c＝测试疫苗#3
*C4+无VLP-CPV2c＝测试疫苗#5
表13.第二CPV VLP v. C4和研究的按组的汇总统计数据*
表14.按组和天计算的应答者数(血清转化)；1＝是，0＝否；血清转化被定义为从基线开始效价增加4倍或更多。
因此，在MDA+幼犬中CPV VLP促进早于单独MLV的免疫开始(onset of immunity，OOI)，且在MDA+幼犬中CPV VLP与MLV C4协同作用。申请人认为这些结果是出乎意料的并且非常有利。克服母源抗体长期以来已经对疫苗生物学家提出了挑战，并且这些数据表明本文公开的VLP+MLV方法可以广泛地应用于为MDA+后代提供保护性免疫力的问题。
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VP2 of Canine parvovirus - GenBank BAD34656.1
<400> 1
Met Ser Asp Gly Ala Val Gln Pro Asp Gly Gly Gln Pro Ala Val Arg
1 5 10 15
Asn Glu Arg Ala Thr Gly Ser Gly Asn Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Ser Gly Gly Val Gly Ile Ser Thr Gly Thr Phe Asn Asn Gln
35 40 45
Thr Glu Phe Lys Phe Leu Glu Asn Gly Trp Val Glu Ile Thr Ala Asn
50 55 60
Ser Ser Arg Leu Val His Leu Asn Met Pro Glu Ser Glu Asn Tyr Arg
65 70 75 80
Arg Val Val Val Asn Asn Leu Asp Lys Thr Ala Val Asn Gly Asn Met
85 90 95
Ala Leu Asp Asp Thr His Ala Gln Ile Val Thr Pro Trp Ser Leu Val
100 105 110
Asp Ala Asn Ala Trp Gly Val Trp Phe Asn Pro Gly Asp Trp Gln Leu
115 120 125
Ile Val Asn Thr Met Ser Glu Leu His Leu Val Ser Phe Glu Gln Glu
130 135 140
Ile Phe Asn Val Val Leu Lys Thr Val Ser Glu Ser Ala Thr Gln Pro
145 150 155 160
Pro Thr Lys Val Tyr Asn Asn Asp Leu Thr Ala Ser Leu Met Val Ala
165 170 175
Leu Asp Ser Asn Asn Thr Met Pro Phe Thr Pro Ala Ala Met Arg Ser
180 185 190
Glu Thr Leu Gly Phe Tyr Pro Trp Lys Pro Thr Ile Pro Thr Pro Trp
195 200 205
Arg Tyr Tyr Phe Gln Trp Asp Arg Thr Leu Ile Pro Ser His Thr Gly
210 215 220
Thr Ser Gly Thr Pro Thr Asn Ile Tyr His Gly Thr Asp Pro Asp Asp
225 230 235 240
Val Gln Phe Tyr Thr Ile Glu Asn Ser Val Pro Val His Leu Leu Arg
245 250 255
Thr Gly Asp Glu Phe Ala Thr Gly Thr Phe Phe Phe Asp Cys Lys Pro
260 265 270
Cys Arg Leu Thr His Thr Trp Gln Thr Asn Arg Ala Leu Gly Leu Pro
275 280 285
Pro Phe Leu Asn Ser Leu Pro Gln Ala Glu Gly Gly Thr Asn Phe Gly
290 295 300
Tyr Ile Gly Val Gln Gln Asp Lys Arg Arg Gly Val Thr Gln Met Gly
305 310 315 320
Asn Thr Asn Tyr Ile Thr Glu Ala Thr Ile Met Arg Pro Ala Glu Val
325 330 335
Gly Tyr Ser Ala Pro Tyr Tyr Ser Phe Glu Ala Ser Thr Gln Gly Pro
340 345 350
Phe Lys Thr Pro Ile Ala Ala Gly Arg Gly Gly Ala Gln Thr Asp Glu
355 360 365
Asn Gln Ala Ala Asp Gly Asp Pro Arg Tyr Ala Phe Gly Arg Gln His
370 375 380
Gly Gln Lys Thr Thr Thr Thr Gly Glu Thr Pro Glu Arg Phe Thr Tyr
385 390 395 400
Ile Ala His Gln Asp Thr Gly Arg Tyr Pro Glu Gly Asp Trp Ile Gln
405 410 415
Asn Ile Asn Phe Asn Leu Pro Val Thr Glu Asp Asn Val Leu Leu Pro
420 425 430
Thr Asp Pro Ile Gly Gly Lys Thr Gly Ile Asn Tyr Thr Asn Ile Phe
435 440 445
Asn Thr Tyr Gly Pro Leu Thr Ala Leu Asn Asn Val Pro Pro Val Tyr
450 455 460
Pro Asn Gly Gln Ile Trp Asp Lys Glu Phe Asp Thr Asp Leu Lys Pro
465 470 475 480
Arg Leu His Val Asn Ala Pro Phe Val Cys Gln Asn Asn Cys Pro Gly
485 490 495
Gln Leu Phe Val Lys Val Ala Pro Asn Leu Thr Asn Glu Tyr Asp Pro
500 505 510
Asp Ala Ser Ala Asn Met Ser Arg Ile Val Thr Tyr Ser Asp Phe Trp
515 520 525
Trp Lys Gly Lys Leu Val Phe Lys Ala Lys Leu Arg Ala Ser His Thr
530 535 540
Trp Asn Pro Ile Gln Gln Met Ser Ile Asn Val Asp Asn Gln Phe Asn
545 550 555 560
Tyr Val Pro Ser Asn Ile Gly Gly Met Lys Ile Val Tyr Glu Lys Ser
565 570 575
Gln Leu Ala Pro Arg Lys Leu Tyr
580
<210> 2
<211> 9632
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pVL1393 - 9632 bp baculovirus transfer vector from Invitrogen
<400> 2
aagctttact cgtaaagcga gttgaaggat catatttagt tgcgtttatg agataagatt 60
gaaagcacgt gtaaaatgtt tcccgcgcgt tggcacaact atttacaatg cggccaagtt 120
ataaaagatt ctaatctgat atgttttaaa acacctttgc ggcccgagtt gtttgcgtac 180
gtgactagcg aagaagatgt gtggaccgca gaacagatag taaaacaaaa ccctagtatt 240
ggagcaataa tcgatttaac caacacgtct aaatattatg atggtgtgca ttttttgcgg 300
gcgggcctgt tatacaaaaa aattcaagta cctggccaga ctttgccgcc tgaaagcata 360
gttcaagaat ttattgacac ggtaaaagaa tttacagaaa agtgtcccgg catgttggtg 420
ggcgtgcact gcacacacgg tattaatcgc accggttaca tggtgtgcag atatttaatg 480
cacaccctgg gtattgcgcc gcaggaagcc atagatagat tcgaaaaagc cagaggtcac 540
aaaattgaaa gacaaaatta cgttcaagat ttattaattt aattaatatt atttgcattc 600
tttaacaaat actttatcct attttcaaat tgttgcgctt cttccagcga accaaaacta 660
tgcttcgctt gctccgttta gcttgtagcc gatcagtggc gttgttccaa tcgacggtag 720
gattaggccg gatattctcc accacaatgt tggcaacgtt gatgttacgt ttatgctttt 780
ggttttccac gtacgtcttt tggccggtaa tagccgtaaa cgtagtgccg tcgcgcgtca 840
cgcacaacac cggatgtttg cgcttgtccg cggggtattg aaccgcgcga tccgacaaat 900
ccaccacttt ggcaactaaa tcggtgacct gcgcgtcttt tttctgcatt atttcgtctt 960
tcttttgcat ggtttcctgg aagccggtgt acatgcggtt tagatcagtc atgacgcgcg 1020
tgacctgcaa atctttggcc tcgatctgct tgtccttgat ggcaacgatg cgttcaataa 1080
actcttgttt tttaacaagt tcctcggttt tttgcgccac caccgcttgc agcgcgtttg 1140
tgtgctcggt gaatgtcgca atcagcttag tcaccaactg tttgctctcc tcctcccgtt 1200
gtttgatcgc gggatcgtac ttgccggtgc agagcacttg aggaattact tcttctaaaa 1260
gccattcttg taattctatg gcgtaaggca atttggactt cataatcagc tgaatcacgc 1320
cggatttagt aatgagcact gtatgcggct gcaaatacag cgggtcgccc cttttcacga 1380
cgctgttaga ggtagggccc ccattttgga tggtctgctc aaataacgat ttgtatttat 1440
tgtctacatg aacacgtata gctttatcac aaactgtata ttttaaactg ttagcgacgt 1500
ccttggccac gaaccggacc tgttggtcgc gctctagcac gtaccgcagg ttgaacgtat 1560
cttctccaaa tttaaattct ccaattttaa cgcgagccat tttgatacac gtgtgtcgat 1620
tttgcaacaa ctattgtttt ttaacgcaaa ctaaacttat tgtggtaagc aataattaaa 1680
tatgggggaa catgcgccgc tacaacactc gtcgttatga acgcagacgg cgccggtctc 1740
ggcgcaagcg gctaaaacgt gttgcgcgtt caacgcggca aacatcgcaa aagccaatag 1800
tacagttttg atttgcatat taacggcgat tttttaaatt atcttattta ataaatagtt 1860
atgacgccta caactccccg cccgcgttga ctcgctgcac ctcgagcagt tcgttgacgc 1920
cttcctccgt gtggccgaac acgtcgagcg ggtggtcgat gaccagcggc gtgccgcacg 1980
cgacgcacaa gtatctgtac accgaatgat cgtcgggcga aggcacgtcg gcctccaagt 2040
ggcaatattg gcaaattcga aaatatatac agttgggttg tttgcgcata tctatcgtgg 2100
cgttgggcat gtacgtccga acgttgattt gcatgcaagc cgaaattaaa tcattgcgat 2160
tagtgcgatt aaaacgttgt acatcctcgc ttttaatcat gccgtcgatt aaatcgcgca 2220
atcgagtcaa gtgatcaaag tgtggaataa tgttttcttt gtattcccga gtcaagcgca 2280
gcgcgtattt taacaaacta gccatcttgt aagttagttt catttaatgc aactttatcc 2340
aataatatat tatgtatcgc acgtcaagaa ttaacaatgc gcccgttgtc gcatctcaac 2400
acgactatga tagagatcaa ataaagcgcg aattaaatag cttgcgacgc aacgtgcacg 2460
atctgtgcac gcgttccggc acgagctttg attgtaataa gtttttacga agcgatgaca 2520
tgacccccgt agtgacaacg atcacgccca aaagaactgc cgactacaaa attaccgagt 2580
atgtcggtga cgttaaaact attaagccat ccaatcgacc gttagtcgaa tcaggaccgc 2640
tggtgcgaga agccgcgaag tatggcgaat gcatcgtata acgtgtggag tccgctcatt 2700
agagcgtcat gtttagacaa gaaagctaca tatttaattg atcccgatga ttttattgat 2760
aaattgaccc taactccata cacggtattc tacaatggcg gggttttggt caaaatttcc 2820
ggactgcgat tgtacatgct gttaacggct ccgcccacta ttaatgaaat taaaaattcc 2880
aattttaaaa aacgcagcaa gagaaacatt tgtatgaaag aatgcgtaga aggaaagaaa 2940
aatgtcgtcg acatgctgaa caacaagatt aatatgcctc cgtgtataaa aaaaatattg 3000
aacgatttga aagaaaacaa tgtaccgcgc ggcggtatgt acaggaagag gtttatacta 3060
aactgttaca ttgcaaacgt ggtttcgtgt gccaagtgtg aaaaccgatg tttaatcaag 3120
gctctgacgc atttctacaa ccacgactcc aagtgtgtgg gtgaagtcat gcatctttta 3180
atcaaatccc aagatgtgta taaaccacca aactgccaaa aaatgaaaac tgtcgacaag 3240
ctctgtccgt ttgctggcaa ctgcaagggt ctcaatccta tttgtaatta ttgaataata 3300
aaacaattat aaatgctaaa tttgtttttt attaacgata caaaccaaac gcaacaagaa 3360
catttgtagt attatctata attgaaaacg cgtagttata atcgctgagg taatatttaa 3420
aatcattttc aaatgattca cagttaattt gcgacaatat aattttattt tcacataaac 3480
tagacgcctt gtcgtcttct tcttcgtatt ccttctcttt ttcatttttc tcctcataaa 3540
aattaacata gttattatcg tatccatata tgtatctatc gtatagagta aattttttgt 3600
tgtcataaat atatatgtct tttttaatgg ggtgtatagt accgctgcgc atagtttttc 3660
tgtaatttac aacagtgcta ttttctggta gttcttcgga gtgtgttgct ttaattatta 3720
aatttatata atcaatgaat ttgggatcgt cggttttgta caatatgttg ccggcatagt 3780
acgcagcttc ttctagttca attacaccat tttttagcag caccggatta acataacttt 3840
ccaaaatgtt gtacgaaccg ttaaacaaaa acagttcacc tcccttttct atactattgt 3900
ctgcgagcag ttgtttgttg ttaaaaataa cagccattgt aatgagacgc acaaactaat 3960
atcacaaact ggaaatgtct atcaatatat agttgctgat atcatggaga taattaaaat 4020
gataaccatc tcgcaaataa ataagtattt tactgttttc gtaacagttt tgtaataaaa 4080
aaacctataa atattccgga ttattcatac cgtcccacca tcgggcgcgg atcccgggta 4140
ccttctagaa ttccggagcg gccgctgcag atctgatcct ttcctgggac ccggcaagaa 4200
ccaaaaactc actctcttca aggaaatccg taatgttaaa cccgacacga tgaagcttgt 4260
cgttggatgg aaaggaaaag agttctacag ggaaacttgg acccgcttca tggaagacag 4320
cttccccatt gttaacgacc aagaagtgat ggatgttttc cttgttgtca acatgcgtcc 4380
cactagaccc aaccgttgtt acaaattcct ggcccaacac gctctgcgtt gcgaccccga 4440
ctatgtacct catgacgtga ttaggatcgt cgagccttca tgggtgggca gcaacaacga 4500
gtaccgcatc agcctggcta agaagggcgg cggctgccca ataatgaacc ttcactctga 4560
gtacaccaac tcgttcgaac agttcatcga tcgtgtcatc tgggagaact tctacaagcc 4620
catcgtttac atcggtaccg actctgctga agaggaggaa attctccttg aagtttccct 4680
ggtgttcaaa gtaaaggagt ttgcaccaga cgcacctctg ttcactggtc cggcgtatta 4740
aaacacgata cattgttatt agtacattta ttaagcgcta gattctgtgc gttgttgatt 4800
tacagacaat tgttgtacgt attttaataa ttcattaaat ttataatctt tagggtggta 4860
tgttagagcg aaaatcaaat gattttcagc gtctttatat ctgaatttaa atattaaatc 4920
ctcaatagat ttgtaaaata ggtttcgatt agtttcaaac aagggttgtt tttccgaacc 4980
gatggctgga ctatctaatg gattttcgct caacgccaca aaacttgcca aatcttgtag 5040
cagcaatcta gctttgtcga tattcgtttg tgttttgttt tgtaataaag gttcgacgtc 5100
gttcaaaata ttatgcgctt ttgtatttct ttcatcactg tcgttagtgt acaattgact 5160
cgacgtaaac acgttaaata aagcttggac atatttaaca tcgggcgtgt tagctttatt 5220
aggccgatta tcgtcgtcgt cccaaccctc gtcgttagaa gttgcttccg aagacgattt 5280
tgccatagcc acacgacgcc tattaattgt gtcggctaac acgtccgcga tcaaatttgt 5340
agttgagctt tttggaatta tttctgattg cgggcgtttt tgggcgggtt tcaatctaac 5400
tgtgcccgat tttaattcag acaacacgtt agaaagcgat ggtgcaggcg gtggtaacat 5460
ttcagacggc aaatctacta atggcggcgg tggtggagct gatgataaat ctaccatcgg 5520
tggaggcgca ggcggggctg gcggcggagg cggaggcgga ggtggtggcg gtgatgcaga 5580
cggcggttta ggctcaaatg tctctttagg caacacagtc ggcacctcaa ctattgtact 5640
ggtttcgggc gccgtttttg gtttgaccgg tctgagacga gtgcgatttt tttcgtttct 5700
aatagcttcc aacaattgtt gtctgtcgtc taaaggtgca gcgggttgag gttccgtcgg 5760
cattggtgga gcgggcggca attcagacat cgatggtggt ggtggtggtg gaggcgctgg 5820
aatgttaggc acgggagaag gtggtggcgg cggtgccgcc ggtataattt gttctggttt 5880
agtttgttcg cgcacgattg tgggcaccgg cgcaggcgcc gctggctgca caacggaagg 5940
tcgtctgctt cgaggcagcg cttggggtgg tggcaattca atattataat tggaatacaa 6000
atcgtaaaaa tctgctataa gcattgtaat ttcgctatcg tttaccgtgc cgatatttaa 6060
caaccgctca atgtaagcaa ttgtattgta aagagattgt ctcaagctcg ccgcacgccg 6120
ataacaagcc ttttcatttt tactacagca ttgtagtggc gagacacttc gctgtcgtcg 6180
acgtacatgt atgctttgtt gtcaaaaacg tcgttggcaa gctttaaaat atttaaaaga 6240
acatctctgt tcagcaccac tgtgttgtcg taaatgttgt ttttgataat ttgcgcttcc 6300
gcagtatcga cacgttcaaa aaattgatgc gcatcaattt tgttgttcct attattgaat 6360
aaataagatt gtacagattc atatctacga ttcgtcatgg ccaccacaaa tgctacgctg 6420
caaacgctgg tacaatttta cgaaaactgc aaaaacgtca aaactcggta taaaataatc 6480
aacgggcgct ttggcaaaat atctatttta tcgcacaagc ccactagcaa attgtatttg 6540
cagaaaacaa tttcggcgca caattttaac gctgacgaaa taaaagttca ccagttaatg 6600
agcgaccacc caaattttat aaaaatctat tttaatcacg gttccatcaa caaccaagtg 6660
atcgtgatgg actacattga ctgtcccgat ttatttgaaa cactacaaat taaaggcgag 6720
ctttcgtacc aacttgttag caatattatt agacagctgt gtgaagcgct caacgatttg 6780
cacaagcaca atttcataca caacgacata aaactcgaaa atgtcttata tttcgaagca 6840
cttgatcgcg tgtatgtttg cgattacgga ttgtgcaaac acgaaaactc acttagcgtg 6900
cacgacggca cgttggagta ttttagtccg gaaaaaattc gacacacaac tatgcacgtt 6960
tcgtttgact ggtacgcggc gtgttaacat acaagttgct aacgtaatca tggtcatagc 7020
tgtttcctgt gtgaaattgt tatccgctca caattccaca caacatacga gccggaagca 7080
taaagtgtaa agcctggggt gcctaatgag tgagctaact cacattaatt gcgttgcgct 7140
cactgcccgc tttccagtcg ggaaacctgt cgtgccagct gcattaatga atcggccaac 7200
gcgcggggag aggcggtttg cgtattgggc gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc 7260
tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt 7320
tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg 7380
ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg 7440
agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat 7500
accaggcgtt tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta 7560
ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct 7620
gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc 7680
ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa 7740
gacacgactt atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg 7800
taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaaggacag 7860
tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt 7920
gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta 7980
cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc 8040
agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca 8100
cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa 8160
cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat 8220
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taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaccc acgctcaccg gctccagatt 8340
tatcagcaat aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat 8400
ccgcctccat ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta 8460
atagtttgcg caacgttgtt gccattgcta caggcatcgt ggtgtcacgc tcgtcgtttg 8520
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tgtgcaaaaa agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt tgtcagaagt aagttggccg 8640
cagtgttatc actcatggtt atggcagcac tgcataattc tcttactgtc atgccatccg 8700
taagatgctt ttctgtgact ggtgagtact caaccaagtc attctgagaa tagtgtatgc 8760
ggcgaccgag ttgctcttgc ccggcgtcaa tacgggataa taccgcgcca catagcagaa 8820
ctttaaaagt gctcatcatt ggaaaacgtt cttcggggcg aaaactctca aggatcttac 8880
cgctgttgag atccagttcg atgtaaccca ctcgtgcacc caactgatct tcagcatctt 8940
ttactttcac cagcgtttct gggtgagcaa aaacaggaag gcaaaatgcc gcaaaaaagg 9000
gaataagggc gacacggaaa tgttgaatac tcatactctt cctttttcaa tattattgaa 9060
gcatttatca gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt tgaatgtatt tagaaaaata 9120
aacaaatagg ggttccgcgc acatttcccc gaaaagtgcc acctgacgtc taagaaacca 9180
ttattatcat gacattaacc tataaaaata ggcgtatcac gaggcccttt cgtctcgcgc 9240
gtttcggtga tgacggtgaa aacctctgac acatgcagct cccggagacg gtcacagctt 9300
gtctgtaagc ggatgccggg agcagacaag cccgtcaggg cgcgtcagcg ggtgttggcg 9360
ggtgtcgggg ctggcttaac tatgcggcat cagagcagat tgtactgaga gtgcaccata 9420
tgcggtgtga aataccgcac agatgcgtaa ggagaaaata ccgcatcagg cgccattcgc 9480
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agtcacgacg ttgtaaaacg acggccagtg cc 9632
<210> 3
<211> 584
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CPV Souriou (serotype 2c)
<400> 3
Met Ser Asp Gly Ala Val Gln Pro Asp Gly Gly Gln Pro Ala Val Arg
1 5 10 15
Asn Glu Arg Ala Thr Gly Ser Gly Asn Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Ser Gly Gly Val Gly Ile Ser Thr Gly Thr Phe Asn Asn Gln
35 40 45
Thr Glu Phe Lys Phe Leu Glu Asn Gly Trp Val Glu Ile Thr Ala Asn
50 55 60
Ser Ser Arg Leu Val His Leu Asn Met Pro Glu Ser Glu Asn Tyr Arg
65 70 75 80
Arg Val Val Val Asn Asn Leu Asp Lys Thr Ala Val Asn Gly Asn Met
85 90 95
Ala Leu Asp Asp Thr His Ala Gln Ile Val Thr Pro Trp Ser Leu Val
100 105 110
Asp Ala Asn Ala Trp Gly Val Trp Phe Asn Pro Gly Asp Trp Gln Leu
115 120 125
Ile Val Asn Thr Met Ser Glu Leu His Leu Val Ser Phe Glu Gln Glu
130 135 140
Ile Phe Asn Val Val Leu Lys Thr Val Ser Glu Ser Ala Thr Gln Pro
145 150 155 160
Pro Thr Lys Val Tyr Asn Asn Asp Leu Thr Ala Ser Leu Met Val Ala
165 170 175
Leu Asp Ser Asn Asn Thr Met Pro Phe Thr Pro Ala Ala Met Arg Ser
180 185 190
Glu Thr Leu Gly Phe Tyr Pro Trp Lys Pro Thr Ile Pro Thr Pro Trp
195 200 205
Arg Tyr Tyr Phe Gln Trp Asp Arg Thr Leu Ile Pro Ser His Thr Gly
210 215 220
Thr Ser Gly Thr Pro Thr Asn Ile Tyr His Gly Thr Asp Pro Asp Asp
225 230 235 240
Val Gln Phe Tyr Thr Ile Glu Asn Ser Val Pro Val His Leu Leu Arg
245 250 255
Thr Gly Asp Glu Phe Ala Thr Gly Thr Phe Phe Phe Asp Cys Lys Pro
260 265 270
Cys Arg Leu Thr His Thr Trp Gln Thr Asn Arg Ala Leu Gly Leu Pro
275 280 285
Pro Phe Leu Asn Ser Leu Pro Gln Ala Glu Gly Gly Thr Asn Phe Gly
290 295 300
Tyr Ile Gly Val Gln Gln Asp Lys Arg Arg Gly Val Thr Gln Met Gly
305 310 315 320
Asn Thr Asn Tyr Ile Thr Glu Ala Thr Ile Met Arg Pro Ala Glu Val
325 330 335
Gly Tyr Ser Ala Pro Tyr Tyr Ser Phe Glu Ala Ser Thr Gln Gly Pro
340 345 350
Phe Lys Thr Pro Ile Ala Ala Gly Arg Gly Gly Ala Gln Thr Asp Glu
355 360 365
Asn Gln Ala Ala Asp Gly Asp Pro Arg Tyr Ala Phe Gly Arg Gln His
370 375 380
Gly Gln Lys Thr Thr Thr Thr Gly Glu Thr Pro Glu Arg Phe Thr Tyr
385 390 395 400
Ile Ala His Gln Asp Thr Gly Arg Tyr Pro Glu Gly Asp Trp Ile Gln
405 410 415
Asn Ile Asn Phe Asn Leu Pro Val Thr Glu Asp Asn Val Leu Leu Pro
420 425 430
Thr Asp Pro Ile Gly Gly Lys Thr Gly Ile Asn Tyr Thr Asn Ile Phe
435 440 445
Asn Thr Tyr Gly Pro Leu Thr Ala Leu Asn Asn Val Pro Pro Val Tyr
450 455 460
Pro Asn Gly Gln Ile Trp Asp Lys Glu Phe Asp Thr Asp Leu Lys Pro
465 470 475 480
Arg Leu His Val Asn Ala Pro Phe Val Cys Gln Asn Asn Cys Pro Gly
485 490 495
Gln Leu Phe Val Lys Val Ala Pro Asn Leu Thr Asn Glu Tyr Asp Pro
500 505 510
Asp Ala Ser Ala Asn Met Ser Arg Ile Val Thr Tyr Ser Asp Phe Trp
515 520 525
Trp Lys Gly Lys Leu Val Phe Lys Ala Lys Leu Arg Ala Ser His Thr
530 535 540
Trp Asn Pro Ile Gln Gln Met Ser Ile Asn Val Asp Asn Gln Phe Asn
545 550 555 560
Tyr Val Pro Ser Asn Ile Gly Gly Met Lys Ile Val Tyr Glu Lys Ser
565 570 575
Gln Leu Ala Pro Arg Lys Leu Tyr
580
<210> 4
<211> 584
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Non-Truncated CPV VP2 in pMEB072
<400> 4
Met Ser Asp Gly Ala Val Gln Pro Asp Gly Gly Gln Pro Ala Val Arg
1 5 10 15
Asn Glu Arg Ala Thr Gly Ser Gly Asn Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Ser Gly Gly Val Gly Ile Ser Thr Gly Thr Phe Asn Asn Gln
35 40 45
Thr Glu Phe Lys Phe Leu Glu Asn Gly Trp Val Glu Ile Thr Ala Asn
50 55 60
Ser Ser Arg Leu Val His Leu Asn Met Pro Glu Ser Glu Asn Tyr Arg
65 70 75 80
Arg Val Val Val Asn Asn Leu Asp Lys Thr Ala Val Asn Gly Asn Met
85 90 95
Ala Leu Asp Asp Thr His Ala Gln Ile Val Thr Pro Trp Ser Leu Val
100 105 110
Asp Ala Asn Ala Trp Gly Val Trp Phe Asn Pro Gly Asp Trp Gln Leu
115 120 125
Ile Val Asn Thr Met Ser Glu Leu His Leu Val Ser Phe Glu Gln Glu
130 135 140
Ile Phe Asn Val Val Leu Lys Thr Val Ser Glu Ser Ala Thr Gln Pro
145 150 155 160
Pro Thr Lys Val Tyr Asn Asn Asp Leu Thr Ala Ser Leu Met Val Ala
165 170 175
Leu Asp Ser Asn Asn Thr Met Pro Phe Thr Pro Ala Ala Met Arg Ser
180 185 190
Glu Thr Leu Gly Phe Tyr Pro Trp Lys Pro Thr Ile Pro Thr Pro Trp
195 200 205
Arg Tyr Tyr Phe Gln Trp Asp Arg Thr Leu Ile Pro Ser His Thr Gly
210 215 220
Thr Ser Gly Thr Pro Thr Asn Ile Tyr His Gly Thr Asp Pro Asp Asp
225 230 235 240
Val Gln Phe Tyr Thr Ile Glu Asn Ser Val Pro Val His Leu Leu Arg
245 250 255
Thr Gly Asp Glu Phe Ala Thr Gly Thr Phe Phe Phe Asp Cys Lys Pro
260 265 270
Cys Arg Leu Thr His Thr Trp Gln Thr Asn Arg Ala Leu Gly Leu Pro
275 280 285
Pro Phe Leu Asn Ser Leu Pro Gln Ala Glu Gly Gly Thr Asn Phe Gly
290 295 300
Tyr Ile Gly Val Gln Gln Asp Lys Arg Arg Gly Val Thr Gln Met Gly
305 310 315 320
Asn Thr Asn Tyr Ile Thr Glu Ala Thr Ile Met Arg Pro Ala Glu Val
325 330 335
Gly Tyr Ser Ala Pro Tyr Tyr Ser Phe Glu Ala Ser Thr Gln Gly Pro
340 345 350
Phe Lys Thr Pro Ile Ala Ala Gly Arg Gly Gly Ala Gln Thr Asp Glu
355 360 365
Asn Gln Ala Ala Asp Gly Asp Pro Arg Tyr Ala Phe Gly Arg Gln His
370 375 380
Gly Gln Lys Thr Thr Thr Thr Gly Glu Thr Pro Glu Arg Phe Thr Tyr
385 390 395 400
Ile Ala His Gln Asp Thr Gly Arg Tyr Pro Glu Gly Asp Trp Ile Gln
405 410 415
Asn Ile Asn Phe Asn Leu Pro Val Thr Glu Asp Asn Val Leu Leu Pro
420 425 430
Thr Asp Pro Ile Gly Gly Lys Thr Gly Ile Asn Tyr Thr Asn Ile Phe
435 440 445
Asn Thr Tyr Gly Pro Leu Thr Ala Leu Asn Asn Val Pro Pro Val Tyr
450 455 460
Pro Asn Gly Gln Ile Trp Asp Lys Glu Phe Asp Thr Asp Leu Lys Pro
465 470 475 480
Arg Leu His Val Asn Ala Pro Phe Val Cys Gln Asn Asn Cys Pro Gly
485 490 495
Gln Leu Phe Val Lys Val Ala Pro Asn Leu Thr Asn Glu Tyr Asp Pro
500 505 510
Asp Ala Ser Ala Asn Met Ser Arg Ile Val Thr Tyr Ser Asp Phe Trp
515 520 525
Trp Lys Gly Lys Leu Val Phe Lys Ala Lys Leu Arg Ala Ser His Thr
530 535 540
Trp Asn Pro Ile Gln Gln Met Ser Ile Asn Val Asp Asn Gln Phe Asn
545 550 555 560
Tyr Val Pro Ser Asn Ile Gly Gly Met Lys Ile Val Tyr Glu Lys Ser
565 570 575
Gln Leu Ala Pro Arg Lys Leu Tyr
580
<210> 5
<211> 1752
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pMEB072 Codon-optimized nucleic acid encoding CPV VP2 (SEQ ID
NO:4)
<400> 5
atgtccgacg gtgctgtgca gcccgacggt ggccagcccg ctgtgcgtaa cgagcgtgct 60
accggttccg gtaacggttc aggcggaggt ggaggtggtg gttccggcgg tgtgggcatc 120
tccaccggca ccttcaacaa ccagaccgag ttcaagttcc tcgagaacgg ttgggtggag 180
atcaccgcta actcctcccg tctggtgcac ctgaacatgc ccgagtccga gaactaccgt 240
cgtgtggtgg tgaacaacct ggacaagacc gctgtgaacg gtaacatggc tctggacgac 300
acccacgctc agatcgtgac cccctggtcc ctggtggacg ctaacgcttg gggcgtgtgg 360
ttcaaccccg gtgactggca gctgatcgtg aacaccatgt ccgagctgca cctggtgtcc 420
ttcgagcaag agatcttcaa cgtcgtcctc aagaccgtgt ccgagtccgc tacccagccc 480
cccaccaagg tgtacaacaa cgacctgacc gcttccctga tggtcgctct ggactccaac 540
aacaccatgc ccttcacccc cgctgctatg cgttccgaga ccctgggctt ctacccctgg 600
aagcccacca tccccacccc ctggcgttac tacttccagt gggaccgtac cctgatcccc 660
tcccacaccg gtacttccgg cacccccacc aacatctacc acggcaccga ccccgacgac 720
gtgcagttct acaccatcga gaactccgtg cccgtgcacc tgctgcgtac cggtgacgag 780
ttcgctaccg gaaccttctt cttcgactgc aagccctgcc gtctgaccca cacctggcag 840
accaaccgtg ctctgggtct gcctcccttc ctgaactccc tgccccaggc tgagggtggc 900
accaacttcg gttacatcgg tgtgcagcag gacaagcgtc gtggtgtgac ccagatgggt 960
aacaccaact acatcaccga ggctaccatc atgcgtcccg ctgaggtcgg ctactccgct 1020
ccctactact ccttcgaggc ttccacccag ggccccttca agacccccat cgctgctggt 1080
cgtggtggtg ctcagaccga cgagaaccag gctgctgacg gtgacccccg ttacgctttc 1140
ggtcgtcagc acggccaaaa gaccaccacc accggcgaga cccccgagcg tttcacctac 1200
atcgctcacc aggacaccgg tcgttacccc gagggcgact ggattcagaa catcaacttc 1260
aacctgcccg tgaccgagga caacgtgctg ctgcccaccg accccatcgg tggcaagacc 1320
ggtatcaact acactaacat cttcaacacc tacggtcctc tgaccgctct gaacaacgtg 1380
ccccccgtgt accccaacgg ccagatctgg gacaaggagt tcgacaccga cctgaagccc 1440
cgtctgcacg tgaacgctcc cttcgtgtgc cagaacaact gccctggcca gctgttcgtc 1500
aaggtggccc ccaacctgac caacgagtac gaccctgacg cttccgctaa catgtcccgt 1560
atcgtgacct actccgactt ctggtggaag ggcaagctgg tgttcaaggc caagctgcgt 1620
gcttctcaca cctggaaccc catccagcag atgtccatca acgtggacaa ccagttcaac 1680
tacgtgccct ccaacatcgg tggaatgaag atcgtgtacg agaagtccca gctggctccc 1740
cgtaagctgt ac 1752
<210> 6
<211> 578
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Truncated CPV VP2 in pMEB073
<400> 6
Met Leu Lys Gly Gly Gln Pro Ala Val Arg Asn Glu Arg Ala Thr Gly
1 5 10 15
Ser Gly Asn Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Val
20 25 30
Gly Ile Ser Thr Gly Thr Phe Asn Asn Gln Thr Glu Phe Lys Phe Leu
35 40 45
Glu Asn Gly Trp Val Glu Ile Thr Ala Asn Ser Ser Arg Leu Val His
50 55 60
Leu Asn Met Pro Glu Ser Glu Asn Tyr Arg Arg Val Val Val Asn Asn
65 70 75 80
Leu Asp Lys Thr Ala Val Asn Gly Asn Met Ala Leu Asp Asp Thr His
85 90 95
Ala Gln Ile Val Thr Pro Trp Ser Leu Val Asp Ala Asn Ala Trp Gly
100 105 110
Val Trp Phe Asn Pro Gly Asp Trp Gln Leu Ile Val Asn Thr Met Ser
115 120 125
Glu Leu His Leu Val Ser Phe Glu Gln Glu Ile Phe Asn Val Val Leu
130 135 140
Lys Thr Val Ser Glu Ser Ala Thr Gln Pro Pro Thr Lys Val Tyr Asn
145 150 155 160
Asn Asp Leu Thr Ala Ser Leu Met Val Ala Leu Asp Ser Asn Asn Thr
165 170 175
Met Pro Phe Thr Pro Ala Ala Met Arg Ser Glu Thr Leu Gly Phe Tyr
180 185 190
Pro Trp Lys Pro Thr Ile Pro Thr Pro Trp Arg Tyr Tyr Phe Gln Trp
195 200 205
Asp Arg Thr Leu Ile Pro Ser His Thr Gly Thr Ser Gly Thr Pro Thr
210 215 220
Asn Ile Tyr His Gly Thr Asp Pro Asp Asp Val Gln Phe Tyr Thr Ile
225 230 235 240
Glu Asn Ser Val Pro Val His Leu Leu Arg Thr Gly Asp Glu Phe Ala
245 250 255
Thr Gly Thr Phe Phe Phe Asp Cys Lys Pro Cys Arg Leu Thr His Thr
260 265 270
Trp Gln Thr Asn Arg Ala Leu Gly Leu Pro Pro Phe Leu Asn Ser Leu
275 280 285
Pro Gln Ala Glu Gly Gly Thr Asn Phe Gly Tyr Ile Gly Val Gln Gln
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Tyr Ser Phe Glu Ala Ser Thr Gln Gly Pro Phe Lys Thr Pro Ile Ala
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tgtcataaat atatatgtct tttttaatgg ggtgtatagt accgctgcgc atagtttttc 3660
tgtaatttac aacagtgcta ttttctggta gttcttcgga gtgtgttgct ttaattatta 3720
aatttatata atcaatgaat ttgggatcgt cggttttgta caatatgttg ccggcatagt 3780
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cccaccaagg tgtacaacaa cgacctgacc gcttccctga tggtcgctct ggactccaac 4680
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gcgttcaacg cggcaaacat cgcaaaagcc aatagtacag ttttgatttg catattaacg 7320
gcgatttttt aaattatctt atttaataaa tagttatgac gcctacaact ccccgcccgc 7380
gttgactcgc tgcacctcga gcagttcgtt gacgccttcc tccgtgtggc cgaacacgtc 7440
gagcgggtgg tcgatgacca gcggcgtgcc gcacgcgacg cacaagtatc tgtacaccga 7500
atgatcgtcg ggcgaaggca cgtcggcctc caagtggcaa tattggcaaa ttcgaaaata 7560
tatacagttg ggttgtttgc gcatatctat cgtggcgttg ggcatgtacg tccgaacgtt 7620
gatttgcatg caagccgaaa ttaaatcatt gcgattagtg cgattaaaac gttgtacatc 7680
ctcgctttta atcatgccgt cgattaaatc gcgcaatcga gtcaagtgat caaagtgtgg 7740
aataatgttt tctttgtatt cccgagtcaa gcgcagcgcg tattttaaca aactagccat 7800
cttgtaagtt agtttcattt aatgcaactt tatccaataa tatattatgt atcgcacgtc 7860
aagaattaac aatgcgcccg ttgtcgcatc tcaacacgac tatgatagag atcaaataaa 7920
gcgcgaatta aatagcttgc gacgcaacgt gcacgatctg tgcacgcgtt ccggcacgag 7980
ctttgattgt aataagtttt tacgaagcga tgacatgacc cccgtagtga caacgatcac 8040
gcccaaaaga actgccgact acaaaattac cgagtatgtc ggtgacgtta aaactattaa 8100
gccatccaat cgaccgttag tcgaatcagg accgctggtg cgagaagccg cgaagtatgg 8160
cgaatgcatc gtataacgtg tggagtccgc tcattagagc gtcatgttta gacaagaaag 8220
ctacatattt aattgatccc gatgatttta ttgataaatt gaccctaact ccatacacgg 8280
tattctacaa tggcggggtt ttggtcaaaa tttccggact gcgattgtac atgctgttaa 8340
cggctccgcc cactattaat gaaattaaaa attccaattt taaaaaacgc agcaagagaa 8400
acatttgtat gaaagaatgc gtagaaggaa agaaaaatgt cgtcgacatg ctgaacaaca 8460
agattaatat gcctccgtgt ataaaaaaaa tattgaacga tttgaaagaa aacaatgtac 8520
cgcgcggcgg tatgtacagg aagaggttta tactaaactg ttacattgca aacgtggttt 8580
cgtgtgccaa gtgtgaaaac cgatgtttaa tcaaggctct gacgcatttc tacaaccacg 8640
actccaagtg tgtgggtgaa gtcatgcatc ttttaatcaa atcccaagat gtgtataaac 8700
caccaaactg ccaaaaaatg aaaactgtcg acaagctctg tccgtttgct ggcaactgca 8760
agggtctcaa tcctatttgt aattattgaa taataaaaca attataaatg ctaaatttgt 8820
tttttattaa cgatacaaac caaacgcaac aagaacattt gtagtattat ctataattga 8880
aaacgcgtag ttataatcgc tgaggtaata tttaaaatca ttttcaaatg attcacagtt 8940
aatttgcgac aatataattt tattttcaca taaactagac gccttgtcgt cttcttcttc 9000
gtattccttc tctttttcat ttttctcctc ataaaaatta acatagttat tatcgtatcc 9060
atatatgtat ctatcgtata gagtaaattt tttgttgtca taaatatata tgtctttttt 9120
aatggggtgt atagtaccgc tgcgcatagt ttttctgtaa tttacaacag tgctattttc 9180
tggtagttct tcggagtgtg ttgctttaat tattaaattt atataatcaa tgaatttggg 9240
atcgtcggtt ttgtacaata tgttgccggc atagtacgca gcttcttcta gttcaattac 9300
accatttttt agcagcaccg gattaacata actttccaaa atgttgtacg aaccgttaaa 9360
caaaaacagt tcacctccct tttctatact attgtctgcg agcagttgtt tgttgttaaa 9420
aataacagcc attgtaatga gacgcacaaa ctaatatcac aaactggaaa tgtctatcaa 9480
tatatagttg ctgatatcat ggagataatt aaaatgataa ccatctcgca aataaataag 9540
tattttactg ttttcgtaac agttttgtaa taaaaaaacc tataaatatt ccggattatt 9600
cataccgtcc caccatcggg cgcggatccc gggtcgacgc caccatgctg aagggcggcc 9660
agcctgctgt gagaaacgag agagccaccg gcagcggcaa tggcagcggc ggagggggcg 9720
gaggaggatc tggcggagtg ggcatcagca ccggcacctt caacaaccag accgagttca 9780
agttcctgga gaacggctgg gtggagatca ccgccaacag cagcagactg gtgcacctga 9840
acatgcccga gagcgagaac taccggagag tggtggtgaa caacctggac aagaccgccg 9900
tgaacggcaa tatggccctg gatgacaccc acgcccagat cgtgaccccc tggagcctgg 9960
tggacgccaa cgcctgggga gtgtggttca accctggcga ctggcagctg atcgtgaaca 10020
ccatgagcga gctgcacctg gtgtccttcg agcaggagat tttcaacgtg gtgctgaaaa 10080
ccgtgtccga gagcgccacc cagcccccca ccaaagtgta caacaacgac ctgaccgcct 10140
ccctgatggt ggccctggac agcaacaaca ccatgccctt cacccctgcc gccatgagaa 10200
gcgagaccct gggcttctac ccttggaagc ccaccatccc caccccttgg cggtactact 10260
tccagtggga caggaccctg atccccagcc acaccggcac cagcggcacc cctaccaata 10320
tctaccacgg caccgaccct gatgacgtgc agttctacac catcgagaac agcgtgcctg 10380
tgcacctgct gagaaccggc gacgagttcg ccaccggcac attcttcttc gactgcaagc 10440
cctgcagact gacccacacc tggcagacca acagagccct gggcctgcct cctttcctga 10500
acagcctgcc ccaggccgag ggcggcacca acttcggcta catcggcgtg cagcaggaca 10560
agagaagagg cgtgacccag atgggcaaca ccaactacat caccgaggcc accatcatga 10620
gacccgccga agtgggctac agcgccccct actacagctt cgaggccagc acccagggcc 10680
ccttcaagac ccccatcgcc gctggcagag gcggagccca gaccgacgag aaccaggccg 10740
ccgacggcga ccccagatac gccttcggca gacagcacgg ccagaaaacc accaccaccg 10800
gcgagacccc cgagagattc acctacatcg cccaccagga caccggcaga taccccgagg 10860
gcgactggat tcagaacatc aacttcaacc tgcccgtgac cgaggataat gtgctgctgc 10920
ccaccgaccc catcggcggc aagaccggca tcaactacac caacatcttc aacacctacg 10980
gccccctgac cgccctgaat aacgtgcccc ccgtgtaccc caacggccag atttgggaca 11040
aggagttcga caccgacctg aagcctaggc tgcacgtgaa tgcccccttc gtgtgtcaga 11100
acaactgccc tggccagctg tttgtgaaag tggcccccaa cctgaccaac gagtacgatc 11160
ctgacgccag cgccaacatg agccggatcg tgacctacag cgacttctgg tggaagggca 11220
agctggtgtt caaggccaag ctgagagcca gccacacatg gaaccccatc cagcagatga 11280
gcatcaacgt ggacaaccag ttcaactacg tgcccagcaa tatcggcggc atgaagatcg 11340
tgtacgagaa gagccagctg gcccccagaa agctgtactg ataat 11385

Claims (20)

1.包含病毒样颗粒(VLP)组分和修饰的活病毒(MLV)组分的组合疫苗，其中VLP和MLV都针对相同的病原体或疾病，并且其中组合疫苗克服母源抗体(MDA)。
2.权利要求1所述的组合疫苗，其以单剂量提供保护性免疫。
3.权利要求1所述的组合疫苗，其中病原体或疾病是犬科动物细小病毒(CPV)。
4.权利要求1所述的组合疫苗，其中病原体或疾病是口蹄疫病毒(FMDV)。
5.权利要求3所述的组合疫苗，其中该组合的VLP组分包含作为总蛋白质含量的函数的至少10％CPV VLP(w/w)。
6.权利要求5所述的组合疫苗，其中VLP组分包含至少20％CPV VLP(w/w)。
7.权利要求3所述的组合疫苗，其中由昆虫细胞的杆状病毒载体表达CPV VLP。
8.权利要求3所述的组合疫苗，其中CPV VLP包含至少一种CPV衣壳蛋白。
9.权利要求3所述的组合疫苗，其中CPV VLP包含CPV多肽，所述CPV多肽具有SEQ IDNO:1、3、4、6、8、9或10中所示的序列；或
其中CPV VLP包含CPV多肽，所述CPV多肽具有SEQ ID NO:1、3、4、6、8、9或10中所示的序列的至少90％同一性。
10.权利要求1所述的组合物或疫苗，其中CPV VLP包含CPV多肽，所述多肽由具有SEQID NO:2、5或7中所示的序列的多核苷酸编码；或，
其中CPV VLP包含CPV多肽，所述CPV多肽由与SEQ ID NO:2、5或7中所示的序列具有至少90％同一性的多核苷酸编码。
11.权利要求1所述的组合疫苗，其中组合物或疫苗没有佐剂化并且任选地包含药学上或兽医上可接受的承载体、赋形剂或媒介物。
12.用于生产CPV VLP的质粒，其包含编码具有SEQ ID NO:1、3、4、6或8-10中所示的序列的CPV抗原的多核苷酸或与SEQ ID NO:1、3、4、6或8-10中所示的序列具有至少90％同一性的多核苷酸序列。
13.权利要求12所述的质粒，其中多核苷酸包含SEQ ID NO:2、5、7、11或12中所示的序列或由其组成。
14.权利要求12所述的质粒，其中质粒由SEQ ID NO:11或12中所示的序列组成。
15.权利要求12所述的质粒，其稳定转化进入昆虫细胞，其表达CPV VLP。
16.在昆虫细胞中表达的基本上纯化的CPV空衣壳或CPV VLP，其中所述CPV空衣壳或VLP包含具有SEQ ID NO：1、3、4、6或8-10中所示的序列的多肽；或，
其中所述CPV空衣壳或VLP包含与SEQ ID NO：1、3、4、6或8-10中所示的序列具有至少90％同一性的多肽；或，
17.权利要求16所述的纯化的CPV空衣壳或CPV VLP，其中所述CPV空衣壳或VLP由具有SEQ ID NO：1、3、4、6或8-10中所示的序列的多肽组成。
18.引发动物的针对CPV的免疫应答的方法，包括对动物施用权利要求1-7中任一项的组合物或权利要求16的CPV空衣壳或VLP。
19.权利要求18所述的方法，其中所述免疫应答是保护性的，并且其中所述保护性免疫应答保护接种者免于随后暴露于强毒性CPV的感染。
20.权利要求19所述的方法，其中无论所述动物中存在高水平的抗CPV的母源抗体(MDA)与否，均在接种的动物中引发保护性免疫应答。
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