CN103409377A - 犬细小病毒病毒样颗粒的制备及用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种犬细小病毒病毒样颗粒，以及其制备方法及用途。本发明的犬细小病毒病毒样颗粒由VP2蛋白组成，其基因序列为SEQID№1。本发明的犬细小病毒病毒样颗粒的制备方法是以犬细小病毒DNA为模板，用SEQID№2和SEQID№3为引物扩增得到扩增产物，将扩增产物插入载体pSMK中，得重组质粒pSMK-VP2，将pSMK-VP2转化到大肠杆菌BL21-CondonPlus(DE3)-RIL株，在LB培养并以IPTG诱导表达重组蛋白，再将重组蛋白纯化后进行体外组装，得到犬细小病毒病毒样颗粒。

Description

犬细小病毒病毒样颗粒的制备及用途

技术领域

 本发明涉及一种病毒的病毒样颗粒，这种病毒颗粒的制备方法及用途，确切讲本发明是一种犬细小病毒病毒样颗粒，以及其制备方法及用途。

背景技术

犬细小病毒（Canine parvovirus，CPV）是引起犬出血性胃肠炎以及幼犬心肌炎的烈性传染病之一，CPV基因组编码2个阅读框架，其中ORF1由2007个碱基组成，编码参与病毒复制等功能相关的非结构蛋白NS1、NS2；ORF2由 1755个碱基组成，编码病毒主要有结构蛋白VP1、VP2，其中VP2蛋白是构成病毒衣壳的主要成分，含量约在90%以上。研究表明， VP2蛋白在病毒感染诱导的免疫反应中起重要作用。主要的抗原位点也均在VP2蛋白上，因此，VP2 已成为目前构建CPV 基因工程疫苗的首选靶基因，目前，已有文献报道犬细小病毒能在真核细胞中形成病毒样颗粒、但由于真核表达表达量低且费用高，使采用真核表达产物制备病毒样颗粒疫苗难于应用于临床。

发明内容

本发明提供一种可克服现有技术不足的，用原核表达系统表达和组装得到犬细小病毒的病毒样颗粒，以及这一病毒样颗粒的制备方法及相关的用途。

本发明的犬细小病毒病毒样颗粒由VP2蛋白组成，其基因序列为SEQ ID №1。

本发明的犬细小病毒病毒样颗粒的制备方法是以犬细小病毒DNA为模板，用SEQ ID №2和SEQ ID №3为引物扩增得到扩增产物，将扩增产物插入载体pSMK中，得重组质粒pSMK-VP2，将pSMK-VP2转化到大肠杆菌BL21-CondonPlus(DE3)-RIL株，在37℃，含卡那霉素（Kanamycin ）(50μg/mL) 和氯霉素（chloramphenicol）（34μg/ml）的LB培养基中培养重组大肠杆菌，以IPTG诱导表达重组蛋白，再将重组蛋白纯化后进行体外组装，得到犬细小病毒病毒样颗粒。

本发明的犬细小病毒病毒样颗粒的制备方法中，对表达得到的VP2重组蛋白进行纯化的方式为亲和层析纯化，更确切讲，本发明的犬细小病毒病毒样颗粒的制备方法中，是将表达菌沉淀超声裂解后的上清转移至经buffer A（500mM NaCl、20mM Tris-HCl、20mM Imidazole、1mM DTT，pH=8.0）平衡的镍亲和层析树脂层析柱中，在室温条件下结合1h，之后用buffer A洗涤层析柱，目的蛋白用buffer B（500mM NaCl、20mM Tris-HCl、300mM Imidazole、1mM DTT，pH=8.0）洗脱，每次1ml，反复洗脱5-6次。

本发明的犬细小病毒病毒样颗粒的制备方法中重组蛋白纯化后进行体外组装方法为：将重组融合VP2蛋白按质量比100:1加入sumo酶，再置于透析袋内，透析袋外部的缓冲液为150mM NaCl，50mM Tris-HCl，pH 7.0，组装时整个缓冲体系置于搅拌仪上，使缓冲液轻微搅动，得到犬细小病毒病毒样颗粒。

本发明的犬细小病毒病毒样颗粒可在制备用于预防犬细小病毒引起疾病的疫苗中的应用，也可以在制备用于检测犬细小病毒的检测试剂中的应用。

病毒样颗粒（VLP）是由病毒的一个或者多个结构蛋白的多个拷贝按照一定的顺序排列自我组装成形态上与真实病毒粒子相似的颗粒状物质。由于不含有病毒的遗传物质，因此没有感染性。由于病毒样颗粒可与真实病毒具有相似嗜性，可通过和病毒感染一样的途径呈递给免疫细胞，有效地诱导机体免疫系统产生免疫保护。

多种病毒的结构蛋白能在不同的表达系统中自动组装成病毒样颗粒。病毒样颗粒作为一种新型生物学工具被引进相关生物学研究领域，如：作为生物载体携带核酸、蛋白、药物、及标记物，尤其是将病毒样颗粒作为目前最优越的候选疫苗，在动物及人类疾病预防与治疗中发挥了强大潜力。目前病毒样颗粒疫苗研究取得较大进展的病毒有：人乳头瘤病毒、人获得性免疫缺陷型病毒、流感病毒、乙肝病毒、细小病毒等。如前所述，现有技术中虽曾有以真核表达方式建立犬细小病毒病毒样颗粒的作法，但本发明可克服真核表达的不足，使可实际应用于临床的犬细小病毒病毒样颗粒成为可能。

传统的原核表达系统表达效率高，但是由于缺乏正确的修饰与折叠，多数情况下以非可溶性的包涵体形式存在。研究发现，泛素和小分子泛素样修饰蛋白能够帮助原核表达蛋白的正确折叠，提高蛋白的水溶性，这些辅助分子已经被成功地应用于毒性蛋白的表达。本发明采用了小泛素样修饰蛋白的原核表达系统，即促进了表达蛋白的正确折叠，提高了水溶性，又兼顾了原核表达系统表达效率高的优点。

附图说明    

图1为纯化蛋白洗脱后的SDS-PAGE鉴定，其中的泳道：1为沉淀，2为滤液，3和4为洗脱缓冲液（wash buffer），5-8为洗脱液。

图2为用抗犬细小病毒的单克隆抗体对纯化的重组VP2蛋白的Western-bloting鉴定，其中的泳道：1、2、3分别为图1 中泳道6、7、8中的纯化的蛋白样品。

图3为犬细小病毒病毒样颗粒透视电镜的图片，其中颗粒的直径大约为20nm。

图4为小鼠血清抗体效价的ELISA检测。

图5为VLP组小鼠淋巴增殖实验结果。

具体实施方式

本发明以下结合实施例解说。

1.犬细小病毒结构蛋白VP2 重组表达载体的构建

根据已公布的犬细小病毒序列（GenBabnk登录号：M:38245）设计用于扩增结构蛋白VP2的引物，并在引物中引入酶切位点，引物序列如下：

VP2F：5’-TGTCGTCTCAAGGTATGAGTGATGGAGCAGTTC-’3  SEQ ID №2

VP2R：5’-CGGGATCCG TTAATATAATTTTCTAGGTGCT-’3     SEQ ID №3。

参考Yin等（2009）的方法（Yin S, Sun S, Yang S, Shang Y, Cai X, Liu X. Self-assembly of virus-like particles of porcine circovirus type 2 capsid protein expressed from Escherichia coli. Virol J. 2010 Jul 21;7:166. doi: 10.1186/1743-422X-7-166.），以犬细小病毒DNA为模板，用引物对VP2F/VP2R通过聚合酶链式反应（PCR）扩增获得VP2基因，经BsmB I和BamH I双酶切后插入经相应酶切处理的载体pSMK中，所得载体命名为pSMK/VP2。具体方法如下：

（1）病毒DNA提取

参照试剂盒说明，从犬细小病毒中提取病毒DNA，操作过程如下：取400 μL细胞毒样品，加入 400 μL Digestion Buffer，混匀，然后加入 20μL Proteinase K，混匀，55℃保温 30 分钟。加入 200 μL的结合缓冲液，70℃保温 10分钟。加入400 μL无水乙醇，混匀，然后用将样品分两次转移到吸附柱中，柱子放入 2ml 收集管中。每次转移混合液时10000r/min，室温离心1分钟。取出吸附柱，弃去收集管中的废液。将柱子放回同一收集管中，加入500μL PW Solution，10000r/min，室温离心1分钟。取下吸附柱，弃去收集管中的废液。将柱子放回同一收集管中，加入 500μL Wash Solution，10000r/min，室温离心 1 分钟。取下吸附柱，弃去收集管中的全部废液。将柱子放回同一收集管中，1000r/min，室温离心1分钟，以去除残留的 Wash Solution。将柱子放入新的无菌的 1.5ml 离心管中，在柱子中央加入30μLElution Buffer，室温放置 2分钟，等待核酸充分溶解在缓冲液中。10000r/min，室温离心1分钟。离心管中的液体即为提取的总 DNA，样品在-20℃保存。

（2）VP2片段扩增

用带酶切位点引物VP2F和VP2R扩增VP2基因，扩增采用TaKara公司高保真聚合酶（PrimeSTAR HS DNA Polymerase Kit）。PCR反应总体积50μL，包含10μLPCR buffer，dNTP mix4 μL，引物各1μL，酶0.5μL，模板2μL。PCR反应程序如下：95℃ 3min，98℃ 10s，68℃ 2min，扩增35个循环，72℃延伸10min。

（3） VP2片段的胶回收

PCR产物用1%的琼脂糖凝胶分离。然后用凝胶成像系统观察结果；切取目的片段，用TransGen公司EasyPure Quick Gel Extraction kit纯化回收。具体操作步骤如下：

在紫外灯下切取琼脂糖凝胶中的目的DNA条带，放入干净的离心管中称重，100mg凝胶视为100μL体积。加入3倍体积溶液GSB，于55℃水浴融胶6-10min，间断混合，确保胶块完全融化，当胶完全融化后，观察溶液颜色，若颜色为紫色，加入3M醋酸钠（PH5.2），调整颜色和GSB颜色相同，待融化后的凝胶溶液降至室温，加入吸附柱静置1min，1000×g离心1min，弃流出液。

加入650μL溶液WB，1000×g离心1min，弃流出液。1000×g离心1-2min，去除残留的WB液。

将吸附柱置于干净的离心管，开盖静置1min，使残留的乙醇挥发干净。在柱中央加入30-50μL去离子水，室温静置1min。

1000×g离心1min，洗脱DNA，将洗脱的DNA于-20℃保存。

（4）载体及片段酶切

VP2基因片段和pSMK载体质粒分别酶切消化，反应体系如下：DNA 20μL，Buffer 35μL，BSA 0.5μL，BamH I 酶1μL，去离子水23.5μL，37℃酶切1h；继续加入0.5μL BSA和1μL BsmB I酶，55℃酶切1.5h，反应完成时加入终止液终止酶切。酶切产物经琼脂糖电泳确认切开后，胶回收目的片段和切开的pSMK表达载体。

（5）连接反应

按照载体和回收片段摩尔比如下将两种产物进行连接。反应体系为：目的片段 2μL、载体1μL、T4 DNA 连接酶 1μL（1U/μL），10×T4 DNA 连接缓冲液1μL，补充超纯水至总体积10μL，混匀后 4 ℃过夜连接或者 16 ℃连接反应 3 小时。

（6）转化 JM109 克隆菌

取连接产物 5μL加入100μL JM109 感受态细胞中，柔和混匀后冰浴30min，42℃热激92 sec，立即冰浴 5min，加入37℃预热后的LB液体培养基 0.8ml，于 37℃震荡培养 45min，将培养物均匀涂布于含有kanamycin（80μg/ml）的 LB 琼脂平板上，37℃静置培养 16～18 小时。

（7）重组质粒鉴定

用无菌牙签挑取生长 LB 平皿上大小均匀的菌落并进行编号，挑取菌落接种于 LB 液体培养基中，37℃震荡培养 16 小时。将不同编号过夜培养后的菌液接种于 10μL PCR 缓冲液体系中，利用全菌 PCR 法进行鉴定。将 PCR 反应鉴定为阳性的菌落，利用小量质粒提取试剂盒提取对应编号扩增菌的质粒，并进行酶切鉴定。酶切体系如下：EcoRI 0.5μL，10×H Buffer， DNA 4μL，超纯水4.5μL，37℃酶切1h。酶切反应结束后取酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，将阳性质粒命名为pSMK-VP2。

测序结果为：

VP2序列

ATGAGTGATGGAGCAGTTCAACCAGACGGTGGTCAGCCTGCTGTCAGAAATGAAAGAGCTACAGGATCTGGGAACGGGTC

TGGAGGCGGGGGTGGTGGTGGTTCTGGGGGTGTGGGGATTTCTACGGGTACTTTCAATAATCAGACGGAATTTAAATTTT

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2. VP2的表达以、纯化及免疫印迹分析

（1）重组VP2蛋白的表达

将pSMK-VP2转化到大肠杆菌BL21-CondonPlus(DE3)-RIL菌株中。 在37℃，含卡那霉素（Kanamycin ）(50μg/mL) 和氯霉素（chloramphenicol）（34μg/ml）的LB培养基中培养的重组大肠杆菌RIL菌，培养至菌液OD₆₀₀值为0.6左右，加入异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度为 0.05 mM/L，继续培养4小时。10000r/min 离心30 min收获细胞。将沉淀悬浮于 buffer A (500mM NaCl，20mM Tris-Hcl，20mM Imidazole，1mM DTT，pH=8.0) ，冰上超声6 min。在4℃下，将超声后裂解菌液12000r/min离心两次，每次20min，并留取上清。

（2）表达蛋白纯化

VP2融合蛋白通过亲和层析纯化。将上清转移至预装有buffer A平衡后的镍亲和层析树脂的层析柱中，室温条件下结合1h。上清反复过滤两次，之后用buffer A洗涤柱子，目的蛋白用buffer B（500m M NaCl， 20mM Tris-Hcl，300mM Imidazole，1mM DTT， pH=8.0）洗脱，每次1ml，反复洗脱5-6次。将以上步骤保留的液体样品，进行 SDS-PAGE 电泳，结果显示获得了与预期大小相等的蛋白，且纯化效果良好（图1）。

（3）免疫印迹实验

将洗脱下来的VP2重组蛋白进行10 % SDS-PAGE电泳，利用湿转将重组蛋白电转移至聚偏氟乙烯杂交膜（PVDF 膜），用封闭液（PBST，5%脱脂奶粉，pH7.0） 37℃条封闭1h，用 PBST 1:2000稀释抗犬细小病毒单抗，37℃作用1小时，充分洗涤后，用PBST 1:6000稀释辣根过氧化物酶标记的抗小鼠IgG二抗，在 37 ℃条件充分作用1h， PBST充分洗涤；之后于暗室加入发光底物反应3min，在Kozak胶片下曝光，显影及定影固定后，可见其条带与预期大小相符，说明获得的蛋白能够与抗犬细小病毒单抗反应的特异性目标蛋白（图2）。

3. 犬细小病毒的病毒样颗粒的体外自主装

将纯化的重组融合VP2蛋白按质量比100:1加入sumo酶（Invitrogen公司产品）置于透析袋内，以切除融合蛋白sumo，透析袋外部的缓冲液为150mM NaCl，50mM Tris-HCl，pH 7.0，为促进透析袋内外液体交换，使内部高浓度咪唑渗出，减少对蛋白酶切的影响，整个缓冲体系置于搅拌仪上，使缓冲液轻微搅动，并置于4℃过夜酶切15-16h，组装效果通过常规透射电子显微镜观察，具体方法为，将10μL样品加到200目的铜网上，室温吸附2-3分钟，用滤纸吸干铜网，用3%的磷钨酸染色，用日立H-7100FA透射电镜观察，结果显示，所得的病毒样颗粒与犬细小病毒相似，为球形，直径为20nm左右（图3）。

4. 犬细小病毒病毒样颗粒的免疫原性研究

将18只4周龄的BALb/c小鼠随机分为3组，第一组用病毒样颗粒免疫，第二组用犬细小病毒免疫，第三组为PBS对照组。在首免后第二周、第四周分别加强免疫一次，每周对各组小鼠进行采血收集血清。其中第6周每组各随机取1只小鼠断颈处死，取其脾脏分离淋巴细胞进行淋巴细胞增殖实验，同时取一部分淋巴细胞用流式细胞仪分析淋巴细胞亚群CD4+、CD8+分布情况。

（1）间接 ELISA 试验检测小鼠血清抗犬细小病毒抗体

将96孔板 (Nunc Maxisorp) 用100μL 0.05 M 碳酸钠缓冲液(pH9.6) 稀释的抗犬细小病毒高免血清4°C包被过夜。PBST清洗3次，再用犬细小病毒液在37°C下孵育1 h，PBST清洗3次，孔板用含5%脱脂奶粉的PBST（100μL）37°C封闭 1 h。PBST清洗3遍后，阳性组、阴性组、实验组小鼠血清分别用含1% 脱脂奶粉PBST 按1:100稀释后，每孔100μL加于封闭孔板中，于37°C孵育 1 h。PBST清洗3次后，HRP标记的抗小鼠IgG抗体（Sigma）用含1%脱脂牛奶的PBST 按1:3000稀释并每孔100μL加于封闭孔板中，于37°C孵育 1 h。PBST清洗3次后，50μL底物溶液（TMB, Sigma）加于各孔中于37°C 孵育 15 min。然后用50μL 2N H₂SO₄加于各孔终止颜色反应，于450nm检测光密度（OD值）。结果显示，与PBS阴性对照组相比，其它两组小鼠在首次免疫后，血清中特异性抗体含量随着时间的推移不断升高，并且在第28d，病毒样颗粒免疫组与病毒免疫组之间，抗体水平差异不显著(P>0.05)，证明病毒样颗粒免疫小鼠后，能有效刺激小鼠产生特异性抗体，并且抗体水平接近全病毒免疫后的效果（图 4）。

（2）T-淋巴细胞增殖实验

在6周随机收取VLP免疫组小鼠1只将其脱颈处死，然后放入酒精中浸泡5min消毒，无菌取脾，加入1mL无血清1640培养液于200目铜网上研磨，用无血清RPMI 1640培养液冲洗铜网，将研磨获得的脾细胞悬液加入装有2mL淋巴细胞分离液的离心管中，4°C 2500 r/min离心10min，用长针头吸出淋巴细胞层放入新离心管中，用无Ca²⁺、Mg²⁺  HankS液洗两次并以RPMI 1640培养液混匀，细胞计数后，以含10% FBS的RPMI 1640培养液稀释成10⁷/mL浓度。将稀释好的淋巴细胞悬液加入96孔细胞板中（100μL/孔），每个样品设4复孔，每孔加入CPV、ConA 10 μg，同时以不加刺激物的淋巴细胞为对照，培养板在含5% CO₂的37°C恒温培养箱培养72h后，加入20μL MTS/PMS混合试剂（CellTiter 96 Aqueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay, Promega），于37°C培养4h，用酶标仪检测波长为490 nm的光密度值。计算刺激指数。继续培养4h后，采用酶联免疫检测仪测定每孔OD450值，计算每孔的平均值，计算淋巴细胞的增殖指数（stimulation index,SI增殖指数=实验组OD450/阴性对照组OD450），不同分组间应用t检验进行差异显著性比较。结果显示，VLP免疫组小鼠的淋巴细胞经特异的CPV刺激后，T-淋巴细胞的增值效果明显高于对照组，说明VLP作为疫苗，能够持续刺激机体产生细胞免疫应答 (图 5)。

（3）T-淋巴细胞亚群分布检测

取脾脏分离淋巴细胞，用预冷的PBS调整细胞浓度至6×10⁶个/mL。各取100μL分别加入APC标记的抗鼠CD4+、PE标记的抗鼠CD8+单克隆抗体（APC、PE均购自BD公司），混匀后置于4℃避光30 min，以预冷的PBS洗两遍，4°C 2000 r/min离心5min，弃上清，沉淀用350μL预冷的PBS重悬，用流式细胞仪分析T淋巴细胞亚群。T-淋巴细胞亚群CD4+、CD8+增值分布的结果显示，与PBS阴性组相比，CPV组与VLP组的CD3⁺ T淋巴细胞总数显著升高（P<0.05），CD4⁺与CD8⁺分子标记的T淋巴细胞占总T淋巴细胞数量的比例均下降（P<0.05）。并且CD4 ⁺T淋巴细胞数量与CD8 ⁺T淋巴细胞数量的比值下降（P<0.05）（表1），表明CPV能有效刺激VLP组小鼠脾脏淋巴细胞增殖。

以上试验说明利用原核表达系统表达的犬细小病毒VP2蛋白具有良好的反应原性，能够与抗犬细小病毒单克隆抗体反应，该VP2蛋白能够在体外组装成病毒样颗粒，免疫试验表明本发明的犬细小病毒病毒样颗粒有良好的免疫性，可用于在制备用于预防犬细小病毒引起疾病的疫苗中的应用，也可在制备用于检测犬细小病毒的检测试剂中的应用。

 

<110>  中国农业科学院兰州兽医研究所

<120>  犬细小病毒病毒样颗粒及用途

<160>  2

 

<210>  1

<211>  1755

<212>  DNA

<213>  犬细小病毒病毒样颗粒（VP2）

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atgagtgatg gagcagttca accagacggt ggtcagcctg ctgtcagaaa tgaaagagct      60

 

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agaaaattat attaa                                                     1755

 

<210>  2

<211>  33

<212>  DNA

<213>  人工序列（VP2F）

<400>

tgtcgtctca aggtatgagt gatggagcag ttc                                   33

 

<210>  3

<211>  31

<212>  DNA

<213>  人工序列（VP2R）

<400>

cgggatccgt taatataatt ttctaggtgc t                                     31

Claims (7)

1.犬细小病毒病毒样颗粒，其特征在于由VP2蛋白组成，其基因序列为SEQ ID №1。

2.权利要求1所述的犬细小病毒病毒样颗粒的制备方法，其特征在于以犬细小病毒DNA为模板，用SEQ ID №2和SEQ ID №3为引物扩增得到扩增产物，将扩增产物插入载体pSMK中，得重组质粒pSMK-VP2，将pSMK-VP2转化到大肠杆菌BL21-CondonPlus(DE3)-RIL株，在37℃，含卡那霉素（Kanamycin ）(50μg/mL) 和氯霉素（chloramphenicol）（34μg/ml）的LB培养基中培养重组大肠杆菌，以IPTG诱导表达重组蛋白，再将重组蛋白纯化后进行体外组装，得到犬细小病毒病毒样颗粒。

3.根据权利要求2所述的犬细小病毒病毒样颗粒的制备方法，其特征在于VP2重组蛋白纯化方式为亲和层析纯化。

4.根据权利要求3所述的犬细小病毒病毒样颗粒的制备方法，其特征在于将表达菌沉淀超声裂解后的上清转移至经buffer A（500mM NaCl、20mM Tris-HCl、20mM Imidazole、1mM DTT，pH=8.0）平衡的镍亲和层析树脂层析柱中，在室温条件下结合1h，之后用buffer A洗涤层析柱，目的蛋白用buffer B（500mM NaCl、20mM Tris-HCl、300mM Imidazole、1mM DTT，pH=8.0）洗脱，每次1ml，反复洗脱5-6次。

5.根据权利要求2或3或4所述的犬细小病毒病毒样颗粒的制备方法，其特征在于重组蛋白纯化后进行体外组装方法为：将重组融合VP2蛋白按质量比100:1加入sumo酶，再置于透析袋内，透析袋外部的缓冲液为150mM NaCl，50mM Tris-HCl，pH 7.0，组装时整个缓冲体系置于搅拌仪上，使缓冲液轻微搅动，得到犬细小病毒病毒样颗粒。

6.权利要求1所述的犬细小病毒病毒样颗粒在制备用于预防犬细小病毒引起疾病的疫苗中的应用。

7.权利要求1所述的犬细小病毒病毒样颗粒在制备用于检测犬细小病毒的检测试剂中的应用。

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