CN101914501A - 口蹄疫病毒样颗粒及制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种亚洲I型口蹄疫病毒样颗粒及制备方法和用途。本发明的亚洲I型口蹄疫病毒样颗粒是由亚洲I型口蹄疫病毒的结构蛋白VP0、VP3和VP1构成，其中VP0的基因序列为SEQ 1，其中VP3的基因序列为SEQ 3，其中VP1的基因序列为SEQ 2。本发明的亚洲I型口蹄疫病毒样颗粒制备方法是通过扩增得到结构蛋白VP0、VP3和VP1，再经酶切后得到重组表达载体，再经小泛素样修饰蛋白酶酶切融合蛋白后在体外组装得到口蹄疫病毒样颗粒。
Description
技术领域
发明涉及一种亚洲I型口蹄疫病毒样颗粒，以及这种病毒样颗粒的制备方法和用途。
背景技术
口蹄疫是危害我国主要畜种猪、牛、羊最严重的疫病。这些畜种创值占畜牧业产值的80％左右，该病造成的经济损失每年达数百亿元，又涉及食品安全和公共卫生。我国十分重视对该病的防控，对推动农业产业结构调整，加快“三农”发展意义重大。
加入WTO后，发达国家通过对畜牧业产品的技术壁垒手段，限制我国活畜及其产品的出口，畜牧业的外贸出口损失巨大。目前使用的灭活疫苗防控已不能适应当前国际贸易形势，大大影响了我国动物及其产品的出口，严重限制畜牧业对畜牧业的健康发展和对国民经济的贡献度。因此，研究和创制具有自主知识产权的口蹄疫新型疫苗制剂是当务之急，也符合国家提出的有效防控重大动物疫病，保障畜牧业健康可持续发展的需要。
中国发明专利200710008843.6公开了“含O型口蹄疫病毒IRES RNA的病毒样颗粒与制备方法及应用”，该专利采用了原核表达系统，且其病毒样颗粒是噬菌体外壳蛋白包裹口蹄疫病毒的IRES RNA。即外壳是噬菌体外壳蛋白而非口蹄疫外壳蛋白。口蹄疫病毒的IRES RNA是指口蹄疫病毒基因组非编码区的其中一小段。该病毒样颗粒主要用途是想做为检测RNA病毒时的标准参照品。
发明内容
本发明的目的是提供一种亚洲I型口蹄疫病毒样颗粒，同时本发明提供这种病毒样颗粒的制备方法及用途。
本发明的亚洲I型口蹄疫病毒样颗粒是由亚洲I型口蹄疫病毒的结构蛋白VP0、VP3和VP1构成，其中VP0的基因序列为SEQ 1，其中VP3的基因序列为SEQ 3，其中VP1的基因序列为SEQ 2。
本发明的亚洲I型口蹄疫病毒样颗粒的制备方法是：
(1)小泛素样修饰蛋白融合表达载体pSMA的构建：
a.以酿酒酵母基因组DNA为模板，以smt3F/smt3R为引物扩增得到smt3基因，引物序列如下：
上游引物smt3F：5’GCCATGG (Nco I) GT CAT CAC CAT CAT CAT CAC (6×His)GGG TCG GACTCA GAA GTC AAT CAA 3’，
下洲引物smt3R：5’GGA TCC (BamH I) GAGACC (Bsa I) TTAA GGTCTC (Bsa I)AA CCT CCA ATCTGT TCG CGG TG 3’，
b.经Nco I和BamH I双酶切后将smt3基因插入到用同样内切酶处理的pET-28a载体中，所得载体为pSMK，将pSMK的卡那霉素抗性基因替换为氨苄抗性基因，得载体pSMA；
(2)亚洲I型口蹄疫病毒结构蛋白VP0、VP3和VP1基因的扩增：通过反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)，以亚洲I型(Asia I)口蹄疫病毒RNA为模板，分别用引物VP0BsmBI/VP0BamH I、VP3BsmB I/VP3BamH I和VP1BsmB I/VP1BamH I扩增获得VP0，VP3和VP1基因。
引物序列如下：
上游引物VP0BsmBI：5’GTA CTT CGTCTC AAGGT GGA GCC GGG CAA TCC AGT，
下游引物VP0BamH I：5’GCG AGT GGA TCC TCA CTC TTT CGA GGG CAG TTC，
上游引物VP3BsmB I：5’GGA CTT CGTCTCA AGGT GGG ATA GTT CCT GTG GCG，
下游引物VP3BamH I：5’GCT TAT GGA TCC TCA CTG TTG GCG GGC ATC CAC；
上游引物VP1BsmB I：5’GCA CTT CGTCTCA AGGT ACT ACC ACC ACT GGC GAG，
下游引物VP1BamH I：5’GCG CAC GGA TCC TCA CAG AGT CTG TTT CTC AGG；
(3)重组表达载体的构建
将经BsmB I/BamH I双酶切后的VP0、VP3和VP1分别插入经Bsa I酶切处理的pSMK，pSMA和pSMK，得到重组表达载体pSMK/VP0，pSMA/VP3和pSMK/VP1；
(4)双表达重组载体的构建
以pSMK/VP1为模板，以T7BamH I/VP1Xho I为引物扩增获得含有T7启动子等原核表达元件和VP1基因的DNA片段，经BamH I/Xho I双酶切后插入用同样酶切处理的pSMK/VP0中，得双表达重组载体pSMK/VP0-VP1，引物序列如下：
上游引物T7BamH I：5’GCA ATT GGA TCC CGT CCG GCG TAG AGG ATC GA，
下游引物VP1Xho I：5’GCG CAC CTC GAG TCA CAG AGT CTG TTT CTC AGG；
(5)蛋白表达与纯化
将pSMA/VP3和pSMK/VP0-VP1共转化到表达菌BL21-CodonPlus(DE3)-RIL株(Stratagene)，用氯霉素、青霉素和卡那霉素筛选三抗性克隆进行蛋白表达和纯化
(6)口蹄疫病毒样颗粒的体外组装：
用小泛素样修饰蛋白酶酶切融合蛋白，通过HisTrap HP除去小泛素样修饰蛋白，收集含有VP0、VP1和VP3的液体，用透析缓冲液PBS(pH 7.5)透析组装成目的病毒样颗粒。
本发明的亚洲I型口蹄疫病毒样颗粒可用于制备亚洲I型口蹄疫疫苗。
病毒样颗粒是不含病毒核酸的空壳结构，在形态结构上与天然的病毒颗粒相似，具有很强的免疫原性和生物学活性；由于病毒样颗粒不含有病毒遗传物质，因此不具有感染性。从安全性和免疫效力方面来讲，它是一种可开发理想的疫苗资源。本发明的病毒样颗粒是不含任何核酸的口蹄疫结构蛋白质外壳，与口蹄疫全病毒相比，其不含任何核酸，外壳与全病毒的外壳相似或一样，由于不含核酸，所以无传染性，即非常安全，由于其外壳与全病毒的相似或一样，所以其抗原性或免疫原性好，是一种非常有潜力的用于制备相应疫苗或制备相应药物的资源。
包括口蹄疫病毒在内的多种病毒的结构蛋白能在不同的表达系统中自动组装成病毒样颗粒。然而到目前为止，能够形成病毒样颗粒的表达系统主要是哺乳动物细胞表达系统和杆状病毒/昆虫细胞表达系统，用这些系统生产病毒样颗粒，不仅费用昂贵，而且生产效率低下。本发明采用了原核表达系统生产病毒样颗粒，可以解决现有技术中哺乳动物细胞表达系统和杆状病毒/昆虫细胞表达系统的昂贵费用和效率低下问题，同时也可以克服目前基因工程苗免疫效率低下的问题，具有表达系统表达效率较高的优点。另外在现有原核表达系统中，由于缺乏正确的修饰与折叠，多数情况下以重组蛋白是以非可溶性的包涵体形式存在，而本发明由于采用了小泛素样修饰蛋白能够帮助原核表达蛋白的正确折叠，提高蛋白的水溶性，这些辅助分子曾被成功地应用于毒性蛋白的表达。
附图说明
图1为VP0、VP1和VP3共表达的SDS-PAGE和Western-blotting检测，其中：M为蛋白marker，1为VP0、VP1和VP3共表达的SDS-PAGE结果，2为VP0、VP1和VP3共表达的Western-blotting结果。
图2体外组装的本发明病毒样颗粒在电镜下观察的结果。
具体实施方式
1.小泛素样修饰蛋白融合表达载体的构建：
根据已发表的酿酒酵母smt3基因(GenBank登陆号：AY558174)设计引物，引物序列见基因序列表SEQ 5和SEQ 6。
在上游引物smt3F(5’GCCATGG (Nco I) GT CAT CAC CAT CAT CAT CAC (6×His)GGG TCG GAC TCAGAA GTC AAT CAA 3’)中引入Nco I内切酶位点和6×His编码序列，在下游引物smt3R(5’GGA TCC (BamH I) GAGACC (Bsa I)TTAA GGTCTC (Bsa I)AA CCT CCA ATC TGT TCG CGG TG 3’)中引入包含BamH I内切酶位点和在正负双链中各含一Bsa I内切酶位点的序列。参考Motejadded等(2009)的方法(Motejadded H，Altenbuchner J，2009.Construction of a dual-tag systemfor gene expression，protein affinity purification and fusion protein processing.Biotechnol Lett.31(4)：543-9.)，以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株EGY48基因组DNA为模板，用smt3F和smt3R扩增获得smt3基因。经Nco I和BamH I双酶切后将smt3基因插入到用同样内切酶处理的pET-28a载体(Novagen)中，所得载体命名为pSMK。将pSMK的卡那霉素抗性基因通过基因工程技术替换为氨苄抗性基因，所得载体命名为pSMA。
2.口蹄疫结构蛋白重组表达载体的构建
根据已公布的亚洲I型(Asia I)口蹄疫病毒的序列(GenBank登陆号：EF149009)设计用于扩增口蹄疫结构蛋白VP0，VP3和VP1基因的引物，并在引物中引入相应的内切酶位点，引物序列如下：
VP0BsmB I：5’GTA CTT CGTCTC AAGGT GGA GCC GGG CAA TCC AGT
VP0BamH I：5’GCG AGT GGA TCC TCA CTC TTT CGA GGG CAG TTC
VP3BsmB I：5’GGA CTT CGTCTCAAGGT GGG ATA GTT CCT GTG GCG
VP3BamH I：5’GCT TAT GGA TCC TCA CTG TTG GCG GGC ATC CAC
VP1BsmB I：5’GCA CTT CGTCTCA AGGT ACT ACC ACC ACT GGC GAG
VP1BamH I：5’GCG CAC GGA TCC TCA CAG AGT CTG TTT CTC AGG
T7BamH I：5’GCA ATT GGA TCC CGT CCG GCG TAG AGG ATC GA
VP1Xho I：5’GCG CAC CTC GAG TCA CAG AGT CTG TTT CTC AGG
采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法，用引物VP0BsmB I/VP0BamH I，VP1BsmBI/VP1BamH I和VP3BsmB I/VP3BamH I分别扩增获得VP0，VP1和VP3基因，经BsmB I/BamHI双酶切后分别插入经Bsa I酶切处理的pSMK和pSMA，所构建重组表达载体分别命名为pSMK/VP0，pSMK/VP1和pSMA/VP3。以pSMK/VP1为模板，以T7BamH I/VP1Xho I为引物扩增获得含T7启动子等原核表达元件和VP1基因的DNA片段，经BamH I/Xho I双酶切后插入用同样酶切处理的pSMK/VP0中，所得双表达重组载体命名为pSMK/VP0-VP1。具体过程方法如下：
(1)病毒RNA的提取
参照试剂盒说明，用RNaeasy Mini kit(Qiagen)从亚洲I型(Asia I)口蹄疫病毒中提取病毒RNA，操作过程简要概括如下：
a)在350μl病毒液中加入350μl RLT(使用前按10μl β-ME/1ml RLT的比例加β-ME)，混匀。
b)在上述裂解物中加350μl的冷乙醇，颠倒混匀，不要离心。
c)取700μl样品(包括可能产生的沉淀)，加入一座于2ml收集管上的吸附柱中，离心(≥8000×g)15s，弃滤液。
d)取700μl RW1加到RNA吸附柱中，离心(≥8000×g)15s，弃滤液。
e)将吸附柱移到一个新的2ml收集管中，取500μl RPE于吸附柱中，离心(≥8000×g)15s，弃滤液。再取500μl RPE到吸附柱，离心(≥8000×g)2min。
f)将吸附柱转移到一个新的1.5ml离心管中，取30-50μl RNase-free water直接加到吸附柱中的膜表面，离心(≥8000×g)1min。RNA直接用于反转录合成cDNA或置-20℃备用。
(2)反转录(RT)合成cDNA第一链
取10μl RNA，加入20μl反转录体系中，内含1×RT buffer(50mmol/L Tris-HCl(pH8.3)，75mmol/L KCl，8mmol/LMgCl2，10mmol/L DTT)，dNTP(1mmol/L each)，50pmol特异性引物VP0BamH I或VP1 BamH I或VP3BamH I，10U AMV reverse transcriptase(TaKaRa)，20URibonuclease inhibitor(TaKaRa)。在42℃水浴1h，置-20℃备用。
(3)PCR扩增cDNA
取5μl反转录产物加入50μl PCR反应体系中，内含1×PCR buffer(10mmol/L Tris-HClpH8.3，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2)，dNTP(0.2mmol/L each)，250nmol/L特异性引物VP0BsmB I/VP0BamH I或VP1BsmB I/VP1BamH I或VP3BsmB I/VP3BamH I。0.25U LA Taq(TaKaRa)。PCR循环参数为：94℃ 5min，1个循环；94℃ 60s，58℃ 60s，72℃ 2.5min，30个循环；最后一循环72℃延伸8min。
(4)扩增片段的纯化
参照试剂盒说明，用DNA Fragment Purification Kit(TaKaRa)纯化扩增产物，其操作过程简述如下：
a)向PCR反应液中加入3倍量的DB Buffer，然后均匀混合。
b)将试剂盒中的Spin Column安置于Collection Tube上。
c)将上述操作1)的溶液转移至Spin Column中，12,000r/min离心1min，弃滤液。
d)将500μl的RinseA加入Spin Column中，12,000r/min离心30s，弃滤液。
e)将700μl的Rinse B加入Spin Column中，12,000r/min离心30s，弃滤液。
f)重复操作步骤5。
g)将Spin Column按置于新的1.5ml的离心管上，在Spin Column膜的中央处加入25-30μl约60℃的灭菌水，室温静置1min。
h)12,000r/min离心1min洗脱DNA。
(5)酶切DNA片段和载体
参照内切酶使用说明，取20μl DNA加入50μl酶切体系，内含1×内切酶Buffer，内切酶各5U，37℃酶切2h。如上述方法纯化。
(6)连接、转化和筛选
参照DNA Ligation Kit(TaKaRa)说明，将4μl目的基因片段、1μl载体和5μl高效连接液(Soluion I)混匀，16℃反应30min，全量转化DH5α感受态细胞。用PCR筛选阳性重组子，并通过测序确证。
3.高效可溶性表达及高纯度蛋白的纯化
将pSMA/VP3和pSMK/VP0-VP1共转化到表达菌BL21-CodonPlus(DE3)-RIL株(Stratagene)，用氯霉素、青霉素和卡那霉素筛选三抗性克隆。挑取单克隆菌于LB培养基37℃ 220rpm震荡过夜培养，按1∶100的比例加到LB培养基，于37℃ 220rpm震荡培养，待OD600达0.6-0.8时，加入IPTG至终浓度0.4mM诱导，20℃ 220rpm继续震荡培养16h左右，5000rpm离心收集细菌沉淀，-70℃储存备用。
用经冰浴的缓冲液A(50mM Tris-Cl pH7.4，500mM NaCl，20mM Imidazol，1mM DTT)重悬细菌沉淀，在冰浴中超声波破碎：超声时间5s，间隔时间5s，共30min，功率200W。然后20,000×g离心30min，取上清，弃沉淀。
用快速液相色谱仪(FPLC)纯化目标蛋白。具体方法为以0.5ml/min的流速将上述上清液注入并流经镍亲和柱HisTrap HP(GE healthcare)，用10％的缓冲液B(50mM Tris-Cl pH7.4，500mM NaCl，500mM Imidazol，1mM DTT)以1ml/min的流速洗去非特异性结合蛋白，用100％的缓冲液B洗脱并收集目标蛋白，加20％甘油，-70℃保存备用。
通过SDS-PAGE和免疫印迹(western)检测蛋白质的表达和免疫活性，结果显示，获得了预期大小的蛋白，且具有免疫活性，参见图1。
4.口蹄疫病毒样颗粒的体外组装：
参照invitrogen的试剂使用说明，用小泛素样修饰蛋白酶酶切融合蛋白，具体按照如下方法和比例进行：20μg上述纯化的融合蛋白，20μl 10×Buffer(500mM Tris-HCl，pH 8.0，2％ Igepal(NP-40)，1.5M NaCl，10mM DTT)，10μl小泛素样修饰蛋白酶(1U/μl)，4℃酶切过夜。
由于小泛素样修饰蛋白酶带有组氨酸标签，将酶切混合物通过HisTrap HP除去小泛素样修饰蛋白，收集含有VP0、VP1和VP3的流穿液，用PBS(pH 7.5)于4℃透析组装病毒样颗粒，经超滤浓缩后，透射电镜观察，具体方法为：将10μl含病毒样颗粒的液体加到200目的铜网上，室温吸附2-3min，用滤纸吸干铜网，用3％的磷钨酸染色，用Hitachi，H-7100FA透射电镜观察，其体外组装的病毒样颗粒电镜观察结果参见图2，如图所示，可见约20nm的病毒样颗粒，说明本发明利用原核表达的蛋白，在体外成功组装获得了病毒样颗粒。
Claims (3)
1.亚洲I型口蹄疫病毒样颗粒，其特征在于由亚洲I型口蹄疫病毒的结构蛋白VP0、VP3和VP1构成，其中VP0的基因序列为SEQ 1，VP3的基因序列为SEQ 3，VP1的基因序列为SEQ 2。
2.权利要求1所述的亚洲I型口蹄疫病毒样颗粒的制备方法，其特征是：
(1)小泛素样修饰蛋白融合表达载体pSMA的构建：
a.以酿酒酵母基因组DNA为模板，以smt3F/smt3R为引物扩增smt3基因，引物序列如下：
上游引物smt3F：5’GCCATGG (Nco I) GT CAT CAC CAT CAT CAT CAC (6×His)GGG TCG GAC TCA GAA GTC AAT CAA 3’，
下游引物smt3R：5’GGA TCC (BamH I) GAGACC (Bsa I)TTAA GGTCTC (Bsa I)AA CCTCCA ATC TGT TCG CGG TG 3’，
b.经Nco I和BamH I双酶切后将smt3基因插入到用同样内切酶处理的pET-28a载体中，所得载体为pSMK，将pSMK的卡那霉素抗性基因替换为氨苄抗性基因，得载体pSMA；
(2)亚洲I型口蹄疫病毒结构蛋白VP0、VP3和VP1基因的扩增：通过反转录聚合酶链式反应，以亚洲I型口蹄疫病毒RNA为模板，分别用引物VP0BsmBI/VP0BamH I、VP3BsmB I/VP3BamH I和VP1BsmB I/VP1BamH I扩增获得VP0，VP3和VP1基因。
引物序列如下：
上游引物VP0BsmBI：5’GTA CTT CGTCTC AAGGT GGA GCC GGG CAA TCCAGT，
下游引物VP0BamH I：5’GCG AGT GGA TCC TCA CTC TTT CGA GGG CAGTTC，
上游引物VP3BsmB I：5’GGA CTT CGTCTCA AGGT GGG ATA GTT CCT GTGGCG，
下游引物VP3BamH I：5’GCT TAT GGA TCC TCA CTG TTG GCG GGC ATCCAC；
上游引物VP1BsmB I：5’GCA CTT CGTCTCA AGGT ACT ACC ACC ACT GGCGAG，
下游引物VP1BamH I：5’GCG CAC GGA TCC TCA CAG AGT CTG TTT CTCAGG；
(3)重组表达载体的构建
将经BsmB I/BamH I双酶切后的VP0、VP3和VP1分别插入经Bsa I酶切处理的pSMK，pSMA和pSMK，得到重组表达载体pSMK/VP0，pSMA/VP3和pSMK/VP1；
(4)双表达重组载体的构建
以pSMK/VP1为模板，以T7BamH I/VP1Xho I为引物扩增获得含有T7启动子等原核表达元件和VP1基因的DNA片段，经BamH I/Xho I双酶切后插入用同样酶切处理的pSMK/VP0中，得双表达重组载体pSMK/VP0-VP1，引物序列如下：
上游引物T7BamH I：5’GCA ATT GGA TCC CGT CCG GCG TAG AGG ATCGA，
下游引物VP1Xho I：5’GCG CAC CTC GAG TCA CAG AGT CTG TTT CTCAGG；
(5)蛋白表达与纯化
将pSMA/VP3和pSMK/VP0-VP1共转化到表达菌BL21-CodonPlus(DE3)-RIL株(Stratagene)，用氯霉素、青霉素和卡那霉素筛选三抗性克隆进行蛋白表达和纯化；
(6)口蹄疫病毒样颗粒的体外组装：
用小泛素样修饰蛋白酶酶切融合蛋白，通过HisTrap HP除去小泛素样修饰蛋白，收集含有VP0、VP1和VP3的液体，用透析缓冲液PBS(pH 7.5)透析组装成目的病毒样颗粒。
3.权利要求1所述的亚洲I型口蹄疫病毒样颗粒在制备亚洲I型口蹄疫疫苗的应用。
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