CN110777160A - 一种口蹄疫病毒样颗粒抗原的制备方法及其制备的口蹄疫病毒样颗粒抗原和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种口蹄疫病毒样颗粒抗原的制备方法，该方法通过表达的豆蔻酰化转移酶对口蹄疫病毒衣壳前体蛋白P1进行豆蔻酰化修饰，改善了3C蛋白酶酶切后VP0，VP3和VP1衣壳蛋白组装形成所述口蹄疫病毒样颗粒的稳定性。其制备的疫苗组合物具有良好的免疫原性，较相同血清型的商业疫苗产生抗体更快、产生的抗体滴度更高，维持期也更长。

Description

一种口蹄疫病毒样颗粒抗原的制备方法及其制备的口蹄疫病 毒样颗粒抗原和应用

技术领域

本发明涉及口蹄疫病毒前体蛋白P1的修饰后表达、组装口蹄疫病毒样颗粒抗原的制备方法，及其制备的口蹄疫病毒样颗粒抗原，以及含有该抗原的疫苗组合物和应用，属于兽用生物制品领域。

背景技术

口蹄疫(FMD)为一种急性、高度接触传染性和可快速远距离传播的动物疾病，是哺乳动物中感染性最强的疾病，其中偶蹄类动物染病更会造成全球重大的经济损失。遭受口蹄疫危害的动物包括牛，羊、山羊和猪。致病因子为口蹄疫病毒(FMDV)，是小核糖核酸病毒属家族的一种口疮病毒。该病毒分为7个血清型(A、O、C、Asia1、SAT1、SAT2 和SAT3型)，其中O型口蹄疫病毒流行最为广泛。疫苗免疫是控制此病、保护家畜免受危害的有效措施。

病毒样颗粒(VLPs)是一种在体外和/或体内表达时能够自组装成病毒外壳结构的类病毒粒子，它们是具有病毒的相似外壳结构但是不具有病毒复制能力的假病毒。VLPs疫苗能有效地激发机体产生抗感染，抗肿瘤免疫，基于病毒样颗粒设计的疫苗是一种较为理想的疫苗形式。

大肠杆菌表达系统由于具有易于培养，不需要复杂设备，安全性高，生产成本低等显著特点，因此被广泛应用于生物制药行业中。然而大肠杆菌表达系统直接表达口蹄疫病毒衣壳前体蛋白P1蛋白在酶切后组装，并不能形成稳定的VLPs。

综上所述，针对口蹄疫防治的需求，降低生产成本的需要，迫切需要建立一种生产周期短，VLPs结构稳定的大肠杆菌表达的口蹄疫病毒样颗粒制备的方法。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明提供一种口蹄疫病毒样颗粒抗原的制备方法，其中，所述方法包括：步骤(1)分别克隆、重组口蹄疫病毒衣壳前体蛋白P1全长基因和豆蔻酰化转移酶的基因到表达载体，获得口蹄疫病毒衣壳前体蛋白P1的重组表达质粒和豆蔻酰化转移酶的重组表达质粒；步骤(2)将所述步骤(1)获得的所述口蹄疫病毒衣壳前体蛋白P1的重组表达质粒和所述豆蔻酰化转移酶的重组表达质粒转化到大肠杆菌，获得所述大肠杆菌的重组表达菌株；步骤(3)将所述步骤(2)的所述大肠杆菌的重组表达菌株培养表达，诱导豆蔻酰化转移酶的表达，然后诱导可溶性P1蛋白的表达；步骤(4)从所述步骤(3) 的表达体系中分离所述大肠杆菌的重组表达菌株，破碎菌体后分离上清液并纯化其中的P1蛋白；以及步骤(5)使用3C蛋白酶体外酶切豆蔻酰化修饰的口蹄疫病毒衣壳前体蛋白P1，得到VP0，VP3和VP1衣壳蛋白，其自我组装形成所述口蹄疫病毒样颗粒。

本发明的口蹄疫病毒样颗粒抗原的制备方法经重组的豆蔻酰化转移酶表达后，对前体蛋白P1进行豆蔻酰化修饰，使得其经3C蛋白酶酶切后，VP0，VP3和VP1衣壳蛋白组装的口蹄疫病毒样颗粒粒子的稳定性得到提高，其病毒粒子置于4℃下放置4个月，仍能保持完整的粒子形态以及良好的免疫原性。

作为本发明的一种实施方式，本发明所述的口蹄疫病毒样颗粒的制备方法中，所述步骤(1)中所述口蹄疫病毒衣壳前体蛋白P1基因为A 型、Asia1型或O型的口蹄疫病毒衣壳前体蛋白P1基因，所述豆蔻酰化转移酶基因为牛源的豆蔻酰化转移酶基因。

本发明的制备方法通过豆蔻酰化对前体蛋白P1进行修饰，以提高后续酶切的VP0，VP3和VP1衣壳蛋白自我组装体——口蹄疫病毒样颗粒粒子的稳定性，该方法可以适用于制备不同血清型的口蹄疫病毒衣壳前体蛋白P1基因来源的口蹄疫病毒样颗粒粒子。

作为本发明的一种实施方式，本发明所述的口蹄疫病毒样颗粒的制备方法中，所述步骤(1)中所述口蹄疫病毒衣壳前体蛋白P1基因如SEQ ID.No.1或其简并序列所示，所述豆蔻酰化转移酶基因如SEQ ID. No.2或其简并序列所示，所述表达口蹄疫病毒衣壳前体蛋白P1的质粒为PET28a，所述表达豆蔻酰化转移酶的质粒为PET32a；所述步骤(2) 中所述大肠杆菌表达菌株为BL21(DE3)，所述口蹄疫病毒衣壳前体蛋白P1的重组表达质粒的转化和所述豆蔻酰化转移酶的重组表达质粒的转化为依次转化；所述步骤(3)中添加肉豆蔻酸诱导豆蔻酰化转移酶的表达，在添加肉豆蔻酸2h后添加IPTG诱导可溶性P1蛋白的表达。

本发明构建表达豆蔻酰化修饰的口蹄疫病毒衣壳前体蛋白P1的大肠杆菌菌株，生产口蹄疫病毒样颗粒，可溶性表达产量高、生产成本低、该口蹄疫病毒样颗粒稳定、免疫原性好、无生物安全风险。

本发明还提供了所述制备方法制备的所述口蹄疫病毒样颗粒抗原。

本发明的口蹄疫病毒样颗粒抗原在制备过程中经豆蔻酰化修饰后，改善了酶切产生的VP0，VP3和VP1衣壳蛋白自我组装体的稳定性，较不经豆蔻酰化修饰，直接表达P1蛋白后酶切、组装产生的口蹄疫病毒样颗粒抗原稳定性大大提高。

本发明还提供了一种疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包含免疫量的所述的口蹄疫病毒样颗粒抗原和药学上可以接受的载体。

本发明的疫苗组合物具有良好的免疫原性，较商业上可获得的同血清型的疫苗产生抗体更快、产生的抗体滴度更高，维持期也更长。

作为本发明的一种实施方式，本发明所述的疫苗组合物中，所述口蹄疫病毒样颗粒抗原含量为160-240μg/ml。

本发明的口蹄疫病毒样颗粒疫苗组合物中口蹄疫病毒样颗粒抗原含量可以任意选自160μg/ml、165μg/ml、170μg/ml、175μg/ml、180μg/ml、 185μg/ml、190μg/ml、195μg/ml、200μg/ml、205μg/ml、210μg/ml、215μg/ml、 220μg/ml、225μg/ml、230μg/ml、235μg/ml、240μg/ml。

作为本发明的一种实施方式，本发明所述的口蹄疫病毒样颗粒疫苗组合物中，所述的口蹄疫病毒样颗粒抗原含量为200μg/ml。

作为本发明的一种实施方式，本发明所述的疫苗组合物中，所述药学上可以接受的载体包括佐剂，所述佐剂选自：(1)铝胶佐剂、皂苷、阿夫立定、DDA；(2)油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂；或(3)丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物；以及RIBI佐剂系统、Block co-polymer、SAF-M、单磷酰脂质A、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素、霍乱毒素、IMS 1314、胞壁酰二肽、Gel佐剂中的一种或几种；优选地，皂苷为Quil A、 QS-21、GPI-0100。

作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的疫苗组合物中，所述佐剂为ISA206佐剂。

作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的疫苗组合物中，所述佐剂的浓度范围是从5％-60％V/V，优选从30％-60％，更优选50％ V/V。

作为本发明的一种实施方式，所述的药学上可接受的载体包括药物、免疫刺激剂、抗氧化剂、表面活性剂、着色剂、挥发性油、缓冲剂、分散剂、推进剂和防腐剂；所述免疫刺激剂包括α-干扰素、β-干扰素、γ-干扰素、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和白介素2(IL2)。

为了制备这样的组合物，可以使用本领域公知的方法。

本发明还提供了所述的疫苗组合物在制备预防和/治疗口蹄疫的药物中的应用。

作为本发明的一种实施方式，本发明所述的应用中，所述口蹄疫病毒为A型口蹄疫病毒、Asia1型口蹄疫病毒和/或O型口蹄疫病毒。

本发明所述的制备预防和/或治疗口蹄疫病毒感染的药物的施用对象包括猪。

附图说明

下面结合附图对本发明作进一步描述：

图1为豆蔻酰化修饰的口蹄疫病毒衣壳前体蛋白P1经过亲和色谱层析纯化后的SDS-PAGE结果，泳道1为经本发明纯化所得豆蔻酰化修饰的口蹄疫病毒衣壳前体蛋白P1上样2μL后的电泳图；泳道2为分子量Marker的电泳图，结果显示，经过纯化的豆蔻酰化修饰的口蹄疫病毒衣壳前体蛋白P1纯度达到了80％以上；

图2为纯化所得豆蔻酰化修饰的口蹄疫病毒衣壳前体蛋白P1经过 3C蛋白酶切，组装之后，分子筛色谱层析纯化的SDS-PAGE结果，泳道1为分子量Marker的电泳图，泳道2为经本发明纯化所得的口蹄疫病毒衣壳上样10μL后的电泳图，结果显示，经过纯化的口蹄疫病毒衣壳纯度超过了90％以上；

图3为本发明所得的口蹄疫病毒衣壳蛋白组装形成的病毒样颗粒透射电镜观察结果，视野中，可见大量均匀直径为25nm左右的病毒样颗粒，颗粒实际大小与理论大小相符，表观状态均匀一致；

图4为本发明所得的口蹄疫病毒衣壳组装形成的病毒样颗粒的动态光散射测试结果，结果显示，口蹄疫病毒样颗粒的水化分子动力学直径为26.39nm，颗粒组装百分比约为100％。

具体实施方式

以下，对本发明的实施方式进行说明。

“病毒样颗粒(virus-like particles，VLPs)”是由一种或多种病毒结构蛋白组装成的颗粒，具有与病毒颗粒相似的外部结构和抗原性，但不含病毒基因。

本发明所用术语“疫苗”、“疫苗组合物”指含有口蹄疫病毒样颗粒抗原的药物组合物，该药物组合物可诱发、刺激或增强猪只针对口蹄疫的免疫反应。

术语“免疫量”应当理解为“免疫有效量”，又称免疫保护量或产生免疫应答的有效量，为可在接受者体内有效诱导免疫应答的抗原量，该量足以预防或改善疾病的体征或症状，包括不利的健康影响或其并发症。所述免疫应答可能足以用于诊断目的或其它试验，或可能适合用于预防疾病的征兆或症状，包括由病原体引起的感染所造成的不利的健康结果或其并发症。体液免疫力或由细胞介导的免疫力或此二者均可被诱导。动物对免疫原性组合物的免疫应答可通过例如测量抗体效价、淋巴细胞增殖分析而间接评估，或在以野生型毒株攻击后通过监测征兆或症状来直接评估，而该由疫苗提供的保护性免疫力可通过测量例如受试者的临床征兆如死亡率、发病率的减少、温度数值、受试者总体生理状况及总体健康和表现来评估。所述免疫应答可包括但不限于诱导细胞性和/或体液免疫力。

术语“药学上可接受的载体”是指在本发明疫苗组合物中除口蹄疫病毒抗原之外的其它所有成分，不刺激机体不阻碍使用化合物的生物学活性和特性的载体或者稀释剂，优选为佐剂。术语“佐剂”可包括铝胶佐剂；皂苷(saponin)，如Quil A、QS-21(CambridgeBiotech Incorporation, Cambridge MA)、GPI-0100(Galenica PharmaceuticalsIncorporation， Birmingham AL)；油包水乳剂；水包油乳剂；水包油包水乳剂；丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物；顺丁烯二酸酐和链烯基(alkenyl)衍生物的共聚物选出的化合物。术语“乳剂”可尤其基于轻液体石蜡油(European Pharmacopea类型)；因烯烃寡聚产生的类异戊二烯油(isoprenoid oil)，如角鲨烷(squalane)或角鲨烯油(squalene oil)，尤其异丁烯或葵烯；酸或醇的含线性烷基的酯，更尤其植物油、油酸乙酯、丙二醇二-(辛酸酯/葵酸酯)、甘油三-(辛酸酯/葵酸酯)或丙二醇二油酸酯；支链脂肪酸或醇的酯，尤其异硬脂酸酯。油与乳化剂组合使用以便形成乳剂。乳化剂优选非离子表面活性剂，尤其山梨聚糖的酯、二缩甘露醇 (mannide)的酯(如无水甘露醇油酸酯)、脂肪族二元醇(glycol)的酯、聚甘油(polyglycerol)的酯、丙二醇的酯以及油酸的酯、异硬脂酸的酯、蓖麻油酸的酯或羟基硬脂酸的酯，它们任选乙氧基化，还有聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物，尤其Pluronic产品，特别是L121。参见 Hunter等编写的《The theory and practical application of adjuvants》(Ed. by DES Stewart-Tull,John Wiley and Sons,New York,1995:51-94)和 Todd等编写的《Vaccine》(1997,15:564-570)。例如，可使用Powell M和Newman M编写的《Vaccinedesign,the Subunit and adiuvant approach》(Plenum Press,1995)第147页描述的SPT乳剂及第183页描述的MF59乳剂。术语“丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物”优选为交联的丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物，尤其是与糖(sugar)的聚链烯基醚或聚醇交联，这些化合物已知被称为卡波姆(Carbomer，商品名Carbopol) (Phameuropa,1996,8(2))。本领域技术人员还可参见美国专利 US2909462，其描述了这类丙烯酸聚合物，其与聚羟基化的化合物交联，所述化合物具有至少3个羟基，优选不超过8个，其中至少3个羟基的氢原子被具有至少2个碳原子的不饱和脂烃基(aliphatic radical)取代。优选的基团是那些含有2-4个碳原子的基团，例如乙烯基、烯丙基和其它烯属不饱和基团(ethylenically unsaturated group)。所述不饱和基团自身可包含其它取代基，如甲基。这些产品以卡波普的名义出售，(BFGoodrich,Ohio,USA)特别合适。它们与烯丙基蔗糖或与烯丙基季戊四醇(allylpentaerythritol)交联。这其中可提及卡波普974P、934P和971P，最优选使用卡波普971P。术语“顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物”也可考虑顺丁烯二酸酐与乙烯的共聚物EMA(Monsanto)，这些聚合物在水中溶解产生酸性溶液，经中和，优选中和至生理pH，以便产生佐剂溶液，能向其中掺入免疫原性、致免疫性或疫苗性组合物本身。术语“佐剂”还包括，但不限于，RIBI佐剂系统(Ribi Incorporation)、Block co-polymer(CytRx,Atlanta GA)、SAF-M(Chiron,Emeryville CA)、单磷酰脂质A(monophosphoryl lipid A)、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素(重组或其它)、霍乱毒素、IMS 1314、胞壁酰二肽、 Gel佐剂等。优选地，所述佐剂包括铝胶佐剂、皂苷、油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂、丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基(alkenyl)衍生物的共聚物、RIBI佐剂系统、Block co-polymer、SAF-M、单磷酰脂质A、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素、霍乱毒素、IMS 1314、胞壁酰二肽或Gel佐剂中的一种或几种。

术语“预防和/或治疗”在涉及口蹄疫病毒感染时是指抑制口蹄疫病毒的复制、抑制口蹄疫病毒的传播或防止口蹄疫病毒在其宿主体内定居，以及减轻口蹄疫病毒感染的疾病或病症的症状。若病毒荷载量减少、病症减轻和/或摄食量和/或生长增加，那么就可以认为所述治疗达到了治疗效果。

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

本发明实施例中所用到的化学试剂均为分析纯，购自国药集团。

为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。本发明所述的实验方法，若无特殊说明，均为常规方法；所述的生物材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。

材料及试剂：本发明中涉及基因合成的由苏州金唯智生物科技有限公司进行全序列合成，pET28a和pET32a质粒购于Novagen公司，50L 发酵罐购于上海保兴生物公司，其它试剂及药品均为分析纯。大肠杆菌 BL21(DE3)购自New England Biolabs。

实施例1：具有序列2的豆蔻酰化转移酶和序列1的口蹄疫病毒衣壳前体蛋白P1的可溶性共表达

1.1用做模板的口蹄疫基因片段和豆蔻酰化转移酶基因片段的制备

O型口蹄疫病毒衣壳前体蛋白P1基因全长和豆蔻酰化转移酶基因全长均由苏州金唯智生物科技有限公司进行全序列合成。所合成的基因片段全长分别为2211bp，1491bp。将人工合成的口蹄疫基因和豆蔻酰转移酶基因连接到载体中，以扩增这两个基因。

1.2口蹄疫病毒衣壳前体蛋白P1和豆蔻酰化转移酶的表达载体的构建

以1.1中重组有合成的O型口蹄疫病毒衣壳前体蛋白P1基因全长的载体用做PCR反应的模板。以O-P1F为正向引物，以O-P1R为反向引物，扩增获得口蹄疫衣壳前体蛋白P1基因，正向引物的5’端引入限制性内切酶NdeⅠ位点及保护性碱基，其中NdeⅠ位点序列为CATATG；反向引物的5’端引入限制性内切酶NotⅠ位点，两个终止密码子及保护性碱基，其中NotⅠ位点序列为GCGGCCGC。引物序列见表1。

以1.1中重组有合成的NMT基因全长的载体用做PCR反应的模板。以NMT F为正向引物，以NMT R为反向引物，扩增获得NMT基因，正向引物的5’端引入限制性内切酶BamHⅠ位点及保护性碱基，其中 BamHⅠ位点序列为GGATCC；反向引物的5’端引入限制性内切酶NotⅠ位点，两个终止密码子及保护性碱基，其中NotⅠ位点序列为 GCGGCCGC。引物序列见表1。在PCR仪按照表2条件进行PCR反应：

表1引物序列

表2 PCR扩增条件

扩增得到的P1DNA片段经NdeⅠ/NotⅠ酶切消化后得到的酶切片段，与经过相同酶切的pET28a载体连接，得到插入口蹄疫病毒衣壳前体蛋白P1基因的阳性克隆pET28a-P1。将连接好的质粒转化到以氯化钙法制备的DH5α感受态细胞中，涂在含有卡那霉素平板培养。等单克隆菌落清晰可见时，挑取单菌落至含有卡那霉素的LB培养基中，37℃，220 转/分钟，培养12小时，提取质粒pET28a-P1。扩增得到的NMT DNA 片段经BamHⅠ/NotⅠ酶切消化后得到的片段，与经过相同酶切的pET32a 载体连接，得到插入NMT基因的阳性克隆pET32a-NMT。将连接好的质粒转化到以氯化钙法制备的DH5α感受态细胞中，涂在含有氨苄青霉素平板培养。等单克隆菌落清晰可见时，挑取单菌落至含有氨苄青霉素的LB培养基中，37℃，220转/分钟，培养12小时，提取质粒 pET32a-NMT。

将上述pET28a-P1质粒转化到50μL的大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,涂布于含有卡那霉素的固体LB培养基，37℃静置培养12小时至单菌落清晰可辨，挑取单菌落至5mL含卡那霉素的液体LB培养基的试管中，37℃，220转/分钟，震荡培养12小时，然后按照1％的比例转接到50mL含卡那霉素的液体LB培养基中，37℃，220转/分钟，震荡培养OD₆₀₀＝0.5时，按照氯化钙法制备BL21(DE3)/pET28a-P1感受态细胞。

将pET32a-NMT质粒转化到50μL BL21(DE3)/pET28a-P1感受态细胞，涂布于含有卡那霉素和氨苄青霉素的固体LB培养基，37℃静置培养12小时至单菌落清晰可辨，挑取单菌落至5mL含卡那霉素和氨苄青霉素的液体LB培养基的试管中，37℃，220转/分钟，震荡培养12 小时，从中取1mL菌液于-80℃保存。

1.3口蹄疫病毒衣壳前体蛋白P1和豆蔻酰化转移酶的共表达

从-80℃中取出带有pET28a-P1质粒和pET32a-NMT质粒的大肠杆菌菌种，接种于卡那霉素和氨苄青霉素抗性的50mL LB培养基，37℃， 220转/分钟震荡培养12小时后，转接入1L LB液体培养基中，37℃培养，等OD₆₀₀达到0.6后，加入5μg/mL肉豆蔻酸，37℃继续培养2h后，加入0.1mM的IPTG，诱导蛋白共同表达，28℃过夜。

使用发酵罐为上海保兴生物公司50L发酵罐，配制30L培养基装入发酵罐，121℃灭菌30分钟。第二天将5L种子液接入发酵罐，培养菌液OD₆₀₀为10左右时，加入150mg肉豆蔻酸，继续培养2h后，将培养温度降至28℃，加入4g IPTG诱导培养12小时。OD₆₀₀为40左右放罐，离心收集菌体大约为2.0kg。

实施例2：豆蔻酰化修饰的口蹄疫病毒衣壳前体蛋白P1的亲和色谱层析纯化

重悬菌体，采用均质机以800bar压力破碎菌体4次。13500转，离心40分钟，留取上清，通过12％SDS-PAGE检测，此时上清中口蹄疫病毒衣壳前体蛋白P1占总蛋白量约为30％。上清采用硫酸铵分级沉淀法进行蛋白初步纯化，随后进行色谱纯化。通过12％SDS-PAGE检测，电泳结果见图1，目的蛋白占总蛋白量约为80％。

实施例3：豆蔻酰化口蹄疫病毒衣壳前体蛋白P1的3C酶切和病毒样颗粒的组装及分子筛色谱纯化

收集实施例2获得的豆蔻酰化修饰的口蹄疫病毒衣壳前体蛋白P1，在酶切缓冲液中(100mM HEPES pH7.5，500mM NaCl，1mM EDTA， 1mMβ巯基乙醇)，30℃酶切16小时。P1蛋白和3C蛋白酶的摩尔比例为1:2。酶切完成后，在20mM磷酸缓冲液pH8.0，150mM NaCl中透析组装形成口蹄疫病毒样颗粒。然后进行分子筛色谱纯化。

纯化产物通过12％SDS-PAGE检测，电泳结果见图2。由电泳结果可知，目的蛋白占总蛋白量约为90％。

实施例4：口蹄疫病毒样颗粒透射电镜的形态学观察及动态光散射检测

仪器为JEM-2100透射电子显微镜，通过磷钨酸负染后，电镜观察结果如图3，可见实施例3所得的样品均形成了类病毒样颗粒，直径约为25nm左右，并且形成的类病毒样颗粒饱满，呈现为空心形态。

口蹄疫病毒样颗粒动态光散射观察。仪器为Malvern公司生产的 Zetasizer ZSE型动态光散射仪。样品为实施例3所得的样品。测量结果见图4。结果显示Z-Average(d.nm)为26.39，PDI值为0.070，说明实施例3形成的口蹄疫病毒样颗粒大小均一，无聚集现象。

通过将上述口蹄疫病毒样颗粒置于4℃下放置4个月，再通过磷钨酸负染及电镜观察可见类病毒样颗粒依旧颗粒饱满，呈空心形态，无聚集现象。说明本发明方法制备的口蹄疫蛋白形成了稳定的病毒样颗粒，在4℃下可维持病毒粒子形态达4个月。

实施例5：口蹄疫病毒样颗粒疫苗组合物的制备

取实施例3制备的病毒样颗粒及实施例4放置4个月的病毒样颗粒缓缓加入到佐剂中，加的过程不断用转速为800rpm乳化机搅拌12min，混匀，4℃保存，即为口蹄疫病毒样颗粒疫苗组合物。疫苗1、疫苗2、疫苗3为实施例3制备的病毒样颗粒配制，疫苗4为实施例4放置4个月的病毒样颗粒配制，具体配比见表3。适用于本发明的佐剂可以为本领域技术人员公知的佐剂。在本实施例中，选用佐剂ISA 206(法国赛比克公司)。

表3口蹄疫病毒样颗粒疫苗组合物成分配比

	疫苗1	疫苗2	疫苗3	疫苗4
					口蹄疫抗原(μg/ml)	160	200	240	200
ISA 206佐剂(V/V％)	50％	50％	50％	50％

实施例6：口蹄疫病毒样颗粒疫苗免疫原性试验

1.免疫程序

选取O型口蹄疫病毒抗原、抗体均为阴性的体重40kg左右的健康易感架子猪25头，随机分为5组，每组5头。1-4组分别为本发明实施例5制备的疫苗1、疫苗2、疫苗3、疫苗4免疫组，第5组为空白对照组。免疫组免疫途径为颈部肌肉注射2ml，空白对照组注射等量的PBS。疫苗免疫前每头猪采血，免疫后第21日进行第2次免疫，两次免疫后分别于第7日、14日、21日采血。

2.抗体水平检测

对采集的血清使用口蹄疫O型抗体ELISA检测试剂盒进行抗体的检测。结果显示，疫苗免疫前所有猪只的抗体水平均为阴性，1次免疫后14天均能达到1:128以上，2次免疫后第7日均能达到1:720以上。 PBS对照组猪只抗体水平为阴性，无变化。具体结果见表4。

表4疫苗免疫猪只后口蹄疫ELISA抗体水平

表4数据证明了本发明提供的口蹄疫病毒样颗粒疫苗能够快速形成高水平的特异性抗体，对猪只起到良好的免疫保护作用；同时，即便 4℃放置4个月后病毒样颗粒抗原仍然保持了刚制备疫苗时的免疫效力，免疫原性良好。

实施例7口蹄疫病毒样颗粒疫苗组合物的免疫原性对比试验

选取O型口蹄疫病毒抗原、抗体均为阴性的体重40kg左右的健康易感架子猪15头，随机分为3组，每组5头。第6组为本发明实施例 5制备的疫苗2免疫组，第7组为商品化灭活苗(O/Mya98/XJ/2010株 +O/GX/09-7株)免疫组，第8组为空白对照组。免疫组免疫途径为颈部肌肉注射2ml，空白对照组免疫等量的PBS。疫苗免疫前每头猪采血，免疫后第21日采血并进行第2次免疫，2次免疫后分别于第7日、14 日、56日、84日、112日采血。

对采集的血清使用O型口蹄疫抗体ELISA检测试剂盒进行相关抗体的检测。结果显示，疫苗免疫前所有猪只的抗体均为阴性，1次免疫后第21日疫苗2免疫组能达到1:128以上，商品苗免疫组不能达到 1:128；2次免疫后第7日两组均能达到1:128，但疫苗2免疫组抗体水平远高于商品苗免疫组；2次免疫后第112日，疫苗2免疫组依然维持较高的抗体水平，而商品苗免疫组抗体水平接近1:128免疫保护临界值。对照组猪只抗体为阴性，无变化。具体结果见表5。

表5 O型口蹄疫ELISA抗体水平比较结果

表5数据表明本发明制备的病毒样颗粒疫苗组合物与商品化全病毒灭活苗相比，对O型口蹄疫不仅抗体产生快，抗体水平高，而且免疫持续期显著增长，能维持更长时间的免疫保护，该保护期能完整保护了从架子猪时期免疫维持直至大猪出栏的整个阶段。

以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是为脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

序列表

<110> 普莱柯生物工程股份有限公司

<120> 一种口蹄疫病毒样颗粒抗原的制备方法及其制备的口蹄疫病毒样颗粒抗原和应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2211

<212> DNA

<213> 口蹄疫病毒(foot and mouth disease virus)

<400> 1

ggtgctggtc agtcttctcc ggctaccggt tctcagaacc agtctggtaa caccggttct 60

atcatcaaca actactacat gcagcagtac cagaactcta tggacaccca gctgggtgac 120

aacgctatct ctggtggttc taacgaaggt tctaccgaca ccacctctac ccacaccacc 180

aacacccaga acaacgactg gttctctaaa ctggcttctt ctgctttctc tggtctgttc 240

ggtgctctgc tggctgacaa aaaaaccgaa gaaaccaccc tgctggaaga ccgtatcctg 300

accacccgta acggtcacac cacctctacc acccagtctt ctgttggtat cacccacggt 360

tacgctaccg ctgaagactt cgtttctggt ccgaacacct ctggtctgga aacccgtgtt 420

atccaggctg aacgtttctt caaaacccac ctgttcgact gggttacctc tgacccgttc 480

ggtcgttacc acctgctgga actgccgacc gaccacaaag gtgtttacgg ttctctgacc 540

gactcttacg cttacatgcg taacggttgg gacgttgaag ttaccgctgt tggtaaccag 600

ttcaacggtg gttgcctgct ggttgctatg gttccggaac tgtgctctat cgaacgtcgt 660

gaactgttcc agctgaccct gttcccgcac cagttcatca acccgcgtac caacatgacc 720

gctcacatca aagttccgtt cgttggtgtt aaccgttacg accagtacaa agttcacaaa 780

ccgtggaccc tggttgttat ggttgttgct ccgctgaccg ttaacaccga aggtgctccg 840

cagatcaaag tttacgctaa catcgctccg accaacgttc acgttgctgg tgaattcccg 900

tctaaagaag gtatcttccc ggttgcttgc tctgacggtt acggtggtct ggttaccacc 960

gacccgaaaa ccgctgaccc ggtttacggt aaagttttca acccgccgcg taacatgctg 1020

ccgggtcgtt tcaccaacct gctggacgtt gctgaagctt gcccgacctt cctgcacttc 1080

gacggtgacg ttccgtacgt taccaccaaa accgactctg accgtgttct ggctcagttc 1140

gacctgtctc tggctgctaa acacatgtct aacaccttcc tggctggtct ggctcagtac 1200

tacacccagt actctggtac catcaacctg cacttcatgt tcaccggtcc gaccgacgct 1260

aaagctcgtt acatgatcgc ttacgctccg ccgggtatgg aaccgccgaa aaccccggaa 1320

gctgctgctc actgcatcca cgctgaatgg gacaccggtc tgaactctaa attcaccttc 1380

tctatcccgt acctgtctgc tgctgactac gcttacaccg cttctggtgc tgctgaaacc 1440

accaacgttc agggttgggt ttgcctgttc cagatcaccc acggtaaagc tgaaggtgac 1500

gctctggttg ttctggcttc tgctggtaaa gacttcgaac tgcgtctgcc ggttgacgct 1560

cgtcagcaga ccacctctac cggtgaatct gctgacccgg ttaccgctac cgttgaaaac 1620

tacggtggtg aaacccaggt tcagcgtcgt caccacaccg acgtttcttt catcctggac 1680

cgtttcgtta aagttacccc gaaagactct atcaacgttc tggacctgat gcagaccccg 1740

ccgcacaccc tggttggtgc tctgctgcgt accgctacct actacttcgc tgacctggaa 1800

gttgctgtta aacacaaagg tgacctgacc tgggttccga acggtgctcc ggaagctgct 1860

ctggacaaca ccaccaaccc gaccgcttac cacaaagctc cgctgacccg tctggctctg 1920

ccgtacaccg ctccgcaccg tgttctggct accgtttaca acggtaactg caaatacgct 1980

ggtggttctc tgccgaacgt tcgtggtgac ctgcaggttc tggctcagaa agctgcttgg 2040

ccgctgccga cctctttcaa ctacggtgct atcaaagcta cccgtgttac cgaactgctg 2100

taccgtatga aacgtgctga aacctactgc ccgcgtccgc tgctggctgt tcacccgtct 2160

gctgctcgtc acaaacagaa aatcgttgct ccggttaaac agtctctgta a 2211

<210> 2

<211> 1491

<212> DNA

<213> 牛(bovine)

<400> 2

atggctgacg aatctgacac cgctgttaaa ccgccggctc cgccgctgcc gcagatgatg 60

gaaggtaacg gtaacggtca cgaacactgc tctgactgcg aaaacgaaga agacaactct 120

tacaaccgtg gtggtctgtc tccggctaac gacaccggtg ctaaaaaaaa aaaaaaaaaa 180

cagaaaaaaa aaaaagaaaa aggttctgaa accgactctg ctcaggacca gccggttaaa 240

atgaactctc tgccggctga acgtatccag gaaatccaga aagctatcga actgttctct 300

gttggtcagg gtccggctaa aaccatggaa gaagcttcta aacgttctta ccagttctgg 360

gacacccagc cggttccgaa actgggtgaa gttgttaaca cccacggtcc ggttgaaccg 420

gacaaagaca acatccgtca ggaaccgtac accctgccgc agggtttcac ctgggacgct 480

ctggacctgg gtgaccgtgg tgttctgaaa gaactgtaca ccctgctgaa cgaaaactac 540

gttgaagacg acgacaacat gttccgtttc gactactctc cggaattcct gctgtgggct 600

ctgcgtccgc cgggttggct gccgcagtgg cactgcggtg ttcgtgttgt ttcttctcgt 660

aaactgggtg gtttcatctc tgctatcccg gctaacatcc acatctacga caccgaaaaa 720

aaaatggttg aaatcaactt cctgtgcgtt cacaaaaaac tgcgttctaa acgtgttgct 780

ccggttctga tccgtgaaat cacccgtcgt gttcacctgg aaggtatctt ccaggctgtt 840

tacaccgctg gtgttgttct gccgaaaccg gttggtacct gccgttactg gcaccgttct 900

ctgaacccgc gtaaactgat cgaagttaaa ttctctcacc tgtctcgtaa catgaccatg 960

cagcgtacca tgaaactgta ccgtctgccg gaaaccccga aaaccgctgg tctgcgtccg 1020

atggaaaaaa aagacatccc ggttgttcac cagctgctgt ctcgttacct gaaacagttc 1080

cacctgaccc cggttatgtc tcaggaagaa gttgaacact ggttctaccc gcaggaaaac 1140

atcatcgaca ccttcgttgt tgaaaacgct aacggtgaag ttaccgactt cctgtctttc 1200

tacaccctgc cgtctaccat catgaaccac ccgacccaca aatctctgaa agctgcttac 1260

tctttctaca acgttcacac ccagaccccg ctgctggacc tgatgtctga cgctctggtt 1320

ctggctaaaa tgaaaggttt cgacgttttc aacgctctgg acctgatgga aaacaaaacc 1380

ttcctggaaa aactgaaatt cggtatcggt gacggtaacc tgcagtacaa cctgtacaac 1440

tggaaatgcc cgtctatggg tgctgaaaaa gttggtctgg ttctgcagta a 1491

Claims (10)

1.一种口蹄疫病毒样颗粒抗原的制备方法，其中，所述方法包括：

步骤(1)分别克隆、重组口蹄疫病毒衣壳前体蛋白P1全长基因和豆蔻酰化转移酶的基因到表达载体，获得口蹄疫病毒衣壳前体蛋白P1的重组表达质粒和豆蔻酰化转移酶的重组表达质粒；

步骤(2)将所述步骤(1)获得的所述口蹄疫病毒衣壳前体蛋白P1的重组表达质粒和所述豆蔻酰化转移酶的重组表达质粒转化到大肠杆菌，获得所述大肠杆菌的重组表达菌株；

步骤(3)将所述步骤(2)的所述大肠杆菌的重组表达菌株培养表达，诱导豆蔻酰化转移酶的表达，然后诱导可溶性P1蛋白的表达；

步骤(4)从所述步骤(3)的表达体系中分离所述大肠杆菌的重组表达菌株，破碎菌体后分离上清液并纯化其中的P1蛋白；

步骤(5)使用3C蛋白酶酶切豆蔻酰化修饰的口蹄疫病毒衣壳前体蛋白P1，得到VP0，VP3和VP1衣壳蛋白，其自我组装形成所述口蹄疫病毒样颗粒。

2.根据权利要求1所述的口蹄疫病毒样颗粒的制备方法，其中，所述步骤(1)中所述口蹄疫病毒衣壳前体蛋白P1基因为A型、Asia1型或O型的口蹄疫病毒衣壳前体蛋白P1基因，所述豆蔻酰化转移酶基因为牛源的豆蔻酰化转移酶基因。

3.根据权利要求1所述的口蹄疫病毒样颗粒的制备方法，其中，所述步骤(1)中所述口蹄疫病毒衣壳前体蛋白P1基因如SEQ ID.No.1或其简并序列所示，所述豆蔻酰化转移酶基因如SEQ ID.No.2或其简并序列所示，所述表达口蹄疫病毒衣壳前体蛋白P1的质粒为PET28a，所述表达豆蔻酰化转移酶的质粒为PET32a；

所述步骤(2)中所述大肠杆菌表达菌株为BL21(DE3)，所述口蹄疫病毒衣壳前体蛋白P1的重组表达质粒的转化和所述豆蔻酰化转移酶的重组表达质粒的转化为依次转化；

所述步骤(3)中添加肉豆蔻酸诱导豆蔻酰化转移酶的表达，在添加肉豆蔻酸2h后添加IPTG诱导可溶性P1蛋白的表达。

4.根据权利要求1～3任一项所述制备方法制备的所述口蹄疫病毒样颗粒抗原。

5.一种疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包含免疫量的权利要求4所述的口蹄疫病毒样颗粒抗原和药学上可以接受的载体。

6.根据权利要求5所述的疫苗组合物，其中，所述口蹄疫病毒样颗粒抗原含量为160-240μg/ml。

7.根据权利要求5所述的疫苗组合物，其中，所述口蹄疫病毒样颗粒抗原含量为200μg/ml。

8.根据权利要求5所述的疫苗组合物，其中，所述药学上可以接受的载体包括佐剂，所述佐剂选自：(1)铝胶佐剂、皂苷、阿夫立定、DDA；(2)油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂；或(3)丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物；以及RIBI佐剂系统、Block co-polymer、SAF-M、单磷酰脂质A、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素、霍乱毒素、IMS 1314、胞壁酰二肽、Gel佐剂中的一种或几种；优选地，皂苷为Quil A、QS-21、GPI-0100；优选地，所述佐剂为ISA 206佐剂。

9.根据权利要求8所述的疫苗组合物，其中，所述佐剂的浓度范围是从5％-60％V/V，优选从30％-60％，更优选50％V/V。

10.根据权利要求5～9任一项所述的疫苗组合物在制备预防和/治疗口蹄疫的药物中的应用。

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