CN113151171B - 猪肺泡巨噬细胞健康细胞系及构建方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了猪肺泡巨噬细胞健康细胞系及构建方法与应用，该猪肺泡巨噬细胞健康细胞系的保藏编号为：CGMCC No：21498。本发明的猪肺泡巨噬细胞健康细胞系采用特殊的细胞培养液结合自然驯化选择的方法筛选100％健康的猪肺泡巨噬细胞系，其可应用于病毒的细胞培养、用于活疫苗和灭活疫苗的研发和生产以及制备诱导极化后M1和M2巨噬细胞分泌的生物活性物质分别用于癌症治疗和消炎等。本发明首创培养出了猪肺泡巨噬细胞健康细胞系，本发明的构建方法没有采用慢病毒转化或质粒转染等任何致癌性物质，所构建的健康的猪肺泡巨噬细胞系保有原代猪肺泡巨噬细胞的特质。

Description

猪肺泡巨噬细胞健康细胞系及构建方法与应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及猪肺泡巨噬细胞健康细胞系及构建方法与应用。
背景技术
巨噬细胞是机体重要的免疫细胞之一。猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolarmacrophages,PAM)是机体抵抗病原感染的重要组成部分，不但具有吞噬和抗原提呈功能，而且还分泌大量的生物活性物质，可以提高免疫炎性反应，也能抑制炎症的发生。猪肺泡巨噬细胞也是许多病毒感染和攻击的靶目标，因此这些病毒和相应的疫苗病毒可以在猪肺泡巨噬细胞大量复制和繁殖，例如非洲猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合症病毒、猪流行性腹泻病毒、猪圆环病毒、猪流感病毒等等。
目前，国内外都已经利用慢病毒转化和SV40大T抗原质粒转染制备了永生化的肺泡巨噬细胞，即肺泡巨噬细胞细胞系，这些肺泡巨噬细胞细胞系已经用于实验室研究。专利号为CN110195080A的专利用稳定表达CD163受体蛋白的重组质粒和重组慢病毒构建了猪肺泡巨噬细胞系，该重组质粒是以慢病毒表达载体pLV-sfGFP[2A]Puro为基础构建的，并整合有CD163编码基因，并采用特殊的慢病毒系统将CD163基因整合到永生化的PAM细胞染色体上，使得永生化的PAM细胞系能够永久性地稳定表达CD163蛋白，而使细胞易受PRRSV感染。PRRSV在该细胞系(mPAM-CD163)上的毒价可以高达106.9TCID50/0.1mL，且能够稳定传代。专利号为CN110577934A的专利中将含有sgRNA的重组慢病毒转染猪肺泡巨噬细胞，经抗性筛选得到所述TLR4基因敲低的猪肺泡巨噬细胞系。与未敲低的细胞系相比，构建的敲低TLR4基因猪肺泡巨噬细胞系可以促进口蹄疫病毒复制，该敲低TLR4基因猪肺泡巨噬细胞系中口蹄疫病毒复制量是前者的2～3倍。
Weingartl等(2002)用pSV3neo质粒(质粒携带新霉素抗性和SV40大T抗原)转染猪肺泡巨噬细胞得到了猪肺泡巨噬细胞系。该猪肺泡巨噬细胞系支持以下病毒的复制：水泡性口炎病毒(VSV)、伪狂犬病病毒(PRV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪水泡病病毒(SVDV)、猪痘病毒、非洲猪瘟病毒(ASFV)、单纯疱疹病毒(HSV)、副流感病毒(parainfluenza virus)、牛腺病毒(BAV)、痘苗病毒(VV)和猪腺病毒(PAV)。在试验条件下，该细胞系不支持猪繁殖和呼吸综合征病毒的复制。荷兰英特维特国际股份有限公司用pSV3amp质粒制备了猪肺泡巨噬细胞系。
随着新的猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪流行性腹泻病毒突变株/变异株等新病毒的出现，用Marc145细胞系分离新出现的猪繁殖与呼吸综合征病毒突变株和用Vero细胞系分离新出现的猪流行性腹泻病毒变异株越来越困难。猪巨噬细胞健康细胞系是其最佳选择，但目前尚没有只靠实验室内自然驯化而不用任何慢病毒转化或任何质粒转染得到的猪巨噬细胞健康细胞系。
发明内容
因此，基于以上背景，本发明的目的之一是提供猪巨噬细胞健康细胞系，该猪巨噬细胞健康细胞系的保藏编号为：CGMCC No：21498。
本发明的目的之二，提供一种能够构建上述的猪巨噬细胞健康细胞系的方法。
为了保证所培养的猪肺泡巨噬细胞健康细胞系仍可以保持其原代细胞固有的各种特性，本发明未使用慢病毒转化或质粒转染细胞的方法，而是采取特殊的细胞培养液结合自然驯化选择的方法筛选出的100％健康的猪肺泡巨噬细胞系，然后进行克隆、鉴定、培养，最后选出两株生长速度明显快的细胞系。
本发明的猪巨噬细胞健康细胞系的构建方法的技术方案为：
其包括如下步骤：
S1：从健康仔猪肺泡灌洗液中获取猪肺泡巨噬细胞，将其置于培养箱中进行培养；
S2：在对第1代至第3代细胞培养时，所用的培养液由以下组分组成：12-15％(V/V)的牛血清、青霉素和链霉素，其余为DMEM培养基，所述青霉素、链霉素的浓度分别为100U/ml和0.1mg/ml；
S3：猪肺泡巨噬细胞从第4代至第19代，所采用的培养液由以下组分组成：12-15％(V/V)的牛血清、DMEM培养基，此步骤的培养液中未加任何青霉素和链霉素；
S4：猪肺泡巨噬细胞从第20代始，所采用的培养液由以下组分组成：12-15％(V/V)的牛血清、青霉素和链霉素，其余为DMEM培养基，所述青霉素、链霉素的浓度分别为100U/ml和0.1mg/ml；
S5：猪肺泡巨噬细胞到25代时，采用有限稀释法进行克隆筛选；
S6：将克隆的细胞株采用4％多聚甲醛室温固定细胞、0.1％Triton100-X室温透化和3％BSA封闭，用巨噬细胞特异性抗体MAC387和Alex Fluor 488标记山羊抗小鼠IgG(H+L)二抗以及DAPI染色，观察荧光出现情况鉴定猪肺泡巨噬细胞；
S7：将步骤S5克隆的细胞株鉴定为猪肺泡巨噬细胞的细胞株，使用20代以后的细胞培养液，并接上继续培养至60代时，选出两个培养稳定的细胞系，即为猪巨噬细胞健康细胞系。
进一步地，每三天细胞传代一次，传代时细胞消化使用0.25％的胰酶。
进一步地，培养箱的培养条件为：37℃、5％CO2。
进一步地，每3天采用DMEM洗涤一次，将未贴壁细胞离心后重新加入新的培养液继续进行培养。
进一步地，所述DMEM培养基为含有L-谷氨酰胺的DMEM培养基。
本发明的目的之三，提供了上述猪肺泡巨噬细胞健康细胞系在促进病毒复制中的应用，所述病毒的种类包括人和动物病毒，所述病毒包括但不限于非洲猪瘟野毒株和弱毒疫苗毒株、猪繁殖与呼吸综合征病毒及其变异株、猪流行性腹泻病毒及其变异株、猪圆环病毒2型、伪狂犬病病毒及其变异株、猪水泡病病毒、猪痘病毒、猪腺病毒、单纯疱疹病毒、副流感病毒、水泡性口炎病毒，所培养的病毒可用于活疫苗和灭活疫苗的研发和生产。
本发明未采用慢病毒转化或质粒转染细胞来构建猪肺泡巨噬细胞健康细胞系，所制备的猪肺泡巨噬细胞健康细胞系为100％健康的猪肺泡巨噬细胞系，其保持着像原代猪肺泡巨噬细胞一样的特性，特别是对各种病毒的感染敏感性。因此，采取本发明的猪肺泡巨噬细胞健康细胞系培养的病毒在用于活疫苗和灭活疫苗的研发和生产时，不会有生物安全隐患。
本发明的目的之四，提供了上述猪肺泡巨噬细胞健康细胞系在增加机体的免疫功能、癌症治疗的应用，将本发明的猪肺泡巨噬细胞健康细胞系用脂多糖(LPS)和γ干扰素(IFN-γ)诱导极化为经典活化巨噬细胞(M1型巨噬细胞)；M1型巨噬细胞大规模悬浮培养后，细胞培养液冻融三次后离心去除细胞碎片，上清液通过仪器收获抗癌因子的有效生物活性物质，用于癌症治疗和增强机体的免疫功能。
其中所述机体为人体和动物。
其中，M1型巨噬细胞分泌大量促炎因子，对病原体和肿瘤发挥宿主免疫清除功能，这个功能可以用于增强人类和动物免疫功能和治疗人类和动物癌症。
本发明的目的之五，提供了上述猪肺泡巨噬细胞健康细胞系在机体的炎症治疗的应用，其技术方案为将上述的猪肺泡巨噬细胞健康细胞系在IL4/IL13刺激下极化为替代性活化巨噬细胞(M2型巨噬细胞)。M2型巨噬细胞大规模悬浮培养后，细胞培养液冻融三次后离心去除细胞碎片，上清液通过仪器收获抗炎有效生物活性物质，用于炎症治疗。
其中，M2巨噬细胞具有抗炎、促进伤口愈合和纤维化、修复组织以及促进肿瘤生长和浸润的作用，这个功能可以用于人类和动物炎症治疗。
本发明的猪肺泡巨噬细胞健康细胞系可作为免疫增强剂(如疫苗的免疫佐剂)进行使用。
采用上述技术方案，具有的有益效果如下：
1、本发明首创培养出了猪肺泡巨噬细胞健康细胞系，本发明的构建方法没有采用慢病毒转化或质粒转染等任何致癌性物质，所构建的健康的猪肺泡巨噬细胞系保有原代猪肺泡巨噬细胞的特质。例如对猪病毒感染的敏感性，这将使越来越困难的用Marc145细胞系分离培养新出现的猪繁殖与呼吸综合征病毒突变株和用Vero细胞系分离培养新出现的猪流行性腹泻病毒变异株等新出现的病毒的研究变得更容易。
2、本发明的猪肺泡巨噬细胞健康细胞系上与猪相关的致病病毒(如猪流行性腹泻病毒)的复制量与在原代猪肺泡巨噬细胞相似，无明显差异。
3、本发明的猪肺泡巨噬细胞健康细胞系可将其诱导极化为能够分泌大量促炎因子，对病原体和肿瘤发挥宿主免疫清除功能的经典活化巨噬细胞(M1型巨噬细胞)，其可用于增强机体免疫功能及治疗癌症。
4、本发明的猪肺泡巨噬细胞健康细胞系可将其诱导极化为具有抗炎、促进伤口愈合和纤维化、修复组织以及促进肿瘤生长和浸润的作用的M2细胞，其可用于增强机体免疫功能及治疗癌症人类和动物的炎症治疗。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1A为本发明的实施例单抗Mac387染色的猪肺泡巨噬细胞；
图1B为本发明实施例DAPI染色的猪肺泡巨噬细胞；
图1C为本发明实施例合成的单抗Mac387染色和DAPI染色的猪肺泡巨噬细胞；
图2为本发明实施例用猪肺泡巨噬细胞健康细胞系培养的猪流行性腹泻病毒变异株S基因套式反转录PCR扩增结果：M.DL2000 Marker；
保藏信息：
保藏时间：2021年2月1日
保藏单位名称：中国科学院微生物研究所H129房间菌种保藏中心
保藏编号：CGMCC No：21498；
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
分类命名：猪肺泡巨噬细胞健康细胞系PAM19
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。下述实施例中所用未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例：本实例提供了不使用任何致瘤病毒感染或任何带有致瘤基因的重组质粒转染构建的猪肺泡巨噬细胞健康细胞系的方法及过程：
1、猪肺泡巨噬细胞健康细胞系的建立
扑杀健康仔猪，所述健康仔猪为无14种病原的8周龄SPF仔猪，购买于哈尔滨国生生物科技股份有限公司。这14种病原包括：猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪细小病毒、牛病毒性腹泻病毒、口蹄疫病毒、猪肺炎支原体、猪轮状病毒、猪伪狂犬病毒抗原抗体双阴性；非洲猪瘟病毒、乙型脑炎病毒、猪流感病毒抗原阴性。
从扑杀健康仔猪肺泡灌洗液中获取PAM细胞，用DMEM培养基洗涤三次，在4℃下200xg离心10分钟收集细胞，再次用DMEM培养基洗涤两次后，配制培养液，并将1×106个细胞/ml接种到T25细胞培养瓶，在37℃、5％CO2的培养箱中培养。每3天用DMEM培养基洗涤一次，使用胰酶消化细胞，将未贴壁细胞离心后重新加入新的细胞培养瓶中，换液继续培养。
第1代至第3代细胞的所采用的培养液由以下组分组成：
12-15％(V/V)的牛血清(北京政博伟业生物科技有限公司)、青霉素、链霉素、其余为含有L-谷氨酰胺的DMEM培养基(Gibco)，其中青霉素、链霉素的浓度分别为100U/ml和0.1mg/ml。传代时细胞消化使用0.25％的胰酶。
从第4代至第19代，培养液中不加任何青霉素和链霉素，其组成组分为12-15％(V/V)的牛血清、含有L-谷氨酰胺的DMEM培养基。
第20代以后，细胞培养液中青霉素和链霉素的浓度分别为100U/ml和0.1mg/ml，其余组分为12-15％(V/V)的牛血清、其余为含有L-谷氨酰胺的DMEM培养基。
第25代时，采用有限稀释法进行克隆筛选。
克隆的细胞株用巨噬细胞特异性抗体MAC387和Alex Fluor 488标记马抗鼠IgG(H+L)二抗以及DAPI染色，观察荧光出现情况鉴定猪肺泡巨噬细胞。
2、激光共聚焦检测
将本发明的PAM细胞接种共聚焦专用玻底培养皿(Cat.No.801001，φ20mm TC，NEST)，在37℃、5％CO2细胞培养箱培养。弃掉细胞培养液，用PBS洗涤3次，弃尽PBS，用4％多聚甲醛(Sigma)室温固定细胞30min。用PBS洗涤3次，弃尽PBS，加入0.1％triton 100-X室温透化10min。用PBS洗涤3次，弃尽PBS，加入3％BSA于37℃封闭1h。用PBS洗涤3次，弃尽PBS，加入1:200稀释好的小鼠单克隆抗体(MAC387抗体)(abcam)，于37℃孵育1h。用PBS在脱色摇床上洗涤5次，弃尽PBS，加入1:200稀释的山羊抗小鼠IgG H&L(Alexa488)二抗(abcam)，于37℃避光孵育1h。用PBS在脱色摇床上避光洗涤5次，弃尽PBS，加入1:10稀释的500ulDAPI染色液(北京索莱宝科技有限公司)，室温避光孵育10min。用PBS洗涤5次，弃尽PBS，加入适量的PBS。用ZEISS共聚焦扫描显微镜观察。
分析结果如图1A、图1B、图1C的共聚焦激光扫描显微镜显示，图1A为本发明的实施例单抗Mac387染色的猪肺泡巨噬细胞，图1B为本发明实施例DAPI染色的猪肺泡巨噬细胞，图1C为本发明实施例合成的单抗Mac387染色和DAPI染色的猪肺泡巨噬细胞。本实施例构建的健康PAM细胞系为能够稳定表达MAC387的细胞系，MAC387蛋白主要定位在细胞膜。
将克隆的细胞株鉴定为猪肺泡巨噬细胞，使用20代以后的细胞培养液，并继续培养至60代，选出两个培养稳定的细胞系PAM18和PAM19。
3、猪肺泡巨噬细胞健康细胞系培养的猪流行性腹泻病毒变异株的病毒效价测定
将本发明的猪肺泡巨噬细胞健康细胞系在含有12％牛血清的含有L-谷氨酰胺DMEM培养液(Gibco)中于37℃和5％CO2条件下培养(T25细胞培养瓶)。当细胞浓度达到90％时，接种天蓝生物工程(哈尔滨)有限公司提供的猪流行性腹泻病毒变异株(在ST细胞上TCID50为1×108/0.1mL)1ml，37℃孵育1.5h，然后换成2％牛血清的DMEM培养液(含L-glutamine；Gibco)中于37℃和5％CO2条件下培养4天，细胞培养物冻融三次后收获病毒。猪流行性腹泻病毒在PAM19细胞上连续传代7次。PAM19细胞感染PEDV变异株后，第2天开始出现细胞肿胀开始脱落，至第4天80-90％的细胞脱落。
为确定PEDV在PAM19细胞上的TCID50，用PEDV病毒液按10-1－10-11的10倍梯度稀释浓度，感染PAM19细胞，同时设未感染细胞作为正常细胞对照组。感染后每日观察并记录结果，连续观察6天。该试验进行三次独立重复。按照Reed-Muench两氏法计算PEDV对PAM19细胞的TCID50。
结果计算：
距离比例＝(高于50％病变率的百分数-50％)/(高于50％病变率的百分数-低于50％病变率的百分数)
lgTCID50＝距离比例×稀释对数之间的差+高于50％病变率后稀释度的对数
按上述公式计算TCID50的值为109.3，即PEDV感染PAM19对应的半数感染量可以达到109.3TCID50/0.1mL。
4、应用套式反转录PCR检测猪肺泡巨噬细胞S健康细胞系培养的猪流行性腹泻病毒变异株病毒
试验步骤为：S1.用猪肺泡巨噬细胞健康细胞系培养的猪流行性腹泻病毒变异株S基因套式反转录PCR产物；
S2.用猪睾丸细胞ST细胞系培养的猪流行性腹泻病毒变异株S基因套式反转录PCR产物(阳性对照)；C.猪肺泡巨噬细胞健康细胞系PAM19套式反转录PCR产物(阴性对照)。
具体操作为：用病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒(江苏康为世纪生物科技有限公司)提取猪肺泡巨噬细胞健康细胞系培养的猪流行性腹泻病毒变异株RNA、猪睾丸细胞ST细胞系培养的猪流行性腹泻病毒变异株RNA(阳性对照)和未接种病毒猪肺泡巨噬细胞健康细胞系的对照RNA(阴性对照)。用套式反转录PCR检测猪流行性腹泻病毒变异株S基因。外引物的扩增PCR产物为945bp，PCR引物序列如下：
PEDSW-F AAGTCAAGATTGCACCCACG
PEDSW-R GACGGTCAACCTGAACATCG
内引物的扩增PCR产物为485bp，PCR引物序列如下：
PEDSN-F CACGCCTGTTAGTGTTGATTGT
PEDSN-R GCACCATACCACCGATGAGA
用PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit(Takara)反转录合成cDNA:加Oligo dT引物1μL,10mmol/L dNTP mixture 1μL,模板RNA 5μL,RNase Free dH2O 3μL,65℃金属浴5min后立即冰浴冷却5min,离心去气泡,加入4μL 5×Prime Script IIBuffer、0.5μL RNA酶抑制剂40U/μl,1μL PrimeScript II RTase 200U/μl,4.5μL ddH2O,42℃金属浴反应1h。
取上述cDNA 3μL为模板,加入2×Premix Taq(LATaqTMVersion2.0 plus dye，Takara)12.5μL,PEDSW-F1μL,PEDSW-R 1μL，ddH2O 7.5μL,置PCR仪,95℃5min,95℃15s,55℃退火1min,72℃延伸1min,进行30个循环,最后延伸10min,反应结束。
取上述PCR产物3μL为模板,加入2×Premix Taq(LA TaqTMVersion 2.0plus dye，Takara)12.5μL,PEDSN-F 1μL,PEDSN-R 1μL，ddH2O 7.5μL,置PCR仪,95℃5min,95℃15s,57℃退火30s,72℃延伸30s,进行40个循环,最后延伸10min,反应结束。反应产物在10g/L的琼脂糖凝胶下电泳,紫外光下检测结果，观察到一条接近485bp的PCR产物。PCR产物测序结果证实，PCR产物为485bp的猪流行性腹泻病毒变异株S基因片段。
以上对本发明及其实施方式进行了描述，这种描述没有限制性，上述实施例中所示的也只是本发明的实施方式之一，实际的结构并不局限于此。总而言之如果本领域的普通技术人员受其启示，在不脱离本发明创造宗旨的情况下，不经创造性的设计出与该技术方案相似的结构方式及实施例，均应属于本发明的保护范围。

Claims (2)

1.猪肺泡巨噬细胞健康细胞系，其特征在于，
该猪肺泡巨噬细胞健康细胞系的保藏编号为：CGMCC No：21498。
2.权利要求 1 所述的猪肺泡巨噬细胞健康细胞系在促进病毒复制中的应用，其特征在于，所述病毒选自非洲猪瘟野毒株和弱毒疫苗毒株、猪繁殖与呼吸综合征病毒及其变异株、猪流行性腹泻病毒及其变异株、猪圆环病毒 2 型、伪狂犬病病毒及其变异株、猪水泡病病毒、猪痘病毒、猪腺病毒、单纯疱疹病毒、副流感病毒、水泡性口炎病毒，所培养的病毒可用于活疫苗和灭活疫苗的研发和生产。
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