CN113528453B - 一种永生化猪巨噬细胞株及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种永生化猪巨噬细胞株及其构建方法和应用，属于生物工程技术领域。本发明提供的永生化猪巨噬细胞株为将永生化基因SV40LT和hTERT通过慢病毒感染的方式共转染入原代猪骨髓源性巨噬细胞中获得，提供的永生化猪巨噬细胞株是一种适用于培养非洲猪瘟病毒且可以获得高病毒滴度的可靠、稳定且可连续传代的永生化猪巨噬细胞株，可以有效应用在猪抗非洲猪瘟病毒感染方面的免疫学研究以及非洲猪瘟病毒疫苗生产中。

Description

一种永生化猪巨噬细胞株及其构建方法和应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及一种永生化猪巨噬细胞株及其构建方法和应用，具体涉及一种适用于培养非洲猪瘟病毒的永生化猪巨噬细胞株及其构建方法和应用，尤其涉及一种适用于培养非洲猪瘟病毒且可以获得高病毒滴度的可靠、稳定且可连续传代的永生化猪巨噬细胞株及其构建方法和在猪抗非洲猪瘟病毒感染方面的免疫学研究以及非洲猪瘟病毒疫苗生产中的应用。

背景技术

非洲猪瘟病毒(African Swine Fever Virus，ASFV)是非洲病毒科中唯一的非洲病毒属，也是目前唯一的DNA虫媒病毒属。该病毒主要靠口或鼻腔直接接触感染，同时拥有多个循环传播方式，主要存在于血液、组织液、内脏、分泌物和排泄物中，具有感染率高，传播迅速，致死率高等特点，对全球养猪业造成了巨大经济损失。

在非洲猪瘟常态化防控中，疫苗是适用性较强且相对有效的预防方法，故而，安全、有效、质量稳定的非洲猪瘟病毒疫苗将使猪场遭受非洲猪瘟的概率大幅降低。目前，用于非洲猪瘟病毒体外培养和疫苗研究的细胞为猪原代巨噬细胞，其主要来源为从猪肺脏分离而得的猪肺泡巨噬细胞和从猪骨髓分离并诱导而来的猪骨髓源性巨噬细胞。然而，随着近年来猪病疫情的日趋复杂，分离的猪原代巨噬细胞存在外源病毒、细菌、真菌及支原体污染的风险，这些外源因子的污染可能对非洲猪瘟病毒的体外培养及其疫苗的安全性和效力均构成严重影响和威胁。此外，由于猪的个体差异，分离的猪原代巨噬细胞的数量和对非洲猪瘟病毒的敏感性也有很大差异，因此对非洲猪瘟病毒的体外培养以及疫苗研究和生产(例如造成疫苗质量不稳定)造成了较大的限制。

已知通过基因工程技术手段构建的永生化细胞可以避免分离的原代细胞存在外源病毒、细菌、真菌及支原体污染的风险，并且构建获得的永生化细胞由于是单克隆细胞且连续传代稳定，因此对利用其培养的病毒的敏感性一致，进而可以保证生产的疫苗的质量稳定。故而，构建一株适用于培养非洲猪瘟病毒的可靠、稳定且可连续传代的永生化猪巨噬细胞对于非洲猪瘟病毒的体外培养和疫苗生产具有重大的意义。虽然现有技术中已经存在永生化猪巨噬细胞，例如专利文献CN105793416A公开的永生化猪肺泡巨噬细胞(以下称文献1)，和Mingeun Sagong等人构建的永生化猪单核细胞/巨噬细胞(Mingeun Sagong等人，Human telomerase reverse transcriptase-immortalized porcine monomyeloid celllines for the production of porcine reproductive and respiratory syndromevirus，Journal of Virological Methods 179(2012)26-32，以下称文献2)，然而上述文献1和文献2构建的永生化猪巨噬细胞均是适用于猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的永生化细胞。由于PRRSV和ASFV是来源不同的两种病毒，虽然均可以在猪巨噬细胞中复制，但两者在基因组结构和感染机制上存在较大差别，例如ASFV的基因组是由长度为170～190kb的单分子线状双股DNA组成，而PRRSV的基因组为单股线性正链RNA，长度约为15kb；猪巨噬细胞的细胞表面糖蛋白CD163对于PRRSV感染细胞是必须的，而该糖蛋白CD163对于ASFV的感染可能是需要的，但不是必须的，提示其他巨噬细胞表面蛋白可能参与ASFV的感染过程。因此上述文献1和文献2公开的适用于培养PRRSV的永生化猪巨噬细胞并不适合用于培养ASFV，并且现有技术中还没有适用于体外培养ASFV的可靠、稳定且可连续传代的永生化猪巨噬细胞的报道。

发明内容

针对现有技术中存在的一个或多个问题，本发明一个方面提供一种永生化猪巨噬细胞株，命名为pBMDM-JY05，该永生化猪巨噬细胞株pBMDM-JY05于2021年5月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：C2021128。

本发明另一方面提供一种易感非洲猪瘟病毒的永生化猪巨噬细胞株，所述永生化猪巨噬细胞株同时表达SV40LT抗原和hTERT抗原，且所述易感是指使用该永生化猪巨噬细胞株体外培养非洲猪瘟病毒获得的病毒液中病毒滴度为10^5.0TCID₅₀/mL或更高。

上述易感是指使用该永生化猪巨噬细胞株体外培养非洲猪瘟病毒获得的病毒液中病毒滴度为10^6.5TCID₅₀/mL或更高。

本发明又一方面还提供上述的易感非洲猪瘟病毒的永生化猪巨噬细胞株的构建方法，其包括以下步骤：

S1：用GM-CSF因子刺激猪骨髓细胞，获得原代猪骨髓源性巨噬细胞；

S2：用分别携带SV40LT基因和hTERT基因的慢病毒共感染步骤S1获得的原代猪骨髓源性巨噬细胞，获得慢病毒感染的猪巨噬细胞；

S3：培养步骤S2获得的慢病毒感染的猪巨噬细胞7～10天，对增殖的细胞进行亚克隆和连续传代，获得一系列永生化细胞株；

S4：分别利用步骤S3获得的一系列永生化细胞株对非洲猪瘟病毒进行培养，并对培养获得的病毒液的滴度进行检测，以病毒滴度高的病毒液所对应的永生化细胞株作为易感非洲猪瘟病毒的永生化猪巨噬细胞株；其中所述病毒滴度高是指病毒滴度为10^5.0TCID₅₀/mL或更高，优选10^6.5TCID₅₀/mL或更高。

上述构建方法中，步骤S1中所述用GM-CSF因子刺激猪骨髓细胞的具体操作为：在37±0.5℃，5％CO₂条件下使用含有10～20％FBS、5～15ng/mL GM-CSF、50～150U/mL青霉素、0.05～0.15mg/mL链霉素、0.20～0.30μg/ml两性霉素B的RPMI1640培养基培养猪骨髓细胞，得到的分化好的猪骨髓源性巨噬细胞即为原代猪骨髓源性巨噬细胞。

上述构建方法中，步骤S2中所述SV40LT基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述hTERT基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，两种慢病毒的感染MOI分别均为10～100。

本发明再一方面还提供一种复制非洲猪瘟病毒的方法，所述方法包括以下步骤：

T1：培养上述的永生化猪巨噬细胞株，获得永生化猪巨噬细胞群；

T2：使步骤T1获得的永生化猪巨噬细胞群与非洲猪瘟病毒接触；和

T3：使所述非洲猪瘟病毒复制。

上述方法中，T1中所述培养的条件与使用原代猪骨髓源性巨噬细胞培养非洲猪瘟病毒的条件一致，具体可为：在37±0.5℃，5％CO₂条件下使用含有10～20％FBS、5～15ng/mL GM-CSF、50～150U/mL青霉素、0.05～0.15mg/mL链霉素、0.20～0.30μg/ml两性霉素B的RPMI1640培养基培养。

本发明再一方面还提供一种非洲猪瘟病毒疫苗，其由上述复制非洲猪瘟病毒的方法获得的非洲猪瘟病毒复制病毒液与疫苗佐剂混合制备得到。

上述非洲猪瘟病毒疫苗是活减毒形式或灭活形式。

基于以上技术方案提供的永生化猪巨噬细胞株是将永生化基因SV40LT和hTERT通过慢病毒感染的方式共转染入原代猪骨髓源性巨噬细胞中，并筛选获得的易感(由该永生化猪巨噬细胞株培养ASFV获得的病毒液中的病毒滴度为10^5.0TCID₅₀/mL或更高，甚至10^6.5TCID₅₀/mL或更高，更优选10^7.0TCID₅₀/mL或更高)ASFV的永生化细胞株，该永生化猪巨噬细胞株能够同时表达SV40LT和hTERT抗原，进而实现永生化，并且具有纯净、稳定连续传代的特点，能够避免现有技术中用于培养ASFV的分离的猪原代巨噬细胞中常存在外源病毒、细菌、真菌及支原体污染的风险，从而可以避免这些外源因子的污染对ASFV的体外培养及其疫苗的安全性和效力可能构成的严重影响和威胁。另一方面，由该永生化猪巨噬细胞株繁殖获得的单克隆永生化猪巨噬细胞群不仅仅对ASFV易感，而且还对ASFV的敏感性一致，从而可以保证生产的ASFV疫苗质量可靠且稳定，避免现有技术中由于猪的个体差异导致的ASFV疫苗质量差异问题。因此，本发明提供的永生化猪巨噬细胞株可以为ASFV的基础研究及高质量疫苗开发提供重要的生物素材，有利于非洲猪瘟病毒疫情的防控。

附图说明

图1为原代猪骨髓源性巨噬细胞(B)和永生化猪巨噬细胞pBMDM-JY05(A)的细胞形态照片；

图2为原代猪骨髓源性巨噬细胞(B)和永生化猪巨噬细胞pBMDM-JY05(A)的细胞表面CD14蛋白的流式检测火山图；

图3为原代猪骨髓源性巨噬细胞(B)和永生化猪巨噬细胞pBMDM-JY05(A)接毒后的荧光照片；

图4为原代猪骨髓源性巨噬细胞和永生化猪巨噬细胞pBMDM-JY05接毒后随时间的病毒液中病毒滴度变化曲线图。

具体实施方式

针对现有技术中还没有适用于体外培养ASFV且可以获得高病毒滴度的可靠、稳定且可连续传代的永生化猪巨噬细胞株，本发明旨在利用基因工程技术手段构建一种适用于ASFV的永生化猪巨噬细胞株及其构建方法，该永生化猪巨噬细胞株可以稳定连续传代，并且在体外培养ASFV时可以稳定获得高病毒滴度的非洲猪瘟病毒液，因此可以用于稳定生产非洲猪瘟病毒疫苗，并能够保证疫苗的质量。

虽然上述文献1和文献2已经公开了永生化猪巨噬细胞的构建方法，但两者的构建方法均是为了获得适用于培养PRRSV的永生化猪巨噬细胞，由于已知PRRSV和ASFV的感染机制不同(例如细胞表面糖蛋白CD163对于PRRSV感染细胞是必须的，而该糖蛋白CD163对于非洲猪瘟病毒的感染可能是需要的，但不是必须的，提示其他巨噬细胞表面蛋白可能参与ASFV的感染过程)，并且不同的构建方法可能会导致获得的永生化猪巨噬细胞表面糖蛋白的损失或变化(这些损失或变化的细胞表面糖蛋白中可能包含对于ASFV感染所必须的糖蛋白)，例如Lee等人用SV40 T抗原基因转染PAM(猪肺泡巨噬细胞)培养物后，虽然产生了永生化的猪单髓细胞，但该永生化细胞不能支持PRRSV感染和复制，且证实这种结果的原因是细胞表面缺失决定PRRSV易感性和感染水平所必须的细胞受体CD163(Lee,Y.J.等人，2010.Generation of a porcine alveolar macrophage cell line for the growth ofporcine reproductive and respiratory syndrome virus.J.Virol.Methods 163，410-415)，因此上述文献1和文献2公开的构建适用于培养PRRSV的永生化猪巨噬细胞的方法以及其他构建永生化细胞的现有技术均不能用于指导本发明构建适用于培养ASFV的永生化猪巨噬细胞株。

本发明人则基于对非洲猪瘟病毒的前期研究成果，利用两种分别携带有永生化基因(SV40LT和hTERT)的慢病毒共感染猪骨髓源性巨噬细胞，从而成功获得一系列稳定连续传代培养的永生化猪骨髓源性巨噬细胞株，再从这一系列永生化猪骨髓源性巨噬细胞株的亚克隆中筛选获得对ASFV易感的永生化细胞株作为永生化猪巨噬细胞株。该永生化猪巨噬细胞株可以用于在体外培养ASFV并稳定获得高病毒滴度的ASFV病毒液，对于猪抗ASFV感染方面的免疫学研究以及ASFV疫苗生产均具有重要的意义。

以下结合具体实施例，对本发明进一步阐述。应当理解的是，具体实施例仅用于进一步说明本发明，而不是用于限制本发明的内容。

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。具体步骤可参见：《分子克隆实验指南》(《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》Sambrook，J.，Russell，DavidW.，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold SpringHarbor)。

实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。

实施例中涉及的序列均用已有技术合成。

实施例1：永生化猪巨噬细胞株的构建

该实施例利用基因工程技术手段将两种永生化基因(SV40LT基因和hTERT基因)共转染入原代猪骨髓源性巨噬细胞中，得到永生化猪巨噬细胞株，具体包括以下步骤。

1.1、原代猪骨髓细胞的分离和培养

(1)取30～45日龄健康猪(购自草原立新绿色养殖园有限公司，内蒙古包头市)，处死后，取出两侧肋骨和8个腿骨，去除表皮和部分肌肉组织后用无菌袋封装，低温保存；

(2)将骨头于操作间剔除骨膜，在无菌操作台内用含有抗生素(青霉素100U/mL、链霉素0.1mg/mL、两性霉素B 0.25μg/ml)的PBS冲洗消毒骨头外表面，将肋骨截为3～4cm的小段，并将腿骨从中间断开，置于提前准备好的冰盒内保存备用；

(3)用20mL一次性无菌注射器吸取PBS溶液(青霉素100U/mL、链霉素0.1mg/mL、两性霉素B 0.25μg/ml、2％FSB(其为10mM氯化钙、45mM氯化锰、100mM氯化钾、10mM乙酸钾、10mM氯化六氨合钴、10％甘油的水溶液，pH值为6.2)，pH值为7.2～7.5)，从肋骨的两端切面和从腿骨的中间断面插孔并反复冲洗至发白，用50ml离心管收集冲洗后的含骨髓细胞的溶液；

(4)待骨髓全部冲洗完毕后，将含有骨髓细胞的溶液反复吹打10次以上，并用70μm细胞筛进行过滤，收集滤过液并于4℃，500g离心5min；

(5)小心弃去上清，按照红细胞裂解液使用说明书在细胞沉淀中加入适量红细胞裂解液(品牌：TBD，货号：NH4CL2009，规格：100ml/瓶)，吹打均匀后常温静置2min，加入10mLPBS进行终止，并于4℃，1400rpm，离心5min；

(6)弃上清，将离心后的细胞沉淀用含抗凝剂、抗生素(青霉素100U/mL、链霉素0.1mg/mL、两性霉素B 0.25μg/ml)和血清的PBS重悬，并再次于4℃，1400rpm，离心5min；

(7)重复步骤(6)一次，之后将细胞沉淀用RPMI1640培养基(15％FBS、10ng/mL GM-CSF、青霉素100U/mL、链霉素0.1mg/mL、两性霉素B 0.25μg/ml)重悬计数，将细胞调整至合适密度后放入5％CO₂和37±0.5℃细胞培养箱中培养，培养5天后，得到分化好的猪骨髓源性巨噬细胞，即为原代猪骨髓源性巨噬细胞。

1.2、慢病毒包装

该步骤采用常规慢病毒包装的方法将SV40LT基因(其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，启动子为CMV启动子)和hTERT基因(其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，启动子为CMV启动子)分别插入GLV2-CMV-MCS-PGK-puro慢病毒表达载体(由本发明人通过常规方法构建)中，分别得到表达SV40LT基因和hTERT基因的重组质粒，将这两种重组质粒分别与慢病毒原件PMD2G和PSPAX质粒混合，利用PEI转染到293T细胞中，于48小时和72小时后分别收集病毒上清，并合并上清液，即分别得到携带有SV40LT基因和hTERT基因的慢病毒，分别命名为SV40LT慢病毒和hTERT慢病毒。

1.3、慢病毒感染原代猪骨髓源性巨噬细胞及获得永生化猪巨噬细胞

(1)将步骤1.1获得的原代猪骨髓源性巨噬细胞按3～5×10⁵个/孔接种于96孔板，培养基为RPMI1640培养基(15％FBS、10ng/mL GS-CSF、青霉素100U/mL、链霉素0.1mg/mL、两性霉素B 0.25μg/ml)；

(2)向步骤(1)的96孔板的细胞孔中加入聚凝胺(polybrene)(购自Sigma)，其终浓度为4μg/mL，孵育30min；

(3)按MOI＝50分别加入步骤1.2获得的两种慢病毒(SV40LT慢病毒和hTERT慢病毒)，并于室温500g离心60min进行吸附，后于5％CO₂和37±0.5℃培养24小时；

(4)弃掉含慢病毒的培养基，加入新鲜RPMI1640培养基(15％FBS、10ng/mL GS-CSF、青霉素100U/mL、链霉素0.1mg/mL、两性霉素B 0.25μg/ml)继续培养3天；

(5)将培养3天后的猪巨噬细胞以RPMI1640培养基(15％FBS、10ng/mL GS-CSF、青霉素100U/mL、链霉素0.1mg/mL、两性霉素B 0.25μg/ml)重悬，按照0.5～1×10⁵细胞/孔，接入6孔板，标记为第0天；

(6)将步骤(5)的6孔板置于37±0.5℃，5％CO₂培养箱中培养，每天观察细胞状态，当细胞液变黄时，进行半量换液；

(7)培养7～10天后，将细胞进行传代，传代的细胞初始密度为0.5×10⁶个/mL，培养得到永生化猪巨噬细胞。

1.4、适用于培养ASFV且可以获得高病毒滴度的永生化猪巨噬细胞株的筛选

(1)取步骤1.3获得的部分永生化猪巨噬细胞的细胞培养物，用RPMI1640培养基(15％FBS、10ng/mL GS-CSF、青霉素100U/mL、链霉素0.1mg/mL、两性霉素B 0.25μg/ml)将细胞稀释至每毫升0.5～1×10⁵个细胞的浓度，再利用96孔细胞板对细胞进行有限稀释；

(2)将步骤(1)的96孔细胞板于37℃，5％CO₂下静置培养3h，在倒置相差显微镜下观察并记录下只含有1～2个细胞的孔；

(3)将步骤(2)中所记录的孔每5d进行半量换液，待细胞增殖长满小孔底部后，将细胞消化吸出，转入24孔细胞培养板中增殖；

(4)待步骤(3)的24孔细胞培养板底部长满单层后再转入6孔细胞培养板；

(5)待步骤(4)的6孔细胞培养板长满后再转入25cm²的细胞培养瓶中进行传代培养；

(6)逐步扩大培养，筛选细胞形态良好、倍增时间稳定的单克隆细胞株，得到永生化猪巨噬细胞株8株，分别命名为pBMDM-1至pBMDM-8(如下表1所示)，即为可靠、稳定且可连续传代的永生化猪巨噬细胞株，经免疫荧光检测证明这些细胞株都是SV40LT阳性和hTERT阳性的细胞株。

实施例2：适用于培养ASFV且可以获得高病毒滴度的永生化猪巨噬细胞株的筛选

该实施例在实施例1获得的8株永生化猪巨噬细胞株(pBMDM-1至pBMDM-8)的基础上从中筛选出适用于培养ASFV且可以获得高病毒滴度的永生化猪巨噬细胞株，具体包括以下步骤。

2.1、构建非洲猪瘟病毒缺失株

(1)该步骤中用于构建非洲猪瘟病毒缺失株的基础毒株为由华南农业大学兽医学院禽病教研室野外分离的广东毒株，经测序鉴定为非洲猪瘟病毒，命名为ASFV GZ2018，该毒株的基因组数据的GenBank登录号为MT496893。该ASFV GZ2018毒株通过高致病性病原微生物转运手续审批后运送至金宇保灵生物药品有限公司生物安全3级实验室保存。

(2)该步骤中使用的非洲猪瘟病毒缺失株为在非洲猪瘟病毒野生毒株ASFVGZ2018的基础上缺失Lectin(MT496893表示的基因组序列的第72837-73313位)、CD2v(MT496893表示的基因组序列的第73383-74465位)、MGF360(MT496893表示的基因组序列的第29384-32916位)的编码基因，并且携带GFP绿色荧光标记。其中基因缺失方法可以采用常规的构建病毒基因缺失株的方法，例如专利文献CN112063634A、CN111593028A或CN110551695A中公开的方法。将敲除非洲猪瘟病毒野生毒株ASFV GZ2018的Lectin、CD2v和MGF360的编码基因的重组毒株命名为GZ2018ΔLectin/CD2v/MGF360，该基因敲除过程由华南农业大学完成，获得的基因敲除毒株保存于金宇保灵生物药品有限公司生物安全3级实验室。

2.2、细胞培养：将实施例1获得的永生化猪巨噬细胞株pBMDM-1至pBMDM-8分别接种于6孔板，汇合度达到80％以上时，进行换液。

2.3、病毒接种：步骤2.2的6孔板中的细胞换液后18～24h，按MOI＝1向细胞孔中分别接种步骤2.1构建的非洲猪瘟重组病毒GZ2018ΔLectin/CD2v/MGF360。

2.4、收获病毒液：每天观察步骤2.3接种病毒后的细胞孔中荧光(GFP绿色荧光)及细胞病变情况，直至荧光不再增多并且孔中80～90％细胞病变明显甚至死亡脱落，收集病毒培养物反复冻融3～5次，8000rpm离心5min，去除细胞碎片，上清病毒液于-70℃保存备用。

2.5、病毒滴度测定：用敏感的原代猪骨髓源性巨噬细胞(实施例1中步骤1.1获得)以3×10⁶个/ml密度接种至96孔板，置于37±0.5℃，5％CO₂培养箱中培养过夜。将步骤2.4收获的病毒液分别进行10¹～10⁷梯度稀释后接种于96孔板(100μL/孔)，每天观察并记录病毒滴度变化。如下表1所示，示出了接毒后5天8株永生化猪巨噬细胞株接毒后所获得病毒液的病毒滴度测定结果。

根据下表1所示的结果，对分别利用8株永生化猪巨噬细胞株(pBMDM-1至pBMDM-8)所获得的病毒液的病毒滴度测定结果进行比较，可见相对于其他7株永生化猪巨噬细胞株，利用永生化猪巨噬细胞株pBMDM-5获得的病毒液的病毒滴度明显较高，接毒5天后即可达到10^7.33TCID₅₀/mL，因此选择该永生化猪巨噬细胞株pBMDM-5作为适用于培养ASFV且可以获得高病毒滴度的永生化猪巨噬细胞株(即对非洲猪瘟病毒高度敏感的细胞株)，将其命名为pBMDM-JY05，该细胞株已由申请人于2021年5月19日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：中国.武汉.武汉大学)，保藏编号为CCTCC NO：C2020128，分类命名为：猪骨髓源性巨噬细胞pBMDM-JY05。另外，利用由pBMDM-1、pBMDM-2、pBMDM-3、pBMDM-5、pBMDM-6和pBMDM-8繁殖获得的单克隆细胞群培养ASFV均可以获得病毒滴度不低于10^5.0TCID₅₀/mL(pBMDM-8可以达到10^6.67TCID₅₀/mL，pBMDM-5可以达到10^7.33TCID₅₀/mL)的病毒液，因此这些细胞株都可以称为对ASFV易感的永生化猪巨噬细胞株，其中优选pBMDM-5(对应pBMDM-JY05)是对ASFV最易感的永生化猪巨噬细胞株。

表1.8株永生化猪巨噬细胞株接毒后所获得病毒液的病毒滴度测定结果

实施例3：永生化猪巨噬细胞株pBMDM-JY05的细胞形态观察及细胞表面标记分析

该实施例对实施例2中筛选获得的适用于培养ASFV且可以获得高病毒滴度的永生化猪巨噬细胞株pBMDM-JY05进行细胞形态观察及细胞表面标记分析，具体包括以下步骤。

3.1、细胞形态观察

将实施例2获得的永生化猪巨噬细胞株pBMDM-JY05接种于T25细胞瓶，汇合度达到80％以上时，显微观察其细胞形态，结果如图1中A幅所示；同时将原代猪骨髓源性巨噬细胞(实施例1中步骤1.1获得)以5×10⁶个/ml密度接种至T25细胞瓶，10ml/瓶，置于37±0.5℃，5％CO₂培养箱中培养过夜，显微观察其细胞形态，结果如图1中B幅所示。

由图1中A幅和B幅可知，A幅为永生化猪巨噬细胞，细胞呈多边形，细胞体积较大，贴壁生长，细胞间边界明晰，生长致密，可平铺为单层；B幅为原代猪骨髓源性巨噬细胞，细胞呈球形，为半贴壁半悬浮状态，细胞间隙大，细胞体积较小，有细胞结团现象。由A幅和B幅结果对比可知，原代猪骨髓源性巨噬细胞经过永生化后，细胞的形态、大小和贴壁性等都有了较大改善，具有了贴壁细胞系的典型特征，有利于在培养皿中的传代培养。

3.2、细胞表面标记分析

猪CD14是猪骨髓源性单核-巨噬细胞特有的表面标记蛋白之一，该标记蛋白在GM-CSF诱导下在猪骨髓源性单核-巨噬细胞集群中高水平表达，该步骤用于检测猪CD14的表达及其表达水平，具体包括以下步骤：将永生化猪巨噬细胞株pBMDM-JY05接种于T25细胞瓶，汇合度达到80％以上时，消化后用PBS重悬，用猪CD14-FITC流式抗体(Mouse Anti PigCD14:FITC,品牌：Bio-Rad,货号：MCA1218F)标记细胞，用于CD14流式检测，结果如图2中A幅所示；同时将原代猪骨髓源性巨噬细胞(实施例1中步骤1.1获得)以5×10⁶个/ml密度接种至T25细胞瓶，10ml/瓶，置于37±0.5℃，5％CO₂培养箱中培养过夜，消化后用PBS重悬，用猪CD14-FITC流式抗体标记细胞，用于CD14流式检测，结果如图2中B幅所示。

根据图2中A幅和B幅所示的流式检测结果可知，永生化猪巨噬细胞株pBMDM-JY05和原代猪骨髓源性巨噬细胞中CD14⁺细胞比例占比一致，均为99％以上，证明实施例1中的永生化过程未造成该永生化猪巨噬细胞株pBMDM-JY05的细胞表面CD14标记发生显著变化。并且由以上实施例3的结果可知，获得的永生化猪巨噬细胞株对ASFV易感，当用于培养ASFV时可以获得具有高病毒滴度的病毒液，也表明猪巨噬细胞表面对于ASFV感染细胞所必须的糖蛋白未发生损失或改变。

实施例4：永生化猪巨噬细胞株pBMDM-JY05培养ASFV的生长特性

该实施例利用实施例2筛选获得的适用于培养ASFV且可以获得高病毒滴度的永生化猪巨噬细胞株pBMDM-JY05培养实施例2中步骤2.1构建的非洲猪瘟病毒基因缺失株GZ2018ΔLectin/CD2v/MGF360，以分析永生化猪巨噬细胞株pBMDM-JY05在培养ASFV时的生长特性，具体包括以下步骤。

(1)细胞培养：将永生化猪巨噬细胞株pBMDM-JY05接种于T25细胞瓶，共接种8瓶，汇合度达到80％以上时，进行换液，以备接毒，作为实验组；将原代猪骨髓源性巨噬细胞(实施例1中步骤1.1获得)以5×10⁶个/ml密度接种至T25细胞瓶，10ml/瓶，共接种8瓶，置于37±0.5℃，5％CO₂培养箱中培养过夜，以备接毒，作为对照组；

(2)病毒接种：按MOI＝1将实施例2获得的非洲猪瘟病毒基因缺失株GZ2018ΔLectin/CD2v/MGF360分别接种至步骤(1)的实验组和对照组的细胞中；

(3)病毒液收获：每天观察步骤(2)接毒后的实验组和对照组的荧光(GFP)及细胞病变情况，分别于接种后0～7天每天每种接毒细胞随机选1瓶，收集病毒培养物反复冻融3～5次，8000rpm离心5min，去除细胞碎片，上清病毒液于-70℃保存备用；如图3所示，示出了实验组和对照组细胞接毒后的荧光情况，其中A幅表示实验组细胞接毒后的荧光情况，B幅表示对照组细胞接毒后的荧光情况。Trans代表了在明场下的细胞状态，GFP代表了在激发光下细胞感染病毒的情况，对比A、B两幅图，表明永生化猪巨噬细胞株pBMDM-JY05可以感染非洲猪瘟病毒(A幅中有大量绿色荧光)，且敏感性与猪原代骨髓源性细胞大体相同(A幅中绿色荧光数量与B幅中绿色荧光数量大体相同)。

(4)病毒滴度测定：用敏感的原代猪骨髓源性巨噬细胞(实施例1中步骤1.1获得)以3×10⁶个/ml密度接种至96孔板，置于37±0.5℃，5％CO₂培养箱中培养过夜。将步骤(3)收获的实验组和对照组病毒液分别进行10¹～10⁷梯度稀释后接种于96孔板(100μL/孔)的细胞中，每天观察并记录病毒滴度变化；

(5)根据步骤(4)测定的病毒液的病毒滴度绘制生长曲线，结果如图4所示，可见本发明筛选获得的永生化猪巨噬细胞株pBMDM-JY05对GZ2018ΔLectin/CD2v/MGF360的敏感性与原代猪骨髓源性巨噬细胞相当，接毒后6天，可达到最高滴度Log TCID₅₀/mL＝7.50，而原代猪骨髓源性巨噬细胞接毒后5天，最高滴度为Log TCID₅₀/mL＝7.50。

综上所述，本发明筛选获得的永生化猪巨噬细胞株不仅仅具有永生化、可靠、且稳定连续传代的特点，还能够用于体外培养ASFV稳定获得高病毒滴度的病毒液，甚至与原代猪骨髓源性巨噬细胞(传统用于体外培养ASFV的细胞)培养ASFV获得的病毒液的病毒滴度相当。因此本发明提供的永生化猪巨噬细胞株不仅仅获取保存方便，还可以避免现有技术中分离的猪原代巨噬细胞存在外源病毒、细菌、真菌及支原体污染的风险，从而避免这些外源因子的污染可能对非洲猪瘟病毒的体外培养及其疫苗的安全性和效力构成的严重影响和威胁。另一方面，由本发明提供的永生化猪巨噬细胞株繁殖的细胞群为对非洲猪瘟病毒高度敏感的单克隆细胞群，因此由该细胞群培养ASFV获得的病毒液的病毒滴度稳定且滴度高，从而避免了分离的猪原代巨噬细胞的数量和敏感性差异对非洲猪瘟病毒疫苗质量的影响，更加有利于非洲猪瘟病毒疫苗的高质量生产。再一方面，本发明提供的永生化猪巨噬细胞株由于其连续传代稳定可靠、且对ASFV具有高敏感性的特点，因此该永生化猪巨噬细胞株还可以用于猪抗ASFV感染方面的免疫学研究。其中用于制备非洲猪瘟病毒疫苗的步骤主要包括利用本发明提供的永生化猪巨噬细胞株复制非洲猪瘟病毒得到非洲猪瘟病毒复制病毒液的步骤和将该非洲猪瘟病毒复制病毒液与疫苗佐剂混合制备疫苗的步骤，其中利用永生化猪巨噬细胞株复制非洲猪瘟病毒的步骤包括：(1)培养本发明提供的永生化猪巨噬细胞株，获得永生化猪巨噬细胞群，其中培养的条件为：在37±0.5℃，5％CO₂条件下使用含有10～20％FBS、5～15ng/mL GM-CSF、50～150U/mL青霉素、0.05～0.15mg/mL链霉素、0.20～0.30μg/ml两性霉素B的RPMI1640培养基培养；(2)使步骤(1)获得的永生化猪巨噬细胞群与非洲猪瘟病毒接触；和(3)使非洲猪瘟病毒复制得到非洲猪瘟病毒复制病毒液。利用本发明提供的永生化猪巨噬细胞株制备得到的非洲猪瘟病毒疫苗形式可以为活减毒形式或灭活形式。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明。尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 金宇保灵生物药品有限公司

<120> 一种永生化猪巨噬细胞株及其构建方法和应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2127

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggataaag ttttaaacag agaggaatct ttgcagctaa tggaccttct aggtcttgaa 60

aggagtgcct gggggaatat tcctctgatg agaaaggcat atttaaaaaa atgcaaggag 120

tttcatcctg ataaaggagg agatgaagaa aaaatgaaga aaatgaatac tctgtacaag 180

aaaatggaag atggagtaaa atatgctcat caacctgact ttggaggctt ctgggatgca 240

actgagattc caacctatgg aactgatgaa tgggagcagt ggtggaatgc ctttaatgag 300

gaaaacctgt tttgctcaga agaaatgcca tctagtgatg atgaggctac tgctgactct 360

caacattcta ctcctccaaa aaagaagaga aaggtagaag accccaagga ctttccttca 420

gaattgctaa gttttttgag tcatgctgtg tttagtaata gaactcttgc ttgctttgct 480

atttacacca caaaggaaaa agctgcactg ctatacaaga aaattatgga aaaatattct 540

gtaaccttta taagtaggca taacagttat aatcataaca tactgttttt tcttactcca 600

cacaggcata gagtgtctgc tattaataac tatgctcaaa aattgtgtac ctttagcttt 660

ttaatttgta aaggggttaa taaggaatat ttgatgtata gtgccttgac tagagatcca 720

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atgtgtttaa aatgtattaa aaaagaacag cccagccact ataagtacca tgaaaagcat 960

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tggtacagac ctgtggctga gtttgctcaa agtattcaga gcagaattgt ggagtggaaa 1800

gagagattgg acaaagagtt tagtttgtca gtgtatcaaa aaatgaagtt taatgtggct 1860

atgggaattg gagttttaga ttggctaaga aacagtgatg atgatgatga agacagccag 1920

gaaaatgctg ataaaaatga agatggtggg gagaagaaca tggaagactc agggcatgaa 1980

acaggcattg attcacagtc ccaaggctca tttcaggccc ctcagtcctc acagtctgtt 2040

catgatcata atcagccata ccacatttgt agaggtttta cttgctttaa aaaacctccc 2100

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<210> 2

<211> 3399

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgccgcgcg ctccccgctg ccgagccgtg cgctccctgc tgcgcagcca ctaccgcgag 60

gtgctgccgc tggccacgtt cgtgcggcgc ctggggcccc agggctggcg gctggtgcag 120

cgcggggacc cggcggcttt ccgcgcgctg gtggcccagt gcctggtgtg cgtgccctgg 180

gacgcacggc cgccccccgc cgccccctcc ttccgccagg tgtcctgcct gaaggagctg 240

gtggcccgag tgctgcagag gctgtgcgag cgcggcgcga agaacgtgct ggccttcggc 300

ttcgcgctgc tggacggggc ccgcgggggc ccccccgagg ccttcaccac cagcgtgcgc 360

agctacctgc ccaacacggt gaccgacgca ctgcggggga gcggggcgtg ggggctgctg 420

ctgcgccgcg tgggcgacga cgtgctggtt cacctgctgg cacgctgcgc gctctttgtg 480

ctggtggctc ccagctgcgc ctaccaggtg tgcgggccgc cgctgtacca gctcggcgct 540

gccactcagg cccggccccc gccacacgct agtggacccc gaaggcgtct gggatgcgaa 600

cgggcctgga accatagcgt cagggaggcc ggggtccccc tgggcctgcc agccccgggt 660

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ctgggcctgg acgatatcca cagggcctgg cgcaccttcg tgctgcgtgt gcgggcccag 2100

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gtgcgtcggt atgccgtggt ccagaaggcc gcccatgggc acgtccgcaa ggccttcaag 2280

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caggagacca gcccgctgag ggatgccgtc gtcatcgagc agagctcctc cctgaatgag 2400

gccagcagtg gcctcttcga cgtcttccta cgcttcatgt gccaccacgc cgtgcgcatc 2460

aggggcaagt cctacgtcca gtgccagggg atcccgcagg gctccatcct ctccacgctg 2520

ctctgcagcc tgtgctacgg cgacatggag aacaagctgt ttgcggggat tcggcgggac 2580

gggctgctcc tgcgtttggt ggatgatttc ttgttggtga cacctcacct cacccacgcg 2640

aaaaccttcc tcaggaccct ggtccgaggt gtccctgagt atggctgcgt ggtgaacttg 2700

cggaagacag tggtgaactt ccctgtagaa gacgaggccc tgggtggcac ggcttttgtt 2760

cagatgccgg cccacggcct attcccctgg tgcggcctgc tgctggatac ccggaccctg 2820

gaggtgcaga gcgactactc cagctatgcc cggacctcca tcagagccag tctcaccttc 2880

aaccgcggct tcaaggctgg gaggaacatg cgtcgcaaac tctttggggt cttgcggctg 2940

aagtgtcaca gcctgtttct ggatttgcag gtgaacagcc tccagacggt gtgcaccaac 3000

atctacaaga tcctcctgct gcaggcgtac aggtttcacg catgtgtgct gcagctccca 3060

tttcatcagc aagtttggaa gaaccccaca tttttcctgc gcgtcatctc tgacacggcc 3120

tccctctgct actccatcct gaaagccaag aacgcaggga tgtcgctggg ggccaagggc 3180

gccgccggcc ctctgccctc cgaggccgtg cagtggctgt gccaccaagc attcctgctc 3240

aagctgactc gacaccgtgt cacctacgtg ccactcctgg ggtcactcag gacagcccag 3300

acgcagctga gtcggaagct cccggggacg acgctgactg ccctggaggc cgcagccaac 3360

ccggcactgc cctcagactt caagaccatc ctggactga 3399

Claims (9)

1.一种永生化猪巨噬细胞株，命名为pBMDM-JY05，该永生化猪巨噬细胞株pBMDM-JY05于2021年5月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：C2021128。

2.权利要求1所述的永生化猪巨噬细胞株的构建方法，其包括以下步骤：

S1：用GM-CSF因子刺激猪骨髓细胞，获得原代猪骨髓源性巨噬细胞；

S2：用分别携带SV40LT基因和hTERT基因的慢病毒共感染步骤S1获得的原代猪骨髓源性巨噬细胞，获得慢病毒感染的猪巨噬细胞；

S3：培养步骤S2获得的慢病毒感染的猪巨噬细胞7～10天，对增殖的细胞进行亚克隆和连续传代，获得一系列永生化细胞株；

S4：分别利用步骤S3获得的一系列永生化细胞株对非洲猪瘟病毒进行培养，并对培养获得的病毒液的滴度进行检测，以病毒滴度高的病毒液所对应的永生化细胞株作为易感非洲猪瘟病毒的永生化猪巨噬细胞株；其中所述病毒滴度高是指病毒滴度为10^5.0 TCID₅₀/mL或更高。

3.根据权利要求2所述的构建方法，其中所述病毒滴度高是指病毒滴度为10^6.5 TCID₅₀/mL或更高。

4.根据权利要求2或3所述的构建方法，步骤S1中所述用GM-CSF因子刺激猪骨髓细胞的操作为：在37±0.5℃，5％CO₂条件下使用含有10～20% FBS、5～15 ng/mL GM-CSF、50～150U/mL青霉素、0.05～0.15 mg/mL链霉素、0.20～0.30 μg/ml两性霉素B的RPMI1640培养基培养猪骨髓细胞，得到的分化好的猪骨髓源性巨噬细胞即为原代猪骨髓源性巨噬细胞。

5.根据权利要求2或3所述的构建方法，步骤S2中所述SV40LT基因的核苷酸序列如SEQID NO：1所示，所述hTERT基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，两种慢病毒的感染MOI分别均为10～100。

6.复制非洲猪瘟病毒的方法，所述方法包括以下步骤：

T1：培养权利要求1所述的永生化猪巨噬细胞株，获得永生化猪巨噬细胞群；

T2：使步骤T1获得的永生化猪巨噬细胞群与非洲猪瘟病毒接触；和

T3：使所述非洲猪瘟病毒复制。

7.根据权利要求6所述的方法，T1中所述培养的条件与使用原代猪骨髓源性巨噬细胞培养非洲猪瘟病毒的条件一致，为：在37±0.5℃，5％CO₂条件下使用含有10～20% FBS、5～15 ng/mL GM-CSF、50～150 U/mL青霉素、0.05～0.15 mg/mL链霉素、0.20～0.30 μg/ml两性霉素B的RPMI1640培养基培养。

8.一种非洲猪瘟病毒疫苗，其由权利要求6或7所述的方法获得的非洲猪瘟病毒复制病毒液与疫苗佐剂混合制备得到；

其中所述非洲猪瘟病毒为敲除非洲猪瘟病毒野生毒株ASFV GZ2018的Lectin、CD2v和MGF360的编码基因的基因缺失毒株。

9.根据权利要求8所述的非洲猪瘟病毒疫苗，其中所述非洲猪瘟病毒疫苗是活减毒形式或灭活形式。

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