CN114574439A - 猪骨髓细胞的制备方法及猪骨松质粉碎装置 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种猪骨髓细胞的制备方法及猪骨松质粉碎装置，所述猪骨髓细胞的制备方法包括以下步骤：获得猪骨组织样品；在2～8℃的环境下，将所述猪骨组织样品中的骨松质粉碎，流入细胞洗涤液中，得到富含骨松质与细胞的混合液；将所述混合液过滤，获得细胞洗涤液；将所述细胞洗涤液离心、固液分离，获得PBM沉淀物；将所述PBM沉淀物重悬，加入红细胞裂解液，离心处理，获得不含红细胞的PBM沉淀物；将所述不含红细胞的PBM沉淀物离心洗涤，再进行细胞培养，获得猪骨髓细胞。本发明旨在提供一种制备方法，以制备出低污染、质量好，制备量高的猪骨髓细胞。

Description

猪骨髓细胞的制备方法及猪骨松质粉碎装置

技术领域

本发明涉及细胞制备技术领域，具体涉及一种猪骨髓细胞的制备方法及猪骨松质粉碎装置。

背景技术

骨髓(Bone Marrow)是机体内具有造血、免疫和防御机能，柔软且富有血液的组织。它存在于骨松质腔隙和长骨骨髓腔内，由多种类型的细胞和网状结缔组织构成，可分为红骨髓(Red Bone Marrow)和黄骨髓(Yellow Bone Marrow)。红骨髓是人体的造血器官，分布于骨髓腔内，哈佛氏管内也含有少量，它主要是由血窦和造血组织构成。初生时期，骨内充满的全部是红骨髓，具有活跃的造血功能。成年后，红骨髓主要存在于一些扁骨、不规则骨和长骨的骨骺内，以椎骨、胸骨和髂骨处最为丰富，造血功能也最为活跃。除造血功能之外，红骨髓还有防御、免疫和创伤修复等多种功能。幼龄动物的骨髓腔内全部为红骨髓，随着日龄增长，长骨内的红骨髓，逐渐被脂肪组织所代替，成为黄骨髓。正常成年动物的红骨髓与黄骨髓各占一半。黄骨髓主要由脂肪组织构成，即骨髓的基质细胞大量变为脂肪细胞，仅有少量幼稚细胞团，其造血功能微弱。

骨髓细胞为骨髓(主要为红骨髓)内各种细胞的总称。骨髓为主要造血器官，产生红细胞、粒细胞、单核细胞、淋巴细胞和血小板等，故骨髓细胞包括各种血细胞系的不同发育阶段的细胞，成分较复杂。如粒细胞系，约占40％～60％；淋巴细胞系约占20％，；红细胞系约占20％；单核细胞系约占4％，含原单核细胞、幼单核细胞和单核细胞；巨核细胞系约占4％，包括原巨核细胞、幼巨核细胞和巨核细胞，最后形成血小板；浆细胞系包括原浆细胞、幼浆细胞和浆细胞。除以上外，骨髓内还含有其它一些细胞，如网状细胞、内皮细胞(吞噬细胞)等。

骨髓的造血微环境由骨髓基质细胞、细胞外基质和各种生长因子共同组成，是造血干细胞维持最佳功能状态的“壁龛”(Niche)，造血干细胞在骨髓的造血微环境中宿居、增殖、分化，以维持造血组织的功能和血细胞数量的恒定。在适当条件下，造血干细胞具备向多个方向分化为各系细胞的潜能，且细胞的加工与分化依据环境的不同而不同，很多细胞在骨髓腔里只是进行初步加工和分化，进入组织或器官后会进一步加工和分化成功能完备的细胞而起作用。如：巨噬细胞(Macrophage)，由骨髓腔中的多能(向)造血干细胞在骨髓里分化成单核细胞(Monotyces)后随血液循环进入全身各自组织和器官，并进行进一步分化成巨噬细胞或树突状细胞，巨噬细胞还可进一步分化为经典型巨噬细胞(M1)及替代型巨噬细胞(M2)等，在脊椎动物体内参与非特异性防卫(先天性免疫)和特异性防卫(细胞免疫)，主要功能是以固定细胞或游离细胞的形式对细胞残片及病原体进行噬菌作用(即吞噬以及消化)，并激活淋巴球或其他免疫细胞，令其对病原体作出反应。是研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象。巨噬细胞属不繁殖细胞群，多用做原代培养，难以长期生存。猪骨髓细胞(Porcine Bone Marrow)的制备研究因非洲猪瘟(African Swine Fever，ASF)病大流行而有所增多，非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒(African Swine Fever Virus，ASFV)感染家猪和野猪引起的一种急性、烈性、高度接触性传染病，强毒株可在感染的5-14天使感染猪致死，死亡率接近100％，无有效疫苗，无特效药物。各阶段家猪、野猪和软蜱是非洲猪瘟病毒自然宿主，可在家猪和野猪之间直接传播，也可通过蜱虫叮咬传播，还可以通过污染了病毒的泔水、饲料及腌制火腿等猪肉产品跨国家和地区传播。发现疫情，必须进行扑杀。我国生猪养殖占世界50％以上。根据国外非洲猪瘟净化根除历史看，一旦发生非洲猪瘟疫情，要彻底根除，均需要花费漫长的时间，并付出重大的代价。非洲猪瘟病毒自发现100多年来，采用传统疫苗研制策略均未成功。目前，通过基因缺失致弱成为该疫苗研究重要的方向，但非洲猪瘟病毒只能通过极少数的原代细胞培养后配制成的疫苗才有效，其中，PBM分化成的巨噬细胞就是其中一种最重要的原代细胞。

骨髓细胞的常规制备方法采用冲洗法分离，适用于制备少量骨髓细胞，多用于实验室研究，但是常规制备方法主要存在制备量不稳定，制备量少，操作时间过长，污染难控等问题，一直无法制备大量的目的细胞用于放大生产研究。

发明内容

本发明的主要目的是提出一种猪骨髓细胞的制备方法及猪骨松质粉碎装置，旨在解决现有猪骨髓细胞污染率高、细胞制备量少、制备效率低的问题。

为实现上述目的，本发明提出的一种猪骨髓细胞的制备方法，包括以下步骤：

获得猪骨组织样品；

在2～8℃的环境下，将所述猪骨组织样品中的骨松质粉碎，流入细胞洗涤液中，得到富含骨松质与细胞的混合液；

将所述混合液过滤，获得细胞洗涤液；

将所述细胞洗涤液离心、固液分离，获得PBM沉淀物；

将所述PBM沉淀物重悬，加入红细胞裂解液，离心处理，获得不含红细胞的PBM沉淀物；

将所述不含红细胞的PBM沉淀物离心洗涤，进行细胞培养，获得猪骨髓细胞。

可选地，在2～8℃的环境下，将所述猪骨组织样品中的骨松质粉碎，流入细胞洗涤液中，得到富含骨松质与细胞的混合液的步骤包括：在2～8℃的环境下，将所述猪骨组织样品浸泡在所述洗涤液中，且距离液面不低于5mm，在所述洗涤液中，将所述猪骨组织样品中的骨松质粉碎，使其与所述洗涤液混合，得到富含骨松质和细胞的混合液。

可选地，所述洗涤液包括含80～150IU/ml肝素、100～200U/ml青霉素和0.1～0.2mg/ml链霉素的无菌磷酸盐缓冲液。

可选地，将所述富含骨松质和细胞的混合液过滤，获得细胞洗涤液的步骤包括：采用100目铜纱网配合纱布过滤所述混合液，获得第一细胞洗涤液和骨松质沉淀，取所述骨松质沉淀，再次加入2～8℃的洗涤液，搅拌均匀后再次过滤，获得第二细胞洗涤液，将所述第一细胞洗涤液和所述第二细胞洗涤液混合获得细胞洗涤液。

可选地，所述红细胞裂解液包括1.2～1.5mol/L NH₄Cl、90～110mmol/L KHCO₃和8～15mmol/L Na₄EDTA，所述红细胞裂解液的pH值为7.2～7.4。

可选地，将所述PBM沉淀物重悬，加入红细胞裂解液，离心处理，获得不含红细胞的PBM沉淀物的步骤中；

所述离心的转速为1000～1500rpm，所述离心的时间为8～12min。

可选地，将所述不含红细胞的PBM沉淀物离心洗涤，进行细胞培养，获得猪骨髓细胞的步骤中；

所述细胞培养的培养基配方包括78～89％RPMI 1640、10～20％FBS和1～2％双抗。

此外，本发明还提供了一种猪骨松质粉碎装置，用于粉碎猪骨组织样品中的骨松质，所述猪骨松质粉碎装置包括：

箱体，所述箱体内形成有第一腔和上端开口的第二腔，所述第一腔环绕所述第二腔设置，所述第一腔用于放置冷凝液，用于冷却所述第二腔，所述第二腔用于放置洗涤液；以及，

粉碎装置，活动设于所述箱体，所述粉碎装置包括固定器和雕刻机，所述固定器用于夹持所述猪骨组织样品，所述雕刻机用于取出并粉碎所述猪骨组织样品中的骨松质。

可选地，所述第一腔上开设有用以连通外界环境的第一通孔和第二通孔；

所述猪骨松质粉碎装置还包括：

冷凝液提供装置，设于所述箱体的上端，所述冷凝液供水装置上设有输水管，所述输水管与所述第一通孔连通；

回收装置，设于所述箱体的下端，所述回收装置上设有回收管，所述回收管与所述第二通孔连通；

第一温度计，设于所述冷凝液提供装置上，用于检测所述冷凝液的温度；以及，

第二温度计，设于所述第一腔内，用于检测所述洗涤液的温度。

可选地，所述输水管上设有第一调速阀，所述回收管上设有第二调速阀。

本发明的技术方案中，通过本制备方法制备的猪骨髓细胞，在获得猪骨组织样品时，无需剔除附着于猪骨组织样品以及骨组织两端的软骨或者结缔组织，减小对骨组织的伤害，同时对猪骨组织样品前期处理的步骤越少，对其造成的损伤越少，获得的猪骨髓细胞被污染的概率越低，且还能够获得更多目的猪骨髓细胞，提高制备效率；在取出骨松质时，在洗涤液中，粉碎富含猪骨髓细胞的骨松质，使其直接流入细胞洗涤液，获得含有猪骨髓细胞的骨松质，且操作过程省时，省力，高效；用红细胞裂解液裂解收集的细胞悬液，裂解效果更加好，培养后的细胞状态更加优，存活率更加高；采用本方法制备的猪骨髓细胞，操作方法简单，细胞污染率低，细胞制备量稳定，且细胞制备量高，操作时间短，制备效率高。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。

图1为本发明提出的一种猪骨髓细胞的制备方法的一实施例的流程示意图；

图2为本发明提出的一种猪骨松质粉碎装置的结构示意图；

图3为本发明提出的猪骨松质粉碎装置骨组织切割器切割示意图。

图4为图3切割完成后获得的猪骨组织样品示意图；

图5为图4中猪骨组织样品的另一视角的示意图；

图6为取出并粉碎骨松质示意图；

图7为猪骨组织样品骨松质粉碎后示意图；

图8为PBM裂解与非裂解培养结果示意图；

图9为本发明提出的红细胞裂解液与商品化红细胞裂解液的培养9天对比图；

图10为PBM沉淀培养3天在40x显微镜下的结果图；

图11为PBM沉淀培养7天在40x显微镜下的结果图；

图12为PBM沉淀培养14天在40x显微镜下的结果图；

图13为PBM培养3天、7天和14天在40x显微镜下的结果图。

标号说明：

本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。另外，全文中出现的“和/或”的含义，包括三个并列的方案，以“A和/或B”为例，包括A方案、或B方案、或A和B同时满足的方案。此外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

骨髓细胞的常规制备方法采用冲洗法分离，适用于制备少量骨髓细胞，多用于实验室研究，但是常规制备方法主要存在制备量不稳定，制备量少，操作时间过长，污染难控等问题，无法制备大量的目的细胞满足放大生产使用。

鉴于此，本发明提供一种猪骨髓细胞的制备方法，通过该制备方法制备出来的污染率低、细胞制备量多；结合图1所示的猪骨髓细胞的制备方法的一实施例的流程示意图，所述猪骨髓细胞的制备方法，包括以下步骤：

步骤S10、获得猪骨组织样品；

为了获得更多的猪骨髓细胞，降低污染率，在获得猪骨组织样品时，需要尽量避免猪骨组织样品不被污染，因此，在制备过程中，首先将实验猪进行麻醉，放置在已消毒的手术台上，再用消毒液对实验猪的表面进行清洗和消毒，前腔放血致死，随后倒置于解剖台，沿胸腔锁骨处打开胸腔和腹腔，切开锁骨，并沿主气管剖开喉头两侧表皮，分离出主气管；沿喉头边缘剪断主气管，将肺、气管、内脏与肠道等整体取出；沿颈部割断猪头，沿两侧剔除猪皮，直至尾部，获得猪骨架，用PBS缓冲液清洗骨架的外表面，然后将猪骨架浸泡于PBS缓冲液，转入可控环境，以猪骨组织连接处的软骨或结缔组织为切口，将整个猪骨架分解成单一骨块，无需剔除附着于骨组织上肌肉、软骨或结缔组织，将处理后的单一骨块浸泡于75～80％酒精中，浸泡消毒10～20min，取出放置在超净台上，让酒精挥发，从而获得猪骨组织样品。

需要说明的是，在本实施例中，在获得猪骨组织样品时，无需剔除附着于骨组织上肌肉、软骨或结缔组织，降低了对猪骨组织样品的损伤几率，与附着于肌肉、软骨或结缔组织一起，更好的保护骨组织免受酒精消毒时可能对细胞带来的伤害，从而能够保存大量的活性猪骨髓细胞；PBS缓冲液既平衡pH值，保留猪骨架上的活性物质在合适的pH环境下，又能够保持盐平衡，不会破坏细胞结构，如此一来，采用PBS缓冲液清洗浸泡猪骨架，既能够清洗掉组骨架上残留的杂质，还能够保存大量的活性猪骨髓细胞，降低对猪骨髓细胞的破坏。

步骤S20、在2～8℃的环境下，将所述猪骨组织样品中的骨松质粉碎，流入细胞洗涤液中，得到富含骨松质与细胞的混合液；

在进行步骤S20时，具体可以通过以下步骤进行操作：在2～8℃的环境下，将所述猪骨组织样品浸泡在所述洗涤液中，且距离液面不低于5mm，在洗涤液中，将猪骨组织样品中的骨松质粉碎，流入细胞洗涤液中，得到富含骨松质与细胞的混合液；

需要说明的是，油脂等杂质在低温的环境下更加容易析出，因此，在本实施例中，通过控制洗涤液的温度在2～8℃，使得猪骨组织样品中的油脂等杂质析出，漂浮在洗涤液的表面，同时低温环境更加利于油脂等杂质结块，使得油脂等杂质团聚，漂浮在洗涤液的上方，使其不再附着在猪骨组织样品的表面，减少对猪骨组织样品的污染。

此外，控制洗涤液的温度在2～8℃的另外一个目的是为了避免高温损坏猪骨髓细胞，在粉碎猪骨组织样品中的骨松质时，需要使用钻头不停的钻取猪骨组织样品中间部位的骨松质，钻头在钻取粉碎骨松质的同时，由于受到较大的摩擦力，会产生大量的热能，控制洗涤液处于低温，能够降低钻头的温度，避免钻头的温度过高，损坏骨松质中的猪骨髓细胞。

将猪骨组织样品浸泡在洗涤液中，同时控制其到液面的距离不低于5mm的目的是为了尽可能的获得更多的猪骨髓细胞；在取出猪骨组织样品中的骨松质时，需要使用钻头不停的钻取猪骨组织样品中间部位的骨松质，在钻取的过程中，骨松质会向周围散射，为了不浪费骨松质，将猪骨组织样品浸泡在洗涤液的液面下5mm，使得骨松质在散射的过程中受到洗涤液的阻力，抵消其受到的钻头的作用力，使其能够完全分散在洗涤液内，避免散射到洗涤液外部。

需要说明的是，在本实施例中，洗涤液包括含80～150IU/ml肝素、100～200U/ml青霉素和0.1～0.2mg/ml链霉素的无菌磷酸盐缓冲液，其中，肝素可有效缓解骨髓液中粉碎析出红细胞的凝固，减少细胞制备时的损失；磷酸盐缓冲液的pH值改变更小，渗透压更加稳定，能够更加好的保护骨松质中的猪骨髓细胞，避免猪骨髓细胞破裂，提高细胞的制备量。

步骤S30、将所述混合液过滤，获得细胞洗涤液；

在进行步骤S30时，具体可以通过以下步骤进行操作：采用100目铜纱网配合纱布过滤所述混合液，获得第一细胞洗涤液和骨松质沉淀，取所述骨松质沉淀，再次加入2～8℃的洗涤液，搅拌均匀后再次过滤，获得第二细胞洗涤液，将所述第一细胞洗涤液和所述第二细胞洗涤液混合获得细胞洗涤液。需要说明的是，在本实施例中，为了保证过滤效果最佳，采用100目铜纱网配合纱布进行过滤，采用纯100目铜纱网过滤，在过滤的过程中大量油脂、结缔组织和软骨等会堵塞网孔，导致过滤速度慢或是过滤不完全；采用纯纱布过滤，如果纱布层数太少(低于4层)，会导致少量骨松质会透过纱布，获得的细胞洗涤液中会含有大量的杂质；如果纱布层数太多(超过8层)，会导致细胞洗涤液损失大，细胞得率降低。

需要说明的是，在本申请中，将过滤分成两步进行，首先将混合液使用100目铜纱网配合纱布获得第一细胞洗涤液和骨松质沉淀，此时过滤出来的骨松质沉淀中还含有很多猪骨髓细胞，为了获得更多的猪骨髓细胞，对骨松质沉淀进行第二次过滤，加入2～8℃的洗涤液，搅拌均匀，然后再次使用100目铜纱网配合纱布过滤，获得第二细胞洗涤液，采用两次过滤的目的是为了将骨松质沉淀中的猪骨髓细胞洗涤的更完全，通过此步骤获得的细胞洗涤液中，猪骨髓细胞的回收率约可提升10％，从而增加细胞的储备量，提高制备效率。

步骤S40、将所述细胞洗涤液离心、固液分离，获得PBM沉淀物；

在本实施例中，离心的速度和离心的时间都会影响到细胞洗涤液中猪骨髓细胞的活性，因此，为了获得活性更好的猪骨髓细胞，在离心处理时，需要控制离心速度为1000～1500rpm，离心处理时间为8～12min。

步骤S50、将所述PBM沉淀物重悬，加入红细胞裂解液，离心处理，获得不含红细胞的PBM沉淀物；

在进行步骤50之前，首先需要配制红细胞裂解液，配制红细胞裂解液具体可以通过以下步骤操作：分别称取1.2～1.5mol/L NH₄Cl、90～110mmol/L KHCO₃和8～15mmol/LNa₄EDTA，将其混合溶解，用NaOH和HCl调节溶液的pH值至7.2～7.4，定容至1000ml，110～120℃的条件下，灭菌处理18～25min，获得高浓度红细胞裂解液，使用时用无菌超纯水进行稀释，获得红细胞裂解液，其中，高浓度红细胞裂解液与无菌超纯水的体积比为1:10。

相较于商品化裂解液，按照上述配方配制的红细胞裂解液效果更佳，该配方的红细胞裂解液使用比例仅为裂解样品体积的2倍，低于市场上多数红细胞裂解液的3倍用量；对于裂解时间方面，该配方裂解液混匀后直接离心即可，优于商品化裂解液需冷藏环境下作用5-10分钟后再离心，裂解时间更加短，且无需进行冷冻处理，操作更加简单；此外，该配方裂解液培养14天均不见结团，商品化裂解液培养7天左右就开始出现结团，9天后，细胞结团严重；因此，本发明提供的细胞裂解液质量更加，操作和使用更加简单，采用其处理PBM沉淀物制备出来的猪骨髓细胞质量更加好。

在进行步骤S50时，离心处理时，离心的转速为1000～1500rpm，离心的时间为8～12min。

步骤S60、将所述不含红细胞的PBM沉淀物离心洗涤，进行细胞培养，获得猪骨髓细胞。

在进行步骤S60时，具体可以通过以下步骤进行：对不含红细胞的PBM沉淀进行离心，在1000～1500rpm的转速作用下离心8～12min，收集沉淀物，再使用无菌磷酸盐缓冲液进行洗涤，获得猪骨髓细胞样品，再将猪骨髓细胞样品接种到培养基上进行培养，其中，培养箱条件为：温度35～37℃，二氧化碳的含量为4.5～5％；此外培养基的配方包括78～89％RPMI 1640、10～20％FBS和1～2％双抗；做为本实施例中的优先实施例，培养基的配方为89％RPMI 1640、10％FBS和1％双抗。

此外，本发明还提出了一种猪骨松质粉碎装置100，用于将猪骨组织样品中的骨松质粉碎，图2至图7为本发明提供的一种猪骨松质粉碎装置100的示意图；

请参阅图2，所述猪骨松质粉碎装置100包括箱体1和粉碎装置2；所述箱体1内形成有第一腔11和上端开口的第二腔12，所述第一腔11环绕所述第二腔12设置，所述第一腔11用于放置冷凝液，用于冷却所述第二腔12，所述第二腔12用于放置洗涤液；所述粉碎装置2，活动设于所述箱体1，所述粉碎装置2包括固定器21和雕刻机22，所述固定器21用于夹持所述猪骨组织样品，所述雕刻机22用于取出并粉碎所述猪骨组织样品中的骨松质。需要说明的是，在本实施例中，并不限定箱体1的具体设置方式，可以采用一体成型的方式，也可以根据现有情况，采用生活中常用的水盆进行改造，具体地，选择两个尺寸不一样的水盆，将两个尺寸不一样的水盆叠加在一起形成箱体1，尺寸较大的水盆放置在底部，内部形成第一腔11，用于放置冷凝液，尺寸较小的水盆放置在尺寸较大的水盆的上端，且漂浮在冷凝液上，使得冷凝液包裹环绕在尺寸较小的水盆的底壁和部分周侧壁，尺寸较小的水盆的内部形成第二腔12，第二腔12用于放置洗涤液，同时为了保证操作环境的整洁度，尺寸较大的水盆上设有隔断膜，用于将冷凝液与环境隔断，避免环境中的污染物落入冷凝液中，造成污染，从而保证冷凝液的干净度，使得冷凝液能够循环利用。需要说明是，为了确保冷却效果，在实际操作时，需要将尺寸较小的水盆放置在冷凝液中，且尺寸较小的水盆的盆地到冷凝液的液面的距离不低于5cm。

此外，请参阅图3至图5，粉碎装置2包括固定器21和雕刻机22，固定器21上形成有夹持端和操作端，夹持端用于夹持固定猪骨组织样品，操作端用于被操作人员持握，进一步地，夹持端设置为一种易于松紧和调整直径的夹具，夹具与骨组织的接触面大，夹持更加稳定，操作端设置为手柄，手柄的长度可以适当地延长，如此能够直接高压灭菌，减少污染，安全性好；雕刻机22包括箱体1、骨组织切割器、粉碎钻头和转速调节器，其中，箱体1内设有电源和电器元器件，箱体1的上端设有骨组织切割器，骨组织切割器用于将骨头切割成不同尺寸的样品块，操作人员可以根据具体地实际需求，切割不同尺寸的样品，合理预处理骨头有利于更高效粉碎骨松质，提高制备效率；此外骨组织切割器的上端还设有保护罩，在不使用骨组织切割器的时候，保护罩罩设在骨组织切割器的外端，避免其误伤操作人员，同时也能够保护骨组织切割器，避免骨组织切割器被污染损坏；进一步地，雕刻机22还包括分别设置在箱体1两端的动力传出接口和动力输出末端的粉碎钻头接口，粉碎钻头通过连接线束与动力传输末端是粉碎钻头接口固定牢固，粉碎钻头用于粉碎猪骨组织样品中的骨松质；其中，转速调节器用于调节粉碎钻头的转速，操作人员可以根据实际操作情况以及猪骨组织样品的大小情况选择不同转速，提高制备效率。

进一步地，所述箱体1上形成有连通所述第一腔11的第一通孔111、连通所述第一腔11的第二通孔112；所述猪骨松质粉碎装置100还包括冷凝液提供装置3、回收装置4、第一温度计5和第二温度计6；所述冷凝液提供装置3设于所述箱体1的上端，所述冷凝液供水装置上设有输水管31，所述输水管31与所述第一通孔111连接；所述回收装置4设于所述箱体1的下端，所述回收装置4上设有回收管41，所述回收管41与所述第二通孔112连接；所述第一温度计5设于所述冷凝液提供装置3上，用于检测所述冷凝液的温度；所述第二温度计6设于所述第二腔12内，用于检测所述洗涤液的温度。在本实施例中，通过连通器的原理来进行冷却和回收的；冷凝液提供装置3、箱体1和回收装置4；在实际冷却过程中冷凝液提供装置3向第一腔11内提供冷凝液，第一温度计5用于检测冷凝液提供装置3的温度，监控冷凝液提供装置3内的冷凝液温度不得高于2℃，当冷凝液提供装置3内的冷凝液温度高于2℃时，需要采用降温手段进行降温，例如可以通过冰块冰冻的方式进行降温，第二温度计6用于检测第二腔12内的冷凝液的温度，需要保证第二腔12内的冷凝液的温度不得高于5℃，同样地，如果第二腔12内的温度高于5℃，需要采用降温手段，对冷凝液提供装置3内的冷凝液进行降温。

进一步地，为了保证冷凝水的循环冷却效果，第一通孔111设置在箱体1的底壁，第二通孔112设置在箱体1的侧壁上；在实际使用时，先将第二通孔112封堵，打开第一通孔111，让冷凝液提供装置3内的冷凝水流入第一腔11内，当第一腔11内冷凝水的液面高于第二通孔112达到1cm时，打开第二通孔112，使得冷凝水能够从第二通孔112流出，形成循坏，从而提高冷却效率。

更近一步地，所述输水管31上设有第一调速阀7，所述回收管41上设有第二调速阀8，所述第一调速阀7用于打开或者截断输水管31；所述第二调速阀8用于打开或者截断回收管41。

请参阅图6至图7，猪骨松质粉碎装置100取出粉碎取出猪骨组织样品中的骨松质可以通过以下步骤获得：将猪骨组织样品夹持固定在固定器21的夹持端，操作人员持握操作端，然后将猪骨组织样品浸泡在洗涤液中，在浸泡过程中，需要保证猪骨组织样品距离洗涤液的液面不得低于5mm，打开雕刻机22开关，操作人员的另外一只手持握粉碎钻头，调节转速调节器，使得粉碎钻头转速不高于100rpm，驱使粉碎钻头进入猪骨组织样品中的骨松质内，从骨组织截面中央进入骨松质中，直至粉碎钻头进入到猪骨组织样品中为一半以上时，调节转速至500-800rpm，然后再以截面中央为轴心，向骨密质边扩散旋转粉碎，直至骨松质完全粉碎进入细胞洗涤液；随后将粉碎钻头松开，将骨组织调头，按相同方式，处理另一端未完全粉碎的骨松质。

需要说明的是，在粉碎骨松质的过程中，开始粉碎时，粉碎钻头的转速宜控制在约100rpm，进入角度应垂直于骨端截面的中央位置，开始缓慢接触骨组织进行粉碎骨松质，保持双手不动，粉碎钻头缓缓向前推进，待粉碎钻头外部约一半进入猪骨组织样品后，调节粉碎钻头速度至500-800rpm，双手配合起来，按一定方向，以猪骨组织样品中间为轴心，向骨密质方向旋转，粉碎钻头可控制在一定行程内来回(保证1/3粉碎钻头在骨髓腔内)，随时可减小旋转或来回幅度，随后，将猪骨组织样品和粉碎钻头同时露出液面，观察粉碎效果，以便调整粉碎方向和力度，达到尽可能多的粉碎骨松质；这样设置有利于安全、快速、高效粉碎骨松质，避免细胞洗涤液的飞溅，降低污染几率，保障骨松质内猪骨髓细胞制备量和活力。其中，刚开始以较低的旋转速度有利于控制粉碎钻头，提高安全性；垂直于骨端截面的中央位置开始缓慢接触骨组织，双手不动有利于粉碎钻头进入骨髓腔的较中间位置，有利于后续的制备操作，待粉碎钻头安全进入骨髓腔后，提高粉碎钻头的转速及双手的配合操作，有利于缩短制备时间，提高制备效率，制备的细胞活力较优，若转速过小或双手固定不定，不利于骨松质的快速粉碎，制备过程耗时长，制备的细胞活力下降；降低旋转或来回幅度，将骨组织和粉碎钻头同时露出液面，观察粉碎效果，以便调整粉碎方向和力度，达到尽可能多的粉碎骨松质，获得较好的目的细胞制备量；若一直盲目粉碎，易引入更多的骨密质，结缔组织等杂质，还不利于骨松质的更彻底的粉碎，从而减少猪骨髓细胞的收量。

进一步地，第一腔11内应盛装1500～2000ml的洗涤液，而一只15kg左右的仔猪骨组织正常情况下约可收集8000～10000ml细胞洗涤液。

以下结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步详细说明，应当理解，以下实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

(1)将实验猪进行麻醉，放置在已消毒的手术台上，再用消毒液对实验猪的表面进行清洗和消毒，前腔放血致死，随后倒置于解剖台，沿胸腔锁骨处打开胸腔和腹腔，切开锁骨，并沿主气管剖开喉头两侧表皮，分离出主气管；沿喉头边缘剪断主气管，将肺、气管、内脏与肠道等整体取出；沿颈部割断猪头，沿两侧剔除猪皮，直至尾部，获得猪骨架，用PBS缓冲液清洗骨架的外表面，然后将猪骨架浸泡于PBS缓冲液，转入可控环境，再以猪骨组织连接处的软骨或结缔组织为切口，将整个猪骨架分解成单一骨块，无需剔除附着于骨组织上肌肉、软骨或结缔组织，将处理后的单一骨块浸泡于75％酒精中，浸泡消毒20min，取出放置在超净台上，让酒精挥发，从而获得猪骨组织样品；

(2)将猪骨组织样品夹持固定在固定器的夹持端，操作人员持握操作端，然后将猪骨组织样品浸泡在洗涤液(洗涤液的温度为5℃)中，在浸泡过程中，需要保证猪骨组织样品距离洗涤液的液面为5mm，打开雕刻机开关，操作人员的另外一只手持握粉碎钻头，调节转速调节器，使得粉碎钻头转速以100rpm，驱使粉碎钻头进入猪骨组织样品中的骨松质内，从骨组织截面中央进入骨松质中，直至粉碎钻头进入到猪骨组织样品中为一半以上时，调节转速至500rpm，然后再以截面中央为轴心，向骨密质边扩散旋转粉碎，直至骨松质完全粉碎进入细胞洗涤液；随后将骨固定器松开，将骨组织调头，按相同方式，处理另一端未完全粉碎的骨松质，从而获得混合液。

(3)采用100目铜纱网配合纱布过滤所述混合液，获得第一细胞洗涤液和骨松质沉淀，将骨松质沉淀放置在消毒的容器中，向所述骨松质沉淀中加入5℃、1000ml的洗涤液，搅拌均匀后再次采用100目铜纱网配合纱布过滤，获得第二细胞洗涤液，将第一细胞洗涤液和第二细胞洗涤液分开按后述步骤进行PBM收集，洗涤，计数等操作。

(4)在离心转速为1000rpm的条件下离心处理细胞洗涤液10min，然后固液分离，获得PBM沉淀物；

(5)将所述PBM沉淀物重悬，按照PBM沉淀与红细胞裂解液体积比为1:2的比例加入红细胞裂解液，随后在离心转速为1000rpm的条件下离心处理10min，获得不含红细胞的PBM沉淀物；

(6)在离心转速为1000rpm的条件下，将所述不含红细胞的PBM沉淀物离心处理10min，洗涤三次，然后进行细胞培养，获得猪骨髓细胞。

实施例2

(1)将实验猪进行麻醉，放置在已消毒的手术台上，再用消毒液对实验猪的表面进行清洗和消毒，前腔放血致死，随后倒置于解剖台，沿胸腔锁骨处打开胸腔和腹腔，切开锁骨，并沿主气管剖开喉头两侧表皮，分离出主气管；沿喉头边缘剪断主气管，将肺、气管、内脏与肠道等整体取出；沿颈部割断猪头，沿两侧剔除猪皮，直至尾部，获得猪骨架，用PBS缓冲液清洗骨架的外表面，然后将猪骨架浸泡于PBS缓冲液，转入可控环境，再以猪骨组织连接处的软骨或结缔组织为切口，将整个猪骨架分解成单一骨块，无需剔除附着于骨组织上肌肉、软骨或结缔组织，将处理后的单一骨块浸泡于75％酒精中，浸泡消毒20min，取出放置在手术台上，让酒精挥发，从而获得猪骨组织样品；

(2)将猪骨组织样品夹持固定在固定器的夹持端，操作人员持握操作端，然后将猪骨组织样品浸泡在洗涤液(洗涤液的温度为5℃)中，在浸泡过程中，需要保证猪骨组织样品距离洗涤液的液面为5mm，打开雕刻机开关，操作人员的另外一只手持握粉碎钻头，调节转速调节器，使得粉碎钻头转速以100rpm，驱使粉碎钻头进入猪骨组织样品中的骨松质内，从骨组织截面中央进入骨松质中，直至粉碎钻头进入到猪骨组织样品中为一半以上时，然后再以截面中央为轴心，向骨密质边扩散旋转粉碎，直至骨松质完全粉碎进入细胞洗涤液；随后将骨固定器松开，将骨组织调头，按相同方式，处理另一端未完全粉碎的骨松质，从而获得混合液。

(3)采用100目铜纱网配合纱布过滤所述混合液，获得第一细胞洗涤液和骨松质沉淀，将骨松质沉淀放置在消毒的容器中，向所述骨松质沉淀中加入5℃、1000ml的洗涤液，搅拌均匀后再次采用100目铜纱网配合纱布过滤，获得第二细胞洗涤液，将第一细胞洗涤液和第二细胞洗涤液分开按后述步骤进行PBM收集，洗涤，计数等操作。

(4)在离心转速为1000rpm的条件下离心处理细胞洗涤液10min，然后固液分离，获得PBM沉淀物；

(5)将所述PBM沉淀物重悬，按照PBM沉淀与红细胞裂解液体积比为1:2的比例加入红细胞裂解液，随后在离心转速为1000rpm的条件下离心处理10min，获得不含红细胞的PBM沉淀物；

(6)在离心转速为1000rpm的条件下，将所述不含红细胞的PBM沉淀物离心处理10min，洗涤三次，然后进行细胞培养，获得猪骨髓细胞。

实施例3

(1)将实验猪进行麻醉，放置在已消毒的手术台上，再用消毒液对实验猪的表面进行清洗和消毒，前腔放血致死，随后倒置于解剖台，沿胸腔锁骨处打开胸腔和腹腔，切开锁骨，并沿主气管剖开喉头两侧表皮，分离出主气管；沿喉头边缘剪断主气管，将肺、气管、内脏与肠道等整体取出；沿颈部割断猪头，沿两侧剔除猪皮，直至尾部，获得猪骨架，用PBS缓冲液清洗骨架的外表面，然后将猪骨架浸泡于PBS缓冲液，转入可控环境，再以猪骨组织连接处的软骨或结缔组织为切口，将整个猪骨架分解成单一骨块，无需剔除附着于骨组织上肌肉、软骨或结缔组织，将处理后的单一骨块浸泡于75％酒精中，浸泡消毒20min，取出放置在手术台上，让酒精挥发，从而获得猪骨组织样品；

(2)将猪骨组织样品夹持固定在固定器的夹持端，操作人员持握操作端，然后将猪骨组织样品浸泡在洗涤液(洗涤液的温度为5℃)中，在浸泡过程中，需要保证猪骨组织样品距离洗涤液的液面为5mm，撤掉冷凝液提供装置、回收装置、第一温度计和第二温度计(即粉碎过程中无冷却处理)。打开雕刻机开关，操作人员的另外一只手持握粉碎钻头，调节转速调节器，使得粉碎钻头转速以100rpm，驱使粉碎钻头进入猪骨组织样品中的骨松质内，从骨组织截面中央进入骨松质中，直至粉碎钻头进入到猪骨组织样品中为一半以上时，调节转速至500rpm，然后再以截面中央为轴心，向骨密质边扩散旋转粉碎，直至骨松质完全粉碎进入细胞洗涤液；随后将骨固定器松开，将骨组织调头，按相同方式，处理另一端未完全粉碎的骨松质，从而获得混合液。

(3)采用100目铜纱网配合纱布过滤所述混合液，获得第一细胞洗涤液和骨松质沉淀，将骨松质沉淀放置在消毒的容器中，向所述骨松质沉淀中加入5℃、1000ml的洗涤液，搅拌均匀后再次采用100目铜纱网配合纱布过滤，获得第二细胞洗涤液，将第一细胞洗涤液和第二细胞洗涤液分开按后述步骤进行PBM收集，洗涤，计数等操作。

(4)在离心转速为1000rpm的条件下离心处理细胞洗涤液10min，然后固液分离，获得PBM沉淀物；

(5)将所述PBM沉淀物重悬，按照PBM沉淀与红细胞裂解液体积比为1:2的比例加入红细胞裂解液，随后在离心转速为1000rpm的条件下离心处理10min，获得不含红细胞的PBM沉淀物；

(6)在离心转速为1000rpm的条件下，将所述不含红细胞的PBM沉淀物离心处理10min，洗涤三次，然后进行细胞培养，获得猪骨髓细胞。

实施例4

(1)将实验猪进行麻醉，放置在已消毒的手术台上，再用消毒液对实验猪的表面进行清洗和消毒，前腔放血致死，随后倒置于解剖台，沿胸腔锁骨处打开胸腔和腹腔，切开锁骨，并沿主气管剖开喉头两侧表皮，分离出主气管；沿喉头边缘剪断主气管，将肺、气管、内脏与肠道等整体取出；沿颈部割断猪头，沿两侧剔除猪皮，直至尾部，获得猪骨架，用PBS缓冲液清洗骨架的外表面，然后将猪骨架浸泡于PBS缓冲液，转入可控环境，再以猪骨组织连接处的软骨或结缔组织为切口，将整个猪骨架分解成单一骨块，无需剔除附着于骨组织上肌肉、软骨或结缔组织，将处理后的单一骨块浸泡于75％酒精中，浸泡消毒20min，取出放置在手术台上，让酒精挥发，从而获得猪骨组织样品；

(2)将猪骨组织样品夹持固定在固定器的夹持端，操作人员持握操作端，然后将猪骨组织样品浸泡在洗涤液(洗涤液的温度为5℃)中，在浸泡过程中，需要保证猪骨组织样品距离洗涤液的液面为5mm，打开雕刻机开关，操作人员的另外一只手持握粉碎钻头，调节转速调节器，使得粉碎钻头转速以100rpm，驱使粉碎钻头进入猪骨组织样品中的骨松质内，从骨组织截面中央进入骨松质中，直至粉碎钻头进入到猪骨组织样品中为一半以上时，调节转速至500rpm，然后再以截面中央为轴心，向骨密质边扩散旋转粉碎，直至骨松质完全粉碎进入细胞洗涤液；随后将骨固定器松开，将骨组织调头，按相同方式，处理另一端未完全粉碎的骨松质，从而获得混合液。

(3)采用100目铜纱网过滤所述混合液，获得第一细胞洗涤液和骨松质沉淀，将骨松质沉淀放置在消毒的容器中，向所述骨松质沉淀中加入5℃、1000ml的洗涤液，搅拌均匀后再次采用100目铜纱网过滤，获得第二细胞洗涤液，将第一细胞洗涤液和第二细胞洗涤液分开按后述步骤进行PBM收集，洗涤，计数等操作。

(4)在离心转速为1000rpm的条件下离心处理细胞洗涤液10min，然后固液分离，获得PBM沉淀物；

(5)将所述PBM沉淀物重悬，按照PBM沉淀与红细胞裂解液体积比为1:2的比例加入红细胞裂解液，随后在离心转速为1000rpm的条件下离心处理10min，获得不含红细胞的PBM沉淀物；

(6)在离心转速为1000rpm的条件下，将所述不含红细胞的PBM沉淀物离心处理10min，洗涤三次，然后进行细胞培养，获得猪骨髓细胞。

实施例5

(1)将实验猪进行麻醉，放置在已消毒的手术台上，再用消毒液对实验猪的表面进行清洗和消毒，前腔放血致死，随后倒置于解剖台，沿胸腔锁骨处打开胸腔和腹腔，切开锁骨，并沿主气管剖开喉头两侧表皮，分离出主气管；沿喉头边缘剪断主气管，将肺、气管、内脏与肠道等整体取出；沿颈部割断猪头，沿两侧剔除猪皮，直至尾部，获得猪骨架，用PBS缓冲液清洗骨架的外表面，然后将猪骨架浸泡于PBS缓冲液，转入可控环境，再以猪骨组织连接处的软骨或结缔组织为切口，将整个猪骨架分解成单一骨块，无需剔除附着于骨组织上肌肉、软骨或结缔组织，将处理后的单一骨块浸泡于75％酒精中，浸泡消毒20min，取出放置在手术台上，让酒精挥发，从而获得猪骨组织样品；

(2)将猪骨组织样品夹持固定在固定器的夹持端，操作人员持握操作端，然后将猪骨组织样品浸泡在洗涤液(洗涤液的温度为5℃)中，在浸泡过程中，需要保证猪骨组织样品距离洗涤液的液面为5mm，打开雕刻机开关，操作人员的另外一只手持握粉碎钻头，调节转速调节器，使得粉碎钻头转速以100rpm，驱使粉碎钻头进入猪骨组织样品中的骨松质内，从骨组织截面中央进入骨松质中，直至粉碎钻头进入到猪骨组织样品中为一半以上时，调节转速至500rpm，然后再以截面中央为轴心，向骨密质边扩散旋转粉碎，直至骨松质完全粉碎进入细胞洗涤液；随后将骨固定器松开，将骨组织调头，按相同方式，处理另一端未完全粉碎的骨松质，从而获得混合液。

(3)采用100目铜纱网配合纱布过滤所述混合液，获得第一细胞洗涤液和骨松质沉淀，将骨松质沉淀放置在消毒的容器中，向所述骨松质沉淀中加入5℃、1000ml的洗涤液，搅拌均匀后再次采用100目铜纱网配合纱布过滤，获得第二细胞洗涤液，将第一细胞洗涤液和第二细胞洗涤液分开按后述步骤进行PBM收集，洗涤，计数等操作。

(4)在离心转速为1000rpm的条件下离心处理细胞洗涤液10min，然后固液分离，获得PBM沉淀物；

(5)将所述PBM沉淀物重悬，按照PBM沉淀与商品化红细胞裂解液体积比为1:3的比例加入商品化红细胞裂解液，随后在离心转速为1000rpm的条件下离心处理10min，获得不含红细胞的PBM沉淀物；

(6)在离心转速为1000rpm的条件下，将所述不含红细胞的PBM沉淀物离心处理10min，洗涤三次，然后进行细胞培养，获得猪骨髓细胞。

对比例1

采用现有技术常规的灌洗法分离获得猪骨髓细胞。

对比例2

采用实施例1中的步骤制备，除在进行步骤(2)时将粉碎钻头转速改为始终以转速为800rpm运转直至骨松质完全粉碎外，其他步骤均同实施例1。

对比例3

采用实施例1中的步骤制备，除在进行步骤(2)时改为无冷凝装置，细胞洗涤液未预冷，均在常温常态下制备外，其他步骤均同实施例1。

对比例4

采用实施例1中的步骤制备，除在进行步骤(3)时，改为过滤用2层纱布，无100目铜纱网外，其他步骤均同实施例1。

对比例5

采用实施例1中的步骤制备，除在进行步骤(5)时，改为按照PBM沉淀与红细胞裂解液体积比为1:1的比例加入红细胞裂解液外，其他步骤均同实施例1。

性能测试

分别对实施例1～5和对比例1～5中制备的猪骨髓细胞计数，统计PBM总量和存活率，测试结果如表1所示，图8至图13为猪骨髓细胞培养过程中在40x显微镜下的结果图。

表1测试结果

对比例1中，采用现有技术常用方法，PBM总量只有1.5×10¹⁰cells，细胞存活率只有82％；整个制备过程耗时长，超过12小时，制备的PBM活率低。用注射器灌洗时费力，操作繁琐，长时间操作时，增大细胞洗涤液的外流几率，减少PBM制备量，增加污染风险。

对比例2中，始终以800rpm的转速粉碎骨松质，存在安全性和可操控性下降，前期高转速易引起细胞洗涤液的飞溅，减少PBM制备量等缺点；

对比例3中，全程不控制低温环境时会存在大量油脂，影响红细胞裂解效果，降低制备细胞的纯度，局部温度过高，死细胞增多，减少PBM的制备量等缺点；

对比例4中，无100目铜纱网时存在较多的骨组织残渣，影响细胞后续培养，降低PBM的纯度等缺点；

对比例5中，按体积比1:1添加自制红细胞裂解液时存在红细胞裂解不完全，大量未裂解的红细胞会影响PBM的纯度和收率等缺点；

本发明实施例1-实施5中，PBM总量共计5.0～6.8×10¹⁰cells，细胞活率91-96％，制备耗时7.3～10.2h；细胞数量活率、总量、耗时、安全性和制备细胞的纯净性等等综合效果均优于对比例。

采用本发明实施例1统计了一批重约15kg健康仔猪制备猪骨髓细胞的相应数据，相应数据按体重进行过折算。并列举出一头12.5kg的健康仔猪制备猪骨髓细胞数据。

经多次研究表明，经过本发明的该标准操作程序制备一头重约15kg仔猪的PBM总量约可达5.0～7.0×10¹⁰个，制备的PBM活率基本在90％以上。实验室细胞制备过程可控制在8.0h左右，制备后的细胞培养时无污染。刚制备的PBM呈圆形，贴壁生长，37℃，5％CO₂培养箱静置培养约3天，大部分细胞已贴壁，绝大部分呈正圆形，极少量会出现生长，呈长梭形(图10)。培养约7天时，PBM均已贴壁，细胞状态佳，大部分生长，呈长梭形、煎鸡蛋型等，少部分正圆形(图11)。培养到约14天时，细胞状态下降，部分细胞脱落，漂浮于上层(图12)。

挑选一体重为12.9kg的健康仔猪，经麻醉，放血致死后取骨组织，冷藏运输回实验室，进行PBM制备。从骨组织支解，清洗消毒，骨松质粉碎，细胞洗涤液收集，经离心，计数到细胞培养，此次实验过程共计约耗时7.8h，制备PBM总量共计5.7×10¹⁰cells，细胞活率94％，请参阅图13，图13为接种后3天、7天和14天的培养效果。

以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (10)

1.一种猪骨髓细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

获得猪骨组织样品；

在2～8℃的环境下，将所述猪骨组织样品中的骨松质粉碎，流入细胞洗涤液中，得到富含骨松质与细胞的混合液；

将所述混合液过滤，获得细胞洗涤液；

将所述细胞洗涤液离心、固液分离，获得PBM沉淀物；

将所述PBM沉淀物重悬，加入红细胞裂解液，离心处理，获得不含红细胞的PBM沉淀物；

将所述不含红细胞的PBM沉淀物离心洗涤，进行细胞培养，获得猪骨髓细胞。

2.如权利要求1所述的猪骨髓细胞的制备方法，其特征在于，在2～8℃的环境下，将所述猪骨组织样品中的骨松质粉碎，流入细胞洗涤液中，得到富含骨松质与细胞的混合液的步骤包括：在2～8℃的环境下，将所述猪骨组织样品浸泡在所述洗涤液中，且距离液面不低于5mm，在所述洗涤液中，将所述猪骨组织样品中的骨松质粉碎，使其与所述洗涤液混合，得到富含骨松质和细胞的混合液。

3.如权利要求1所述的猪骨髓细胞的制备方法，其特征在于，所述洗涤液包括含80～150IU/ml肝素、100～200U/ml青霉素和0.1～0.2mg/ml链霉素的无菌磷酸盐缓冲液。

4.如权利要求1所述的猪骨髓细胞的制备方法，其特征在于，将所述富含骨松质和细胞的混合液过滤，获得细胞洗涤液的步骤包括：采用100目铜纱网配合纱布过滤所述混合液，获得第一细胞洗涤液和骨松质沉淀，取所述骨松质沉淀，再次加入2～8℃的洗涤液，搅拌均匀后再次过滤，获得第二细胞洗涤液，将所述第一细胞洗涤液和所述第二细胞洗涤液混合获得细胞洗涤液。

5.如权利要求1所述的猪骨髓细胞的制备方法，其特征在于，所述红细胞裂解液包括1.2～1.5mol/L NH₄Cl、90～110mmol/L KHCO₃和8～15mmol/LNa₄EDTA，所述红细胞裂解液的pH值为7.2～7.4。

6.如权利要求1所述的猪骨髓细胞的制备方法，其特征在于，将所述PBM沉淀物重悬，加入红细胞裂解液，离心处理，获得不含红细胞的PBM沉淀物的步骤中；

所述离心的转速为1000～1500rpm，所述离心的时间为8～12min。

7.如权利要求1所述的猪骨髓细胞的制备方法，其特征在于，将所述不含红细胞的PBM沉淀物离心洗涤，进行细胞培养，获得猪骨髓细胞的步骤中；

所述细胞培养的培养基配方包括78～89％RPMI 1640、10～20％FBS和1～2％双抗。

8.一种猪骨松质粉碎装置，用于粉碎猪骨组织样品中的骨松质，其特征在于，所述猪骨松质粉碎装置包括：

箱体，所述箱体内形成有第一腔和上端开口的第二腔，所述第一腔环绕所述第二腔设置，所述第一腔用于放置冷凝液，用于冷却所述第二腔，所述第二腔用于放置洗涤液；以及，

粉碎装置，活动设于所述箱体，所述粉碎装置包括固定器和雕刻机，所述固定器用于夹持所述猪骨组织样品，所述雕刻机用于取出并粉碎所述猪骨组织样品中的骨松质。

9.如权利要求8所述的猪骨松质粉碎装置，其特征在于，所述第一腔上开设有用以连通外界环境的第一通孔和第二通孔；

所述猪骨松质粉碎装置还包括：

冷凝液提供装置，设于所述箱体的上端，所述冷凝液供水装置上设有输水管，所述输水管与所述第一通孔连通；

回收装置，设于所述箱体的下端，所述回收装置上设有回收管，所述回收管与所述第二通孔连通；

第一温度计，设于所述冷凝液提供装置上，用于检测所述冷凝液的温度；以及，

第二温度计，设于所述第一腔内，用于检测所述洗涤液的温度。

10.如权利要求9所述的猪骨松质粉碎装置，其特征在于，所述输水管上设有第一调速阀，所述回收管上设有第二调速阀。

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