CN113273567B - 虾夷扇贝精子的低温保存液及保存和使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种虾夷扇贝精子的低温保存液及保存和使用方法，属于水产养殖领域，所述低温保存液的成分及质量百分比为氟苯尼考0.02g/L、复方磺胺甲恶唑0.02g/L、氯化钠26.72g/L、氯化钾0.72g/L、氯化钙1.15g/L和碳酸氢钠0.20g/L，溶剂为无菌海水。本发明还提供利用上述低温保存液保存虾夷扇贝精子的方法及使用方法，本发明能够对虾夷扇贝精子在4℃进行低温保存，在收集精子过程中不可离心，离心可造成扇贝精子活力降低，影响最终受精率。利用本发明方法保存液保存5天的精子进行授精，精卵比例为10000:1，受精率在85％以上。
Description
技术领域
本发明属于水产养殖领域，具体地涉及尤其是一种虾夷扇贝精子的低温保存液及保存和使用方法。
背景技术
虾夷扇贝(Patinopecten yessoensis)隶属于软体动物门(Mollusca)、瓣鳃纲(Lamellibr anchia)、珍珠贝目(Pteriodia)、扇贝科(Pectinidae)，是一种典型的冷水性贝类，自然分布于日本北海道和本州北部、朝鲜半岛以及俄罗斯远东海域，北向延伸至库页岛与鄂霍次克海。虾夷扇贝肉质鲜美、营养丰富、个体大、生长快，自1982年引进中国后，虾夷扇贝一直是我国北方最重要的海水养殖种类之一。目前，我国已成为世界扇贝养殖第一大国，北黄海虾夷扇贝增养殖面积已达到70余万公顷，年产量超过20万吨，产值达50亿元。
精子的保存技术对水产动物的增养殖、良种培育、资源保护以及生物学研究都有重要意义。在扇贝的种质保存和良种繁育工作中，由于需从不同地区引种或培育新种，不同地区的扇贝繁殖期不尽相同，长途运输又易导致扇贝死亡，因此需要对精液进行保存。通常，精子保存技术为低温保存和超低温冻存，低温保存原理是低温能够降低精子的代谢活动，从而将精子寿命延长；超低温冻存则是使精子处于-196℃条件下，其代谢与运动完全停止，生命以静止的状态得以长期保存。精子的低温保存相较于冷冻保存而言，具有操作简单、保存条件温和、易于运输和操作等优点，也能够防止速冻导致细胞内冰晶的形成导致超微结构受损。目前，国内有关于水海洋贝类精子保存的研究主要集中在超低温保存，1994年薛钦报道了超低温冷冻保存栉孔扇贝(Chlamys farreri)胚胎获得65.1％的存活率。李赞等超低温冷冻保存太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)精子，获得了70％的存活率。而扇贝精子的低温保存技术尚未见报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于提供一种虾夷扇贝精子的低温保存液及保存和使用方法，使用所述低温保存液及方法能够提高虾夷扇贝精子的存活时间，为虾夷扇贝种质资源进行开发和改良、遗传育种研究提供技术支持。
本发明采用如下技术方案来实现的：
一种虾夷扇贝精子的低温保存液，所述低温保存液的成分及质量百分比为氟苯尼考0.02g/L、复方磺胺甲恶唑0.02g/L、氯化钠26.72g/L、氯化钾0.72g/L、氯化钙1.15g/L和碳酸氢钠0.20g/L，溶剂为无菌海水。
本发明还提供利用上述低温保存液保存虾夷扇贝精子的方法，所述方法包括如下步骤：
1)挑选生殖期性腺饱满的虾夷扇贝，将性腺完整取出置于培养皿内；
2)使用刀片将性腺切碎，并加少量无菌海水并搅拌；
3)将性腺置于筛绢网过滤收集精浆，将精浆置于离心管中；
4)使用20μg/ml的低温保存液将虾夷扇贝精浆稀释到原来体积的10倍，在离心管上标记好日期，即可放入4℃冰箱中进行精子保存；
进一步，在收集虾夷扇贝精子时，全程注意器具清洁，严防细菌及原生动物混入精浆。
进一步，所述步骤3)收集虾夷扇贝精子后不能离心，离心会使扇贝精子活性迅速降低。
进一步，所述步骤4)精子保存过程中应避免震动，保存精子的离心管需保持密封。
本发明还提供上述方法保存的虾夷扇贝精子的使用方法，将低温保存液与精子混合物摇匀，并加入相同体积的精子激活剂，激活精子并使之与新鲜卵子结合完成受精，使用的低温保存液保存的虾夷扇贝精子在5天内使用；所述的精子激活剂的成分及质量百分比为0.7％NaCl、0.05％KCl、0.2％CaCl2、0.02％NaOH和1.5％葡萄糖，其余为无菌过滤海水。
进一步，低温保存液中的精子与卵子的数量比在10000：1精卵比下仍能够达到85.67％的受精率。
本发明与现有技术相比的有益效果：
本发明能够对虾夷扇贝精子在4℃进行低温保存，利用本发明方法保存液保存5天的精子进行授精，精卵比例为10000:1，受精率在85％以上。
具体实施方式
下面通过实施例来对本发明的保护范围做进一步解释，但本发明的保护范围不受实施例任何形式上的限制。
实施例1.虾夷扇贝精子的低温保存液的筛选
1.精子保存液制备和保存：
无菌海水准备，取天然海水经0.2μm微孔滤膜过滤后，保存于灭菌过的锥形瓶中备用。
低温保存液准备，称量低温保存液试剂置于无菌海水中，配置成20μg/ml的低温保存液，使用磁力搅拌器混合均匀后，经0.2μm微孔滤膜过滤，在低温冰箱中4℃保存。
表1精子保存条件
精子激活剂的成分及质量百分比为0.7％NaCl、0.05％KCl、0.2％CaCl2、0.02％NaOH和1.5％葡萄糖，溶剂为无菌过滤海水。
1.2.精子活力观察
取少量精液与天然海水均匀混合后，立即在显微镜下观察精子的状态，以精子摆动的频率、运动的速度以及方向等作为指标来评价精子的活力。精子活力与授精能力呈正相关，精子活力越高受精能力越强。精子活性采用++、+、±、-表示，定义++表示精子保存液所有精子或者大部分精子都可活动，精子具备受精能力；+表示部分精子可活动，精子受精能力不受影响；±表示部分精子可活动，精子受精能力显著下降；-表示精子失去活性。将激活后的精子与新鲜卵子混合受精，确定精卵比，每次统计100个卵子，重复3次，计算其受精率。受精率以发育至原肠胚的卵子数占全部统计数的百分比来表示。
结果显示，保存液A为过滤海水对照组，精子在1d时存活率大幅降低，而以B、C、D、E为保护液的实验组仍能够使大多数精子存活。经过7d的保存期过后，各组别的精子成活如表1所示：E1保存液效果最佳，B2次之，其余保存液内精子几乎全部死亡。
表2 100倍稀释4℃低温保存条件下的扇贝精子成活率
4.人工授精效果验证
4℃低温保存5天后，将E1保存液中的扇贝精子与保存液充分混合，并加入相同体积的精子激活剂激活精子，将其与虾夷扇贝成熟卵子结合，并以新鲜扇贝精子与虾夷扇贝成熟卵子结合作对照，记录在不同精卵比下的受精率，结果表3所示精卵数量比在10000：1条件下能够使将85.33％的卵子受精并发育至囊胚期。
表3不同条件保存下的扇贝精子受精率
通过上述精子低温保存方式与添加不同抗生素保存液的保存效果显示，显示E1保存条件具有较好的保存效果，足量保存精液的受精效果接近新鲜精子水平。
实施例2.虾夷扇贝精子收集方法
挑选生殖期性腺饱满的虾夷扇贝，将性腺完整取出置于无菌培养皿内，使用手术刀片将性腺切碎，加少量无菌海水并搅拌；将性腺置于500目筛绢网过滤去除杂质，收集精浆于离心管中。
虾夷扇贝精子收集后不可离心提纯，故收集精子过程中应注意菌操作。
虾夷扇贝精子在不同离心转速下的精子活性及离心效果如表4所示(离心时间为5min，未离心的新鲜精子活性为++)。结果表明，即使1000g低速离心仍使虾夷扇贝精子活性显著下降，且此转速下未能将精子充分聚集；2000g与3000g转速下则会使扇贝精子失活，故不能对收集到的精浆离心提纯。
表4不同离心转速下虾夷扇贝精子离心效果及精子活性
实施例3
(1)无菌海水准备：取经沉淀过滤的天然海水，通过0.2μm微孔滤膜进行细菌过滤，经高温蒸汽灭菌锅灭菌，保存于1000ml锥形瓶中，并使用锡箔纸封口。
(2)虾夷扇贝精子的低温保存液准备：使用电子天平准确称量药剂，将其倒入1000ml无菌海水中，低温保存液的成分及质量百分比为氟苯尼考0.02g/L，复方磺胺甲恶唑0.02g/L，氯化钠26.72g/L，氯化钾0.72g/L，氯化钙1.15g/L，碳酸氢钠0.20g/L，氯化镁2.26g/L。所有成分均使用磁力搅拌器与海水混合均匀后，经0.2μm微孔滤膜过滤，在低温冰箱中4℃保存。
(3)取健康且性腺发育良好的虾夷扇贝，将其性腺取出，剪碎并加入少量精子低温保存液，过500目筛绢网过滤，收集过滤后的扇贝精浆并保存于冰块中保持低温。
(4)使用1000μL移液枪取100μL扇贝精浆于1mL离心管中，再向其中加入900μL精子保存液，反复吹打混匀。
(5)将加入保存液并混匀的精浆保存在4℃低温冰箱中，即可完成虾夷扇贝精子低温保存操作，保存过程中应避免震动、避光，保存精子的离心管需保持密封。
(6)使用时，将精子保存液与精子混合摇匀，并加入相同体积的精子激活剂，此时显微镜下观察，精子运动有活力即为激活成功，此时应尽快使之与新鲜卵子结合完成受精。
4℃保存5d后，取上述保存液保存的扇贝精液，经精子激活剂激活后加入新鲜卵子中，并统计扇贝卵子的受精率。结果表明，经保存的扇贝精子具有受精能力，
加入足量的精子可使卵子的受精率达到86.2％，并能正常发育至囊胚期。
Claims (4)
1.一种利用虾夷扇贝精子的低温保存液保存虾夷扇贝精子的方法， 其特征在于所述低温保存液的成分及终浓度为氟苯尼考0.02g/L、复方磺胺甲恶唑0.02g/ L、氯化钠26.72g/L、氯化钾 0.72 g/L、氯化钙 1.15 g/L和碳酸氢钠 0.20 g/L，氯化镁 2.26 g/L，溶剂为无菌海水；
所述的保存方法，具体如下：
1）挑选生殖期性腺饱满的虾夷扇贝，将性腺完整取出置于培养皿内；
2）使用刀片将性腺切碎，并加无菌海水并搅拌；
3）将性腺置于筛绢网过滤收集精浆，将精浆置于离心管中，收集虾夷扇贝精子后不能离心；
4）使用20μg/ml的低温保存液将虾夷扇贝精浆稀释到原来体积的10倍，在离心管上标记好日期，即可放入4℃冰箱中进行精子保存，精子保存过程中应避免震动，保存精子的离心管需保持密封。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于在收集虾夷扇贝精子时，全程注意器具清洁，严防细菌及原生动物混入精浆。
3. 权利要求1-2任何一项所述方法保存的虾夷扇贝精子的使用方法，其特征在于将低温保存液与精子混合物摇匀，并加入相同体积的精子激活剂，激活精子并使之与新鲜卵子结合完成受精；低温保存液保存的虾夷扇贝精子在5天内使用；所述的精子激活剂的成分及质量百分比为0.7%NaCl、0.05%KCl、0.2% CaCl2、0.02%NaOH和1.5%葡萄糖，其余为无菌过滤海水。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述低温保存液中的精子与卵子的数量比在10000：1。
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