CN117898229A - 一种华贵栉孔扇贝人工受精方法 - Google Patents
一种华贵栉孔扇贝人工受精方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及人工受精领域，其具体是一种华贵栉孔扇贝人工受精方法，通过采用整体性腺的冷冻保存方法，与传统的单独精子冷冻保存方法相比，这种方法能够更有效地保持精子的生物活性和自然状态，因为它保留了精子在扇贝体内的自然环境，这种整体性腺的冷冻方式减少了精子在冷冻和解冻过程中的损伤，显著提高了解冻后精子的存活率和质量；本发明使用的冷冻保护液含有特定比例的渗透性和非渗透性抗冻剂，如DMSO和海藻糖，这种独特配方能更有效地保护精子免受冷冻伤害，同时模拟精子在扇贝体内的自然环境，提高其在解冻后的活性和存活率。
Description
技术领域
本发明涉及精子保存领域，其具体是一种华贵栉孔扇贝人工受精方法。
背景技术
华贵栉孔扇贝，属于软体动物门(Mollusca)，腹足纲(Gastropoda)，扇贝科(Pectinidae)，栉孔扇贝(Chlamys), 原产于世界各地热带、亚热带海域均有分布，亚洲分布于中国、日本、印尼等地，除少数分布在深海外，多数野生于潮线下300m以内的浅海底。华贵栉孔扇贝是世界知名度最高的双壳贝类之一，我国主要的扇贝养殖品种，养殖年产量达120万多吨，居世界首位，具有生长快、产量高、周期短、效益高的特点。这种贝类不仅具有较高的经济价值，而且在海洋生态系统中发挥着重要作用。近年来，由于环境污染、科学引导不足、近亲繁殖等问题，导致华贵栉孔扇贝等海洋生物的种质资源出现退化，进而影响了海洋生物多样性和养殖产量。
在这种背景下，精子保存技术的发展对于水产动物的养殖、种质资源保护以及生物学研究具有重要意义。特别是对于华贵栉孔扇贝这样的物种，由于其特有的生殖特性和繁殖周期，需要一种有效的精子保存方法以保证长途运输和人工授精的成功率。此外，由于环境因素和人为操作可能导致的精子活力下降，研发一种能够在超低温条件下长期保持精子活力的保存方法显得尤为重要。
目前，国内外在精子保存技术方面的研究主要集中在低温保存和超低温冻存。然而，对于海洋贝类精子，特别是华贵栉孔扇贝精子的保存研究，尚未形成一套标准化的操作流程。保藏精子的基本原则是尽可能保持其原始状态和形态，延长寿命。在此过程中，稀释液的类型、保存液的配方、环境温度等因素都会对保存效果产生影响。因此，针对华贵栉孔扇贝精子的特性，开发一种适用的保存方法，不仅对于保护其种质资源具有重要意义，对于促进华贵栉孔扇贝良种繁育和养殖业的发展也具有极大的应用价值。
传统的保存方法往往无法充分防止冷冻过程中的细胞损伤，尤其是在长期保存和运输过程中。这些限制不仅影响了精子的质量，也降低了人工繁殖的成功率。此外，大多数现有技术主要集中于单独精子水平的保存，而忽视了整个性腺组织的完整性和功能。性腺作为包含和保护精子的自然环境，其整体保存可能提供更有效的保护机制，维持精子在更接近自然状态下的活力和功能。
因此，开发一种针对华贵栉孔扇贝的性腺整体冷冻保存方法，既能有效保护精子免受冷冻过程中的损伤，又能提高解冻后的精子存活率和活力，对于提升扇贝养殖的效率和遗传多样性保护具有重要意义。这种创新方法的开发对于海洋生物学研究和水产养殖业的可持续发展将提供重要的技术支持。
发明内容
本发明的目的在于提供一种华贵栉孔扇贝人工受精方法，采用整体性腺的冷冻保存方法，这种方法能够更有效地保持精子的生物活性和自然状态，且辅以使用一种特殊配制的冷冻保护液，其配比经过优化以适应华贵栉孔扇贝精子的特殊需要，这种独特的配方旨在模拟精子的自然生存环境，可以进一步地减少冷冻过程中的细胞损伤。
一种华贵栉孔扇贝人工受精方法，包括：
精子和性腺的收集与处理：从处于繁殖盛期的华贵栉孔扇贝中，选择性腺饱满的个体，通过精细的外科手术方法，切开扇贝的一侧闭壳肌，暴露其内脏团，从中提取性腺，并用吸水纸吸干海水及组织液混合物；
这一步骤的创新之处在于采用无菌技术以及精确的解剖方法，确保性腺的完整性和清洁度，为后续的保存和分析提供了良好的基础。
性腺细胞类型的确认：在无菌载玻片上滴一滴海水，使用解剖针从性腺中挑取少量物质放置于载玻片上在显微镜下观察该物质在海水中的扩散情况，以确定是精子还是卵子，若细胞呈颗粒状迅速散开则为卵子，若细胞呈烟雾状散开则为精子；
冷冻保护液的配置：按重量比计包括，HBSS溶液80-90%、 DMSO 4-8%和0.25mol/L海藻糖5-10%，充分混合，其中HBSS溶液中不含钙离子和镁离子，不含酚红；
这种保护液包含渗透性抗冻剂DMSO和非渗透性抗冻剂海藻糖，其配比经过优化以适应华贵栉孔扇贝精子的特殊需要，这种独特的配方旨在模拟精子的自然生存环境，减少冷冻过程中的细胞损伤，提高其在解冻后的活性和存活率。
性腺的称重与冷冻：将提取的性腺称重，确保精确测量，将性腺按照1：20的比例与预先准备好的冷冻保护液混合，将混合后的样本放入冻存管中，置于4℃条件下平衡30分钟；
冷冻过程：使用程序降温仪将混合物样本以3-6℃/min的速率降至﹣25℃，在﹣25℃平衡3-6min，再以7-12℃/min的速率降至﹣80℃，在﹣80℃平衡3-6 min，将样本快速转移到液氮罐中进行保存。
发明中采用的程序降温仪可以精确控制冷冻过程中的温度变化，从而最大限度地减少温度波动对精子的负面影响，这种精确的温度控制技术是传统冷冻保存方法所缺乏的，它可以显著提高精子在冷冻后的复苏能力。
解冻及精子激活：将冻存管从液氮罐中取出，放入30-60℃的恒温水浴锅中轻轻晃动使其均匀解冻，并观察样本的溶解情况至其完全溶解为止；
解冻后，将性腺用干净吸水纸充分吸干、剪碎并放置在500目筛绢网上，使用0.25μm筛绢网过滤的天然海水进行冲洗过滤，去除多余组织碎片，获得激活的20倍稀释的较干净的精子。通过精子质量分析仪检测精子的活力，确保其活力达到60%以上。
在解冻过程中，本发明采用了特定的快速温度恢复技术，这不仅快速恢复精子的活力，而且减少了解冻过程中可能发生的细胞损伤，经过优化的性腺剪碎和过滤过程进一步提高了精子的活性和纯净度。
人工受精操作：准备好处于适宜受精状态的华贵栉孔扇贝卵子，将解冻并激活的精子与卵子混合，保持适宜的温度、pH值和盐度条件，促进受精。
具体地，控制的环境条件包括温度为25-30℃，PH为7.8-8.5，盐度为30-35。
使用显微镜监控受精过程，确保受精率达到或超过40%。
本发明的有益效果是：
本发明采用整体性腺的冷冻保存方法，与传统的单独精子冷冻保存方法相比，这种方法能够更有效地保持精子的生物活性和自然状态，因为它保留了精子在扇贝体内的自然环境，这种整体性腺的冷冻方式减少了精子在冷冻和解冻过程中的损伤，显著提高了解冻后精子的存活率和质量。
本发明使用的冷冻保护液含有特定比例的渗透性和非渗透性抗冻剂，如DMSO和海藻糖，这种独特配方能更有效地保护精子免受冷冻伤害，同时模拟精子在扇贝体内的自然环境，提高其在解冻后的活性和存活率。
本发明采用的程序降温仪可以精确控制冷冻过程中的温度变化，从而最大限度地减少温度波动对精子的负面影响，这种精确的温度控制技术是传统冷冻保存方法所缺乏的，它可以显著提高精子在冷冻后的复苏能力。
在解冻过程中，本发明采用了特定的快速温度恢复技术，这不仅快速恢复精子的活力，而且减少了解冻过程中可能发生的细胞损伤；此外，经过优化的性腺剪碎和过滤过程进一步提高了精子的活性和纯净度。
综上，通过使用本发明的高活力精子，可以显著提高华贵栉孔扇贝的人工受精成功率，这对于其养殖和种质资源的保护具有重要意义。
附图说明
图1为实施例1冷冻精子电镜扫描图；
图2为实施例2冷冻精子电镜扫描图；
图3为实施例3冷冻精子电镜扫描图；
图4为实施例1的精液分析报告图；
图5为实施例2的精液分析报告图；
图6为实施例3的精液分析报告图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种华贵栉孔扇贝人工受精方法，包括：
S1，挑选处于繁殖盛期、性腺饱满的华贵栉孔扇贝个体，用刀片切开贝壳，用无菌手术刀切开一侧闭壳肌，暴露内脏团；
S2，将性腺剥离取下，并用吸水纸吸干海水及组织液混合物；
S3，在无菌载玻片上滴海水，挑取性腺中的乳白色物质进行观察，以确定生殖细胞类型；
S4，制备冷冻保护液，冷冻液包括重量占比85%的HBSS溶液(不含钙镁、不含酚红)、5% 的DMSO和10%的0.25mol/L海藻糖；
S5，将性腺按1：20的重量比例与冷冻保护液混合，然后在4℃下平衡30分钟；
S6，使用程序降温仪对混合物以3℃/min的速率降至﹣25℃，在﹣25℃平衡3min，再以7℃/min的速率降至﹣80℃，在﹣80℃平衡3 min，将样本快速转移到液氮罐中进行保存；
S7，从液氮罐中取出样本，并在40℃恒温水浴中解冻；
S8，对解冻后的性腺进行处理，包括吸干、剪碎、冲洗过滤，最终获得激活的20倍稀释的精子；
S9，随机采取5ml稀释后的精子，使用精子质量分析仪记录精子存活率；
S10，准备处于适合受精状态的华贵栉孔扇贝卵子，将激活的精子与卵子混合，在温度25℃、PH7.8、盐度30的环境下促使混合物进行受精，观察和确认受精的成功，表现为受精卵的形成和发育，使用显微镜监控受精率。
实施例2
实施例2与实施例1相同，不同之处在于：
S4中，冷冻液包括重量占比82%的HBSS溶液(不含钙镁、不含酚红)、8% 的DMSO和10%的0.25mol/L海藻糖。
S6中，使用程序降温仪对混合物以4℃/min的速率降至﹣25℃，在﹣25℃平衡5min，再以9℃/min的速率降至﹣80℃，在﹣80℃平衡5 min，将样本快速转移到液氮罐中进行保存；
S10中，准备处于适合受精状态的华贵栉孔扇贝卵子，将激活的精子与卵子混合，在温度28℃、PH8.0、盐度32的环境下促使混合物进行受精，观察和确认受精的成功，表现为受精卵的形成和发育，使用显微镜监控受精率。
实施例3
实施例3与实施例1相同，不同之处在于：
S4中，冷冻液包括重量占比90%的HBSS溶液(不含钙镁、不含酚红)、4% 的DMSO和6%的0.25mol/L海藻糖。
S6中，使用程序降温仪对混合物以6℃/min的速率降至﹣25℃，在﹣25℃平衡5min，再以12℃/min的速率降至﹣80℃，在﹣80℃平衡6 min，将样本快速转移到液氮罐中进行保存；
S10中，准备处于适合受精状态的华贵栉孔扇贝卵子，将激活的精子与卵子混合，在温度30℃、PH8.5、盐度35的环境下促使混合物进行受精，观察和确认受精的成功，表现为受精卵的形成和发育，使用显微镜监控受精率。
对比例1
对比例1与实施例1相同，不同之处在于，在S5中，将采集的精子与冷冻液按1:20的重量比例混合，然后在4℃下平衡30分钟。
对比例2
对比例2与实施例1相同，不同之处在于，在S4中，冷冻液包括重量占比80%的HBSS溶液(不含钙镁、不含酚红)、10% 的DMSO和10%的0.25mol/L海藻糖。
对比例3
对比例2与实施例1相同，不同之处在于，在S4中，冷冻液包括重量占比70%的HBSS溶液(不含钙镁、不含酚红)、15% 的DMSO和15%的0.25mol/L海藻糖。
对比例4
对比例4与实施例1相同，不同之处在于，在S6中，使用程序降温仪对混合物以8℃/min的速率降至﹣25℃，在﹣25℃平衡3min，再以15℃/min的速率降至﹣80℃，在﹣80℃平衡3min，将样本快速转移到液氮罐中进行保存。
对比例5
对比例5与实施例1相同，不同之处在于，在S10中，准备处于适合受精状态的华贵栉孔扇贝卵子，将激活的精子与卵子混合，在温度35℃、PH8.0、盐度32的环境下促使混合物进行受精，观察和确认受精的成功，表现为受精卵的形成和发育，使用显微镜监控受精率。
对比例6
对比例6与实施例2相同，不同之处在于，在S4中，冷冻液包括重量占比75%的HBSS溶液(不含钙镁、不含酚红)、15% 的DMSO和10%的0.25mol/L海藻糖。
对比例7
对比例7与实施例2相同，不同之处在于，在S4中，冷冻液包括重量占比95%的HBSS溶液(不含钙镁、不含酚红)、3% 的DMSO和2%的0.25mol/L海藻糖。
对比例8
对比例8与实施例2相同，不同之处在于，在S6中，使用程序降温仪对混合物以8℃/min的速率降至﹣25℃，在﹣25℃平衡3min，再以15℃/min的速率降至﹣80℃，在﹣80℃平衡6min，将样本快速转移到液氮罐中进行保存。
对比例9
对比例9与实施例2相同，不同之处在于，在S10中，准备处于适合受精状态的华贵栉孔扇贝卵子，将激活的精子与卵子混合，在温度28℃、PH9.0、盐度32的环境下促使混合物进行受精，观察和确认受精的成功，表现为受精卵的形成和发育，使用显微镜监控受精率。
对比例10
对比例10与实施例2相同，不同之处在于，在S10中，准备处于适合受精状态的华贵栉孔扇贝卵子，将激活的精子与卵子混合，在温度35℃、PH8.0、盐度32的环境下促使混合物进行受精，观察和确认受精的成功，表现为受精卵的形成和发育，使用显微镜监控受精率。
实施例1-3和对比例1-10的实验数据如表1所示，为了便于记录，精子质量分析仪中的其他数据（例如精子总数、精子浓度、PR、NP、IM等等）不予记录，仅记录总活力（PR+NP）值和受精率。
| 总活力值（PR+NP）% | 受精率% | |
| 实施例1 | 72.4 | 45.2 |
| 实施例2 | 74.6 | 45.8 |
| 实施例3 | 71.8 | 42.4 |
| 对比例1 | 66.6 | 38.2 |
| 对比例2 | 58.4 | 26.3 |
| 对比例3 | 54.7 | 24.6 |
| 对比例4 | 56.8 | 25.7 |
| 对比例5 | 52.6 | 23.8 |
| 对比例6 | 57.7 | 25.8 |
| 对比例7 | 48.4 | 20.6 |
| 对比例8 | 62.2 | 29.6 |
| 对比例9 | 58.6 | 27.4 |
| 对比例10 | 56.4 | 26.2 |
表1
由表1数据可知，采用实施例1-3的冷冻保存和人工受精方法，其精子总活力值均超过70%，受精率在40以上，其冷冻精子后存活率和受精率均较为理想。
其中，对比例1与实施例1相比，直接将采集的精子与冷冻液混合，精子总活力值和受精率均有下降，这说明采用整体性腺的冷冻保存方法，与传统的单独精子冷冻保存方法相比，这种方法能够更有效地保持精子的生物活性和自然状态，因为它保留了精子在扇贝体内的自然环境，这种整体性腺的冷冻方式减少了精子在冷冻和解冻过程中的损伤，显著提高了解冻后精子的存活率和质量。
对比例2、3与实施例1相比，对比例6、7与实施例2相比，调整了冷冻液的配比，本发明中使用了一种特殊配制的冷冻保护液，其配比经过优化以适应华贵栉孔扇贝精子的特殊需要，这种独特的配方旨在模拟精子的自然生存环境，减少冷冻过程中的细胞损伤。
对比例4与实施例1相比，对比例8与实施例2相比，调整了降温速率，精子总活力值与受精率有下降，但下降程度优于调整受精环境的改变（对比例5与对比例9、10），这说明冷冻过程中较小的温度波动可以减少对精子的负面影响。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其它相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (3)
1.一种华贵栉孔扇贝人工受精方法，其特征在于，包括：
S1，挑选处于繁殖盛期、性腺饱满的华贵栉孔扇贝个体，用刀片切开贝壳，用无菌手术刀切开一侧闭壳肌，暴露内脏团；
S2，将性腺剥离取下，并用吸水纸吸干海水及组织液混合物；
S3，在无菌载玻片上滴海水，挑取性腺中的乳白色物质进行观察，以确定生殖细胞类型；
S4，制备冷冻保护液，冷冻保护液按重量比计包括：HBSS溶液80-90%、 DMSO 4-8%和0.25mol/L海藻糖5-10%，其中HBSS溶液中不含钙离子和镁离子，不含酚红；
S5，将性腺按1：20的重量比例冷冻保护液混合，然后在4℃下平衡30分钟；
S6，使用程序降温仪对混合物进行冷冻处理，包括从4℃降至﹣25℃，平衡后再降至﹣80℃，最后快速转移到液氮罐中保存；
S7，从液氮罐中取出样本，并在30-60℃恒温水浴中解冻；
S8，对解冻后的性腺进行处理，包括吸干、剪碎、冲洗过滤，最终获得激活的20倍稀释的精子；
S9，使用精子质量分析仪记录精子存活率，确保精子活力达60%以上；
S10，准备处于适合受精状态的华贵栉孔扇贝卵子，将激活的精子与卵子混合，在控制的环境条件下促使混合物进行受精，观察和确认受精的成功，表现为受精卵的形成和发育。
2.根据权利要求1所述的一种华贵栉孔扇贝人工受精方法，其特征在于，S6中，使用程序降温仪将混合物以3-6℃/min的速率降至﹣25℃，在﹣25℃平衡3-6min，再以7-12℃/min的速率降至﹣80℃，在﹣80℃平衡3-6 min，将混合物快速转移到液氮罐中进行保存。
3.根据权利要求1所述的一种华贵栉孔扇贝人工受精方法，其特征在于，在S10中，控制的环境条件包括温度为25-30℃，PH为7.8-8.5，盐度为30-35。
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