JP2019154329A - 幹細胞の凍結保存液 - Google Patents
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Abstract
Description
特許文献2:WO2013/187077号パンフレット
特許文献3:特開2016−73207号公報
非特許文献2:Iwatani et al.、Stem Cells、2006、24(11)、pp.2549−2556
すなわち本発明は以下を提供する。
(1) 培地成分と、低分子ポリオールと、糖類とを少なくとも含んでなることを特徴とする幹細胞の凍結保存液、
(2) 低分子ポリオールがエチレングリコールである上記(1)の幹細胞の凍結保存液、
(3) 培地成分としてナトリウム塩および/またはカリウム塩を少なくとも含むことを特徴とする上記(1)または(2)の幹細胞の凍結保存液、
(4) 培地成分がDMEM、DMEM/F−12、αMEM、EMEM、F−12、RPMI1640、D−PBSからなる群より選択される少なくとも1種類の培養用培地である上記(1)〜(3)のいずれかの幹細胞の凍結保存液、
(5) 糖類が単糖、二糖、三糖、四糖のいずれか一種類以上である上記(1)〜(4)のいずれかの幹細胞の凍結保存液、
(6) タンパク成分を含んでなる上記(1)〜(5)のいずれかの幹細胞の凍結保存液、
(7) タンパク成分がアルブミンである上記(6)の幹細胞の凍結保存液、
(8) アルブミンが遺伝子組換え技術により製造されたアルブミンである上記(7)の幹細胞の凍結保存液、
(9) 幹細胞が多能性幹細胞である上記(1)〜(8)のいずれかの幹細胞の凍結保存液、
(10) 多能性幹細胞が胚性幹細胞(ES細胞)または人工多能性幹細胞(iPS細胞)である上記(9)の幹細胞の凍結保存液、
(11) 多能性幹細胞が霊長類由来である上記(9)または(10)の幹細胞の凍結保存液、
(12) 多能性幹細胞がヒトiPS細胞である上記(9)〜(11)のいずれかの幹細胞の凍結保存液、及び
(13) 幹細胞の凍結保存方法であって、上記(1)〜(12)のいずれかの凍結保存液に幹細胞を懸濁し、凍結保存することを特徴とする幹細胞の凍結保存方法。
本発明の凍結保存は、以下の手法により実施され得るが、これに限るものではない。
本発明の凍結保存液は、
(1)凍結融解後の生細胞または死細胞を特定の試薬(例えばCalsein−AMなどの生細胞を染色する試薬;例えば、トリパンブルー、アクリジンオレンジ、DAPI、エチジウムブロマイド、Propidium Iodideなどの死細胞を染色する試薬;例えば、クリスタルバイオレット、Hoechstなどの全細胞を染色する試薬;例えば、ブロモクロロインドリルリン酸/ニトロブルーテトラゾリウムなどの細胞に発現する酵素活性により呈色する試薬)で染色、計数し、全細胞数のうち当該試薬で定義される生細胞の割合を計算する方法、およびこれらを蛍光強度、吸光強度、発光強度によって間接的に計算する方法(本明細書では「生細胞率」という。)、
(2)凍結融解後、再度所定の培地に播種・培養した後に、必要に応じて上記(1)の試薬を用いて染色し、例えば、細胞や細胞塊(クランプ)の形状、数、面積を光学顕微鏡などで観察して評価する方法、および/または、それらを蛍光強度、吸光強度、発光強度によって間接的に観測する方法(本明細書では、「凍結保存安定性」あるいは単に「保存安定性」ともいう。)、
(3)凍結融解後の上記(1)および/または(2)の時間的変化を見る方法(本明細書では「増殖性」という。)、
などの方法によって評価することが可能であるが、これに限らない。
凍結保存液は、所定の全成分を混合後、孔径0.20μmのメンブレンフィルター(東洋濾紙社製)で無菌的に濾過した後に使用した。市販の滅菌済み凍結保存液(比較保存液)はそのまま使用した。
ヒト多能性幹細胞として京都大学iPS細胞研究所より分譲された健常人由来ヒトiPS細胞株1231A3株を使用した。細胞の培養は、京都大学iPS細胞研究所の公開しているフィーダーフリーでの維持培養プロトコルCiRA_Ff−iPSC_protocol_JP_v140310(URL:http://www.cira.kyoto−u.ac.jp/j/research/img/protocol/hipsprotocolFf_140311.pdf)に従った。具体的には、iMatrix−511(ニッピ社製)でラミニンコートした培養容器及びStemFit AK02N培地(味の素社製)にAntibiotic‐Antimycotic 100×(Thermo Fisher Scientific社製)を添加した培地を用い、37℃、5%CO2条件下で培養した。
細胞から培養培地を除去した後、D−PBS(−)(ダルベッコリン酸緩衝液、ナカライテスク社製)で1回洗浄し、D−PBS(−)で2倍に希釈したTrypLE Select(Thermo Fisher Scientific社製)を添加した。37℃で12分間インキュベートした後、D−PBS(−)で1回洗浄し、10μMのY−27632(ROCK(Rho−associated coiled−coil forming kinase/Rho結合キナーゼ)阻害剤、和光純薬社製)を含むStemFit AK02Nを添加して細胞を剥離・シングルセル化した。100×g、5分間遠心分離し、上清を除いた後、StemFit AK02Nに懸濁し、トリパンブルー染色を行い細胞数をカウントした。細胞懸濁液を再度100×g、5分間遠心分離した後、上清を除き、1.0×106 Live cells/mLとなるように細胞を凍結保存液に懸濁し、0.3mLずつクライオチューブに分注した。クライオチューブはCoolCell(Biocision社製)に入れた状態で−80℃フリーザーに移し、約1℃/分の冷却速度で細胞を凍結させた。必要に応じて、24時間経過後、液体窒素中にクライオチューブを移送した。
凍結保存液の保存安定性評価は、凍結融解後に培養容器底面に定着した生細胞を蛍光染色することにより評価した。
(糖類との組み合わせによる効果)
エチレングリコール(和光純薬社製)、アルブミン(CultureSure(登録商標) BSA、和光純薬社製)、DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle Medium、1.0g/L Glucose、ナカライテスク社製)、及び各種糖類(D(+)−グルコース(和光純薬社製)、D−マンノース(和光純薬製)、myo−イノシトール(和光純薬製),D(−)−ソルビトール(和光純薬製)、D(−)−マンニトール(和光純薬製)、スクロース(和光純薬製)、トレハロース二水和物(林原製)、ネオトレハロース(林原製)、α−ガラクトシルグルコシド(林原製)、マルトース(林原製)、マルチトール(林原製)、イソマルトース(林原製)、ツラノース(林原製)、D(+)−ラフィノース五水和物(和光純薬製)、α−マルトシルグルコシド三水和物(林原製)、グルコシルラクトシド(林原製)、スタキオース水和物(東京化成工業製)、α−マルトトリオシルグルコシド(林原製)または環状ニゲロシルニゲロース五水和物(林原製)を混合して凍結保存液を調整し、上記手法にて凍結保存液の保存安定性評価を実施した。凍結保存液の組成と保存安定性評価の結果を表1に示した。
本発明による保存液組成と市販の凍結保存液であるSTEM−CELLBANKER(比較保存液1、日本全薬社製、DMSOを含有する緩慢凍結保存用保存液)およびCell Reservoir One DMSO Free(比較保存液2、ナカライテスク社製、DMSOを含有しない緩慢凍結保存用保存液)の凍結保存安定性を比較した。保存安定性評価の結果を図1に示した。本発明による凍結保存液組成は、市販の凍結保存液を上回る凍結保存安定性を示した。
高い凍結保存安定性を示した実施例1の凍結保存液組成において、未分化マーカー遺伝子の発現維持効果を下記の手法で確認した。
(凍結後細胞の未分化状態の維持)
アルカリホスファターゼ染色及びレクチン染色により、凍結融解後の細胞の未分化状態の維持を確認した。24時間−80℃にて凍結保存したクライオチューブをフリーザーから取り出し、37℃ウォーターバス中にて湯浴し、速やかに融解した。融解した凍結保存細胞液をiMatrix−511でコーティングされた12ウェルプレートに播種し、37℃、5%CO2の条件下で5日間培養した。アルカリホスファターゼ染色は培養した細胞を4%パラホルムアルデヒド溶液で固定後、Alkaline Phosphatase Substrate Kit VI<BCIP/NBT>(Vector Labratories社製)で染色した。レクチン染色は蛍光標識rBC2LCN(和光純薬社製)を用いて染色した。アルカリホスファターゼ染色の結果を図3、レクチン染色の結果を図4に示す。組成E15、E16、E18、E19のいずれの凍結保存液で凍結保存した細胞も凍結融解後に未分化状態を維持していた。
(解凍後の細胞の増殖性)
24時間−80℃にて凍結保存したクライオチューブをフリーザーから取り出し、37℃ウォーターバス中にて湯浴し、速やかに融解した。融解した凍結保存細胞液50μLをiMatrix−511でコーティングされた6ウェルプレートに播種し、37℃、5%CO2の条件下で培養した。培養4、6日目に細胞を酵素処理により剥離回収し、血球計算盤にて細胞数を計測した。結果を図5に示す。組成E15、E16、E18、E19のいずれの凍結保存液を用いた場合でも比較保存液1、2と比べて良好な細胞増殖が認められた。
<凍結保存液の毒性評価>
従来用いられているガラス化法凍結保存液は細胞毒性が高く、迅速な凍結および融解操作を要求されていることから、凍結保存液への浸漬による細胞への毒性を評価した。比較例として、市販の緩慢凍結保存液である比較保存液1、2に加えて、ガラス化法にて一般的に用いられる凍結保存液DAP213 (Generation of Human induced Pluripotent Stem Cells、CiRA M&M March 5, 2009)(比較保存液3)及び特許文献1記載のDMSOを含有しないガラス化凍結保存液組成VS2E(比較保存液4)を用いた。DAP213はDMSO 2M、アセトアミド 1M、プロピレングリコール 3M(それぞれ和光純薬社製)となるようにDMEM(Dulbecco’s Modified Eagle Medium、1.0g/L Glucose)に希釈して調製した。VS2Eはエチレングリコール40%(v/v)、ポリエチレングリコール(PEG#1,000、ナカライテスク社製)10%(w/v)となるようにユーロコリンズ液に希釈して調製した。ユーロコリンズ液は、D(+)−グルコース34.95g/L、リン酸水素二カリウム7.4g/L、リン酸二水素カリウム2.05g/L、塩化カリウム1.12g/L、炭酸水素ナトリウム0.84g/L(それぞれ和光純薬社製)となるように純水に希釈して調製した。
Claims (13)
- 培地成分と、低分子ポリオールと、糖類とを少なくとも含んでなることを特徴とする幹細胞の凍結保存液。
- 低分子ポリオールがエチレングリコールである請求項1に記載の幹細胞の凍結保存液。
- 培地成分としてナトリウム塩および/またはカリウム塩を少なくとも含むことを特徴とする請求項1または2に記載の幹細胞の凍結保存液。
- 培地成分がDMEM、DMEM/F−12、αMEM、EMEM、F−12、RPMI1640、D−PBSからなる群より選択される少なくとも1種類の培養用培地である請求項1〜3のいずれか一項に記載の幹細胞の凍結保存液。
- 糖類が単糖、二糖、三糖、四糖のいずれか一種類以上である請求項1〜4のいずれか一項に記載の幹細胞の凍結保存液。
- タンパク成分を含んでなる請求項1〜5のいずれか一項に記載の幹細胞の凍結保存液。
- タンパク成分がアルブミンである請求項6に記載の幹細胞の凍結保存液。
- アルブミンが遺伝子組換え技術により製造されたアルブミンである請求項7に記載の幹細胞の凍結保存液。
- 幹細胞が多能性幹細胞である請求項1〜8のいずれか一項に記載の幹細胞の凍結保存液。
- 多能性幹細胞が胚性幹細胞(ES細胞)または人工多能性幹細胞(iPS細胞)である請求項9に記載の幹細胞の凍結保存液。
- 多能性幹細胞が霊長類由来である請求項9または10に記載の幹細胞の凍結保存液。
- 多能性幹細胞がヒトiPS細胞である請求項9〜11のいずれか一項に記載の幹細胞の凍結保存液。
- 幹細胞の凍結保存方法であって、請求項1〜12のいずれか一項に記載の凍結保存液に幹細胞を懸濁し、凍結保存することを特徴とする幹細胞の凍結保存方法。
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