JP7266892B2 - 細胞凍結保存液、凍結細胞保存方法、及び細胞凍結方法 - Google Patents
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Description
凍結対象となる細胞に前記細胞凍結保存液を加えた細胞懸濁液をサンプルとして作製するサンプル作製ステップと、
前記サンプルが収納された第1の容器を、2-プロパノールで満たされた第2の容器内に設置するサンプル設置ステップと、
前記サンプル設置ステップに次いで、前記第2の容器を所定の温度に設定された冷凍庫内に保持して前記サンプルを凍結させる凍結ステップと、
凍結した前記サンプルを-135℃以上-80℃以下の温度で保存する、サンプル保存ステップと、
を含む凍結細胞保存方法である。
凍結対象となる細胞に前記細胞凍結保存液を加えた細胞懸濁液をサンプルとして作製するサンプル作製ステップと、
前記サンプルが収納された第1の容器を、2-プロパノールで満たされた第2の容器内に設置するするサンプル設置ステップと、
前記サンプル設置ステップに次いで、前記第2の容器を所定の温度に設定された冷凍庫内に保持して前記サンプルを凍結させる凍結ステップと、
を含み、
前記凍結ステップでは、前記冷凍庫内に磁場を発生させて、当該磁場を前記サンプルに印加する、
細胞凍結方法としている。
上述したように、医療用途の細胞凍結保存技術を実用化させるためには、高い安全性と細胞生存率に加え、低価格で入手が容易であることが重要である。そこで本発明者は、食品由来の物質を細胞凍結保存液に用いることを検討し、その上で、より高い細胞生存率を達成するべく鋭意研究を重ねた。そして、本発明に想到した。
以下、サンプルの作製手順、サンプルの凍結手順、及びサンプルの解凍手順について、その一例を具体的に説明する。なお、ここでは、凍結対象となる細胞組織として、ヒト胎児由来腎細胞株(HEK293A)を培養して得たHEK293細胞を採用した。
上述したように、細胞毒性のある添加剤を含まず食品由来の糖類を添加剤とした細胞凍結保存液を用いることで細胞生存率が向上することがわかった。そこで、細胞生存率をさらに向上させるために、主成分であるトレハロースと、トレハロース以外の副成分とからなる添加剤を含む細胞凍結保存液を用いてサンプルを作製した。そして、上記と同様の手順でサンプルに対する凍結解凍試験を行って、サンプルの細胞生存率を調べた。
次に、D-PBSを溶媒とし、糖濃度が100mM、又は300mMのトレハロース溶液に対してOVAの添加量を変え、細胞凍結保存液中のOVAの濃度が異なる各種細胞凍結保存液を調製して、上記と同様の細胞懸濁液を作製した。そして、これらの細胞懸濁液をサンプルとして、各サンプルに対して上記と同様の手順で凍結保存試験を行った後、各サンプルにおける細胞生存率を調べた。
医療用途の細胞凍結技術をより確実に実用化させるためには、凍結細胞を長期間保存した後で高い細胞生存率を有していることも必要となる。そこで、第2の実施例として、第1の実施例に係る細胞凍結保存液を用いて凍結させた細胞の保存方法(凍結細胞保存方法)を挙げる。
第1の実施例に係る細胞凍結保存液を用いた凍結解凍試験や凍結細胞保存試験では、サンプルを、一般的な凍結方法を採用していた。しかし、一般的な凍結方法では、極低温(例えば、-80℃)まで冷却できる性能を有する高価な冷凍装置が必要となる。そして、冷凍庫内をこの極低温にまで冷却するためには長い時間を要する。冷却に要する電力も大きい。したがって、細胞を凍結する際の総合的なコストを考慮すれば、細胞をより高い温度で効果的に凍結させることができる技術が必要となる。そこで、第3の実施例として、第1の実施例に係る細胞凍結保存液を用いつつ、高い温度でも細胞を短時間で凍結させることができる細胞凍結方法を挙げる。
上記各実施例では、試験用細胞としてHEK293細胞を用いていたが、上記各実施例は、他の細胞にも適用可能である。
15 温度センサ、16 コイル、20 制御ユニット、22 コイル制御部、
25 温度制御部
Claims (4)
- 生理食塩水を溶媒とし、添加剤として主成分の添加剤と副成分の添加剤とが添加されてなり、
前記主成分の添加剤はトレハロースであり、
前記副成分の添加剤はオボアルブミンである、
細胞凍結保存液。 - 請求項1に記載の細胞凍結保存液であって、
前記生理食塩水中に200mM以上300mM以下の濃度で前記トレハロースが含まれるトレハロース溶液に前記オボアルブミンが添加されてなり、
前記オボアルブミンが1vol%以上~10vol%以下の割合で含まれている、
細胞凍結保存液。 - 請求項1又は請求項2に記載の細胞凍結保存液を用いて凍結させた細胞を保存する方法であって、
凍結対象となる細胞に前記細胞凍結保存液を加えた細胞懸濁液をサンプルとして作製するサンプル作製ステップと、
前記サンプルが収納された第1の容器を、2-プロパノールで満たされた第2の容器内に設置するサンプル設置ステップと、
前記サンプル設置ステップに次いで、前記第2の容器を所定の温度に設定された冷凍庫内に保持して前記サンプルを凍結させる凍結ステップと、
凍結した前記サンプルを-135℃以上-80℃以下の温度で保存する、サンプル保存ステップと、
を含む凍結細胞保存方法。 - 請求項1又は請求項2に記載の細胞凍結保存液を用いて細胞を凍結させる方法であって、
凍結対象となる細胞に前記細胞凍結保存液を加えた細胞懸濁液をサンプルとして作製するサンプル作製ステップと、
前記サンプルが収納された第1の容器を、2-プロパノールで満たされた第2の容器内に設置するするサンプル設置ステップと、
前記サンプル設置ステップに次いで、前記第2の容器を所定の温度に設定された冷凍庫内に保持して前記サンプルを凍結させる凍結ステップと、
を含み、
前記凍結ステップでは、前記冷凍庫内に磁場を発生させて、当該磁場を前記サンプルに印加する、
細胞凍結方法。
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JP2020190092A JP7266892B2 (ja) | 2020-11-16 | 2020-11-16 | 細胞凍結保存液、凍結細胞保存方法、及び細胞凍結方法 |
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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JP2014155443A (ja) | 2013-02-14 | 2014-08-28 | Univ Of Tokyo | 細胞の凍結保存方法 |
JP2019024325A (ja) | 2017-07-25 | 2019-02-21 | 国立大学法人京都大学 | ヒト多能性幹細胞由来心筋細胞の凍結方法 |
JP2019154329A (ja) | 2018-03-14 | 2019-09-19 | 旭化成株式会社 | 幹細胞の凍結保存液 |
JP2019528765A (ja) | 2016-10-04 | 2019-10-17 | トランスウェル バイオテック カンパニー リミテッド | 細胞の凍結保存のための組成物および方法 |
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2020
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