JP2019527050A - 生物学的物質の凍結保存および安定化のための氷核形成調合物 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2016年6月29日に出願された米国仮出願第62/356,008号、および2017年3月14日に出願された米国仮出願第62/471,265号の利益を主張する。前述の内容は全て、参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、国立衛生研究所によって授与された助成金番号EB002503および国防総省によって授与された助成金番号H151−013−0141の下で政府の支援を受けてなされたものである。政府は本発明に一定の権利を有する。
本開示は、生物学的物質の凍結保存および安定化のための氷核形成調合物、ならびにその使用方法に関する。
水および水溶液は、外的な核がなければ、均一な氷核形成が起こるまで、融点よりはるかに低い過冷却液体状態を維持することになる。例えば、純水の均一な氷核形成は、冷却速度および試料体積に応じて、典型的には−35から−38℃の範囲で起こる。しかしながら、比較的より高い零下温度での氷核形成の開始は、広範なプロセス技術に対して多くの利点を提供する。例えば、食品および医薬品の凍結乾燥の際、抑制された過冷却を伴う制御された氷核形成は、一次乾燥時間を顕著に短縮し、食感および製品の均一性を改善し得る。単離されたラット肝細胞およびヒト卵母細胞の緩慢凍結保存において、細胞外空間における、より高い氷核形成温度は、有害な細胞内氷形成(IIF)の可能性も減少させる。よって、過冷却効果(すなわち、氷核形成温度と融点との間の差)を最小にし、比較的高い零下温度で氷核形成を開始させる方法を開発する必要がある。
本開示は、生物学的物質の凍結保存および安定化のための氷核形成調合物、ならびにその使用方法に関する。
一部の実施形態では、組成物は保存剤(preservative)をさらに含み得る。
(1).所望の氷核形成温度を選択する工程;
(2).所定の曲線から、ハイドロゲル粒子組成物中の氷核形成剤の標的総質量を決定する工程であって、所定の曲線が、氷核形成温度と、複数の試料ハイドロゲル粒子組成物についての氷核形成剤の総質量とを相関させる、工程;
(3).標的総質量に基づき、ハイドロゲル粒子組成物のN、Vおよびclocalの値を決定する工程;ならびに
(4).決定されたN、Vおよびclocalの値を有するハイドロゲル粒子組成物を製造する工程
を含む。
(1).所望の氷核形成温度を選択する工程;
(2).所定の曲線から、重水濃度を決定する工程であって、所定の曲線が、氷核形成温度と、各々が氷核形成剤を含む複数の試料重水組成物についての重水濃度とを相関させる、工程;
(3).決定された重水濃度を有し、氷核形成剤を含む重水組成物を製造する工程
を含む。
一部の実施形態では、核形成剤は、ハイドロゲルの液滴中にカプセル化されている。
氷核形成の制御は、食品および製薬の科学ならびに低温生物学に関連する多くのプロセス技術において根本的に重要である。機械的摂動および電磁場は、制御された様式で氷核形成を誘導することが知られている。これらの氷核形成方法は、手動操作の場合の一貫性および標準化の欠如、多数の試料についての煩雑な工程、ならびに電場および/または磁場の必要性などといった多くの不利益を被る。
温度が液体の標準凝固点まで下げられると、液体は、周囲に結晶構造が形成し得る種結晶または核の存在下で結晶化し、固体を生成する。そのような核を欠く場合、液相が結晶の均質核形成が起こる温度まで、ずっと維持され得る。水は通常、273.15K(0℃)で凍結するが、標準圧力で、約224.8K(−48.3℃)における結晶の均質核形成まで「過冷却」され得る。過冷却のプロセスは通常、水が純粋で、核形成部位がないことを必要とし、これは、逆浸透または化学脱塩のようなプロセスによって達成され得る。核形成部位が存在するか、または水が実質的に純粋ではない場合、水は通常−48.3℃よりも高い温度で凍結することになる。氷核形成が起こると、氷核形成部位周辺の結晶化が急速に広まり、水が凍結することになる。したがって、本明細書で使用されるとき、用語「氷核形成温度」は、臨界的サイズの最初の安定した氷胚が形成される温度を指す。
本明細書で使用されるとき、用語「氷核形成剤(ice nucleating agent)」または「氷核剤(ice nucleator)」は、氷の形成を促進し、それらが水性系に添加されると、より高い温度で氷核形成を開始することができる粒子または表面を指す。氷核形成剤の目的は氷の形成を促進することであるので、氷核形成剤はランダムなまたは環境的な混入物、例えば粉塵または煤を含まない。氷核形成剤を水に添加すると、結果として氷核形成温度が上昇する。氷核形成剤が核形成を達成する正確な方法はよく理解されていないが、一般に、氷核形成剤は、水分子を氷に似た様式で組織化し、比較的高い温度で核形成するのに十分なだけ大きな水分子凝集体を作り出すと考えられている。氷核形成剤は効果的に氷形成を促進することができる。一部の実施形態では、十分な量の氷核形成剤は、氷核形成温度を少なくとも1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、または38℃上昇させることができる。一部の実施形態では、十分な量の氷核形成剤は、氷核形成温度を−10℃、−9℃、−8℃、−7℃、−6℃、−5℃、−4℃、−3℃、−2℃、または−1℃より高い温度に上昇させることができる。一部の実施形態では、十分な量とは、0.5ml、1ml、または1.5mlの純水中で試験される0.001mg、0.005mg、0.01mg、0.05mg、0.1mg、0.5mg、1mg、5mg、または10mgを指す。よって、一部の実施形態では、本明細書に記載の0.01または0.1mgの氷核形成剤は、0.5mlの純水の氷核形成温度を−6℃または−5℃より高い温度に上昇させることができる(例えば、図4を参照)。
AGYGSTxTagxxssli AGYGSTxTagxxsxlt AGYGSTxTaqxxsxlt(配列番号2)
本明細書で使用されるとき、用語「ハイドロゲル粒子」は、ハイドロゲルでできた粒子を指す。ハイドロゲルは、親水性の高い天然または合成のポリマーネットワークである。本開示は、氷核形成剤を含有するハイドロゲル粒子を提供する。氷核形成剤は、ハイドロゲル粒子内に封入されるか、カプセル化されるか、または埋め込まれる。ハイドロゲル粒子は、様々な形状、例えば球、ビーズを有することができ、同様な形状およびサイズを有することができる。ハイドロゲル粒子は、いくつかの利点を有する。第1に、氷核形成剤(例えば凍結乾燥させたP.syringae)がハイドロゲルビーズ中にカプセル化されると、INAと生物系との間の相互作用が最小化される。よって、ハイドロゲル粒子は毒性作用を有する可能性が低い。第2に、粒子は生物系から容易に除去されることも可能である。
本開示はまた、ハイドロゲル粒子を含む組成物も提供する。一部の実施形態では、組成物はまた、水(例えば、H2O、D2OまたはT2O)も含む。
m=N・V・clocal
式中、mは氷核形成剤の総質量であり、Nは組成物中のハイドロゲル粒子の数であり、Vはハイドロゲル粒子の体積または平均体積であり、clocalはハイドロゲル粒子の局所濃度である。よって、一部の実施形態では、組成物中の氷核形成剤(例えば、SNOMAX)の総質量は、0.001、0.01、0.1、1、10、100、1000、104、105、または106mgを超える。一部の実施形態では、組成物中の氷核形成剤(例えば、SNOMAX)の総質量は、0.001、0.01、0.1、1、10、100、1000、104、105、または106mg未満である。
重水は、一般的な水素−1(1H)同位体が、通常よりも多い量の重水素同位体(Dまたは2H)またはトリチウム同位体(Tまたは3H)で置換された水の一形態である。よって、本明細書で使用されるとき、重水はD2OまたはT2Oを指す。重水の毒性は、単純な生物から複雑な生物まで様々である:藻類および細菌は、100%のD2O中で増殖するように適応でき、実際、重水素化分子の供給源の役割を果たすが、20%を超える濃度は、通常の体温で動物および動物細胞に対して毒性を及ぼし得る。細胞レベルでは、D2Oは細胞周期を遅くし、概日リズムを長くすること、および巨大分子の熱安定性を増大させるが、(おそらくシャペロン機能の阻害の結果として)熱ストレスに対する細胞応答を減少させる可能性があることが示されている。さらに、D2Oは、生体分子(例えば、タンパク質および核酸)に対するその保護効果の結果としてワクチン接種の安定性を改善することが示されており、それは薬物代謝に影響することから、医薬における用途を有している。
本明細書に記載の組成物(例えば、様々なハイドロゲル粒子組成物および様々な重水組成物)はまた、1、2、または3以上の凍結保護物質も含み得る。本明細書中で使用される場合、用語「凍結保護物質剤」は、凍結中の細胞への損傷を予防または軽減する物質を指す。本開示において記載されている組成物には、様々な凍結保護物質が含められ得る。これらの凍結保護物質は、例えば、糖、ポリプロピレングリコール、ジメチルスルホキシド(DMSO)、デキストラン、グリセロール、ソルビトール、プロピレングリコール、エチレングリコール、ピリジン、2−3ブタンジオール、ヒドロキシエチルデンプン、ポリビニルピロリドン(PVP)、プロリン(または他のタンパク質安定剤)、ヒト血清アルブミンおよびそれらの組合せを含む。糖はまた、例えば以下、スクロース、トレハロース、ラフィノース、スタキオース、フルクトース、およびデキストランのうちのいずれかでもあり得る。例示的な糖およびそのような糖の濃度範囲は、参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第6,673,607号および第7,094,601号に記載されている。
本明細書に記載の組成物は、ナノ粒子もしくはマイクロ粒子または両方をさらに含み得る。ナノ粒子またはマイクロ粒子の添加は、組成物の熱伝導率を高めると考えられる。
本開示は、生物学的試料を保存する方法を提供する。本方法は、生物学的試料を本明細書に記載の組成物または調合物(例えば、ハイドロゲル粒子組成物、重水組成物)と接触させる工程;および生物学的試料を組成物または調合物と共に凍結させる工程を含む。生物学的試料は、細胞、組織試料、オンコソーム、エキソソーム、微小胞またはリポソームであり得る。生物学的試料はまた、核酸(例えば、DNA、RNA、mRNA、マイクロRNAなど)、タンパク質、および/または脂質を含み得る。よって、一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物または調合物は、凍結融解後の核酸の収量を向上させることができる。
所望される場合、本開示の凍結保存された生物学的試料は、当技術分野で公知の方法または本明細書中に記載の方法を使用して温められ得る。例えば、生物学的試料は20〜37℃、例えば室温で、場合により振盪しながら、場合により糖または他の凍結保護物質を補充して、1×PBS溶液中に投入され得る。温めた後、生物学的試料(例えば、細胞)は一般に洗浄され、適切な培地に懸濁され、研究または臨床応用における使用のための必要性に応じて処理される。例えば、胚性幹(ES)細胞は、当技術分野で公知の技術を使用してプレーティングされ、継代され得る。卵母細胞は一般に、油中に浸漬した培地の液滴中で培養される。凍結保存の前後に、細胞を培養するために使用される厳密な条件および培地は、当業者には明らかであろう。
本開示はまた、凍結システムも提供する。本凍結システムは、生物学的試料、器官、または生物のための容器を含み得る。容器は、例えば、バッグ、プラスチックバイアル、ガラスバイアル、プラスチックストロー、プルドストロー、毛細管もしくはストロー、および/またはバイオリアクターを含み得る。冷凍システムはまた、冷却システムも含み得る。凍結システムは、本明細書に記載の組成物または調合物をさらに含み得る。一部の実施形態では、本開示に記載の氷核形成剤またはハイドロゲル粒子は、冷凍システムの表面上に固定化され得る。
ハイドロゲル粒子の氷核形成性能が、本開示において特徴付けられている。一定体積の水性試料において、粒子中のINAの総質量が、氷核形成温度を左右する普遍的パラメーターとして同定された。これらの知見は、ハイドロゲル粒子のサイズおよび数、ならびに局所的なINA濃度を調整することによって、氷核形成温度を6度またはそれ以上の範囲内で調整するための指針を提供する。
Tf=0.6478・log10m−3.052(R2=0.9019)
Tf=1.093・log10(m)−5.771(R2=0.9571)
以下の材料および方法を、実施例2〜5においても使用した。
ある特定の量のアルギン酸ナトリウム塩(Sigma−Aldrich、ミズーリ州セントルイス)を細胞培養用水(Gibco WFI for Cell Culture、サーモフィッシャーサイエンティフィック、マサチューセッツ州ウォルサム)に溶解して、4%(w/v)アルギネートストック溶液を調製した。WFI水中に調製したSNOMAX(SNOMAX International、コロラド州イングルウッド)懸濁液(0.2〜30mg/ml)を等量のアルギネートストック溶液と混合し、0.1〜15mg/mlのSNOMAXおよび2%(w/v)アルギネートの最終局所濃度を得た。
この実施例では、一連のアルギネートビーズを調製した。図1のDは、18ゲージ針によって調製され、それぞれ0.1mg/mlおよび15mg/mlの局所SNOMAX濃度を有する2つの例を示している。予想されたとおり、より高いSNOMAX粒子のClocalは、ハイドロゲルビーズの透明性の低下に寄与した。表1は、異なるSNOMAXの局所濃度を有し、30ゲージまたは18ゲージの針で生成された、アルギネートビーズのサイズをまとめたものである。同じClocalでは、18ゲージ針によって生成されたビーズは、体積に関して、30ゲージ針によって生成されたビーズの約3.5倍の大きさであった。同じサイズの針を使用した場合、SNOMAXの局所濃度が高いほど、ビーズ体積は小さくなる。これは主に、中実粒子の局所濃度がより高い場合、重力が、針の先端での表面張力に打ち勝つために、より小さな体積が必要とされるためである。調製された細菌ハイドロゲルビーズのサイズは、使用されたINA粒子の容易な除去を可能にし、これは、下流の処理に有益であり得る。
図2は、異なるClocal(すなわち、0.1、2.5または15mg/ml)のSNOMAX含有アルギネートビーズの存在下におけるWFI水の凍結温度を示している。氷核形成の確率論的性質を考慮して、全ての反復実験のデータポイントが示され、凍結温度の中央値
と四分位範囲が表示されている。一般に、凍結温度は、調査された以下の3つのパラメーターに正の関係を示す:ビーズの数(N)、ビーズの体積(V)、および局所SNOMAX濃度(clocal)。図2Aに見ることができるように、30ゲージ針で調製され、0.1mg/mlのSNOMAXを含有する単一のビーズの存在は、−5.6℃における氷核形成を誘導したが、凍結温度の中央値は、同じサイズとclocalのビーズをさらに4つ追加すると−4.5℃に上昇した。Vの効果については、30ゲージ針で調製された2.5mg/mlのSNOMAXを含む5つのビーズは、−4.0℃の凍結温度の中央値を導いた。しかし、ビーズが18ゲージ針によって生成され、それゆえ30ゲージ針の対応物の3倍以上の大きさである場合、
は−3.4℃に上昇した。図2Bに見られるように、18ゲージ針によって生成され、0.1mg/mlのSNOMAXを含有する10個のビーズの存在は、−3.7℃の凍結温度の中央値を導いた。SNOMAXの局所濃度が15mg/mlに増えた場合、凍結温度の中央値は−3.3℃になった。表2は、0.5mlのWFI水単独の凍結温度の中央値は−8.0℃であるのに対し、18ゲージ針で調製された10個のSNOMAX不含アルギネートビーズを含む0.5mlのWFI水の
は−7.2℃であることを示している。図2A〜図2Bに示されているほぼ全てのデータポイントは、−7℃より高いことから、SNOMAX粒子は、ハイドロゲルマトリクス内に閉じ込められていても、氷核形成温度を高めるのに大きな役割を果たした。
SNOMAX含有アルギネートビーズによって促進される10%グリセロール水溶液における凍結現象も調査した。グリセロールは、その束一性、強い水素結合能力、および低温での高い粘性のために、最も一般的に使用されている凍結保護物質の1つである[4]。図3のA〜図3のBに見られるように、異なるclocalおよび異なるサイズのアルギネートビーズの存在下における10%グリセロールの凍結温度は、図2A〜2Bに見られるものと同様の傾向を示す。溶質グリセロールの添加は、凍結温度とN、V、またはclocalとの間の正の関係を変えなかった。図3のAは、30ゲージ針で調製された0.1mg/mlのSNOMAXを含有する単一のビーズの存在が−10.0℃での氷核形成を導いた一方、同じVおよびclocalのさらに9個のビーズの追加により、凍結温度の中央値は−8.7℃に上昇したことを示している。2.5mg/mlのSNOMAXを含有し、30ゲージ針で調製された5つのビーズは、−7.0℃の凍結温度中央値に寄与したことも示されている。ビーズが18ゲージ針で調製された場合、
は−6.4℃に上昇した。図3のBは、0.1mg/mlのSNOMAXをそれぞれ含有する10個のビーズの添加が、−7.5℃の凍結温度中央値を生じたことを示している。しかし、ビーズが15mg/mlのSNOMAXを含有した場合、凍結温度中央値は−6.1℃に上昇した。表3にまとめられているように、SNOMAXもハイドロゲルビーズも含有しない0.5mlの10%グリセロールの凍結温度の中央値は−11.8℃である。18ゲージ針で調製した10個のSNOMAX不含アルギネートビーズを有する0.5mlの10%グリセロールの
は−11.1℃である。図3のA〜図3のBに示されている全てのデータポイントは−11℃より高い。したがって、水系の凍結温度を有意に高めたものは、SNOMAX粒子である。
SNOMAX含有ハイドロゲルビーズを含有する水性試料の氷核形成に影響を与えうる複数の因子がある。異なるN、Vおよびclocalの組合せを用いて、同じ凍結温度を得ることができる。したがって、凍結温度を決定する唯一の原因となる普遍的なパラメーターを提供することは、非常に有益であろう。この実施例において、一定体積の水性試料に含有されるSNOMAX粒子の総質量が、そのようなパラメーターであると決定された。
Tf=0.6478・log10m−3.052(R2=0.9019)
Tf=1.093・log10(m)−5.771(R2=0.9571)
重水および氷核形成剤を含む自己核形成および保存調合物が、凍結保存の分野における幅広い用途と共に開発された。自己核形成調合物は、主に以下を達成する:(1)比較的高い温度における氷核形成の開始、(2)所与の試料内でのより均一な氷の伝播、(3)異なる細胞調製物間の、より少ないばらつき、(4)手作業でのシード形成の必要性を排除する、ならびに(5)長期保存のために生物学的分子(例えば、DNA、RNA、タンパク質、代謝産物)、エキソソーム(細胞由来小胞)、細胞、器官、および生物を安定化させる一連の生物学的効果を奏する。液滴技術を使用して、水対D2Oの核形成温度を測定した:核形成温度の中央値は、純粋な水中の−37.4℃から、純粋なD2Oでは−32.1℃へと上昇する。しかしながら、重水と氷核形成剤を組み合わせると、核形成温度は−4.6℃にまで到達することができ(図7)、これら2つを相乗的に使用することの価値を実証している。強力な氷核形成細菌Pseudomonas syringae(SNOMAXとして知られる市販の調製物)をフィージビリティの実証のために選択した。
カクテル1 − ウィスコンシン大学溶液(UW)+3OMG
カクテル2 − UW+3OMG+トレハロース
カクテル3 − UW+3OMG+トレハロース+N−アセチル−L−システイン
カクテル4 − UW+3OMG+トレハロース+硫化水素
カクテル5 − UW+3OMG+重水およびSNOMAX
カクテル6 − UW+3OMG+トレハロース+重水およびSNOMAX
カクテル7 − UW+3OMG+トレハロース+N−アセチル−L−システイン+重水およびSNOMAX
カクテル8 − UW+3OMG+トレハロース+硫化水素+重水およびSNOMAX
氷核を形成する能力を有する生体適合剤をハイドロゲルマイクロビーズ中にカプセル化することができる。INPのカプセル化は、毒性の問題を克服するための手段として働くのではなく、氷の伝播に対する制御を高めるための手段として提案された。SNOMAXが関係する図11に明示されているように、選択されたINPは、平衡凍結の際、多様な細胞型に対して毒性作用を及ぼさなかった。
様々なINPのカプセル化
この研究の延長として、IceStart(商標)およびヨウ化銀などの様々なINPのカプセル化も試験する。ハイドロゲル内への閉じ込めを特徴付けるために、氷核剤を蛍光標識し、外部の蛍光に対する内部の蛍光を定量する。目的は、多様な氷核形成粒子をカプセル化し、1%未満の漏れでハイドロゲル内に80%の閉じ込めを達成することである。
氷核形成温度を評価するために、ハイドロゲルビーズ内に含有されるINPを、約500μlの水溶液に懸濁する。クライオバイアル中に入れられた試料を、速度調節フリーザーで様々な冷却勾配にかける。INP含有ハイドロゲルビーズによって促進される氷核形成温度は、試料中に浸漬した熱電対によって決定する。氷核形成能を定量するために、速度調節フリーザー中で1℃/分の冷却速度に曝した試料を、試料が全て凍結するまで1℃ごとに調べる。凍結していない試料の数を、温度の関数として数える。全ての場合において、カプセル化されていない対応する氷核剤を、カプセル化による効力の喪失を確かめるために使用する。この詳細な特徴付けに続いて、INP含有ハイドロゲルビーズを、ラットとヒトの両方の初代肝細胞の凍結保存に使用する。初代細胞は、二重ゲル構成でプレーティングするが、これは、この構成が、肝細胞機能の長期的な発現を維持する、生理学的に関連する組織構造に相当するためである。さらに、この設計された構築物においては、コラーゲンゲルが、生体内での状況と同様に、凍結保存溶液から実質を分離しており、支持組織バリアによって肝細胞がINP含有ハイドロゲルビーズから分離されている。INP含有ハイドロゲルビーズを、初代肝細胞用の既存の凍結保存調合物に添加する。解凍後の生存能力および長期的な機能を、INPの存在下および非存在下の条件について決定する。カプセル化された氷核形成粒子は、遊離氷核剤の2〜3℃以内の氷核形成温度と効力を達成し得る。さらに、氷核剤なしの場合と比較して、カプセル化された氷核形成粒子の存在下においては、二重構成でプレーティングされた肝細胞の細胞生存能力における30%の増加が予想される。
INP含有ハイドロゲルビーズのサイズを調整できることは、様々な凍結容器全体および器官内の複雑な脈管構造ネットワーク全体にわたる氷核剤の均一な分布を促進できることから有利である。均一な氷核形成は、器官の特定の領域が過冷却されないことを確実にし、不安定な状態が突然崩壊することがないため、これは重大な意味をもつ。これを達成するために、様々なマイクロチャネルサイズを有する装置が提供されている。各マイクロチャネルは、生理学的に関連する大きさの脈管構造空間を反映している。さらに、マイクロ流体モデルは、研究者がINP分布を評価し、氷の伝播が脈管構造空間に限定されることを確実にすることを可能にするために、実質成分も組み込んでいる。
INP含有ハイドロゲルビーズが器官全体に灌流して脈管構造内にもっぱら留まる能力を試験する。器官全体にINP含有ハイドロゲルビーズを分配できる灌流システムを使用する。初期の実験はラットの全肝から始まる。ヒトの肝臓には、分割肝モデルが使用され得る(図13A〜13B)。図13Aでは、右および左の門脈を分岐部のちょうど上で分離し、分割した。移植片を、肝臓の中心面で切断し、肝臓を解剖学的右葉および左葉に分けた。小さな貫通血管と胆管枝は、必要に応じて、縫合結紮するか、またはクリップ留めした。セグメント5および8へのMHV分枝を分割し、右葉の妨害されないドレナージを確実にするために結んだままにした。左門脈、左肝動脈および左胆管を分割し、カニューレ挿入した。大静脈は、右葉移植片と共に保存し、これは、右葉移植片の最大のアウトフローを可能にした。右側の肺門構造にもカニューレ挿入した。各肝葉を秤量し、灌流装置に接続する前に1Lの乳酸リンゲル液で洗い流した。図13Bでは、さらなる生化学的分析のために、灌流液試料を30分ごとに回収した。両方の肝葉は、門脈および肝動脈抵抗によって示されるように、安定した血行動態を有し、それらは互いに匹敵していた(全ての比較についてp>0.1)。肝組織生検を回収し、ATP測定のために1時間ごとに瞬間凍結した。各肝葉における平均総肝臓ATP濃度は、互いに匹敵していた。PV(門脈)、HA(肝動脈)、BD(胆管)。
本発明をその詳細な説明と併せて説明してきたが、前述の説明は、例示を意図したものであり、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を限定しないと理解されるべきものである。他の態様、利点、および改変は以下の特許請求の範囲内にある。
Claims (64)
- 氷核形成剤を含むハイドロゲル粒子であって、前記氷核形成剤は前記ハイドロゲル粒子の内部に封入されているハイドロゲル粒子。
- 前記氷核形成剤はSNOMAXである、請求項1に記載のハイドロゲル粒子。
- 前記氷核形成剤はヨウ化銀である、請求項1に記載のハイドロゲル粒子。
- 前記氷核形成剤はタンパク質、炭水化物、またはリン脂質である、請求項1に記載のハイドロゲル粒子。
- 前記ハイドロゲル粒子中の前記氷核形成剤の濃度は0.5mg/ml、1mg/ml、または2mg/mlを超える、請求項1に記載のハイドロゲル粒子。
- アガロースハイドロゲル粒子である、請求項1に記載のハイドロゲル粒子。
- アルギネートハイドロゲル粒子である、請求項1に記載のハイドロゲル粒子。
- 4mm未満の直径を有する、請求項1に記載のハイドロゲル粒子。
- 3mm未満の直径を有する、請求項1に記載のハイドロゲル粒子。
- 2mm未満の直径を有する、請求項1に記載のハイドロゲル粒子。
- 15μl未満の体積を有する、請求項1に記載のハイドロゲル粒子。
- 5μl未満の体積を有する、請求項1に記載のハイドロゲル粒子。
- 重水をさらに含む、請求項1に記載のハイドロゲル粒子。
- D2Oをさらに含む、請求項1に記載のハイドロゲル粒子。
- 凍結保護物質をさらに含む、請求項1に記載のハイドロゲル粒子。
- 前記凍結保護物質はDMSO、EG、PROH、3−OMG、またはグリセロールである、請求項15に記載のハイドロゲル粒子。
- 前記ハイドロゲル粒子は、試料の氷核形成温度を−8℃より高い温度に上昇させることができる、請求項1に記載のハイドロゲル粒子。
- 前記ハイドロゲル粒子は、試料の氷核形成温度を−5℃より高い温度に上昇させることができる、請求項1に記載のハイドロゲル粒子。
- 前記ハイドロゲル粒子は、複数の試料の氷核形成温度の範囲を縮小する、請求項1に記載のハイドロゲル粒子。
- ハイドロゲル粒子および氷核形成剤を含む組成物であって、前記氷核形成剤は前記ハイドロゲル粒子の内部に封入されている、組成物。
- 前記氷核形成剤はSNOMAXである、請求項20に記載の組成物。
- 前記氷核形成剤はヨウ化銀である、請求項20に記載の組成物。
- 前記氷核形成剤はタンパク質、炭水化物、またはリン脂質である、請求項20に記載の組成物。
- 前記ハイドロゲル粒子中の前記氷核形成剤の濃度は0.5mg/ml、1mg/ml、または2mg/mlを超える、請求項20に記載の組成物。
- 前記ハイドロゲル粒子はアガロースハイドロゲル粒子である、請求項20に記載の組成物。
- 前記ハイドロゲル粒子はアルギネートハイドロゲル粒子である、請求項20に記載の組成物。
- 前記ハイドロゲル粒子は4mm未満の直径を有する、請求項20に記載の組成物。
- 前記ハイドロゲル粒子は3mm未満の直径を有する、請求項20に記載の組成物。
- 前記ハイドロゲル粒子は2mm未満の直径を有する、請求項20に記載の組成物。
- 前記ハイドロゲル粒子は15μl未満の体積を有する、請求項20に記載の組成物。
- 前記ハイドロゲル粒子は5μl未満の体積を有する、請求項20に記載の組成物。
- 凍結保護物質をさらに含む、請求項20に記載の組成物。
- 前記凍結保護物質はDMSO、EG、PROH、3−OMG、またはグリセロールである、請求項32に記載の組成物。
- 重水をさらに含む、請求項20に記載の組成物。
- D2Oをさらに含む、請求項20に記載の組成物。
- 保存剤をさらに含む、請求項20に記載の組成物。
- 重水および氷核形成剤を含む組成物。
- 前記重水はD2Oである、請求項37に記載の組成物。
- 前記組成物中の重水の重量百分率は10%、50%、または75%を超える、請求項37に記載の組成物。
- 水分中の重水の百分率(v/v)は10%、50%、または75%を超える、請求項37に記載の組成物。
- 前記氷核形成剤はSNOMAX、氷核細菌、ヨウ化銀、鉱物粒子、またはナノ粒子である、請求項37に記載の組成物。
- 前記氷核形成剤はタンパク質、炭水化物、またはリン脂質である、請求項37に記載の組成物。
- 凍結保護物質をさらに含む、請求項37に記載の組成物。
- 前記凍結保護物質はDMSO、EG、PROH、3−OMG、またはグリセロールである、請求項43に記載の組成物。
- 前記凍結保護物質は非浸透性凍結保護物質である、請求項43記載の組成物。
- 前記凍結保護物質はスクロース、トレハロース、スタキオース、ラフィノース、またはポリマー(例えば、PEG、PVA、HES)である、請求項43記載の組成物。
- 保存剤をさらに含む、請求項37に記載の組成物。
- 生物学的試料を保存する方法であって、
前記生物学的試料を請求項20〜47のいずれかに記載の組成物と接触させる工程;および
前記生物学的試料を前記組成物と共に凍結させる工程
を含む方法。 - 前記生物学的試料を解凍する工程をさらに含む、請求項48に記載の方法。
- 前記生物学的試料は細胞を含む、請求項48に記載の方法。
- 前記生物学的試料は組織試料を含む、請求項48に記載の方法。
- 前記生物学的試料はエキソソームまたは微小胞を含む、請求項48に記載の方法。
- 器官を保存する方法であって、
前記器官に請求項20〜47のいずれかに記載の組成物を灌流または接触させる工程;および
前記器官を前記組成物の存在下で凍結する工程
を含む方法。 - 前記器官を解凍する工程をさらに含む、請求項53に記載の方法。
- 前記器官は肝臓、心臓、または腎臓である、請求項53に記載の方法。
- 虚血再灌流障害を最小限に抑える、請求項53に記載の方法。
- 表面および氷核形成剤を含む凍結システムであって、前記氷核形成剤は前記表面上に固定化されている、凍結システム。
- 前記凍結システムは、バッグ、プラスチックバイアル、ガラスバイアル、プラスチックストロー、プルドストロー、毛細管もしくはストロー、またはバイオリアクターを含む、請求項57に記載の凍結システム。
- 表面および請求項1〜19のいずれかに記載のハイドロゲル粒子を含む凍結システムであって、前記ハイドロゲル粒子は前記表面上に固定化されている、凍結システム。
- 前記凍結システムは、バッグ、プラスチックバイアル、ガラスバイアル、プラスチックストロー、プルドストロー、毛細管もしくはストロー、またはバイオリアクターを含む、請求項59に記載の凍結システム。
- 請求項1〜19のいずれかに記載のハイドロゲル粒子または請求項20〜47のいずれかに記載の組成物を含む凍結システム。
- 前記凍結システムは、バッグ、プラスチックバイアル、ガラスバイアル、プラスチックストロー、プルドストロー、毛細管もしくはストロー、またはバイオリアクターを含む、請求項61に記載の凍結システム。
- 所望の氷核形成温度を有するハイドロゲル粒子組成物を製造する方法であって、
(5).所望の氷核形成温度を選択する工程;
(6).所定の曲線から、ハイドロゲル粒子組成物中の氷核形成剤の標的総質量を決定する工程であって、前記所定の曲線が、氷核形成温度と、複数の試料ハイドロゲル粒子組成物についての氷核形成剤の総質量とを相関させる、工程;
(7).前記標的総質量に基づき、前記ハイドロゲル粒子組成物のN、Vおよびclocalの値を決定する工程;ならびに
(8).決定された前記N、前記Vおよび前記clocalの値を有するハイドロゲル粒子組成物を製造する工程
を含む方法。 - 所望の氷核形成温度を有する、氷核形成剤を含む重水組成物を製造する方法であって、
(4).所望の氷核形成温度を選択する工程;
(5).所定の曲線から、重水濃度を決定する工程であって、前記所定の曲線が、氷核形成温度と、各々が前記氷核形成剤を含む複数の試料重水組成物についての重水濃度とを相関させる、工程;
(6).決定された前記重水濃度を有し、前記氷核形成剤を含む重水組成物を製造する工程
を含む方法。
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