JP2001139599A - 凍結保護物質とその利用 - Google Patents
凍結保護物質とその利用Info
- Publication number
- JP2001139599A JP2001139599A JP2000059444A JP2000059444A JP2001139599A JP 2001139599 A JP2001139599 A JP 2001139599A JP 2000059444 A JP2000059444 A JP 2000059444A JP 2000059444 A JP2000059444 A JP 2000059444A JP 2001139599 A JP2001139599 A JP 2001139599A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cryoprotectant
- protein
- microorganism
- stabilizing
- genus
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 比較的低濃度の添加量で代謝系酵素などのタ
ンパク質の凍結変性を防止することのできる、微生物由
来の凍結保護物質と、この物質の製造方法並びにこの物
質の利用発明を提供する。 【解決手段】 Erwinia（=Pantoea）属またはXanthomon
as属に属する微生物が産生する凍結保護物質、前記微生
物を30℃以下の温度で培養することにより凍結保護物質
の発現を誘導させ、その培養物中から凍結保護物質を取
得することを特徴とする凍結保護物質の製造方法、並び
に、この凍結保護物資を用いたタンパク質および生物材
料の安定化／保存方法。
ンパク質の凍結変性を防止することのできる、微生物由
来の凍結保護物質と、この物質の製造方法並びにこの物
質の利用発明を提供する。 【解決手段】 Erwinia（=Pantoea）属またはXanthomon
as属に属する微生物が産生する凍結保護物質、前記微生
物を30℃以下の温度で培養することにより凍結保護物質
の発現を誘導させ、その培養物中から凍結保護物質を取
得することを特徴とする凍結保護物質の製造方法、並び
に、この凍結保護物資を用いたタンパク質および生物材
料の安定化／保存方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】この出願の発明は、代謝系酵
素などのタンパク質の凍結変性を防止することができる
凍結保護物質とその利用発明に関するものである。
素などのタンパク質の凍結変性を防止することができる
凍結保護物質とその利用発明に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】タンパク質や細胞、微生物、あるいは動
物臓器等を長期間にわたって保存するためには、これら
を凍結する手段が採られている。しかしながら、一般
に、タンパク質を凍結させるとその高次構造が変化する
こと（以下、この変化を「凍結変性」と記載する）が知
られており、凍結変性が起こるとそのタンパク質は失活
し、融解後に本来の機能を回復できない。
物臓器等を長期間にわたって保存するためには、これら
を凍結する手段が採られている。しかしながら、一般
に、タンパク質を凍結させるとその高次構造が変化する
こと（以下、この変化を「凍結変性」と記載する）が知
られており、凍結変性が起こるとそのタンパク質は失活
し、融解後に本来の機能を回復できない。
【０００３】従来、このようなタンパク質の凍結変性を
防止する方策としては、グルコース、ショ糖、トレハロ
ース、ソルビトールなどの糖類や、グリセリンや、アル
ブミンなどを添加することが知られており、これらを添
加することにより、凍結時にタンパク質の凍結変性を防
止し、融解後にそのタンパク質の本来の機能を回復させ
ることができる。このため、これらの物質の溶液は、例
えば、血液、臓器、酵素などの保存液として用いられて
いる。
防止する方策としては、グルコース、ショ糖、トレハロ
ース、ソルビトールなどの糖類や、グリセリンや、アル
ブミンなどを添加することが知られており、これらを添
加することにより、凍結時にタンパク質の凍結変性を防
止し、融解後にそのタンパク質の本来の機能を回復させ
ることができる。このため、これらの物質の溶液は、例
えば、血液、臓器、酵素などの保存液として用いられて
いる。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、糖類、
グリセリン、アルブミンなどの添加によって凍結変性防
止効果を得るためには、これらの物質を非常に高い濃度
で添加しなければならない。例えば、糖類の場合には、
濃度10〜30％となる程度に添加する必要がある。そし
て、糖類などを高濃度で添加した溶液は、タンパク質の
代謝機能を維持させることが困難であるため、保護した
タンパク質を好適に使用するためには、融解させた後に
その糖類を透析などをして取り除かなければならないと
いう欠点がある。
グリセリン、アルブミンなどの添加によって凍結変性防
止効果を得るためには、これらの物質を非常に高い濃度
で添加しなければならない。例えば、糖類の場合には、
濃度10〜30％となる程度に添加する必要がある。そし
て、糖類などを高濃度で添加した溶液は、タンパク質の
代謝機能を維持させることが困難であるため、保護した
タンパク質を好適に使用するためには、融解させた後に
その糖類を透析などをして取り除かなければならないと
いう欠点がある。
【０００５】また、凍結変性を防止する物質としてジメ
チルスルホキシドも用いられているが、ジメチルスルホ
キシドはタンパク質や細胞の代謝に対して毒性を有する
ことが知られており、好ましくはない。
チルスルホキシドも用いられているが、ジメチルスルホ
キシドはタンパク質や細胞の代謝に対して毒性を有する
ことが知られており、好ましくはない。
【０００６】この出願の発明は、以上のとおりの事情に
鑑みてなされたものであって、従来の凍結保護物質に代
わるものとして、比較的低濃度で使用することができ、
代謝系酵素などのタンパク質の凍結変性を簡便かつ確実
に防止することができる凍結保護物質を提供することを
課題としている。
鑑みてなされたものであって、従来の凍結保護物質に代
わるものとして、比較的低濃度で使用することができ、
代謝系酵素などのタンパク質の凍結変性を簡便かつ確実
に防止することができる凍結保護物質を提供することを
課題としている。
【０００７】また、この出願の発明は、この凍結保護物
質の製造方法ならびにこの凍結保護物質を利用した各種
の発明を提供することを課題としている。
質の製造方法ならびにこの凍結保護物質を利用した各種
の発明を提供することを課題としている。
【０００８】
【課題を解決するための手段】この出願は、前記の課題
を解決するものとして、以下の(1)〜(9)の発明を提供す
る。 (1) Erwinia（=Pantoea）属またはXanthomonas属に属
する微生物が産生する凍結保護物質。 (2) Pseudomonas syringaeまたはPseudomonas viridif
lavaが産生する凍結保護物質。 (3) Erwinia（=Pantoea）属またはXanthomonas属に属
する微生物、もしくはPseudomonas syringaeまたはPseu
domonas viridiflavaを30℃以下の温度で培養すること
により凍結保護物質の発現を誘導させ、その培養物中か
ら凍結保護物質を取得することを特徴とする凍結保護物
質の製造方法。 (4) 前記発明(1)または(2)の凍結保護物質と他のタン
パク質とを共存させることを特徴とするタンパク質の安
定化／保存方法。 (5) 安定化が、他のタンパク質の凍結に対する安定性
向上を目的とするものである前記発明(4)のタンパク質
の安定化／保存方法。 (6) 他のタンパク質が、触媒活性を有する酵素である
前記発明(4)または(5)のタンパク質の安定化／保存方
法。 (7) 前記発明(1)または(2)の凍結保護物質を共存させ
た酵素試薬または酵素含有診断薬およびそれらを含むキ
ット。 (8) 前記発明(1)または(2)の凍結保護物質と細胞、臓
器または微生物とを共存させることを特徴とする生物材
料の安定化／保存方法。 (9) 前記発明(1)または(2)の凍結保護物質と共存した
状態で保存されている細胞、臓器または微生物。
を解決するものとして、以下の(1)〜(9)の発明を提供す
る。 (1) Erwinia（=Pantoea）属またはXanthomonas属に属
する微生物が産生する凍結保護物質。 (2) Pseudomonas syringaeまたはPseudomonas viridif
lavaが産生する凍結保護物質。 (3) Erwinia（=Pantoea）属またはXanthomonas属に属
する微生物、もしくはPseudomonas syringaeまたはPseu
domonas viridiflavaを30℃以下の温度で培養すること
により凍結保護物質の発現を誘導させ、その培養物中か
ら凍結保護物質を取得することを特徴とする凍結保護物
質の製造方法。 (4) 前記発明(1)または(2)の凍結保護物質と他のタン
パク質とを共存させることを特徴とするタンパク質の安
定化／保存方法。 (5) 安定化が、他のタンパク質の凍結に対する安定性
向上を目的とするものである前記発明(4)のタンパク質
の安定化／保存方法。 (6) 他のタンパク質が、触媒活性を有する酵素である
前記発明(4)または(5)のタンパク質の安定化／保存方
法。 (7) 前記発明(1)または(2)の凍結保護物質を共存させ
た酵素試薬または酵素含有診断薬およびそれらを含むキ
ット。 (8) 前記発明(1)または(2)の凍結保護物質と細胞、臓
器または微生物とを共存させることを特徴とする生物材
料の安定化／保存方法。 (9) 前記発明(1)または(2)の凍結保護物質と共存した
状態で保存されている細胞、臓器または微生物。
【０００９】以下、これらの発明について、発明の実施
形態を詳しく説明する。
形態を詳しく説明する。
【００１０】
【発明の実施の形態】発明(1)の凍結保護物質は、18℃
以下の低温で生育可能な微生物、または凍結耐性を有す
る微生物、もしくは18℃以下の低温で生育可能であり、
かつ凍結耐性を有する微生物が低温ストレス下において
産生する物質（タンパク質分子）である。これらの微生
物は、低温環境下の土壌または水中から単離された微生
物であり、具体的には、Erwinia（=Pantoea）属またはX
anthomonas属に属する微生物である。
以下の低温で生育可能な微生物、または凍結耐性を有す
る微生物、もしくは18℃以下の低温で生育可能であり、
かつ凍結耐性を有する微生物が低温ストレス下において
産生する物質（タンパク質分子）である。これらの微生
物は、低温環境下の土壌または水中から単離された微生
物であり、具体的には、Erwinia（=Pantoea）属またはX
anthomonas属に属する微生物である。
【００１１】Erwinia属に属する微生物としてはErwinia
herbicola（新菌株名 Pantoea agglomeransとも言う)
やPantoea ananasを例示することができる。これらの微
生物は氷核細菌であって、財団法人発酵研究所に保存さ
れており、そのカタログから容易に入手できる（例え
ば、Erwinia herbicola IFO12686等）。
herbicola（新菌株名 Pantoea agglomeransとも言う)
やPantoea ananasを例示することができる。これらの微
生物は氷核細菌であって、財団法人発酵研究所に保存さ
れており、そのカタログから容易に入手できる（例え
ば、Erwinia herbicola IFO12686等）。
【００１２】Xanthomonas属に属する微生物としてはXan
thomonas campestrisを例示することができる。このXan
thomonas campestrisもまた氷核細菌であって、財団法
人発酵研究所に保存されており、そのカタログから容易
に入手できる（例えば、Xanthomonas campestris IFO13
559等）。
thomonas campestrisを例示することができる。このXan
thomonas campestrisもまた氷核細菌であって、財団法
人発酵研究所に保存されており、そのカタログから容易
に入手できる（例えば、Xanthomonas campestris IFO13
559等）。
【００１３】発明(2)の凍結保護物質は、氷核細菌Pseud
omonas syringaeまたはPseudomonasviridiflavaが産生
するタンパク質である。Pseudomonas syringaeおよびPs
eudomonas viridiflavaは財団法人発酵研究所に保存さ
れており、そのカタログから容易に入手できる（例え
ば、Pseudomonas syringae IFO3310等）。
omonas syringaeまたはPseudomonasviridiflavaが産生
するタンパク質である。Pseudomonas syringaeおよびPs
eudomonas viridiflavaは財団法人発酵研究所に保存さ
れており、そのカタログから容易に入手できる（例え
ば、Pseudomonas syringae IFO3310等）。
【００１４】なお、以上のとおり、この発明に係る凍結
保護物質は氷核細菌が産生する物質であり、今後に分離
される新規の氷核細菌からも同様の凍結保護物質が単離
されることが期待される。
保護物質は氷核細菌が産生する物質であり、今後に分離
される新規の氷核細菌からも同様の凍結保護物質が単離
されることが期待される。
【００１５】発明(1)および(2)の凍結保護物質は、前記
のとおりの微生物が菌体内に産生するタンパク質であっ
て（Pantoea agglomerans由来のものは分子量約29,000D
a）、少量で各種タンパク質、特に、乳酸デヒドロゲナ
ーゼ、エノラーゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、ア
ルコールデヒドロゲナーゼ、マレイン酸デヒドロゲナー
ゼ、ムタロターゼなどの代謝系酵素の凍結変性を防止す
る効果を有する。
のとおりの微生物が菌体内に産生するタンパク質であっ
て（Pantoea agglomerans由来のものは分子量約29,000D
a）、少量で各種タンパク質、特に、乳酸デヒドロゲナ
ーゼ、エノラーゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、ア
ルコールデヒドロゲナーゼ、マレイン酸デヒドロゲナー
ゼ、ムタロターゼなどの代謝系酵素の凍結変性を防止す
る効果を有する。
【００１６】なお、この出願の発明者らは、氷核活性物
質の製法（特開平２−７６５９５号公報）を既に出願し
ているが、この氷核活性物質は氷結晶となる物質であ
り、菌体外に分泌されるものであって、この発明(1)の
凍結保護物質とは全く異なるものである。
質の製法（特開平２−７６５９５号公報）を既に出願し
ているが、この氷核活性物質は氷結晶となる物質であ
り、菌体外に分泌されるものであって、この発明(1)の
凍結保護物質とは全く異なるものである。
【００１７】発明(1)および(2)の凍結保護物質は、発明
(3)の方法により製造することができる。すなわち、発
明(3)の製造方法は、前記の微生物を30℃以下の低温で
培養することにより凍結保護物質の発現を誘導させ、そ
の培養物中から凍結保護物質を取得することを特徴とす
る。
(3)の方法により製造することができる。すなわち、発
明(3)の製造方法は、前記の微生物を30℃以下の低温で
培養することにより凍結保護物質の発現を誘導させ、そ
の培養物中から凍結保護物質を取得することを特徴とす
る。
【００１８】微生物を培養するための培地は公知のもの
を適宜選択すれば良く、例えば、酵母エキス、肉エキ
ス、麦芽エキス、ペプトン、大豆粉末、トウモロコシ粉
末、カゼイン、セリン、アラニン、グリシン、ロイシ
ン、リジン、スレオニン、チロシン、グルタミン酸など
が窒素源として用いられ、これに、ビタミンＢ1、ビタ
ミンＢ2、葉酸、ニコチン酸、パントテン酸、ビオチン
などのビタミン成分や、ショ糖、硫酸マグネシウム、硫
酸カリウム、塩化カリウム、硫酸アンモニウム、リン酸
一水素カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸二水素
アンモニウム、クエン酸、クエン酸ナトリウム、グルコ
ース、フルクトース、マルトース、澱粉などを適宜選択
して調製することができる。これらの中でも、酵母エキ
ス、アラニン、セリンを窒素源として含有し、硫酸カリ
ウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム７水和物を無機
塩類として含有し、ショ糖を炭素源として含有する培地
が好ましい。
を適宜選択すれば良く、例えば、酵母エキス、肉エキ
ス、麦芽エキス、ペプトン、大豆粉末、トウモロコシ粉
末、カゼイン、セリン、アラニン、グリシン、ロイシ
ン、リジン、スレオニン、チロシン、グルタミン酸など
が窒素源として用いられ、これに、ビタミンＢ1、ビタ
ミンＢ2、葉酸、ニコチン酸、パントテン酸、ビオチン
などのビタミン成分や、ショ糖、硫酸マグネシウム、硫
酸カリウム、塩化カリウム、硫酸アンモニウム、リン酸
一水素カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸二水素
アンモニウム、クエン酸、クエン酸ナトリウム、グルコ
ース、フルクトース、マルトース、澱粉などを適宜選択
して調製することができる。これらの中でも、酵母エキ
ス、アラニン、セリンを窒素源として含有し、硫酸カリ
ウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム７水和物を無機
塩類として含有し、ショ糖を炭素源として含有する培地
が好ましい。
【００１９】また、培地のｐＨは通常６〜８程度に調整
することが好ましい。ｐＨ値がこの範囲から大きく外れ
ると、微生物の生育が低下すると共に凍結保護物質の凍
結保護活性も低下する。
することが好ましい。ｐＨ値がこの範囲から大きく外れ
ると、微生物の生育が低下すると共に凍結保護物質の凍
結保護活性も低下する。
【００２０】微生物を培養する条件は、例えば、通常、
20℃〜40℃、好ましくは25℃〜35℃で、８時間〜24時
間、好ましくは12時間程度培養した後、低温ショックを
かけた状態で低温培養する。低温培養は、温度条件とし
て０℃〜30℃、好ましくは５℃〜18℃、さらに好ましく
は10℃〜15℃、培養時間として10時間〜96時間、好まし
くは24〜72時間の範囲で行うことができる。
20℃〜40℃、好ましくは25℃〜35℃で、８時間〜24時
間、好ましくは12時間程度培養した後、低温ショックを
かけた状態で低温培養する。低温培養は、温度条件とし
て０℃〜30℃、好ましくは５℃〜18℃、さらに好ましく
は10℃〜15℃、培養時間として10時間〜96時間、好まし
くは24〜72時間の範囲で行うことができる。
【００２１】より好ましい培養条件は、約30℃、12時間
程度で培養した後、菌体を15分以内のうちに約12℃まで
急冷し、約12℃下で48時間程度で低温培養する。この条
件によって最も効率よく、かつ保護活性の高い凍結保護
物質が生産される。
程度で培養した後、菌体を15分以内のうちに約12℃まで
急冷し、約12℃下で48時間程度で低温培養する。この条
件によって最も効率よく、かつ保護活性の高い凍結保護
物質が生産される。
【００２２】この発明(1)の凍結保護物質は、上記条件
で培養した後、公知の分離操作を組み合わせることによ
って菌体内から単離精製することができる。例えば、尿
素などの変性剤や界面活性剤による処理、超音波処理、
酵素消化、塩析や溶媒沈殿法、透析、遠心分離、限外濾
過、ゲル濾過、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動、イ
オン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィ
ー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマト
グラフィーなどが挙げられる。
で培養した後、公知の分離操作を組み合わせることによ
って菌体内から単離精製することができる。例えば、尿
素などの変性剤や界面活性剤による処理、超音波処理、
酵素消化、塩析や溶媒沈殿法、透析、遠心分離、限外濾
過、ゲル濾過、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動、イ
オン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィ
ー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマト
グラフィーなどが挙げられる。
【００２３】例えば、具体的には、低温培養後の菌体を
超音波処理やダイノミル等で破砕し、遠心分離によって
不溶物を取り除き、その上清を飽和度40〜90％、好まし
くは飽和度40〜80％、より好ましくは飽和度60〜80％の
硫酸アンモニウムによって塩析することにより、目的と
する凍結保護物質が含まれた画分が沈殿する。
超音波処理やダイノミル等で破砕し、遠心分離によって
不溶物を取り除き、その上清を飽和度40〜90％、好まし
くは飽和度40〜80％、より好ましくは飽和度60〜80％の
硫酸アンモニウムによって塩析することにより、目的と
する凍結保護物質が含まれた画分が沈殿する。
【００２４】上記塩析によって得られた画分を凍結保護
物質として用いてもよいが、さらに必要に応じて、この
画分を各種のクロマトグラフィー処理で精製してもよ
い。例えば、第４級アンモニウム基を有する陰イオン交
換クロマトグラフィーに、所定速度（例えば、流速2.0
ml／分）で目的とする凍結保護物質を含む画分を負荷
し、0.2〜0.4mol／ｌ（モル／リットル）の塩化ナトリ
ウムで溶出させることにより、部分精製された凍結保護
物質を得ることができる。
物質として用いてもよいが、さらに必要に応じて、この
画分を各種のクロマトグラフィー処理で精製してもよ
い。例えば、第４級アンモニウム基を有する陰イオン交
換クロマトグラフィーに、所定速度（例えば、流速2.0
ml／分）で目的とする凍結保護物質を含む画分を負荷
し、0.2〜0.4mol／ｌ（モル／リットル）の塩化ナトリ
ウムで溶出させることにより、部分精製された凍結保護
物質を得ることができる。
【００２５】この発明(3)の製造方法は、菌体を利用し
て製造するものであるため、大型設備、広い敷地、エネ
ルギーなどを必要とせず、工業的製造に適するものであ
る。発明(4)の方法は、前記発明(1)または(2)の凍結保
護物質と他のタンパク質とを共存させることを特徴とす
るタンパク質の安定化／保存方法である。すなわち、発
明(1)または(2)の凍結保護物質は、溶液中において対象
となるタンパク質と共存させた場合に、対象タンパク質
に付着し、溶液の凍結等によるダメージから対象タンパ
ク質を保護する働きを有している。このため、保護すべ
きタンパク質を変性させないで凍結することができ、特
に代謝系酵素の凍結変性を保護できるので、融解後にタ
ンパク質の機能を回復させることができ、しかも、少量
の添加でその効果が現れることから、融解後に凍結保護
物質を取り除かなくてもタンパク質そのまま使用するこ
とが可能となる。凍結保護物質と他のタンパク質とを共
存させる形態としては、溶液中に両者を適量混合するな
どの形態を採用することができる。また、従来知られて
いる凍結保護材（アルブミン等のタンパク質、アミノ
酸、糖類、グリセロール等）と併用することもできる。
さらに、保護対象のタンパク質と凍結保護物質とをそれ
ぞれ固体状（凍結乾燥や粉末）として混合することもで
きる。例えば、凍結保護物質を共存させた酵素試薬また
は酵素含有診断薬およびそれらを含むキット（発明
(7)）等の場合には、製造および販売・出荷時には固体
状で両者を共存させ、利用者がそれを溶解した後、再度
凍結保存するようにしてもよい。
て製造するものであるため、大型設備、広い敷地、エネ
ルギーなどを必要とせず、工業的製造に適するものであ
る。発明(4)の方法は、前記発明(1)または(2)の凍結保
護物質と他のタンパク質とを共存させることを特徴とす
るタンパク質の安定化／保存方法である。すなわち、発
明(1)または(2)の凍結保護物質は、溶液中において対象
となるタンパク質と共存させた場合に、対象タンパク質
に付着し、溶液の凍結等によるダメージから対象タンパ
ク質を保護する働きを有している。このため、保護すべ
きタンパク質を変性させないで凍結することができ、特
に代謝系酵素の凍結変性を保護できるので、融解後にタ
ンパク質の機能を回復させることができ、しかも、少量
の添加でその効果が現れることから、融解後に凍結保護
物質を取り除かなくてもタンパク質そのまま使用するこ
とが可能となる。凍結保護物質と他のタンパク質とを共
存させる形態としては、溶液中に両者を適量混合するな
どの形態を採用することができる。また、従来知られて
いる凍結保護材（アルブミン等のタンパク質、アミノ
酸、糖類、グリセロール等）と併用することもできる。
さらに、保護対象のタンパク質と凍結保護物質とをそれ
ぞれ固体状（凍結乾燥や粉末）として混合することもで
きる。例えば、凍結保護物質を共存させた酵素試薬また
は酵素含有診断薬およびそれらを含むキット（発明
(7)）等の場合には、製造および販売・出荷時には固体
状で両者を共存させ、利用者がそれを溶解した後、再度
凍結保存するようにしてもよい。
【００２６】発明(8)の方法は、発明(1)または(2)の凍
結保護物質と細胞、臓器または微生物とを共存させるこ
とを特徴とする生物材料の安定化／保存方法である。例
えば、細胞、臓器、微生物の冷凍保存溶液中に凍結保護
物質を添加する等によって、この方法を実施することが
できる。また、この凍結保護物質を乾燥させ、凍結乾燥
させた微生物と混合するようにしてもよい。そして、こ
のような方法によって、前記発明(1)または(2)の凍結保
護物質と共存した状態で保存されている細胞、臓器また
は微生物（発明(9)）が提供される。
結保護物質と細胞、臓器または微生物とを共存させるこ
とを特徴とする生物材料の安定化／保存方法である。例
えば、細胞、臓器、微生物の冷凍保存溶液中に凍結保護
物質を添加する等によって、この方法を実施することが
できる。また、この凍結保護物質を乾燥させ、凍結乾燥
させた微生物と混合するようにしてもよい。そして、こ
のような方法によって、前記発明(1)または(2)の凍結保
護物質と共存した状態で保存されている細胞、臓器また
は微生物（発明(9)）が提供される。
【００２７】なお、発明(1)および(2)の凍結保護物質
は、耐熱性を有しているため、熱処理による簡易精製が
可能であることの他に、加熱殺菌が可能であるという利
点を有している。生物材料の場合には、無菌状態である
ことや、プロテアーゼ、ＤＮＡ分解酵素等を含まないこ
が要求されるためである。
は、耐熱性を有しているため、熱処理による簡易精製が
可能であることの他に、加熱殺菌が可能であるという利
点を有している。生物材料の場合には、無菌状態である
ことや、プロテアーゼ、ＤＮＡ分解酵素等を含まないこ
が要求されるためである。
【００２８】以下、実施例を示してこの出願の発明につ
いてさらに詳細かつ具体的に説明するが、これらの発明
は以下の例によって限定されるものではない。なお、以
下の実施例において、得られた凍結保護物質の凍結保護
活性はC. Linらの方法（C.Lin and M.F.Thomashow; Bio
chemical and Biophysical Research Communications,
183, 1103-1108, 1992）に従って測定した。すなわち、
低温感受性酵素である乳酸デヒドロゲナーゼ溶液（150
μg/ml）0.02 mlと試料（1,000μg/ml）0.08 mlを混合
し、プログラムフリーザーを用いて毎分1℃の速度で温
度を下げて-20℃で24時間凍結させた後、同じ速度で融
解した。その溶液60μlに80 mMトリス-塩酸緩衝液（pH
7.5）、100 mM塩化カリウム、2 mMピルビン酸、0.3 mM
NADHからなる反応液3 mlを添加した後、分光光度計を用
いて波長340 nmにおける吸光度の1分間の減少量（ΔA）
を測定し、以下に示す計算式に基づいて、その試料の凍
結保護活性を百分率で表した。なお、試料のかわりに緩
衝液を添加したものの酵素活性を測定し、それぞれ凍結
前後のブランクとした。
いてさらに詳細かつ具体的に説明するが、これらの発明
は以下の例によって限定されるものではない。なお、以
下の実施例において、得られた凍結保護物質の凍結保護
活性はC. Linらの方法（C.Lin and M.F.Thomashow; Bio
chemical and Biophysical Research Communications,
183, 1103-1108, 1992）に従って測定した。すなわち、
低温感受性酵素である乳酸デヒドロゲナーゼ溶液（150
μg/ml）0.02 mlと試料（1,000μg/ml）0.08 mlを混合
し、プログラムフリーザーを用いて毎分1℃の速度で温
度を下げて-20℃で24時間凍結させた後、同じ速度で融
解した。その溶液60μlに80 mMトリス-塩酸緩衝液（pH
7.5）、100 mM塩化カリウム、2 mMピルビン酸、0.3 mM
NADHからなる反応液3 mlを添加した後、分光光度計を用
いて波長340 nmにおける吸光度の1分間の減少量（ΔA）
を測定し、以下に示す計算式に基づいて、その試料の凍
結保護活性を百分率で表した。なお、試料のかわりに緩
衝液を添加したものの酵素活性を測定し、それぞれ凍結
前後のブランクとした。
【００２９】
【式１】
【００３０】すなわち、活性100％とは、凍結後の乳酸
デヒドロゲナーゼ活性が凍結前の活性に保たれている状
態であり、逆に活性0％とは、凍結後の活性が、凍結後
のブランクの活性と同じ状態まで低下した状態を表す。
デヒドロゲナーゼ活性が凍結前の活性に保たれている状
態であり、逆に活性0％とは、凍結後の活性が、凍結後
のブランクの活性と同じ状態まで低下した状態を表す。
【００３１】
【実施例】実施例１：菌体の培養 50ml三角フラスコ中に市販のTrypticasa Soy Broth（TS
B培地、pH7.0、BectonDickinson and Company製）を10
ml入れ121℃で20分間殺菌して冷却した後、そこに菌株
としてPantoea agglomeransを一白金耳分植菌し、18
℃、24時間振とう培養し前培養液とした。次いで、500
ml三角フラスコ中に、市販の酵母エキス30g、ＤＬ-セリ
ン2 g、ＤＬ-アラニン2 g、硫酸カリウム8.6 g、塩化カ
リウム1.4g、硫酸マグネシウム7水和物1.4 g、ショ糖10
gを1000 mlの蒸留水に溶解させた培地を100 ml入れ、1
21℃で20分間殺菌して冷却した後、これに前培養液を1
ml（1.0×108細胞）植菌し、30℃、12時間培養した。そ
の後、低温培養として、12℃に冷却し、さらに48時間培
養した。培養終了後、この培養液を超音波破砕器（19.9
KHz）で破砕し、さらに遠心分離機にて50,000rpmで遠
心分離して膜成分などを除去した。この上澄み液にスト
レプトマイシン硫酸塩を添加して核酸成分を沈澱させ、
遠心分離で除去した。さらに、この上澄み液を10 mMリ
ン酸カリウム緩衝液（pH7.0）で透析し、遠心分離に付
し、その上澄み液を取り出して無細胞抽出液を得た。 実施例２：凍結保護物質の精製 １． 硫酸アンモニウム60〜80％処理 実施例１で得られた無細胞抽出液に、硫酸アンモニウム
を60％飽和になるように添加し、析出した沈殿物を遠心
分離により除き、得られた上清に再度硫酸アンモニウム
を80％飽和になるように添加し、遠心分離により沈殿物
を得た。 ２． スーパーQトヨパールによる精製 沈殿物を、第4級アンモニウム基を有する陰イオン交換
クロマトグラフィー （カラム：2.6 cm×20 cm）にか
け、10 mMリン酸カリウム緩衝液（pH7.0）とNaClによ
り、1 Ｍ NaClの濃度勾配溶出法で溶出させて得られた
活性画分を集めた。 ３． ヒドロキシアパタイトによる精製 活性画分を吸着クロマトグラフィー（カラム：1.6 cm×
20 cm）にかけ、10 mMリン酸カリウム緩衝液（pH7.0）
から500 mMリン酸カリウム緩衝液（pH7.0）への濃度勾
配溶出法で溶出させて得られた活性画分を集めた。 ４． スーパーロース12による精製 活性画分をゲルろ過クロマトグラフィー（カラム：1.6
cm×60 cm）にかけ、0.15 M NaClを含む10 mMリン酸カ
リウム緩衝液（pH7.0）で溶出させて得られた活性画分
を集めた。 ５． フェニルトヨパール による精製 最後に、活性画分を疎水性クロマトグラフィー（カラ
ム：0.32 cm×5 cm）にかけ、10 mMリン酸カリウム緩衝
液（pH7.0）と硫酸アンモニウムにより、55％硫酸アン
モニウムの濃度勾配溶出法で溶出させて得られた活性画
分を分取して精製凍結保護物質を得た。
B培地、pH7.0、BectonDickinson and Company製）を10
ml入れ121℃で20分間殺菌して冷却した後、そこに菌株
としてPantoea agglomeransを一白金耳分植菌し、18
℃、24時間振とう培養し前培養液とした。次いで、500
ml三角フラスコ中に、市販の酵母エキス30g、ＤＬ-セリ
ン2 g、ＤＬ-アラニン2 g、硫酸カリウム8.6 g、塩化カ
リウム1.4g、硫酸マグネシウム7水和物1.4 g、ショ糖10
gを1000 mlの蒸留水に溶解させた培地を100 ml入れ、1
21℃で20分間殺菌して冷却した後、これに前培養液を1
ml（1.0×108細胞）植菌し、30℃、12時間培養した。そ
の後、低温培養として、12℃に冷却し、さらに48時間培
養した。培養終了後、この培養液を超音波破砕器（19.9
KHz）で破砕し、さらに遠心分離機にて50,000rpmで遠
心分離して膜成分などを除去した。この上澄み液にスト
レプトマイシン硫酸塩を添加して核酸成分を沈澱させ、
遠心分離で除去した。さらに、この上澄み液を10 mMリ
ン酸カリウム緩衝液（pH7.0）で透析し、遠心分離に付
し、その上澄み液を取り出して無細胞抽出液を得た。 実施例２：凍結保護物質の精製 １． 硫酸アンモニウム60〜80％処理 実施例１で得られた無細胞抽出液に、硫酸アンモニウム
を60％飽和になるように添加し、析出した沈殿物を遠心
分離により除き、得られた上清に再度硫酸アンモニウム
を80％飽和になるように添加し、遠心分離により沈殿物
を得た。 ２． スーパーQトヨパールによる精製 沈殿物を、第4級アンモニウム基を有する陰イオン交換
クロマトグラフィー （カラム：2.6 cm×20 cm）にか
け、10 mMリン酸カリウム緩衝液（pH7.0）とNaClによ
り、1 Ｍ NaClの濃度勾配溶出法で溶出させて得られた
活性画分を集めた。 ３． ヒドロキシアパタイトによる精製 活性画分を吸着クロマトグラフィー（カラム：1.6 cm×
20 cm）にかけ、10 mMリン酸カリウム緩衝液（pH7.0）
から500 mMリン酸カリウム緩衝液（pH7.0）への濃度勾
配溶出法で溶出させて得られた活性画分を集めた。 ４． スーパーロース12による精製 活性画分をゲルろ過クロマトグラフィー（カラム：1.6
cm×60 cm）にかけ、0.15 M NaClを含む10 mMリン酸カ
リウム緩衝液（pH7.0）で溶出させて得られた活性画分
を集めた。 ５． フェニルトヨパール による精製 最後に、活性画分を疎水性クロマトグラフィー（カラ
ム：0.32 cm×5 cm）にかけ、10 mMリン酸カリウム緩衝
液（pH7.0）と硫酸アンモニウムにより、55％硫酸アン
モニウムの濃度勾配溶出法で溶出させて得られた活性画
分を分取して精製凍結保護物質を得た。
【００３２】なお、実施例１とこの実施例２に準じた方
法でその他低温微生物の凍結保護物質を調製し、30℃で
培養した場合と、さらに低温培養した場合の凍結保護活
性を前記C. Linらの方法で測定した。結果は表１に示し
たとおりである。この表１から明らかなように、30℃で
培養した後、さらに低温培養（12℃）することによっ
て、凍結保護活性が高まることが確認された。
法でその他低温微生物の凍結保護物質を調製し、30℃で
培養した場合と、さらに低温培養した場合の凍結保護活
性を前記C. Linらの方法で測定した。結果は表１に示し
たとおりである。この表１から明らかなように、30℃で
培養した後、さらに低温培養（12℃）することによっ
て、凍結保護活性が高まることが確認された。
【００３３】また、実施例２に示す１〜５のステップに
おける試料の総タンパク質量、凍結保護活性は、表２に
示したとおりであった。
おける試料の総タンパク質量、凍結保護活性は、表２に
示したとおりであった。
【００３４】
【表１】
【００３５】
【表２】
【００３６】実施例３：凍結保護物質の分子量測定 実施例２で精製した凍結保護物質をスーパーロース12を
担体に用いたゲルろ過クロマトグラフィーにかけ、検量
線から分子量を求めた。結果は図１-Aに示したとおりで
あり、得られた凍結保護物質の分子量は約29,000Daであ
った。また、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結
果（図１-B）から推定される分子量も約29,000Daであっ
たことから、この凍結保護物質は、分子量29,000Daの単
量体であることが確認された。 実施例４：他の凍結保護材との保護活性の比較 実施例２で精製した凍結保護物質を各濃度（0.001、0.0
1、0.1、1、10、100、1000 μg/ml）に調製し、C.Linら
の凍結保護活性の測定方法に準じて酵素の残存活性を測
定した。なお、他の凍結保護材と比較するため、牛血清
アルブミン（BSA）およびショ糖についても同様に凍結
保護効果を調べた。
担体に用いたゲルろ過クロマトグラフィーにかけ、検量
線から分子量を求めた。結果は図１-Aに示したとおりで
あり、得られた凍結保護物質の分子量は約29,000Daであ
った。また、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結
果（図１-B）から推定される分子量も約29,000Daであっ
たことから、この凍結保護物質は、分子量29,000Daの単
量体であることが確認された。 実施例４：他の凍結保護材との保護活性の比較 実施例２で精製した凍結保護物質を各濃度（0.001、0.0
1、0.1、1、10、100、1000 μg/ml）に調製し、C.Linら
の凍結保護活性の測定方法に準じて酵素の残存活性を測
定した。なお、他の凍結保護材と比較するため、牛血清
アルブミン（BSA）およびショ糖についても同様に凍結
保護効果を調べた。
【００３７】結果は図２に示したとおりである。この図
２から明らかなように、凍結保護活性を持つことで知ら
れるBSAで、0.1μg/ml、スクロースで10μg/mlで、活性
が消失するのに対して、この発明の凍結保護物質は0.00
1μg/mlでも凍結保護活性を維持していた。また、BSAよ
り105倍も低い濃度で100％の凍結保護活性を示したこと
から、極少量での使用が可能であることが判明した。 実施例５：酵素試薬の安定化 実施例２で精製した凍結保護物質を用いて、低温感受性
酵素として知られる乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）、ア
ルコールデヒドロゲナーゼ（ADH）、NAD+依存型イソク
エン酸デヒドロゲナーゼ（iCDH）、NADP+依存型イソク
エン酸デヒドロゲナーゼ（riCDH）の安定化を実施し
た。乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）に対する残存活性確
認は、C. Linらの測定方法に準じて行った。また、その
他の酵素の残存活性確認についても、それぞれの酵素活
性測定に適した反応液を使用し、乳酸デヒドロゲナーゼ
（LDH）の測定方法に準じて行った。
２から明らかなように、凍結保護活性を持つことで知ら
れるBSAで、0.1μg/ml、スクロースで10μg/mlで、活性
が消失するのに対して、この発明の凍結保護物質は0.00
1μg/mlでも凍結保護活性を維持していた。また、BSAよ
り105倍も低い濃度で100％の凍結保護活性を示したこと
から、極少量での使用が可能であることが判明した。 実施例５：酵素試薬の安定化 実施例２で精製した凍結保護物質を用いて、低温感受性
酵素として知られる乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）、ア
ルコールデヒドロゲナーゼ（ADH）、NAD+依存型イソク
エン酸デヒドロゲナーゼ（iCDH）、NADP+依存型イソク
エン酸デヒドロゲナーゼ（riCDH）の安定化を実施し
た。乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）に対する残存活性確
認は、C. Linらの測定方法に準じて行った。また、その
他の酵素の残存活性確認についても、それぞれの酵素活
性測定に適した反応液を使用し、乳酸デヒドロゲナーゼ
（LDH）の測定方法に準じて行った。
【００３８】結果は表３に示したとおりである。この表
３から明らかなように、上記酵素試薬に対して、1 ng/m
lの濃度のこの発明の凍結保護物質を添加することで、
高い保護活性があり、少量でも酵素試薬の安定化に十分
有効であることが判明した。
３から明らかなように、上記酵素試薬に対して、1 ng/m
lの濃度のこの発明の凍結保護物質を添加することで、
高い保護活性があり、少量でも酵素試薬の安定化に十分
有効であることが判明した。
【００３９】以上のことから、この発明の凍結保護物質
は、試薬以外にも酵素やタンパク質を含む診断薬・医薬
品等の凍結保存時の安定性向上に有効であることが確認
された。
は、試薬以外にも酵素やタンパク質を含む診断薬・医薬
品等の凍結保存時の安定性向上に有効であることが確認
された。
【００４０】
【表３】
【００４１】
【発明の効果】以上詳しく説明したとおり、この出願の
発明によって、比較的低濃度の添加量で代謝系酵素など
のタンパク質の凍結変性を防止することのできる、微生
物由来の凍結保護物質が提供される。また、この凍結保
護物質を用いることによって、タンパク質や細胞、臓
器、微生物等の生物材料を安定に凍結保存する方法や、
生理活性等を維持した状態で安定に凍結保存されたタン
パク質や各種の生物材料が提供される。
発明によって、比較的低濃度の添加量で代謝系酵素など
のタンパク質の凍結変性を防止することのできる、微生
物由来の凍結保護物質が提供される。また、この凍結保
護物質を用いることによって、タンパク質や細胞、臓
器、微生物等の生物材料を安定に凍結保存する方法や、
生理活性等を維持した状態で安定に凍結保存されたタン
パク質や各種の生物材料が提供される。
【図１】Ａはこの発明の凍結保護物質（○）のゲルろ過
クロマトグラフィーによる分子量を示したグラフであ
り、ＢはSDS-PAGEによる電気泳動像である。
クロマトグラフィーによる分子量を示したグラフであ
り、ＢはSDS-PAGEによる電気泳動像である。
【図２】各種凍結保護物質の各濃度における凍結保護活
性を示すグラフである。
性を示すグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 9/96 Ｃ１２Ｎ 9/96 Ｃ１２Ｐ 1/04 Ｃ１２Ｐ 1/04 Ｚ 21/00 21/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｐ 1/04 (Ｃ１２Ｐ 1/04 Ｚ Ｃ１２Ｒ 1:18） Ｃ１２Ｒ 1:18） (Ｃ１２Ｐ 1/04 (Ｃ１２Ｐ 1/04 Ｚ Ｃ１２Ｒ 1:38） Ｃ１２Ｒ 1:38） (Ｃ１２Ｐ 1/04 (Ｃ１２Ｐ 1/04 Ｚ Ｃ１２Ｒ 1:64） Ｃ１２Ｒ 1:64） (Ｃ１２Ｐ 21/00 (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:18） Ｃ１２Ｒ 1:18） (Ｃ１２Ｐ 21/00 (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:38） Ｃ１２Ｒ 1:38） (72)発明者 山出 和弘 大阪府吹田市山手町３丁目３番35号学校法 人関西大学工学部生物工学科内 (72)発明者 小村 啓悟 広島県福山市南永松町２丁目15番２−４号 (72)発明者 金子 昌二 広島県福山市南手城町２−30−12 (72)発明者 坂本 紀子 広島県福山市北美台９−16 Ｆターム(参考） 4B050 CC07 CC10 HH02 KK18 LL03 4B064 AG01 BA14 BH09 CA02 CC06 DA13 DA20 4B065 AA25X AA41X AA56X AC03 AC14 BC03 CA24 CA46 CA60 4H045 AA10 AA20 AA30 BA10 CA11 EA50 FA73 GA06 GA22 GA23 GA25 HA05
Claims (9)
- 【請求項１】 Erwinia（=Pantoea）属またはXanthomon
as属に属する微生物が産生する凍結保護物質。 - 【請求項２】 Pseudomonas syringaeまたはPseudomona
s viridiflavaが産生する凍結保護物質。 - 【請求項３】 Erwinia（=Pantoea）属またはXanthomon
as属に属する微生物、もしくはPseudomonas syringaeま
たはPseudomonas viridiflavaを30℃以下の温度で培養
することにより凍結保護物質の発現を誘導させ、その培
養物中から凍結保護物質を取得することを特徴とする凍
結保護物質の製造方法。 - 【請求項４】 請求項１または２の凍結保護物質と他の
タンパク質とを共存させることを特徴とするタンパク質
の安定化／保存方法。 - 【請求項５】 安定化が、他のタンパク質の凍結に対す
る安定性向上を目的とするものである請求項４のタンパ
ク質の安定化／保存方法。 - 【請求項６】 他のタンパク質が、触媒活性を有する酵
素である請求項４または５のタンパク質の安定化／保存
方法。 - 【請求項７】 請求項１または２の凍結保護物質を共存
させた酵素試薬または酵素含有診断薬およびそれらを含
むキット。 - 【請求項８】 請求項１または２の凍結保護物質と細
胞、臓器または微生物とを共存させることを特徴とする
生物材料の安定化／保存方法。 - 【請求項９】 請求項１または２の凍結保護物質と共存
した状態で保存されている細胞、臓器または微生物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000059444A JP4334719B2 (ja) | 1999-08-27 | 2000-03-03 | 凍結保護物質の調製方法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11-240928 | 1999-08-27 | ||
| JP24092899 | 1999-08-27 | ||
| JP2000059444A JP4334719B2 (ja) | 1999-08-27 | 2000-03-03 | 凍結保護物質の調製方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001139599A true JP2001139599A (ja) | 2001-05-22 |
| JP4334719B2 JP4334719B2 (ja) | 2009-09-30 |
Family
ID=26534993
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000059444A Expired - Lifetime JP4334719B2 (ja) | 1999-08-27 | 2000-03-03 | 凍結保護物質の調製方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4334719B2 (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2014521415A (ja) * | 2011-07-28 | 2014-08-28 | シャンシャン ワン | 複合コラーゲンスポンジ及びその製造方法 |
| WO2019031365A1 (ja) * | 2017-08-08 | 2019-02-14 | 新日本薬業株式会社 | 低温障害軽減剤又はネクローシス抑制剤、及び生体の臓器、組織又は細胞の保存方法 |
| JP2019527050A (ja) * | 2016-06-29 | 2019-09-26 | ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション | 生物学的物質の凍結保存および安定化のための氷核形成調合物 |
| JP2019189553A (ja) * | 2018-04-25 | 2019-10-31 | 日本曹達株式会社 | 微生物農薬の製造方法 |
| WO2023032788A1 (ja) | 2021-09-06 | 2023-03-09 | 公益財団法人微生物化学研究会 | 新規化合物、その用途、及びその製造方法、並びに、化合物含有組成物、４－トレハロサミンの製造方法、及び微生物 |
-
2000
- 2000-03-03 JP JP2000059444A patent/JP4334719B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2014521415A (ja) * | 2011-07-28 | 2014-08-28 | シャンシャン ワン | 複合コラーゲンスポンジ及びその製造方法 |
| US9439999B2 (en) | 2011-07-28 | 2016-09-13 | Harbin Peiqilong Biopharmaceutical Co., Ltd | Composite collagen sponge and preparation method thereof |
| JP2019527050A (ja) * | 2016-06-29 | 2019-09-26 | ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション | 生物学的物質の凍結保存および安定化のための氷核形成調合物 |
| US11477981B2 (en) | 2016-06-29 | 2022-10-25 | The General Hospital Corporation | Ice nucleation formulations for cryopreservation and stabilization of biologics |
| JP7486286B2 (ja) | 2016-06-29 | 2024-05-17 | ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション | 生物学的物質の凍結保存および安定化のための氷核形成調合物 |
| WO2019031365A1 (ja) * | 2017-08-08 | 2019-02-14 | 新日本薬業株式会社 | 低温障害軽減剤又はネクローシス抑制剤、及び生体の臓器、組織又は細胞の保存方法 |
| JP2019030246A (ja) * | 2017-08-08 | 2019-02-28 | 学校法人 関西大学 | 低温障害軽減剤又はネクローシス抑制剤、及び生体の臓器、組織又は細胞の保存方法 |
| JP7011117B2 (ja) | 2017-08-08 | 2022-01-26 | 学校法人 関西大学 | 低温障害軽減剤又はネクローシス抑制剤、及び生体の臓器、組織又は細胞の保存方法 |
| JP2019189553A (ja) * | 2018-04-25 | 2019-10-31 | 日本曹達株式会社 | 微生物農薬の製造方法 |
| JP7177601B2 (ja) | 2018-04-25 | 2022-11-24 | 日本曹達株式会社 | 微生物農薬の製造方法 |
| WO2023032788A1 (ja) | 2021-09-06 | 2023-03-09 | 公益財団法人微生物化学研究会 | 新規化合物、その用途、及びその製造方法、並びに、化合物含有組成物、４－トレハロサミンの製造方法、及び微生物 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP4334719B2 (ja) | 2009-09-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3338081B2 (ja) | 物質の貯蔵 | |
| JPH02265984A (ja) | 物質の貯蔵 | |
| CN114058603B (zh) | 一种鞘磷脂酶的冻干保护剂及制备方法 | |
| EP0816509B1 (en) | Thermostabilization, osmoprotection, and protection against desiccation of enzymes, cell components and cells by mannosyl-glycerate | |
| JP2001139599A (ja) | 凍結保護物質とその利用 | |
| JP4741270B2 (ja) | 熱安定性に優れたポリオール脱水素酵素およびその製造方法 | |
| WO2001094370A1 (fr) | Derives de coenzymes et enzymes appropries | |
| JP4847775B2 (ja) | 安定なポリオール脱水素酵素組成物 | |
| JP4235083B2 (ja) | 微生物由来の不凍タンパク質 | |
| JPS6030513B2 (ja) | グルコ−スイソメラ−ゼの精製方法 | |
| JP5066380B2 (ja) | ポリオール脱水素酵素の製造方法 | |
| JPS61115489A (ja) | 溶菌酵素の製造法 | |
| CA1156570A (en) | Glucose-6-phosphate dehydrogenase and process for preparation thereof | |
| JP2008245533A (ja) | ポリオール脱水素酵素組成物 | |
| JPH08168375A (ja) | ピルベートオルトホスフェートジキナーゼ及びその製造方法 | |
| JPS59166084A (ja) | 安定な酵素試薬の製造法 | |
| JPS58212783A (ja) | 発酵法によるホスホリパ−ゼａの製造法 | |
| Isobe et al. | Crystallization and Characterization of l-Pyrroline-5-carboxylate Dehydrogenase from Bacillus sphaericus | |
| JPS6312278A (ja) | 新規アルコ−ルデヒドロゲナ−ゼ複合体およびその製造法 | |
| JPS6312279A (ja) | 新規アルデヒドデヒドロゲナ−ゼ複合体およびその製造法 | |
| JP2597849B2 (ja) | リゾチーム阻害物質 | |
| Elshafei et al. | Purification and enzymatic properties of α‐galactosidase from Penicillium janthinellum | |
| JP2801694B2 (ja) | 新規酵素 | |
| JP3037809B2 (ja) | 耐アルコール性プロテアーゼ | |
| JP3125954B2 (ja) | 新規なホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ及びその製法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20060307 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20081125 |
|
| RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424 Effective date: 20081224 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20090122 |
|
| RD02 | Notification of acceptance of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7422 Effective date: 20090122 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20090313 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20090512 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20090619 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20090624 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120703 Year of fee payment: 3 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 4334719 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120703 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120703 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20150703 Year of fee payment: 6 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |