JP3285587B2 - サーモトガネアポリターナからのアルカリ性ホスファターゼの精製および特徴づけ - Google Patents

サーモトガネアポリターナからのアルカリ性ホスファターゼの精製および特徴づけ

Info

Publication number
JP3285587B2
JP3285587B2 JP53036597A JP53036597A JP3285587B2 JP 3285587 B2 JP3285587 B2 JP 3285587B2 JP 53036597 A JP53036597 A JP 53036597A JP 53036597 A JP53036597 A JP 53036597A JP 3285587 B2 JP3285587 B2 JP 3285587B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
alkaline phosphatase
enzyme
neapolitana
activity
microorganism
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
JP53036597A
Other languages
English (en)
Other versions
JPH11504223A (ja
Inventor
ドング，グオキヤング
ジー． ゼイカス，ジヨセフ
Original Assignee
ミシガン ステート ユニバーシテイ
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ミシガン ステート ユニバーシテイ filed Critical ミシガン ステート ユニバーシテイ
Publication of JPH11504223A publication Critical patent/JPH11504223A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP3285587B2 publication Critical patent/JP3285587B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 アルカリ（性）ホスファターゼ（alkaline phosphata
se）（オルトリン酸モノエステルホスホヒドロラーゼEC
3.1.3.1.）は、臨床医学および分子生物学において重要
であるため、科学研究および商業利用の一般的な対象と
なった。（参照例、ファリー（H.N.Ferley）“酵素（Th
e Enzyme）”、アカデミックプレス、ニューヨーク（Ac
ademic Press,New York）IV巻、417−447ページ（197
1）；マッコム（R.B.MoComb）ら、“アルカリ性ホスフ
ァターゼ（Alkaline Phosphatase）”、プレナムプレ
ス、ニューヨーク（Plenum Press,New York）（197
9）；ヴァリー（B.L.Vallee）およびオールド（D.S.Aul
d）Biochem.32巻:6494−6500ページ（1993））。
アルカリ性ホスファターゼは種々の細菌、真菌、藻
類、無脊椎動物および脊椎動物種から精製され、特徴づ
け（characterize）られている（マッコムら、同士）。
その酵素は中温菌および好熱菌からも精製されている。
比較的不安定なアルカリ性ホスファターゼが好温性のサ
ームス種（Thermus species）から特徴づけられたが
（ハルトグ（A.T.Hartog）ら、Int.J.Biochem.24巻、16
57−1660ページ（1992））、しかしこれまでアルカリ性
ホスファターゼが超好熱菌から精製され、特徴づけられ
たことはない。
超好熱菌は80℃以上で増殖する細菌群である。これら
の微生物によって産生される非常に耐熱的な酵素は、非
常に高い温度におけるタンパク質の構造的および機能的
研究が可能であるため注目されるようになり、多くの分
子生物学的用途並びに潜在的な工業的用途にも使われ
る。（参照例、アダムス（M.W.W.Adams）Annu.Rev.Micr
obiol.47巻:627−658ページ（1993）：クールベア（T.C
oolbear）ら、Adv.Biochem.En./Biotechol.45巻:57−98
ページ（1992））。超好熱性微生物からの酵素類は、非
常に高い温度におけるタンパク質の構造および機能を研
究する機会を提供する上でも重要である。
サーモトガ（Thermotoga）は80℃で最適に増殖する超
好熱性真正細菌であり、今日までに発見された最も好熱
的な真正細菌である。（ヤナシュ（H.W.Jannasch）ら、
Arch Microbiol.150巻:103−104ページ（1988））。
本発明はサーモトガネアポリターナ（Thermotoga Nea
politana）からのアルカリ性ホスファターゼを精製した
形で提供し、その精製を行う方法も提供する。
発明の概要 本発明はサーモトガ属の超好熱性真正細菌から単離し
た新しい熱安定性アルカリ性ホスファターゼの我々によ
る単離および特徴づけ、およびそのアルカリ性ホスファ
ターゼの精製法に関するものである。
我々は、サーモトガネアポリターナ（T.ネアポリター
ナ（T.neapolitana））から単離したアルカリ性ホスフ
ァターゼが既知のいかなるアルカリ性ホスファターゼよ
り熱安定性であることを発見した。それは高い最適反応
温度並びに高い最適pHの両者を有することを見い出し
た。
そのアルカリ性ホスファターゼはT.ネアポリターナ
（DSM5068）から単離、精製し、2880倍精製した。収率4
4.3％、60℃におけるタンパク質の比活性は663U/mgであ
った。精製酵素は、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動（SDS−PAGE）でMr45,000の単
一タンパク質バンドを示し、ゲル濾過クロマトグラフィ
ーによって見かけ上分子量87,000と推定された；これは
均質二量体構造を示唆する。この酵素の最適pHおよび−
温度はそれぞれ9.9および85℃であった。
本発明のアルカリ性ホスファターゼを精製するために
用いた方法は、第一工程として粗超好熱性真正細菌細胞
抽出物の調製である。細胞抽出物をその後Co2+の存在下
で熱処理し、硫酸アンモニウム沈殿にかける。再懸濁し
た酵素についてその後イオン交換クロマトグラフィーお
よびアフィニティークロマトグラフィーを組み合わせて
行う。
本発明の一般的目的は超好熱性アルカリ性ホスファタ
ーゼ（hyperthermophilic alkaline phosphatase）を純
粋な形で提供することである。
本発明のもう一つの目的は超好熱性アルカリ性ホスフ
ァターゼを精製する方法を提供することである。
本発明のさらなる目的は超好熱性真正細菌、特に、超
好熱性T.ネアポリターナから単離される超好熱性アルカ
リ性ホスファターゼを提供することである。
本発明の利点は、この新しい超好熱性アルカリ性ホス
ファターゼが非常に高い温度におけるタンパク質の構造
および機能を研究する機会を与えることである。
本発明のもう一つの利点は、本発明の超高温安定性ア
ルカリ性ホスファターゼ（hyperthermostable alkaline
phosphatase）が非好熱性微生物からのアルカリ性ホス
ファターゼに比し、より強固で、運搬およびそのままの
貯蔵によりよく耐えることである。
本発明のもう一つの利点は、超好熱性アルカリ性ホス
ファターゼが、超高温安定性および高い比活性両方を有
するアルカリ性ホスファターゼを必要とするELISAシス
テム、非放射性（non−isotopic）検出／試験システ
ム、非放射性（non−radioactive）ハイブリダイゼーシ
ョンおよび配列決定法、およびその他の分子生物学的使
用に役立つことである。
本発明のその他の目的および利点は、ここに示す明細
書、請求の範囲および図を研究することによって、当業
者には明らかであろう。
図の幾つかの見方についての簡単な説明 図１は、ヒスチジルジアベンジルプロピオン酸−アガ
ロース−カラム上のタンパク質（○）およびT.ネアポリ
ターナアルカリ性ホスファターゼ活性（●）のクロマト
グラフィーパターンである。矢印は、試薬を加え、パル
ス溶出を行った場所を示す。
図２はT.ネアポリターナアルカリ性ホスファターゼの
SDS−PAGE（12％）パターンである。レーンＭはマーカ
ータンパク質；レーン１は粗酵素；レーン２は、40mMコ
バルトイオンの存在下で100℃で処理した後の粗酵素；
レーン３はDEAE−セファロースカラムから溶出した部分
的精製酵素；レーン４は親和性カラムからの精製タンパ
ク質である。
図３は、T.ネアポリターナアルカリ性ホスファターゼ
活性をpHおよび温度の関数として示したものである。
（Ａ）酵素活性を60℃で0.2Mトリス−HCl緩衝液中で種
々のpHで測定した。（Ｂ）酵素活性をpHpH9.9で種々の
温度で測定した。
図４は、T.ネアポリターナアルカリ性ホスファターゼ
の60℃（■）、80℃（○）、90℃（●、△、▲）、100
℃（□）における熱安定性を示す。インキュベーション
をCo2+（■、○、●、□）、Mg2+（△）の存在下で、ま
たは金属イオンを付加せずに（▲）行った。半減期を等
式ｔ1/2＝lN2/Kから計算した。ここでＫは熱不活性定数
である。
図５は、2mMZn2+イオン（○）または2mMCo2+イオン
（●）それぞれの存在下におけるアポ酵素活性に与える
pHおよび温度の影響を示す。（Ａ）酵素活性を種々のpH
で、一定温度60℃で0.2Mトリス−HCl緩衝液中で測定し
た。（Ｂ）酵素活性を種々の温度でpH9.9で検出した。
発明の詳細な説明 本発明は一般的に超好熱性アルカリ性ホスファターゼ
の単離、精製、および特徴づけ、および真正細菌、特に
T.ネアポリターナから上記ホスファターゼを精製する方
法に関するものである。
T.ネアポリターナのアルカリ性ホスファターゼは、超
好熱性微生物から単離、精製された最初のアルカリ性ホ
スファターゼである。報告されたすべてのアルカリ性ホ
スファターゼのなかで、T.ネアポリターナアルカリ性ホ
スファターゼは最も大きい熱安定性を示す（以下の表２
参照）。この酵素は極めて高い最適温度およびpH値を有
する。最適条件下ではT.ネアポリターナアルカリ性ホス
ファターゼは、子ウシ腸アルカリ性ホスファターゼが、
基質としてのｐ−ニトロフェニル−ホスフェートで示し
たよりも30％も高い活性を示した。
好適実施態様において、この新規の超好熱性アルカリ
性ホスファターゼは次のような物理的および化学的特性
を有する： （１）分子量：約87,000; （２）アクチベータ:Co2+; （３）インヒビター：エチレンジアミン四酢酸（EDT
A）、Ni2+およびCu2+; （４）最適温度:85℃； （５）室温におけるpH安定性:5.0〜11.5（95％以上の残
留活性） （６）最適pH:9.9; （７）KmおよびVmaxはそれぞれ183μＭおよび1352U/m
g。
天然分子量は大部分の微生物アルカリ性ホスファター
ゼと一致するが（MW68,000〜120,000）、哺乳動物酵素
のそれ（MW120,000〜200,000）よりは低い。
T.ネアポリターナアルカリ性ホスファターゼ活性の最
適温度はその細菌の増殖温度に一致する。この酵素活性
の最適pHは9.9であり、それは報告された大部分のアル
カリ性ホスファターゼ（その最適pH値は約8.5〜9.5であ
る）より高い。（マッコムら、同上）。
報告されているその他のアルカリ性ホスファターゼの
ように、T.ネアポリターナアルカリ性ホスファターゼは
金属結合酵素である。その活性はキレート剤の存在下で
ほとんどゼロに低下した。長時間の透析後、元の活性の
５％未満が残った：これは若干の金属イオンが強固な結
合のためにタンパク質中に残ったことを意味する。Z
n2+、Mg2+、またはMn2+の添加によってアポ酵素活性の
約90％を回復することができる；これは金属イオンを除
去しても酵素構造が非常に安定であることを示してい
る。若干のアポ−アルカリ性ホスファターゼ活性、例え
ばバシラスリケニホルミス（Bacillus licheniformis）
などは、金属イオンの添加によって回復できない。（ス
ペンサー（Spencer）ら、J.Bacteriol.155巻:926−933
ページ（1981））。
T.ネアポリターナアルカリ性ホスファターゼの驚くべ
き１つの特性は、その他の試験されたアルカリ性ホスフ
ァターゼとは異なり、Co2+が酵素活性も熱安定性も高め
ることである。これは、亜鉛および／またはマグネシウ
ムイオンが通常アルカリ性ホスファターゼの不可欠部分
であり、その活性およびコンフォメーション構造にとっ
て重要であるという、既報の大部分の他のアルカリ性ホ
スファターゼとは劇的に異なる。（参照例、ジェーンウ
ェイ（C.M.Janeway）ら、Biochem.32巻、1601−1609ペ
ージ（1993）、キム（E.E.Kim）ら、J.Mol.Biol.218巻:
449−464ページ（1991）、これらは大腸菌（E.Coli）を
論じている）。亜鉛またはマグネシウム以外の天然金属
イオンを含む天然アルカリ性ホスファターゼはほとんど
見い出されていない。（参照例：グリュー（R.H.Grew）
ら、J.Biol.Chem.246巻:1566−1574ページ（1971）（マ
イクロコッカスソドネシス（Micrococcus sodonesis）
における例外を確認した））。コバルトは大腸菌アポ酵
素の亜鉛およびマグネシウムを置換し得るが、アルカリ
性ホスファターゼ活性は12％回復するに過ぎない。（ゴ
ッツマン（Gottesman）ら、Biochem.8巻:3776−3782ペ
ージ（1969））。
本発明のアルカリ性ホスファターゼの精製のために用
いる方法は、第一工程として、粗超好熱性真正細菌細胞
抽出物の調製を含む。その細胞抽出物をその後Co2+存在
下における熱処理および硫酸アンモニウム沈殿にかけ
る。それから再懸濁した酵素にイオン交換クロマトグラ
フィーとアフィニティークロマトグラフィーとの組み合
わせを行う。
本発明の精製アルカリ性ホスファターゼは多数の用途
を有する。過去20年間に、アルカリ性ホスファターゼは
測定システム、例えば酵素免疫測定（ELISA）システ
ム、非放射性試験、ブロッテイングおよび配列決定法な
ど、に広い用途を有することが判明した。（参照：マン
ソン（M.M.Manson）、“免疫化学プロトコル（Immunoch
emical Protocols）”ヒューマンプレス、ニュージャー
シー（Human Press,New Jersey）（1992）；ジャブロン
スキー（E.Jablonski）ら、Nucleic Acids Res.14巻:61
15−6128ページ（1986））。
大部分の測定用途には、高測定感度のための高い比活
性、並びに貯蔵期間を長くするための酵素熱安定性を有
するアルカリ性ホスファターゼの種類が必要である。熱
安定酵素、例えば本発明のアルカリ性ホスファターゼ
は、高温で安定であるばかりでなく、室温でもそれらの
中温性対象物より安定であるのが普通である。
最近、その他の、例えば酵素−プローブ結合体作成中
の化学的変性の減少、バイオセンサーにおける固定酵素
のより長い半減期、および種々の測定システムにおける
酵素の再使用などを含める用途において、高活性を有す
る熱安定性アルカリ性ホスファターゼの必要性が認識さ
れている。
それに加えて、本発明のアルカリ性ホスファターゼ
は、高活性および熱安定性を有するため、約40℃で極め
て安定でありながら、最適活性を示す人為的酵素の設計
を目的とする、未来の遺伝子研究のための出発酵素とし
て用いることができる。
子ウシ腸からの市販のアルカリ性ホスファターゼは、
その高い比活性のために現在分子生物学およびその他の
用途に広く用いられている。しかし、子ウシ腸アルカリ
性ホスファターゼの有用性は、その固有の低い熱安定性
および短い貯蔵期間によって制限される。本発明のアル
カリ性ホスファターゼは熱安定性および高比活性を有す
るため、高特異性および熱安定性を必要とする分子生物
学的用途に理想的に適し、この酵素は子ウシ腸アルカリ
性ホスファターゼの魅力的代替物となる。
下記の非制限的例は本発明のいくつかの面をより詳細
に述べる。
例 下記の実験の詳細は次に記載する特殊な例に参照され
る： 材料および方法 化学物質。DEAE−セファロースセファクリルS200およ
びフェニル−セファロースはファルマシアファインケミ
カAB（Pharmocia Fine Chemica AB）社、アップサラ、
スエーデン、から購入した。ヒスチジルジアゾベンジル
プロピオン酸−アガロース、ｐ−ニトロフェニルリン
酸、アデノシン−5'−二リン酸−二ナトリウム塩（AD
P），アデノシン−5'−三リン酸−二ナトリウム塩（AT
P）、β−グリセロールリン酸、Ｄ−グルコース−１−
リン酸、Ｄ−グルコース−６−リン酸、Ｄ−フルクトー
ス−６−リン酸、Ｄ−フルクトース−１、６−二リン酸
およびトリトンＸ−100はシグマケミカル（Sigma Chemi
cal Co.,）社、USAから購入した。エチレンジアミン四
酢酸−二ナトリウム塩（EDTA）およびアルカリ性ホスフ
ァターゼ（子ウシ腸）はベーリンガーマンハイム（Boeh
rnger Mannheim GmBH）社、ドイツ、から購入した。そ
の他の化学物質は一般的供給源からのものである。
細菌および培養条件。ここに記載の研究に用いるT.ネア
ポリターナの培養は、元はドイツ微生物コレクション
（Deutsche Sammlumgvon Mikroorganismen）、ブラウン
シュワイグ、ドイツ、から入手した菌株DSM5068であ
る。T.ネアポリターナ（DSM5068）を、１リットル中に
次のものを含む培地に培養した:4g澱粉、2g酵母エキ
ス、3gトリプトン、1gグルコース、15gNaCl、0.35gKC
l、2.7gMgCl26H2O、0.1gNaHCO3、0.14gCaCl22H2O、0.05
gK2HPO4、15mgH3BO3、20mgKBr、15mgFe（NH4）２（S
O4）２、3mgNa2WO42H2O、6mgKI、0.6mgNiCl6H2O、1gS
゜、1mgレサズリン、4g澱粉、２酵母エキス、3gトリプ
トン、1gグルコース。最初のpHを1MNaOHで7.5に調節し
た。グルコースおよびホスフェートを別々にオートクレ
ーブに入れた。接種材料は慣例にしたがい、閉鎖したビ
ンのなかで（1.5L容量ビン中700ml培地）80℃で一晩増
殖させ、培地を加熱し、オートクレーブに入れる前に窒
素をスパージし無気的条件に達せしめた。10L培地を含
む発酵槽（バイオテック（B.Braun Biotech）PA、USA）
中で大規模に行った。窒素スパージ下でおだやかに撹拌
しながら（100rpm）発酵温度を80℃に維持した。約20時
間のインキュベーション後、細胞をミリポアペリコンカ
セット細胞収穫器（Millipore Pellicon Cassete Cell
Harvester）で収穫した（ベッドフォード（Bedfors,M
A）、USA）。その後16,300×ｇで15分間遠心分離するこ
とによってさらに濃縮を行い、細胞ペレットを−20℃で
保存した。
アルカリ性ホスファターゼの精製。すべての操作は、特
に記載しない限り室温で有気的条件で行われた。
1.細胞抽出物の調製：冷凍細胞（40g湿式マス）を、0.1
5％（w/v）トリトンＸ−100を含むpH7.5の50mMトリス−
HCl緩衝液100ml（“緩衝液A"）中に懸濁し、１時間撹拌
した。16.300×ｇで15分間遠心分離後、ペレットで上記
操作を繰り返すことによってもう一度抽出した。上澄液
を一つに集め、粗酵素製剤として用いた。
2.熱処理および（NH4）2SO4沈殿:40mMCoCl2を細胞抽出
液に加え、溶液を20分間100℃水浴中で加熱し、それか
ら速やかに室温の水浴中で冷やした。遠心分離後、沈殿
物を棄て、65％飽和（NH4）2SO4を溶解性フラクション
に加えた。硫酸アンモニア沈殿によるペレットを遠心分
離によって収穫し、それから50mMトリス−HCl緩衝液、p
H7.5、に懸濁し、冷やした室内で同じ緩衝液に対して長
時間透析した。
3.イオン交換クロマトグラフィー：上記処理から得た透
析酵素（25ml）を、緩衝液Ａで平衡化したDEAF−セファ
ロースカラム（2.6cm×15cm）に入れた。酵素を、緩衝
液Ａ中0.0〜0.4MKClの直線勾配を用いて10ml/チューブ/
10分の流速で溶出した。アルカリ性ホスファターゼ活性
は溶出の最初に検出された。
4.アフィニティークロマトグラフィー：イオン交換カラ
ムからの活性フラクションを集め、緩衝液Ａで平衡化し
たヒスチジルジアゾベンジルプロピオン酸−アガロース
カラム（1.0×6cm）に担持させた。洗浄後、非特異的結
合タンパク質を緩衝液Ａ中、1MNaClで溶出した。最後
に、酵素を緩衝液Ａ中、10mMリン酸ナトリウムでパルス
溶出によって溶出した（図１）。
分子量の測定。セファクリルS200を含む0.5×45cmカラ
ムを0.2MNaClを含む緩衝液で平衡化した。マーカータン
パク質はウマ心臓チトクロームＣ（12,400）、炭酸脱水
酵素（カルボニックアンヒドラーゼ）（29,000）、ウシ
血清アルブミン（66,000）、アルコール脱水素酵素（15
0,000）およびブルーデキストラン（200,000）を含んで
いた。精製サンプルを緩衝液Ａの存在下でカラムに入れ
た。流速は7ml/時であった。マーカータンパク質および
天然アルカリ性ホスファターゼの溶出を280nmUV−検出
器および活性検定によって決定した。
12％ポリアクリルアミドゲルを用いるドデシル硫酸ナ
トリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS−PAG
E）をレムリ（U.K.Laemmli）の方法によって（レムリ、
Nature、227巻、680−685ページ（1970））、ビオラド
ミニタンパク質II電気泳動装置および標準的分子量マー
カー（ビオラドラボラトリーズ（BioRad Laboratories
Ltd.,）社、リッチモンド、CA、USA）を用いて行った。
タンパク質バンドをクーマッシーブリリアントブルーＲ
−250による染色によって可視化した。
タンパク質の測定。タンパク質濃度をビオ−ラド溶液
（シグマ社、USA）を用いて、ウシ血清アルブミンを標
準タンパク質として測定した。（ブラッドフォード（M.
M.Bradford）、Anal.Biochem.、72巻:248−254ページ
（1976））。
酵素検定法。アルカリ性ホスファターゼ活性を下記のよ
うにｐ−ニトロフェニルホスフェートからのｐ−ニトロ
フェノールの放出によって検定した。その反応は適当に
希釈した50μｌ酵素を0.2Mトリス緩衝液（pH9.9、60
℃）1mlおよび24mMのｐ−ニトロフェニルホスフェート5
0μｌを含むキュベットに加えることによって60℃で開
始した。410nmにおける吸光度の最初の直線変化を、60
℃の恒温にしたスペクトロフォトメーター（カリー21
9、USA）で記録することによって検出した。１酵素活性
単位は、これらの標準検定条件下における１分間あたり
の物質１μlmolの加水分解を表す。
酵素活性の最適pHを種々のpHおよび温度60℃で、0.2M
トリス−HCl緩衝液を用いて測定した。これら緩衝液の
すべてのpH値を室温で測定し、高温でのpH変化をトリス
の△pKa/△Ｔ℃を用いて補正した。（ペリン（D.D.Perr
in）およびデンプシー（B.Dempsey）、“pHおよび金属
イオンコントロールのための緩衝液（Buffers for pH a
nd Metal Ion Control）”チャップマン＆ホール（Chap
man ＆ Hall）、ロンドン、157−163ページ（197
4））。最大活性の温度を測定するために、活性検定は
種々温度の0.2Mトリス−HClで行われた。高温では少量
の非酵素的加水分解があったため、酵素なしのコントロ
ール試験も行った。
ｐ−ニトロフェニルホスフェート以外のリン酸エステ
ルを基質として用いたとき、ホスファターゼ活性は80
℃、10分間のインキュベーション中に放出されるホスフ
ェートの量を測定することによって決定された。インキ
ュベーション混合物は0.1Mの種々の基質類0.1ml、純粋
酵素0.1mlと、5mMCoCl2および5mMMgCl2を含む0.2Mトリ
スとを総容量1mlになるように含む。非酵素的加水分解
のためのコントロールは各基質ごとに行った。サンプル
につき、改良法によって放出された無機リン酸を分析試
験した（ロビト（J.F.Robyt）およびホワイト（B.J.Whi
te）、“生化学的方法：理論および実践（Biochemical
Techniques:Theory and Practice）”、ブルックスコー
ル、モンテリーカリフォルニア（1987））。比較とし
て、市販の子ウシ腸からのアルカリ性ホスファターゼも
用い、これらのリン酸エステル類を加水分解した。反応
条件は50mMMgCl2および5mMZnCl2を含む0.1Mトリス−HCl
緩衝液（pH8.5）中、38℃であった。その他の反応条件
は上と同じであった。
熱不活性化研究。100μｌ緩衝液Ａ中に精製酵素20μｇ
と5mMCo2+または5mMMg2+を含む100μlPCRクルーカップ
チューブ（カタログ番号＃72.733.050、サルステット；
ニュートン、NC）を種々の温度の水浴中で種々の時間イ
ンキュベートした。処理後、サンプルを室温で水浴中で
速やかに冷やし、残留活性を標準的条件下で測定した。
EDTAおよび金属イオン処理。緩衝液Ａ中の精製アルカリ
性ホスファターゼをそれぞれ0.0〜5.0mM濃度のEDTAの存
在下で室温で１時間インキュベートした。残留酵素活性
を標準条件下で検定した。
金属イオン処理では、緩衝液Ａ中精製アルカリ性ホス
ファターゼを含むチューブに10mMEDTAを加えた。１時間
後、その混合物を、2mMEDTAを含む緩衝液Ａに対して透
析し、それからEDTAを含まない緩衝液Ａに対して３回透
析した。その後、種々の金属イオン2mMを脱イオン酵素
溶液に加え、混合物を室温で１時間インキュベートし
た。比較のために、種々の金属イオンの2mMを精製タン
パク質に直接加え、同じ条件下でインキュベートした。
使用したすべての金属イオンは塩化物の形であった。酵
素活性を標準条件下で検定した。
例１ アルカリ性ホスファターゼの精製 T.ネアポリターナ細胞を緩衝液Ａに懸濁し、１時間し
ずかに撹拌したとき、上澄液に若干のアルカリ性ホスフ
ァターゼが見い出された。酵素抽出効率は0.15％トリト
ンＸ−100の存在下では増加した。トリトンＸ−100で２
回抽出後、上澄液中のアルカリ性ホスファターゼのほと
んどすべては回収された。表１は精製プロトコルとT.ネ
アポリターナからのアルカリ性ホスファターゼの精製結
果をまとめたものである。
細胞抽出物から得られる粗アルカリ性ホスファターゼ
は非常に熱安定性であった。この粗アルカリ性ホスファ
ターゼ抽出物を40mMCo2+の存在下で100℃で40分間加熱
したとき、残留活性は97％、上澄液の比活性は6.4倍に
増加した。
興味深いことに、その後のアフィニティークロマトグ
ラフィー工程においてCo2+はアルカリ性ホスファターゼ
とリガンドとの間の強固な親和性結合を促進した。Co2+
が存在しないときには、アルカリ性ホスファターゼはpH
値は６〜10の間で、室温でさえもヒスチジル−ジアゾベ
ンジルプロピオン酸−アガロースカラムに結合しなかっ
た。Co2+が存在する場合には、酵素は1MNaClで溶出した
後でも大部分がアフィニティーカラムに残っていた。
（図１）。酵素は10mM基質、例えばｐ−ニトロフェニル
リン酸または10mMインヒビター、例えばリン酸カリウム
によって完全に溶出した。アフィニティークロマトグラ
フィー工程はアルカリ性ホスファターゼのより著しい精
製をもたらした（図１）。
タンパク質の天然分子量はゲル濾過クロマトグラフィ
ーカラムによって推定して87,000であり、タンパク質が
均質二量体であることを示唆した。分子量は他の微生
物、例えば大腸菌およびバシラスサチリス（Bacillus s
ubtilis）などからのアルカリ性ホスファターゼのそれ
に匹敵した（マッコムら、同上）。
図２は種々の精製工程におけるサンプルのSDS−Page
パターンを示す。アフィニティークロマトグラフィー工
程の後にアルカリ性ホスファターゼは電気泳動ゲル上に
サブユニット分子量45,000の単一タンパク質バンドを示
した。酵素を2880倍に精製し、全体的収率は44％であっ
た（表１参照）。
天然タンパク質の分子量は、ゲル濾過クロマトグラフ
ィーによって推定して87,000であった。SDS−PAGAの結
果に照らして、このタンパク質は均質な二量体であるよ
うにみえる。その分子量は大腸菌およびバシラスサチリ
スからの二量体アルカリ性ホスファターゼの分子量に非
常に近かった（マッコムら、同上）。
例２ T.ネアポリターナアルカリ性ホスファターゼの活性およ
び安定性に及ぼすpHおよび温度の影響。
前記の大腸菌アルカリ性ホスファターゼおよびその他
の菌のアルカリ性ホスファターゼのように、T.ネアポリ
ターナアルカリ性ホスファターゼ活性は0.2Mトリスで出
発して、トリス濃度とともに増加し、プラトーに至る。
そこで、すべての酵素活性検定に0.2Mトリスを用いた。
図3Aは種々のpH値で60℃で測定したアルカリ性ホスファ
ターゼ活性を示す。最大活性は約pH9.9で得られた。中
性pHでは、酵素活性は顕著に低い。
T.ネアポリターナは90℃までの温度で増殖するから、
酵素活性に対する温度の影響も測定した。図3Bに示すよ
うに、酵素活性は温度が20℃から85℃に高まるにつれて
増加し、約85℃で最適活性が検出された。
アルカリ性ホスファターゼは、トリス−HCl緩衝液中
で室温で保存したときには広いpH範囲（pH4〜11）にわ
たって安定であった。その安定性を得るために無気的条
件は不必要であった。しかし、その酵素はより低いおよ
びより高いpH値では不安定となった。酵素は中性pHで最
高の安定性を示した。
T.ネアポリターナアルカリ性ホスファターゼの熱安定
性はCo2+またはMg2+の存在下でそれぞれ30および23倍に
増加した。（図４）。酵素は室温、pH6.5〜7.5で、４時
間後にまだ完全に活性であった。酵素は60℃（半減期21
時間30分）またはそれ以下の温度で安定であった。80℃
では酵素は半減期６時間40分を有し、90℃を超えてその
活性は速やかに失われた（90℃における半減期４時間、
100℃では30分）。
表２はT.ネアポリターナおよびその他の供給源からの
アルカリ性ホスファターゼの種々の温度における半減期
を比較したものである。
酵素の熱不活性化速度は、その天然構造の破壊に必要
なエネルギーに依存する。これはこれで、アミノ酸配
列、ポリペプチド鎖の折り重なり程度、疎水性およびそ
の他の分子内結合の存在などの要因によって支配され
る。酵素の熱不活性化に影響を与えることがわかってい
るその他の要因はイオン強度、pH、基質などを含める。
現在のところ、酵素熱安定性に関して入手し得る限られ
た情報は、主として中温性微生物に関する研究からのも
のである。本発明は酵素熱安定性の背後にあるメカニズ
ムを研究し、そのメカニズムに関するより多くの情報を
発見する機会を提供する。
例３ 酵素の動力学的特性 T.ネアポリターナアルカリ性ホスファターゼの動力学
的特性をｐ−ニトロフェニルリン酸を基質として用いて
測定した。最適温度およびpH条件下で、KmおよびVmaxは
それぞれ1.83×10-4Mおよび1352U/mgである。
T.ネアポリターナおよび子ウシ腸アルカリ性ホスファ
ターゼは種々のリン酸化合物を加水分解するが、表３に
示すように異なる特異性を表す。T.ネアポリターナアル
カリ性ホスファターゼは、基質活性としてｐ−ニトロフ
ェニルリン酸を用いたときに最高の活性を示したが、フ
ルクトース−1,6−リン酸は子ウシ腸のアルカリ性ホス
ファターゼによってより容易に加水分解された。
例４ 金属イオンの影響 T.ネアポリターナアルカリ性ホスファターゼはEDTAの
存在下で不活性化された。EDTAで徹底的に処理した後は
その元の活性の約５％だけが検出された；アポ酵素活性
は二価金属イオンの添加によって回復した（表４）。
金属イオンのアポ酵素活性に与える影響は顕著であっ
た。試験したすべての金属イオンのなかで、Co2+が最も
顕著な効果を示した。Mg2+イオン、Zn2+イオン、または
Mn2+イオンの存在はアポ酵素活性を精製酵素活性（663.
3U/mg）（付加塩の存在しないときに測定）の90〜95％
にまで、約18倍高める一方、Co2+イオンは酵素活性を精
製酵素の比活性（663.3U/mg）（付加塩の存在しないと
きに測定）の163％にまで、約33倍にも高める。Cn2+とN
i2+はインヒビターであった（表４参照）。
2mMCo2+またはZn2+で処理したT.ネアポリターナアポ
酵素の活性に対するpHおよび温度の影響も試験した（図
５）。Zn2+の存在下におけるアポ酵素は未処理T.ネアポ
リターナアルカリ性ホスファターゼとほぼ同じ最適pHお
よび最適温度活性を有する（図３参照）。だがCo2+はア
ポ酵素活性に非常に好都合な影響を与えた。Co2+イオン
で処理した後、アポ酵素活性は室温並びに中性pHで、未
処理酵素、またはZn2+の存在下で処理した酵素に比し、
7.7倍増加し、その最適pH範囲は広がった。これらの結
果は、Co2+イオンが反応部位をより活性にし、および／
または酵素の活性部位のコンフォメーションを変化さ
せ、これはこれでタンパク質とそのリガンドとの親和性
を高めたたことを示唆する。
本明細書において上記のすべての参考文献の内容は、
参考として本明細書に組み込まれるものとする。
当業者はこの開示を読むことによって、形態および詳
細における種々の変更が本発明の真の範囲から逸脱する
ことなく加えられることを理解されよう。
フロントページの続き (72)発明者 ゼイカス，ジヨセフ ジー. アメリカ合衆国 48909 ミシガン ラ ンジング ピー．オー．ボツクス 27609 コリンズ ロード 3900 エム ビーアイ インターナシヨナル (56)参考文献 特開 平５−236955（ＪＰ，Ａ) 国際公開95／30756（ＷＯ，Ａ１) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 9/16 ＭＥＤＬＩＮＥ

Claims (10)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】超好熱性微生物から単離された、下記の化
    学的特性を有する熱安定性アルカリ性ホスファターゼ： （１）分子量：約87,000; （２）アクチベータ:Co2+; （３）最適温度:85℃； （４）室温におけるpH安定性:5.0〜11.5（95％以上の残
    留活性） （５）最適pH:9.9; （６）KmおよびVmax値がそれぞれ183μＭおよび1352U/m
    g。
  2. 【請求項２】前記微生物がサーモトガ属に属する真正細
    菌である請求項１記載のアルカリ性ホスファターゼ。
  3. 【請求項３】前記真正細菌がT.ネアポリターナである請
    求項２記載のアルカリ性ホスファターゼ。
  4. 【請求項４】細菌T.ネアポリターナ（DSM 5068）の細
    胞培養物を作り； 前記細菌の細胞培養物から、Co2+の存在下で熱処理する
    ことによってアルカリ性ホスファターゼを単離し；そし
    て 単離した前記アルカリ性ホスファターゼをイオン交換ク
    ロマトグラフィーとアフィニティークロマトグラフィー
    との組み合わせを用いて精製する 諸工程を含んでなる超高温安定性の請求項１記載のアル
    カリ性ホスファターゼを調製する方法。
  5. 【請求項５】前記熱処理工程が100℃の熱処理を適用す
    ることを含む請求項４記載の方法。
  6. 【請求項６】前記超好熱性微生物から細胞抽出物を調製
    し； 細胞抽出物に二価金属イオンの存在下で熱を加え； 細胞抽出物を速やかに冷却し； 細胞抽出物に遠心力を加え、生成した沈殿物を棄て； 生成した溶解性フラクションに硫酸アンモニウムを加
    え； 遠心分離によって生成したペレットを収穫し、それから
    前記ペレットを比較的中性のpHを有する緩衝液に再懸濁
    し、生成した溶液を透析にかけ； 透析溶液を、アルカリ性ホスファターゼが前記樹脂に結
    合するような条件下でイオン交換樹脂に与え、 前記結合したアルカリ性ホスファターゼを前記溶液中の
    未結合の材料から分離し； 前記アルカリ性ホスファターゼを前記樹脂から溶出し、
    それによって部分的に精製したアルカリ性ホスファター
    ゼを得る 諸工程を含んでなる超好熱性微生物から請求項１記載の
    アルカリ性ホスファターゼを産生する方法。
  7. 【請求項７】前記微生物がサーモトガ属に属する真正細
    菌である請求項６記載の方法。
  8. 【請求項８】前記真正細菌がT.ネアポリターナである請
    求項７記載の方法。
  9. 【請求項９】前記二価金属イオンがCo2+である請求項８
    記載の方法。
  10. 【請求項１０】前記部分的に精製したアルカリ性ホスフ
    ァターゼをアフィニティークロマトグラフィーにかけ、
    前記アルカリ性ホスファターゼをパルス溶出によって溶
    出し、それにより精製アルカリ性ホスファターゼが得ら
    れる諸工程をさらに含んでなる請求項６記載の方法。
JP53036597A 1996-02-26 1997-02-25 サーモトガネアポリターナからのアルカリ性ホスファターゼの精製および特徴づけ Expired - Fee Related JP3285587B2 (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US1231596P 1996-02-26 1996-02-26
US60/012,315 1996-02-26
PCT/US1997/002821 WO1997030723A1 (en) 1996-02-26 1997-02-25 Purification and characterization of alkaline phosphatase from thermotoga neapolitana

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPH11504223A JPH11504223A (ja) 1999-04-20
JP3285587B2 true JP3285587B2 (ja) 2002-05-27

Family

ID=21754381

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP53036597A Expired - Fee Related JP3285587B2 (ja) 1996-02-26 1997-02-25 サーモトガネアポリターナからのアルカリ性ホスファターゼの精製および特徴づけ

Country Status (7)

Country Link
US (1) US5980890A (ja)
EP (1) EP0914149A4 (ja)
JP (1) JP3285587B2 (ja)
KR (1) KR100292550B1 (ja)
AU (1) AU1970397A (ja)
CA (1) CA2247188C (ja)
WO (1) WO1997030723A1 (ja)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080305213A1 (en) 2007-06-11 2008-12-11 Kerry Group Services International, Ltd. Method and composition for preparing cured meat products

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4030995A (en) * 1976-07-13 1977-06-21 Sigma Chemical Company Alkaline phosphatase isoenzyme determination
US4720458A (en) * 1983-10-19 1988-01-19 Sullivan Cornelius W Heat sensitive bacterial alkaline phosphatase
GB8328918D0 (en) * 1983-10-28 1983-11-30 Unilever Plc Alkaline phosphatase
US4656128A (en) * 1985-01-22 1987-04-07 Research Corporation Modified alkaline phosphatase
BE1005220A3 (fr) * 1991-01-15 1993-06-01 Analis Sa Procede de separation, d'identification et de quantification d'isoenzymes et d'isoformes de la phosphatase alcaline.
JPH05236955A (ja) * 1992-02-27 1993-09-17 Unitika Ltd 耐熱性アルカリホスファターゼの製造法
WO1995030756A1 (en) * 1994-04-18 1995-11-16 United States Biochemical Corporation Thermostable alkaline phosphatase of thermus thermophilus

Also Published As

Publication number Publication date
US5980890A (en) 1999-11-09
AU1970397A (en) 1997-09-10
CA2247188A1 (en) 1997-08-28
KR100292550B1 (ko) 2001-09-17
JPH11504223A (ja) 1999-04-20
WO1997030723A1 (en) 1997-08-28
CA2247188C (en) 2002-08-06
EP0914149A1 (en) 1999-05-12
KR19990087268A (ko) 1999-12-15
EP0914149A4 (en) 2001-04-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Dong et al. Purification and characterization of alkaline phosphatase from Thermotoga neapolitana
US4442214A (en) Thermo-stable micro-organism
WO2021212723A1 (zh) 一种β-半乳糖苷酶GALA及其应用
US5082772A (en) Process for preparing deacetylcephalosporin c
Dabrowski et al. Cloning, expression, and purification of the His6-tagged thermostable b-galactosidase from Pyrococcus woesei in Escherichia coli and some properties of the isolated enzyme
Mori et al. Purification and characterization of alkaline phosphatase from Bacillus stearothermophilus
JP3285587B2 (ja) サーモトガネアポリターナからのアルカリ性ホスファターゼの精製および特徴づけ
US4720458A (en) Heat sensitive bacterial alkaline phosphatase
JP2603349B2 (ja) 高純度ヘパリナーゼの大規模精製法
Beluhan et al. Partial purification and biochemical characterization of alkaline 5′-phosphodiesterase from barley malt sprouts
JPH062061B2 (ja) Ｎ−アセチルノイラミン酸リア−ゼの製法
JP4245229B2 (ja) 安定なヘキソキナーゼおよびその製造法
JP2003144144A (ja) 菌体または菌体処理物を含有する液体の保存方法
JPS61282076A (ja) 耐熱性トリプトファナーゼおよびその製法
JP2597849B2 (ja) リゾチーム阻害物質
JP3624960B2 (ja) 耐熱性リボヌクレアーゼｈおよびその用途
JPS60241888A (ja) 新規ヒダントイナ−ゼ
JPS58152482A (ja) 耐熱性蛋白分解酵素アクアライシンｉおよびその製造法
CA1219827A (en) Thermo-stable micro-organism
JPS63214182A (ja) 耐熱性イソクエン酸脱水素酵素の製法
JPH06153936A (ja) アリルスルホトランスフェラーゼおよびその製造法
JPH0838169A (ja) ３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素の製造法
JPS6326991B2 (ja)
Dąabrowski et al. Cloning, Expression, and Purification of the His6-Tagged Thermostable β-Galactosidase from Pyrococcus woesei in Escherichia coli and Some Properties of the Isolated Enzyme
JPH03277281A (ja) アリールアシルアミダーゼ

Legal Events

Date Code Title Description
LAPS Cancellation because of no payment of annual fees