JPS63214182A - 耐熱性イソクエン酸脱水素酵素の製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、耐熱性イソクエン酸脱水素酵素を製造する方
法に関し、更に詳細には従来未知の耐熱性イソクエン酸
脱水素酵素を製造する方法に関するものである。

（従来の技術） イソクエン酸脱水素酵素（以下、ＩＣＤＨということも
ある）は、動植物組織や酵母等に広く存在し。

従来、発酵又はブタの心筋といった動物組織を原料とし
て製造されている（「化学大辞典１」共立出版、昭４２
−９−１０＋　Ｐ５９８）。

しかしながら、従来既知のＩＣＤＨは、熱や化学薬品に
対して不安定であるし、そして更に、その反応に際して
、ＮＡＤのみを用いるもの（ＥＣ１，１，１，４１）及
びＮＡＤＰのみを用いるもの（ＩＩＩＣｌ、１．１．４
２）は知られているが、ＮＡＤ、　ＮＡＤＰ補酵素のい
ずれをも利用できるものは全く知られていないのが現状
である。

（発明が解決しようとする問題点） このように従来既知のＩＣＤＩ（は、物理化学的安定性
に欠け、工業的に利用するのには数多くの制約を受けざ
るを得ない、しかもブタの心筋のように動物組織から抽
出するという方法では、原料の入手難、操作の繁雑性、
低い収率、高いコストといった欠点は避けられず、工業
的な方法にはなり得ない。

（問題点を解決するための手段） 本発明は、上記問題点を一挙に解決するためになされた
ものであって、製法及び製品酵素の双方の面からの欠点
を同時に解決するため、先ず、工業的製法とするには組
織からの抽出法ではなく微生物による発酵法とするのが
好適であるとの観点にたった。

このような観点にたち、莫大な数存在する微生物につい
てスクリーニングを実施したにも拘らず目的とするＩＣ
ＤＨは得られなかった。そこで発想を転換して古細菌、
特に好酸性好熱性細菌について検討したところ、スルホ
ロブス属菌がＩＣＤＨを生産するという新知見を得、そ
してまたこのＩＣＤＨが従来未知の新規酵素であるとい
う新知見を得た。そして更にスクリーニングを続けた結
果、好熱細菌であるテルムス属菌も同様に新規なＩＣＤ
Ｈ酵素を生産するという極めて有用な新知見を得た。

本発明は、これらの新知見を基礎として更に研究の結果
、遂に完成されたものである。

本発明においては、テルムス属又はスルホロブス属に属
する耐熱性ＩＣＤＨ生産菌を使用するが１例えば温泉か
ら噴離したテルムス・テルモフィルス（Ｔｈｅｒｖｕｓ
　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、スルホロブス・アシド
カルダリウス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ　ａｃｉｄｏｃａ
ｌｄａｒｉｕｓ）等を使用するのが好適である。これら
の細菌は、通常の細菌用培地で培養すればよいが、いず
れも好熱性細菌であるので温度を６５〜８５℃、好まし
くは７５℃前後で常法により培養する。培養ＰＨは中性
程度でよいが、後者の菌は好酸性菌でもあるので、ｐＨ
を酸性側にもっていくのが好ましい。

目的酵素は、菌体外にも分泌されるが、相当部分は菌体
内に残留するので、培養終了後、遠沈。

濾過等によって菌体を集め、洗浄処理を行う、このよう
にして清浄化した菌体は、超音波処理５機械的攪拌、溶
菌処理等によって１機械的、物理的、化学的、ないし生
物学的に破砕して菌体内容物を外部に放出させる。

これを遠沈、濾過等の分離操作にかけて上澄を分取する
。この上澄を硫安分画して活性画分を得る。また、菌体
内の核酸を除去するために、放出された菌体内成分をＲ
Ｎａｓｅ、　ＤＮａｓｅで処理してＲＮＡ、ＤＮＡを分
解した後、これを遠沈、濾過等の分離操作にかけて沈渣
を分取し、これにバッファー。

ＫＣＱを加え、均質化した後遠沈、濾過して、酵素含有
画分である上清を得る。

このようにして分離したＩＣＤＨに富んだ両分（例えば
上記した硫安画分ないし上溝）を、必要ある場合には該
上清から夾雑蛋白を除去した後に、酵素精製において慣
用される手法を適宜組合せ、ないしは反復使用して処理
し、目的とするＩＣＤＨを極めて効率よく且つ高純度で
しかも活性を低下させることなく、分離精製する１例え
ば、硫安や硫酸ソーダを用いる。塩析、濃硫、ＰＨ調節
、透析、低温エタノール分画、クロマトグラフィー（Ｄ
ＥＡＥ−セルロースや側−セルロース等を用いるイオン
交換クロマトグラフィー、分配クロマトグラフィー。

吸着クロマトグラフィー）、高速液体クロマトグラフィ
ー、薄層クロマトグラフィー、ゲル濾過。

電気泳動、蔗糖密度勾配超遠心等既知の精製法を学用な
いし適宜組合せたりまたはくり返したりして分離精製を
行う。

このようにして分離精製されたＩＣＤＨ酵素は、従来既
知のＩＣＤＨとは全く異なり、　ＮＡＤ、　ＮＡＤＰの
いずれをも補酵素として利用できる全く新規にして有用
な性質を具備している。従来既知のＩＣＤＨは、これま
で補酵素としてＮＡＤのみを用いるもの（ＥＣ１，１゜
１．４１）とＮＡＤＰ（１）みを用いるも（７）　（Ｅ
Ｃ１，１，１，４２）とに峻別されていたものである。

ミカエリス定数は。

テルムス属菌を用いる実施例１で得られた酵素の場合、
ＮＡＤＰで２０μＮ、ＮＡＤで２．６＋ａＭであり、ス
ルホロブス属菌を用いる実施例２で得られた酵素の場合
、ＮＡＤＰで３５μに、　ＮＡＤで１．６１阿であった
。なおＮＡＤにＮＡＤＰが混雑していないのは塩化リチ
ウム水溶液を展開液とする薄層クロマトグラフィーでバ
ンドが１本しか得られなかった事、市販のブタ心筋イソ
クエン酸脱水素酵素（ＮＡＤＰ特異的）では過剰量のＮ
ＡＤでも反応しなかった事から確認された。

二価金属陽イオン要求性についてはＮＡＤ、　ＮＡＤＰ
いずれの補酵素を用いても、　Ｍｎ”＋もしくはＨｇ　
２＋が必須であったが、　Ｓｒ”＋およびｃ、、！＋は
ＮＡＤ依存性の反応のみ有効であった。

ＩＣＤＨ活性に及ぼす２価カチオンの影響２価カチオン
　　　　　　　比　　活　　性（％）ＮＡＤＰ　　　　
ＮＡＤ　　　　　ＮＡＤＰ　　　ＮＡＤＭｎ”　　　　
　１００　　　　１００　　　　１００　　　１００Ｍ
ｇ”　　　　　　７１　　　　６７　　　　６９　　　
６１ｃａ”　　　　　　４７　　　　４７　　　　２２
　　　２４Ｓｒ”　　　　　　１７　　　　６９　　　
　　１．１　　４５Ｇｏ”　　　　　　４．４　　　８
０　　　　　０．９　　４ＯＮｉ”　　　　　　０　　
　　　０　　　　　０．５　　　１．１本発明に係るＩ
ＣＤＨ酵素は、熱に対して極めて安定であって、９０℃
で１５分間保温した後の残存活性は、４０％（実施例１
）及び９０％（実施例２）であり（第１図及び第２図）
、また反応の活性化エネルギーは１０．７Ｋｃａｌ／ｍ
ｏ１（実施例１）及び１１．８Ｋｃａｌ／ｍｏｌ（実施
例２）であって（第３図及び第４図）、本酵素がきわめ
て耐熱性にすぐれていることがわかる。

既知のｒｃＤＨにおいて、このようにすぐれた耐熱性を
示す酵素は存在せず、高温での利用がはじめて可能とな
ったのである。

本発明に係るＩＣＤＨ酵素は、各種変性剤に対しても申
越した耐性を示し、きわめて安定である。たとえば、市
販のブタ心筋由来のＩＣＤＨを対照とした場合、　２Ｍ
尿素中で、市販のＩＣＤＨは完全に失活したが１本酵素
は、それぞれ無処理酵素の７０％（実施例１）（第５図
）及び９０％（実施例２）の活性を示した。また、実施
例２に係る酵素は、５Ｍ尿素中でも８０％の活性を示し
た。　０．１Ｍグアニジン塩酸中では。

市販のＩＣＤＨは完全に失活したが、本酵素は、それぞ
れ無処理酵素の５５％（実施例１）（第６図）及び８０
％（実施例２）の活性を示した。更にまた。ｏ、ｏｏｔ
％ドデシル硫酸ナトリウム中では、市販のＩＣＤＨはほ
ぼ完全に失活したが（３％）１本酵素（実施例１）は８
５％の活性を示した（第７図）。

次に本発明の実施例を示す。

実施例１ 以下の操作は特記しない限り全て室温で行なわれた。高
度好熱菌テルムス・テルモフィルスＨＢ８（ＡＴＣＣ２
７６３４）を栄養培地（＃母エキス３ｇ、ポリペプトン
５ｇ、グルｍｌ　−Ｘｉ　ｇ、　ＮａＣＱ２　ｇをＩＱ
の水に溶解しｐＨ７，２に調製）で７５℃で８時間培養
（湿重量約４ｇＩＱ）した後、遠心分離にて集菌した。

ついで洗浄した後に、超音波処理を行ない遠心により上
滑と沈渣とに分離した。このテルムス粗抽出液を硫酸ア
ンモニウムで分画し、活性のある画分を２０ｍＭ　トリ
ス塩酸（ｐＦＩ７．５）、　ＩｍＮ　ＥＤＴＡを透析外
液として透析を行なった。透析後の液をＤＥ！ＡＥセフ
ァセルカラムクロマトグラフィー（２０ｍＭトリス塩酸
（ｐＨ７，５）１ｍＭ　ＥＤＴＡ緩衝液で平衡化）にが
け、素通りを分画した。これを硫酸アンモニウム濃度２
Ｍとして、トヨバールＨ１１５５−３による疎水クロマ
トグラフィー（硫安濃度勾配２１開にて展開）で分画し
た。これを硫安濃度２Ｎとした後、ブチルトヨパール６
５０Ｓによる疎水クロマトグラフィー（硫安濃度２Ｍ−
硫安濃度ＯＮ、　１０％グリセロール勾配にて展開）で
分画した。これを濃縮後、セファクリル８２００カラム
クロマトグラフイー（２０ｍＭ　トリス塩酸、１ｍＭ　
ＥＤＴＡで展開）により分画し、最後に活性両分を高速
液体クロマトグラフィー（ゲル濾適用担体ＴＳＫ　Ｇｅ
ｌ　Ｇ３０００．０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，９）
で展開）にかけ鋭いピークが分子量８万５千の位置に得
られた。この両分はポリアクリルアミドゲル電気泳動で
１本のバンドとして得られ、またドデシル硫酸ナトリウ
ム存在下のポリアクリルアミドゲル電気泳動で分子量５
万の位置にシーのバンドとして得られ、同一サブユニッ
トからなるダイマー酵素であると考えられた。比活性で
約２００倍にまで精製された。

実施例２ 以下の操作は特記しない限り全て室温で行なわれた。好
酸好熱性古細菌スルホロブス　アシドカルダリウスを培
地（酵母エキスＩｇ、カザミノ酸Ｉｇ、グ）Ｌｔ’：１
−Ｘ　１　ｇ　、　ＮａＣ（１０，２ｇリン酸ｌカリウ
ム０．３ｇ、硫酸アンモニウム１．３ｇ、硫酸マグネシ
ウム７水塩０．２５ｇ、塩化カルシウム２水塩Ｏ，ＯＳ
ｇをＩＱの水に溶解し、硫酸でｐＨを２．５に調Ｉりで
７５℃で４日間振どう培養（湿！！量約１ｇ／Ｊ）Ｌ、
た後、重炭酸ナトリウムを加え、Ｐｉ（を５にした後、
遠心分離により集菌した。ついで洗浄した後、トリス塩
酸（ｐＨ８）でｐＨを７．５に調整して溶菌し、ＤＮａ
ｓｅ。

ＲＮａｓｅを加え、３７℃で７時間放置し、　ＤＮＡ、
　ＲＮＡを分解した。これを遠心し、上溝と沈渣に分離
した。

この沈渣を５０５Ｍ　トリス塩酸に懸濁し塩化カリウム
を加え終濃度０．５Ｍとしてホモジナイズした後遠心し
た。この上清に０．２Ｍクエン酸−０，１Ｍリン酸２ナ
トリウムｐＨ２，６の緩衝液を加え、　ＰＨを４として
遠心により沈殿する蛋白質を除いた０次いで上清を４０
％硫安飽和にして、トヨパールＨＶ５５−Ｓカラムに吸
着させ、３０％飽和へと硫安濃度を下げて展開すると活
性画分が得られたので、これをブチルトヨパール６５０
８カラムクロマトグラフイー（硫安濃度４０％−０％勾
配で展開）にかけ、活性のある画分を集めた。これを２
０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液に対して透析し、　Ｄ１
１！ＡＨセファセルカラムに吸着させ。

塩濃度をＯから０．５Ｍへと直線的に上昇させて溶出す
る活性画分を集めた。これを再び透析して、ブルートヨ
バールカラムに吸着させ、０．５阿ＫＣＱを含む緩衝液
で溶出させた。この画分を濃縮し、高速液体クロマトグ
ラフィー（ＴＳＫ　Ｇｅｌ　Ｔｙｐｅ　Ｇ３００００．
２Ｍリン酸ナトリウム、　１ｍＭ　ＥＤＴＡで展開）に
かけ。

鋭いピークが分子量８万５千の位置に得られた。

この両分はポリアクリルアミドゲル電気泳動で一本のバ
ンドとして得られ、またドデシル硫酸ナトリウム存在下
のポリアクリルアミドゲル電気泳動で分子ｊｔ４万２千
の位置に曝−のバンドとして得られ、アイデンテイカル
ダイマーであると考えられた。比活性で約２００倍にま
で精製された。

（発明の効果） 本発明によれば、耐熱性イソクエン酸脱水素酵素が微生
物を用いる発酵法によって、工業的に大量生産すること
ができる。

しか気水発明によって得られた耐熱性ＩＣＤＨは。

きわめて耐熱性が高く、変性剤に対する耐性もきわめて
高く、補酵素としてＮＡＤ、　ＮＡＤＰの両者を用いる
ものであるが、細菌起源のＩＣＤＨの中でこのように卓
越した性質を併有するものは全く知られておらず、した
がって本発明に係る酵素は、従来未知の新規酵素である
。

本酵素は上記したように耐熱性及び高度の安定性といっ
た卓越した性質を有しているので、高温での反応、変性
剤の存在下での反応において自由に使用することができ
、各種の工業的用途１分析化学の用途、その他の用途に
広範に利用することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図、第２図及び第３図、第４図は、実施例１及び２
によって得た酵素について、これを９０℃に１５分間維
持した後の残存活性及び活性化エネルギーをそれぞれ図
示したものである。 第５〜７図は、各種濃度における尿素、グアニジン塩酸
及びドデシル硫酸ナトリウム中での実施例１によって得
た酵素の活性の変化をそれぞれ図示したものである。 代理人　弁理士　戸　１）親　男 第　１　　図 イシキヱー）°−ショシ；Ａ／ｌ　　Ｔ（’Ｃ）Ｉｓ２
図 イシキューＸ−シＭシｊし曳Ｔ（”Ｃ）第　　３　　図 Ｔ（’Ｃ） ２Ｂ３Ω　：１２　３．４　３．６ １１Ｔｘ１０３ 第　　４　　図 Ｔ（”Ｃ） １／Ｔに１０３ 第　　５　　図 星素（Ｍ） 第　　６　　図 り′アニジ２塩酸　（Ｍ） ふ−一一一ム　アタ曳ｌ厳　ＩＣＤＨ 第　　７　　図

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. テルムス属又はスルホロブス属に属する耐熱性イソクエ
   ン酸脱水素酵素生産菌を培養し、培養物から該酵素を採
   取することを特徴とする耐熱性イソクエン酸脱水素酵素
   の製法。