JPH05137572A

JPH05137572A - 耐熱性アデノシン−５’−３リン酸スルフリラーゼ及びその製造法

Info

Publication number: JPH05137572A
Application number: JP3326950A
Authority: JP
Inventors: Mayumi Hayashi; まゆみ林; Mika Manabe; 美香真鍋; Masaaki Onda; 昌明恩田; Shinichi Tokumitsu; 伸一徳光; Hiroshi Nakajima; 中島　　宏
Original assignee: Unitika Ltd
Current assignee: Unitika Ltd
Priority date: 1991-11-14
Filing date: 1991-11-14
Publication date: 1993-06-01
Anticipated expiration: 2015-08-21
Also published as: JP3078067B2

Abstract

(57)【要約】【構成】約６０℃の緩衝液中で約１５分間処理した後
の活性が、処理前の活性の約９５％の値を保持している
耐熱性のアデノシン−5'−３リン酸スルフリラーゼ及び
前記の耐熱性のアデノシン−5'−３リン酸スルフリラー
ゼの産生能を有するバチルス属の細菌を一般的栄養培地
を用いて培養し、菌体破砕後、必要に応じて、除核酸・
クロマトグラフィー等の操作により、約６０℃の緩衝液
中で約１５分間処理した後の活性が、処理前の活性の約
９５％の値を保持している耐熱性のアデノシン−5'−３
リン酸スルフリラーゼを取得する。【効果】バイオリアクターに有用に用いうる性質を有
する耐熱性のアデノシン−5'−３リン酸スルフリラーゼ
を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、熱安定性に優れたバイ
オリアクターに有用に用いうる性質を有する耐熱性アデ
ノシン−5'−３リン酸スルフリラーゼ（以下，ＡＴＰス
ルフリラーゼという。）及びその製造法に関するもので
ある。

【０００２】

【従来の技術】3'−ホスホアデノシン−5'−ホスホスル
フェート（以下，ＰＡＰＳという）は、微生物から植
物、高等動物に至るまで広く分布する硫酸基供与体であ
る。生体中のＰＡＰＳとプロテオグルカン疾患に代表さ
れるいくつかの疾患との関わりが報告されている〔ブレ
インリサーチ(Brain Research)，Vol.20,p.341-360(197
0)〕。このように、ＰＡＰＳの生体内での役割は非常に
重要であり、医薬などの分野に高い利用価値があると考
えられる。ＰＡＰＳは、下記のように、アデノシン−5'
−３リン酸（以下，ＡＴＰという。）から、ＡＴＰスル
フリラーゼとアデノシン−5'−ホスホスルフェートキナ
ーゼ（以下、ＡＰＳキナーゼという。）の二つの酵素の
働きで合成される物質である。

【０００３】（式中、ＡＰＳは、アデノシン−5'−ホスホスルフェー
トを表す。）

【０００４】従来、ＰＡＰＳ合成に重要である酵素の一
つであるＡＴＰスルフリラーゼは、湿菌体当たりの含量
が非常に低く、そのためにＰＡＰＳを大量に合成できな
いという問題点があった。また、パン酵母（Dry baker'
s yeast, Sigma YSC-1）のＡＴＰスルフリラーゼを３０
℃で保温したところ、１時間で残存活性が約７％しかな
く、ＡＴＰスルフリラーゼは非常に熱に不安定であり、
この酵素とＡＰＳキナーゼを用いて、ＰＡＰＳを効率的
に合成することが出来なかった。

【０００５】上述のような理由から、ＰＡＰＳを効率的
に合成する場合や、ＡＰＳと病態との関連を調べるため
に本酵素の逆反応を利用して体液中のＡＰＳ濃度の測定
等に利用しようとする場合、工業的に実施できるものが
なく、実用化することが強く要望されていた。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記したよ
うな観点から、安定性の高いＡＴＰスルフリラーゼ及び
その製造法を提供することを目的とするものである。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、安定性の
高いＡＴＰスルフリラーゼを効率よく得ることを目的と
して鋭意研究した結果、バチルス・アシドカルダリウス
（Bacillus acidocaldarius），バチルス・コアギュラ
ンス（B.coagulans ），バチルス・リケニフォルミス
（B.licheniformis ），バチルス・シェレゲリ（B.schl
egelii），バチルス・ステアロサーモフィルス（B.stea
rothermophilus）などのバチルス属の細菌が、上記の性
質を有するＡＴＰスルフリラーゼを生産することを見出
し、本発明を完成するに至った。

【０００８】すなわち、本発明は、以下の理化学的性質
を有する耐熱性アデノシン−5'−３リン酸スルフリラー
ゼ及び；（イ）作用：ＡＴＰとＳＯ₄ ^2-に作用し、ＡＰＳを生成
する。（ロ）至適ｐＨ：約７.5〜約８.0である。（ハ）作用適温：約５０℃〜約７０℃である。（ニ）耐熱性：約６０℃の緩衝液中で約１５分間処理し
た後の活性が、処理前の活性の約９５％の値を保持して
いる。（ホ）分子量：約７６０００（ゲル濾過法）。バチルス属の細菌（Bacillus sp. ）を培養し、培養物
から以下の理化学的性質を有する耐熱性アデノシン−5'
−３リン酸スルフリラーゼを採取することを特徴とする
耐熱性アデノシン−5'−３リン酸スルフリラーゼの製造
法を要旨とするものである。（イ）作用：ＡＴＰとＳＯ₄ ^2-に作用し、ＡＰＳを生成
する。（ロ）至適ｐＨ：約７.5〜約８.0である。（ハ）作用適温：約５０℃〜約７０℃である。（ニ）耐熱性：約６０℃の緩衝液中で約１５分間処理し
た後の活性が、処理前の活性の約９５％の値を保持して
いる。（ホ）分子量：約７６０００（ゲル濾過法）。

【０００９】以下、本発明を詳細に説明する。本発明の
耐熱性ＡＴＰスルフリラーゼは以下の理化学的性質を有
するものである。（イ）作用：ＡＴＰとＳＯ₄ ^2-に作用し、ＡＰＳを生成
する。（ロ）基質特異性：正反応においては、硫酸塩およびＡ
ＴＰが基質となる。しかし、ＡＭＰには実質上作用しな
い。逆反応においては、ＡＰＳとピロリン酸塩が基質と
なる。（ハ）至適ｐＨ：後述する力価の測定法に従い、用いる
緩衝液のｐＨを変えて力価を測定した結果、図１に示す
とおり約７.5〜８.0である。（ニ）安定ｐＨ：ｐＨ５.0〜10.0の緩衝液中で、４℃、
２２時間保存した後、後述する力価の測定法に従って力
価を測定した。その結果は図２に示すとおり約５.0〜
７.5である。（ホ）作用適温：温度を２０℃〜８０℃に変え、後述の
方法で力価の測定を行った。作用適温は約５０℃〜約７
０℃である。（ヘ）耐熱性：約６０℃の緩衝液中で約１５分間処理し
た後、後述する力価の測定法により活性を測定した結
果、処理前の活性の９５％の値を保持している。（ト）分子量：ゲル濾過法により分子量を測定した。分
子量は約７６０００である。

【００１０】（チ）力価の測定法：測定原理は、ＡＴＰ
とＨ₂Ｏを基質として酵素を作用させると、ＡＭＰとピ
ロリン酸が生成する。これにピロホスファターゼを作用
させ、生じた無機リン酸を定量するものである。〔試薬〕基質： 100mM ＡＴＰ緩衝液：100mM トリス塩酸緩衝液(pH8.0）酵素： 70u/ml ピロホスファターゼ（ベーリンガーマ
ンハイム山之内社製）その他塩類：100mM モリブデン酸ナトリウム１ M 塩化マグネシウムキット：ホスファＣ−テストワコー（和光純薬社製）〔操作〕上記基質ＡＴＰ５０μｌと、緩衝液５０μｌ
と、モリブデン酸ナトリウム５０μｌと、塩化マグネシ
ウム５μｌと、ピロホスファターゼ３μｌを撹拌混和し
た後、酵素溶液１００μｌを加えて３０℃で１０分間反
応させる。反応終了後、３規定硫酸を５０μｌ加えて撹
拌混和し、反応を停止させる。生成した無機リン酸を無
機リン酸測定用キットを用いて定量する。盲検として、
酵素溶液無添加のものについて同様に処理したものを用
いる。酵素活性の表示は、１分間に２μｍｏｌのリン酸
（１μｍｏｌのピロリン酸）を生成する酵素量を１Ｕと
する。

【００１１】本発明の耐熱性ＡＴＰスルフリラーゼは、
バチルス属の細菌から得られるものであり、そのような
バチルス属の細菌としては、例えばバチルス・アシドカ
ルダリウス（Bacillus acidocaldarius），バチルス・
コアギュランス（B.coagulans ），バチルス・リケニフ
ォルミス（B.licheniformis ），バチルス・シェレゲリ
（B.schlegelii），バチルス・ステアロサーモフィルス
（B.stearothermophilus）などがあげられる。

【００１２】次に本発明の耐熱性ＡＴＰスルフリラーゼ
の製造法について説明する。本発明の耐熱性ＡＴＰスル
フリラーゼの製造法は、上記したようなバチルス属の細
菌を培養し、その培養物から耐熱性のＡＴＰスルフリラ
ーゼを採取するものである。本発明におけるバチルス属
の細菌を培養するに際して用いられる栄養培地におい
て、炭素源として、例えば、グルコース、シュークロー
ス、フルクトース、殿粉加水分解物、糖密、亜硫酸パル
プ廃液の糖類、酢酸、乳酸等の有機酸類、さらには使用
する細菌が資化しうるアルコール類、油脂、脂肪酸およ
びグリセリン等が使用でき、窒素源として、例えば、硫
酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウ
ム、アンモニア、アミノ酸、ペプトン、肉エキス、酵母
エキス等の無機または有機物が使用できる。さらに無機
塩類として、例えば、カリウム、ナトリウム、リン酸、
亜鉛、鉄、マグネシウム、マンガン、銅、カルシウム、
コバルト等の各塩類、必要に応じて微量金属塩、コーン
スティープリカー、ビタミン類、核酸等を使用してもよ
く、細菌の一般的栄養培地が使用できる。これらの培地
を用いて、バチルス属の細菌を２０〜８０℃、好ましく
は４０〜７０℃、最適には６０℃で、２〜６時間、好気
的に培養すればよい。

【００１３】本発明で細胞破砕液を得る手段としては、
例えば、培養物から菌体を集菌したのち、ホモジナイザ
ー、ブレンダー、マントンゴーリン、ダイノミル、フレ
ンチプレス、超音波処理、凍結融解、リゾチーム処理等
により細胞を破砕して得ることが出来る。

【００１４】次に上記細胞破砕液（細胞抽出液）にカチ
オン系高分子凝集剤を添加して、細胞破砕片及び核酸を
沈澱させる。本発明に用いられるカチオン系高分子凝集
剤としては、例えば、ポリアミノアルキルメタアクリレ
ート類、ポリアミノアルキルメタアクリレートとアクリ
ルアミドの共重合物類、ポリアクリルアミドのマンニツ
ヒ変性物類、ポリジメチルジアリルアンモニウム塩類、
ポリビニルイミダゾリン類、ポリアクリルアミド類、ア
ミン系重縮合物類などがあげられる。その際の高分子凝
集剤の添加量としては、凝集剤の種類によって異なる
が、破砕した微生物の乾燥重量１００重量部に対し１〜
４０重量部が好ましい。このカチオン系高分子凝集剤を
予め水に溶解した後、細胞破砕液に添加して１０分から
２４時間撹拌する。また、ｐＨの調整が必要な場合に
は、適宜１０〜２００ｍＭになるように緩衝液を加える
こともできるし、蛋白質の安定化のために、グルコース
を細胞破砕液１００重量部に対し、１〜５０重量部添加
してもよい。

【００１５】次いで沈澱させた細胞破砕片及び核酸を分
離する。そのためには、例えば、静置するか、遠心分離
するか、あるいは濾過するかして行えばよい。これらの
操作により、粗酵素標品を得ることができる。さらに高
度に精製された酵素標品を得るには、ゲル濾過クロマト
グラフィー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティ
ークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィ等
の各種クロマトグラフィーを用いることができる。本発
明のＡＰＳキナーゼは、特にアフィニティークロマトグ
ラフィーを用いた場合、精製倍率が高くなり、より好ま
しい。上記のような方法により、本発明のＡＰＳキナー
ゼの標品が得られる。

【００１６】

【実施例】以下に本発明を実施例により具体的に説明す
る。実施例中、酵素標品の蛋白質量は、２８０ｎｍの吸
収１を蛋白質１ｍｇ／ｍｌと仮定して求めた。実施例１グルコース濃度１％、酵母エキス濃度１％、リン酸濃度
0.１％及び若干のミネラルを含んだ培地を殺菌した後、
ｐＨを６.5に調整し、バチルス・ステアロサーモフィル
ス（ＮＣＡ１５０３株）を接種し、培養を行った。６０
℃で３時間培養後、培地中のグルコースが消費されたこ
とを確認し、遠心分離にて集菌して菌体を得た。上記の
ようにして得られた湿菌体を凍結融解法で破砕したの
ち、ポリアクリルアミド系の高分子凝集剤を用いて除核
酸を行った。生じた沈澱を遠心分離で除去して、上清を
得た。

【００１７】あらかじめ５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．５）で平衡化したＤＥＡＥ−セファロースカラム
に上清をアプライしたところ、ＡＴＰスルフリラーゼが
吸着されたので、同緩衝液で十分洗浄したのち、同緩衝
液を用いて０から５００ｍＭの塩化ナトリウムの直線濃
度勾配にて溶出を行った。その活性画分を回収し、１Ｍ
となるよう硫酸アンモニウムを加えた。これを１Ｍ硫酸
アンモニウムを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液ｐＨ７．
５で平衡化したフェニルセファロースカラムにアプライ
した。同緩衝液で十分洗浄した後、５０ｍＭトリス塩酸
緩衝液ｐＨ７．５を送液した。得られた活性画分を回収
し、濃縮、透析した後、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液ｐＨ
７．５で平衡化したマトリックスゲルブルーＡカラムに
アプライした。同緩衝液で十分洗浄した後、１Ｍ塩化カ
リウムを含む同緩衝液を送液した。活性画分を回収し、
ポリアクリルアミド電気泳動を行ったところ、単一なバ
ンドが得られた。

【００１８】酵素標品の比活性は、１２．１Ｕ／ｍｇで
あった。得られた酵素標品について、理化学的諸性質を
調べたところ前記した（イ）から（チ）に記載した性質
を有していた。

【００１９】実施例２グルコース濃度0.７％、酵母エキス濃度0.８％、リン酸
濃度0.０５％及び若干のミネラルを含んだ培地を殺菌し
た後、ｐＨを７.0に調整し、バチルス・コアギュランス
（ＡＴＣＣ７０５０株）を接種し、培養を行った。６２
℃で４時間培養後、培地中のグルコースが消費されたこ
とを確認し、遠心分離にて集菌して菌体を得た。上記の
ようにして得られた湿菌体をフレンチプレスにて破砕し
たのち、ポリアクリルアミド系の高分子凝集剤を用いて
除核酸を行った。生じた沈澱を遠心分離で除去して、Ａ
ＴＰスルフリラーゼを含む粗抽出液を得た。

【００２０】あらかじめ５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．５）で平衡化したＤＥＡＥ−セファロースカラム
に上清をアプライしたところ、ＡＴＰスルフリラーゼが
吸着されたので、同緩衝液で十分洗浄したのち、同緩衝
液を用いて０から０．４Ｍの塩化ナトリウムの直線濃度
勾配にて溶出を行った。その活性画分を回収し、濃縮し
た。これを５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）を
溶出液に用いたウルトロゲルＡＣＡ３４カラムクロマト
グラフィーにより分画し、活性画分を得た。活性画分を
回収し、同緩衝液で平衡化したヒドロキシルアパタイト
カラムにアプライした。同緩衝液で十分洗浄した後、１
００ｍＭリン酸二カリウムを含む同緩衝液を送液した。
濃縮後、ポリアクリルアミド電気泳動で単一なバンドを
与えるまで精製できた。

【００２１】この酵素標品の比活性は、１０．５Ｕ／ｍ
ｇであった。得られた酵素標品について、理化学的諸性
質を調べたところ前記した（イ）から（チ）に記載した
性質を有していた。

【００２２】

【発明の効果】本発明のＡＴＰスルフリラーゼは、従来
知られているＡＴＰスルフリラーゼに比べ、はるかに熱
安定性に優れているため、産業界に与えるメリットは甚
大である。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明のＡＴＰスルフリラーゼの至適ｐＨ曲線
を示す図である。

【図２】本発明のＡＴＰスルフリラーゼのｐＨ安定性曲
線を示す図である。

【図３】本発明のＡＴＰスルフリラーゼの熱安定性（耐
熱性）を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者徳光伸一京都府宇治市宇治小桜23番地ユニチカ株式会社中央研究所内 (72)発明者中島宏京都府宇治市宇治小桜23番地ユニチカ株式会社中央研究所内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】以下の理化学的性質を有する耐熱性アデ
ノシン−5'−３リン酸スルフリラーゼ。（イ）作用：アデノシン−5'−３リン酸と硫酸イオンに
作用し、アデノシン−5'−ホスホスルフェートを生成す
る。（ロ）至適ｐＨ：約７.5〜約８.0である。（ハ）作用適温：約５０℃〜約７０℃である。（ニ）耐熱性：約６０℃の緩衝液中で約１５分間処理し
た後の活性が、処理前の活性の約９５％の値を保持して
いる。（ホ）分子量：約７６０００（ゲル濾過法）。
【請求項２】バチルス属の細菌（Bacillus sp. ）を
培養し、培養物から以下の理化学的性質を有する耐熱性
アデノシン−5'−３リン酸スルフリラーゼを採取するこ
とを特徴とする耐熱性アデノシン−5'−３リン酸スルフ
リラーゼの製造法。（イ）作用：アデノシン−5'−３リン酸と硫酸イオンに
作用し、アデノシン−5'−ホスホスルフェートを生成す
る。（ロ）至適ｐＨ：約７.5〜約８.0である。（ハ）作用適温：約５０℃〜約７０℃である。（ニ）耐熱性：約６０℃の緩衝液中で約１５分間処理し
た後の活性が、処理前の活性の約９５％の値を保持して
いる。（ホ）分子量：約７６０００（ゲル濾過法）。