JPH03292887A - 新規なエキソ型加水分解酵素及びイヌロペンタオースの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発Ｆ３ＡＩ；、フルクタンをそのフルクトース末端側
から５個の糖単位ごとに特異的に加水分解する、従来ま
ったく知られていなかった新規なエキソ型加水分解酵素
（エキソーイヌロペンタオヒドロラーゼ（仮称））及び
該酵素を用いてイヌロペンタオースを製造する方法に関
する。

［従来の技術及び発明が解決しようとする問題点］フル
クトースが５個結合したイヌロペンタオースは、高機能
（ビフィズス因子、抗う触性、低カロリー等）を有する
イヌロオリゴ糖であり、食品、あるいは医薬品分野に有
用である。

従来、フルクタンからイヌロペンタオースを製造する方
法として、フルクタン、例えばイヌリンを酸で加水分解
する方法が知られている。

しかし、この方法によると生成物の大部分がフルクトー
スであり、イヌロオリゴ糖、もとよりイヌロベンタオー
スの生成収率が極めて悪く、しかも、着色物質が生成し
たり、ジフルクトースアンハイドライドのような副生物
が生じてイヌロペンタオースの精製を困難にしていた。

一方、酵素を利用してフルクタンを分解し、イヌロペン
タオースを製造する方法が提案されている。しかし、従
来知られている酵素は、フルクタンをランダムに加水分
解するエンド型イヌリキーゼが知られているのみであり
、従って、例えばイヌリンに作用させた場合、イヌロペ
ンタオースの他、イヌロビオース、イヌロトリオース、
イヌロチトラオースやイヌロチトラオースなど種々のフ
ルクトースが結合したイヌロオリゴ糖が生成し、しかも
、副生フルクトースを生じるなど生成収率は低く、目的
とするイヌロペンタオースの製造には不適当であった。

［問題点を解決するための手段Ｊ 本発明者らは、フルクタンからイヌロペンタオースを製
造する方法について鋭意検討した結果、フルクタンを５
個のフルクトースが結合した糖単位に特異的に加水分解
する性質を有する、従来まったく知られていなかった新
規なエキソ型加水分解酵素（エキソーイヌロペンタオヒ
ドロラーゼ（仮称））をはじめて見いだし、本発明を完
成するに至った。

即ち、本発明の要旨は、フルクタンに作用し、フルクタ
ンのフルクトース末端側から５個の糖単位ごとに加水分
解してイヌロペンタオースを生成させる性質を有するこ
とを特徴とする新規なエキソ型加水分解酵素及び、フル
クタンのフルクトース端末側から５個の糖単位ごとに加
水分解してイヌロペンタオースを生成させる性質を有す
る新規なエキソ型加水分解酵素とフルクタンとを反応さ
せることを特徴とするイヌロペンタオースの製造方法に
存する。

以下本発明につき、詳細に説明する。

イヌロオリゴ糖を生成する酵素（イヌリナーゼ）として
従来知られている酵素は、イヌリン等をランダムに加水
分解して種々の数のフルクトースが結合したイヌロオリ
ゴ糖を生成させるエンド型のもの、エキソ型として１個
の等単位ごとに加水分解してフルクトースのみを生成さ
せるもの及びジフルクトースアンハイドライドを生成さ
せるもののみであり、本発明の上記性質を有する酵素は
従来知られていなかったまったく新しいタイプのエキソ
型加水分解酵素である。

本発明の酵素は、例えばバチルス属に属する微生物から
得られる。具体的には、バチルスニスビー（Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ　ｓｐ、）　ＭＣＩ　２４９５号菌から得られる
。

かかる菌株は、微工研菌寄第１１３７０号（ＦＥＲＭＰ
　−１１３７０）として寄託されている。

バチルスエスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ、）　ＭＣ
Ｉ　２４９５号菌は、本発明者等により、天然土壌から
分離された細菌であり、その菌学的性状は次の通りであ
る。

１、形態的性状 ○Ｊ寒天培地（トリプトン０．５％、酵母エキス１．５
％、Ｋ２ＨＰＯ４０，３％、グルコース０．２％、寒天
１．５％、ｐＨ７，３〜７．５）上、３７°Ｃ，１週間
のコロニーの特徴 １）外　形　　　二　　円形 ２）大きさ　　　：　　２〜３ｍｍ ３）表面の隆起　：　　凸状 ４）表面の形状　：　　平滑 ５）光　沢　　　：　　鈍光 ６）色　調　　　：　　灰色 ７）透明度　　　二　　半透明 ８）周　縁　　　：　　全線 ○５ｏｉｌ　ｅｘｔｒａｃｔ寒天培地（Ｒ，Ｅ、　Ｇｏ
ｒｄｏｎ　ｅｔ、　ａｔ、、　ＴｈｅＧｅｎｕｓ　Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ、　Ｐ、　１０１．　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕ
ｒｅ　Ｈａｎｄ　ｂｏｏｋＮｏ、　４２７．１９７３　
）上、３７°Ｃ１４８時間培養中の形態的性質 １）細胞形態　：細胞は短稈状で、連鎖上に連なってい
るものもある ：あり ：細胞中央部に楕円形の芽胞 を形成する ４）グラム染色：陽性 ５）抗酸性　　：陰性 ２、生理的性質 １）嫌気条件下での生育：陰性 ２）空気中での生育　　：陽性 ３）カタラーゼ　　　　：陽性 ４）オキシダーゼ　　　：陽性 ５）Ｏ−Ｆテスト　　　　：　０ｘｉｄａｔｉｖｅ６）
ゼラチンの加水分解：陰性 ７）リドマス・ミルク　　：リドマス脱色、ペプトン化
あり ２）運動性 ３）胞子形成 ８）硝酸塩の還元　　　：陽性 ９）メチルレッドテスト　：陰性 １ａ）　ＶＰテスト　　　　　　：陰性（ｐＨ５，２）
１１）インドールの生成　：陰性 １２）硫化水素の生成　　：陰性 １３）デンプンの加水分解：陽性 １４）クエン酸の利用　　　：陽性 （クリステンセン培地上） １５）無機窒素源の利用　：陽性（アンモニウム塩）１
６）ウレアーゼ　　　　　：陰性 １７）カゼインの加水分解：陰性 １８）　Ｄ　Ｎａ５ｅの生産　　　：陰性１９）２％塩
化ナトリウム中での生育　：　陽性５％塩化ナトリウム
中での生育　：　陰性２０）色素の生成　　　　　：陰
性 ２１）生育温度域　　　　：１５〜４０°Ｃ２２）生育
ｐＨ：ｐＨ５〜９ ２３）　Ｔｗｅｅｎ　８０の分解　　：陽性２４）チロ
シン分解性　　：陰性 ２５）リゾチーム耐性　　　：陽性 （ｉｏ、ｏｏｏユニット／　ｍｅ） ２６）各種糖類からの酸の生成 培養後１〜２週間観察 申　培養後１〜２週間観察 ネすべての炭素源についてガスの生成はなかったネ　＋
：生成能有（強）、十ｗｅａｋ　：生成能有（弱）、−
二生成能無 ３、化学分類学的性状 １）ＤＮＡ中のＧＣ含量　５２．５％ ２）細胞壁のジアミノ−アミン酸（全菌体氷解物）ｍｅ
ｓｏ−ジアミノピメリン酸 ３）全菌体糖組成　　　　グルコース、リボース４）主
要メナキノン　　　ＭＫ−７ ４、分類学的考察 Ｏ属しベルの同定 本菌株（ＭＣＩ　１２４９５２４９５号菌）グラム陽性
桿菌である。

２）運動性を有する。

３）芽胞を形成する。

４）グルコースから酸を生成する。

５）細胞壁のジアミノ−アミノ酸はｍｅｓｏ−ジアミノ
ピメリン酸を有する。

６）主要メナキノンはＭＫ−７を有する。

などの特徴を示す。

これらの特徴から、本菌株バージエイ、Ｃ−ｒニュアル
オブシステマティックバクテリオロジ−（Ｂｅｒｇｅｙ
’ｓ　Ｍａｎｎｕａｌ　ｏｆ　Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　
Ｂａｃｔｅｒ−ｉｏｌｏｇｙ）第２巻に記載されている
、内生胞子形成、ダラム染色陽性桿菌及び球菌（Ｅｎｄ
ｏｓｐｏｒｅ　−ｆｏｒｍｉｎｇ　Ｇｒａｍ　−Ｐｏ５
ｉｔｉｖｅ　Ｒｏｄｓ　ａｎｄ　Ｃｏｃｃｉ）群のバチ
ルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属菌に帰属することが判明し
た。

０種レベルの同定 バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属菌には、現在約５０種
近い菌が含まれている。これらの種は、芽胞の形態・形
成部位、各種の生理学的性質及び化学分類学的性質によ
って識別されている。特にＧＣ含量が３２〜６９％と幅
広い範囲に渡っており、その相違は種の特徴として取り
上げられている。

本菌株（ＭＣＩ　２４９５号菌）のＤＮＡ中のＧＣ含量
は５２．５％であり、パージエイズマニュアル第２巻（
前述）に基づいて検索したところ、本菌に近いＧＣ含量
を持つ種として、Ｂ、　ｍａｃｅｒａｎｓ　Ｂ。

ｖａｌｉｄｕｓ、　Ｂ、　ａ　ａｒｏｒｅｘｅｄａｎｓ
、及びＢ、　５ｔｅａｒｏｔｈ＝虹四ｍｌ屯匹、影胆肋
立虫匹ナトカ挙げラレる。

しかし、Ｂ、ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍ　ｈｉｌｕｓ　Ｂ
、ｃａｌｄｏｌ　ｔｉｃｕｓは好熱細菌であり、生育温
度範囲の点で明らかに区別された。また、Ｂ、　ｍａｃ
ｅｒａｎｓ、　Ｂ、　ｖａＬｉｄｕｓ。

Ｂ、ａ　ａｒｏｒｅｘｅｄａｎｓなどの菌とは糖からの
酸の生成、チロシン分解性、リゾチーム耐性などの生理
学的性質において一致しなかった。さらに本菌は普通寒
天やハートインフュージョン寒天培地等の一般細菌生育
用の培地では殆ど生育が認められないという特徴を持っ
ている。従って種の帰属は、今後これらの類似様と核酸
レベルで比較した上で決定することとし、現段階では、
本菌株（ＭＣＩ　２４９５号菌）をバチルスエスピー（
Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ、　）と同定した。

本発明の新規エキソ型加水分解酵素を生産するための本
菌株（ＭＣＩ　２４９５号菌）の培養は、通常の微生物
が利用し得る栄養物を含有する培地で行うことができる
。

具体的には、β−２−１′フラクトシド結合を含むフラ
クトオリゴ糖、イヌロオリゴ糖、イヌリン等のフルクタ
ンを基質とし、その細菌の生育に必要な成分、例えば窒
素源として、大豆粉、小麦胚芽、コーンステイープリカ
ー、綿実粕、肉エキス、ペプトン、酵母エキス、硫酸ア
ンモニウム、硝酸ソーダ、尿素等を使用し、必要に応じ
、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、
コバルト、塩素、硫酸及びその他のイオンを生成するこ
とのできる無機塩類、ビタミン類等を含む培地で培養す
る。その際、培地に加えるフルクタンの量は、例えばイ
ヌリンの場合、０．５〜２０％の範囲が有効である。

さらに、培養温度は２０〜３７°Ｃが、また培養時間は
２４〜９６時間が適当である。

培養終了後、培養液を遠心分離により除菌し、得られた
ろ液に硫安（６５％飽和）を加え塩析を行い、析出した
沈澱物を遠心分離により取得し、少量の水に懸濁させた
後透析を行い、粗酵素液を得る。この粗酵素液を例えば
ｐＨ７，０に調製した０、０１〜０．１Ｍのリン酸緩衝
液中でイヌリンに作用させる事のよって所期のイヌロペ
ンタオースが得られる。

本酵素は、例えばＤＥＡＥ　−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ　６
５０　Ｍ　（東ソー社製）によるイオン交換クロマトグ
ラフィーＴｏｙｏｐｅａｌ　ＨＷ　５５　（東ソー社製
）による分子ふるいにて精製を行う事により、電気泳動
的に単一のバンドを示す酵素標品を得ることができる。

本酵素標品の至適ｐＨは６で、また６０’Ｃで最大活性
を示した。ｐＨは５〜７の範囲で安定であり３０分間の
熱処理では４０　’Ｃまで安定である。

本発明の酵素を使用してイヌロペンタオースを製造する
方法は、フルクトースを６個以上を含むフルクタン、特
にイヌリンを基質に用い、酵素を作用させる事により、
イヌロペンタオースを製造することができる。作用させ
る酵素としては培養上清から精製した精製酵素を使って
も良いし、また上記基質を含んだ培地で菌体を培養した
ときの培養上清を使っても良い。あるいは、酵素もしく
は菌体を公知の方法で固定化担体に吸着、結合、包括さ
せたものを使っても良い。

例えば精製酵素を作用させるときは、イヌリン０．１〜
１０％含有０，１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，５）に酵素
０．０１〜１０単位で、２０〜５０°Ｃ１５分〜１００
時間の条件で作用させると、反応の所期段階からイヌロ
ペンタオースが特異的に生成する。

また上記基質含有培地で菌体を培養すると、培養液中に
イヌロペンタオースが生成する。この培養物を除菌し、
得られた培養上清を、活性炭処理、脱塩処理する事によ
り、不純物塩等を取り除く。次に得られた物で活性炭カ
ラムクロマトグラフィーを行う。エタノールＯ〜１０％
の濃度勾配溶出を行うと、５〜１０％のフラクション部
分にイヌロペンタオースが溶出され、エタノールを除く
事により培養上溝中のイヌロペンタオースを精製するこ
とができる。

［実施例１ 次に本発明を実施例により詳しく説明するが、本発明は
その要旨を越えない限り、以下に限定されるものではな
い。

実施例１ 市販イヌリン５％、酵母エキス０．０２％、硝酸ナトリ
ウム０．２％、硫酸マグネシウム０，０５％、塩化カリ
ウム０．０５％、リン酸−カリウム０．０５％、塩化第
二鉄０．００１％を含んだ培地１５０ｍｅをｐＨ７，０
に調製して、１２０°Ｃで２０分間蒸気殺菌した。この
滅菌した溶液に、本菌株（ＭＣＩ　２４９５号菌）を−
白金耳接種し、１６０ｒｐｍで３０°Ｃ１３０時間培養
した。

培養終了後遠心分離により菌体を除去し、培養ろ液を得
た。得られた培養ろ液を１０分間加熱処理する事により
酵素を失活させ、約１０ｍ１にまで減圧濃縮した。この
液は活性炭カラム（活性炭３０ｇとセライ）Ｎｏ、５３
５　６０ｇの混合物を蒸留水にて充填）に吸着させ、蒸
留水１ぞを流した後、５％エタノール水溶液で溶出した
。

溶出ピークを集めて減圧濃縮にて乾固してイヌロペンタ
オースを得た。得られたイヌロペンタオースは、原料イ
ヌリンにたいして１０％であった。

実施例２ 実施例１で得られた培養ろ液１　ｍｔ’を、１０％のイ
ヌリンを含む０．０５　Ｍリン酸緩衝液４ｍｆｆに加え
て３０℃で一夜反応させた。

反応液を加熱した酵素を失活後、反応液中のイヌロオリ
ゴ糖の生成率をＨＰＬＣを用いて求めると、イヌロペン
タオースが２５．１％生成しており、他のイヌロオリゴ
糖の生成はみられなかった。

実施例３ 実施例１と同様な方法で５ｅ培養し、培養後遠心分離に
より除菌し上溝を粗酵素液とする。５ｅ粗酵素液に三菱
化成社製ハイポーラス型強塩基性陰イオン交換樹脂ＨＰ
Ａ　７５を６７　ｍＭ　、　ｐＨ６，９リン酸緩衝液で
緩衝化した物を８０　ｍｅ　（湿潤状態）加え、３゜０
Ｃで３時間板どう撹拌し酵素を吸着固定化した。

固定化酵素懸濁液を上記リン酸緩衝液１００ｍｅで３回
（計３００　ｍｅ　）洗浄後、吸引ろ過して湿潤固定化
酵素を得た。この固定化酵素を内径２０ｍｍのカラムに
高さ１８０ｍｍに充填し４０°Ｃに保温した。この充填
カラムに流速０．１　ｍｅ／分で水を１００ｍｅ流し安
定させた後、イヌリン３％水溶液１ｅを流速０．１　ｍ
ｅ　／分で流し反応させた。反応後活性炭によって脱色
し、脱塩液減圧濃縮した。実施例２と同様な方法で分析
した結果イヌロペンタオースｉｏ、ｉ　ｇが生成した。

［発明の効果１ 本発明の酵素は、フルクタンをそのフルクトース末端側
から５個の糖単位ごとに特異的に加水分解する新規なエ
キソ型加水分解酵素であり、該酵素を用いることにより
、食品あるいは医薬品分野に有用なイヌロペンタオース
を有利に製造することができる。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）フルクタンに作用し、フルクタンのフルクトース
   末端側から５個の糖単位ごとに加水分解してイヌロペン
   タオースを生成させる性質を有することを特徴とする新
   規なエキソ型加水分解酵素（２）フルクタンのフルクト
   ース末端側から５個の糖単位ごとに加水分解してイヌロ
   ペンタオースを生成させる性質を有する新規なエキソ型
   加水分解酵素とフルクタンとを反応させることを特徴と
   するイヌロペンタオースの製造方法。