JPH04144692A - ジフルクトース・ジアンヒドリドｉの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、ジフルクトース・ジアンヒドリドＩ（以下ｒ
　ＤＦＡＩ　Ｊと称す）の製造方法に関するものである
。

［従来の技術及び発明が解決しようとする問題点１ＤＦ
ＡＩはフルクトース２分子が１−２′、２−１′の間で
脱水縮合した構造を持つ三糖類であり、ジャクソンらに
より１９２９年に単離同定されている。

（Ｂｕｒ、　５ｔａｎｄ、　Ｊ、　Ｒｅ５−、３．１２
７．１９２９）。

ＤＦＡＩは、動物体内では代謝されない、非発酵性の糖
であるため低カロリー甘味剤として注目されており、今
後美容食等多方面に利用されることが予想される。

ジャクソンらは、フルクトースを主成分とする多糖であ
るイヌリンを酸加水分解することにより、ＤＦＡＩを得
ているが収率はわずか２％弱であり、化学的にイヌリン
を加水分解する方法は効率的とはいえない。

そこで近年、微生物学的方法を利用してイヌリンからＤ
ＦＡＩを製造する方法が提唱されている。例えば、特定
のかび（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ　、　Ｒｅｓ　、　、互、
　３４０゜１９７９　）或いはアルスロバクタ−・グロ
ビフォルミス（特開昭６２　＋　２７５６９３号公報）
の産生ずるイヌリン分解酵素を用いてイヌリンがらＤＦ
ＡＩを生成させることが報告されている。また、本発明
者らの一部は、アルスロバクタ−・エスピー（ＭＣＩ　
２４９３　）の産生ずるイヌリン分解酵素によりＤＦＡ
Ｉが生成することを報告している（特願平２−４４９９
６号）。しかしながら、微生物学的方法によるＤＦＡＩ
の製造方法については、まだ数が少なく、効率的に生産
する酵素の提供が必要である。

またストレプトマイセス属に属する細菌がＤＦＡＩを生
成させる酵素を生産していることについては、まだ報告
されていない。

［問題を解決するための手段］ そこで、本発明者らはイヌリンからＤＦＡＩを微生物学
的方法により製造する方法について鋭意研究を進めた結
果、ストレプトマイセス属に属する細菌、例えばストレ
プトマイセス・エスピーＭＣＩ２５２４　（微工研菌寄
第１１７３４号）または、ストレプトマイセス・エスピ
ーＭＣＩ　２５２５　（微工研菌寄第１１７３５号）由
来のイヌリン分解酵素が効率よ＜　ＤＦＡＩを生産する
ことを見いだし、本発明を完成するに至った。

すなわち本発明の要旨は、イヌリン含有溶液に、ストレ
プトマイセス属に属する細菌由来のイヌリン分解酵素を
作用させてＤＦＡＩを生成させることを特徴とするＤＦ
ＡＩの製造方法に存する。

以下、本発明を説明するに、本発明で使用するイヌリン
分解酵素は、ストレプトマイセス属に属する細菌、たと
えば、ストレプトマイセス、エスピーＭＣＩ　２５２４
　（微工研菌寄第１１７３４号）または、ストレプトマ
イセス・エスピーＭＣＩ　２５２５　（微工研菌寄第１
１７３５号）由来のものが好適である。

ストレプトマイセス・エスピーＭＣＩ　２５２４　及ヒ
ストレプトマイセス・エスピーＭＣＩ　２５２５は、本
発明者等により、天然土壌から分離された細菌であり、
その菌学的性状は次の通りである。

ストレプトマイセス・エスピーＭＣＩ　２５２４につい
てａ）形態学的特徴 胞子形成培地として、スターチ・無機塩寒天培地、及び
酵母エキス・麦芽エキス寒天培地を用い、２７°Ｃ１１
４日間培養後観察した。コロニーの色調は白〜灰色。基
中菌糸は分岐して伸長し分断は見られない。気菌糸は単
純分岐である。胞子鎖の形態はスターチ、無機塩寒天培
地上では、多くのものは長鎖のラセン状を示し、酵母エ
キス・麦芽エキス寒天培地上では、胞子形成が貧弱でホ
ック状から１〜２回のループ状を示す。胞子は楕円形〜
短円筒状、表面はトゲ状の突起におおわれている。

ｂ）各培地上における性状 ＩＳＰ［インターナショナル・ストレプトマイセス。

プロジェクト（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｓｔｒｅ
ｐｔｏｍｙｃｅｓ　Ｐｒｏｊｅｃｔ）］規定の各種培地
上で２７°Ｃ２１４日間培養後の性状は次に示すとおり
である。

Ｃ） 生理学的性状 １）生育温度範囲 ２）生育ｐＨ範囲 ３）ゼラチンの液化 ４）デンプンの加水分解 ５）脱脂乳の凝固 ペプトン化 ６）メラニン様色素の生成 （ペプトン・酵母エキス・鉄寒天、 トリプトン・酵母エキス寒天 及びチロシン寒天培地上） ７）硝酸塩の還元 ８）　ＮａＣ１耐性 １５〜４５°Ｃ ｐＨ５〜１０ 陽性 陽性 陰性 陽性 陽性 陰性 ７％で弱い生育 １０％で生育せず ９）各種糖類からの酸の生成 り−グルコース Ｌ−アラビノース Ｄ−キシロース Ｄ−フラクトース シュークロース Ｌ−ラムノース　　　　　　　　　士 ラフィノース　　　　　　　　＋ イノシトール　　　　　　　　＋ Ｄ−マンニトール　　　　　　　　＋ ＋：利用する。±：利用が疑わしい、−：利用しないｄ
ン　菌体成分について ＭＣＩ　２５２４号菌の細胞壁アミノ酸タイプは、全菌
体水解物の分析によりり、Ｌ−ジアミノピメリン酸が検
出されたことから、細胞壁タイプＩ型であることが確認
された。また、糖組成についても全菌体水解物中からグ
ルコース、ガラクトース及びリボースが検出されたが、
特徴的なパターンは認められなかった。

ｅ）分類学的考察 以上の結果から当該放線菌（ＭＣＩ　２５２４号菌）は
５ｔｒｃ且頃匹匹竪属に帰属することが判明した。

さらに野々村らによって提案されている、５ｔｒｅ　ｔ
ｏｍ　ｃｅｓ属のＩＳＰ菌種検索（Ｊ　、　Ｆｅｒｍｅ
ｎｔ　。

ｔｅｃｈｎｏｌ　、、　Ｖｏｌ　、　５２　、Ｎｏ　、
　２　、ｐ　、　７８−９２　、１９７４　）及びパー
ジエイズマニュアルオブシステマティノク　バクテリオ
ロジ−（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆｓｙｓ
ｔｅｍａｔｉｃ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｇｙ　、　Ｖｏｌ
　、　４　、　ｐ　、　２４５１〜２４９２　。

１９８９　）から種レベルの検索を行った。ＭＣＩ２５
２４号菌は１）コロニー色調は灰色を呈する、２）ラセ
ン状の胞子鎖を形成し、胞子表面はトゲ状である、３）
メラニン様色素を生成する、４）特徴的な可溶性色素を
生成しないなどの特徴を有する。このような特徴を有す
る菌種としてれ胛匹瓜沙。

Ｓ、ｆｉｌｉ　１ｎｅｎｓｉｓ、Ｓ、ｃａｎｕｓ、Ｓ、
ｃｈｒｏｍｏｆｕｓｃｕｓ　Ｓ、ａｎｔｉｍ　ｃｏｔｉ
ＣＵＳなどが挙げられる。そこで本菌株とＩＳＰ指定の
標準菌株の各種性状を比較したところ、下表に示すよう
に炭素源の資化性、ＮａＣ１耐性、その他の生理性状に
おいて一致しない点があった。従って本菌株をジ胆四凹
息朋ｓｐ　、　ＭＣＩ　２５２４号菌を同定した。

＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ２、ストレプトマイセス・エスピーＭＣＩ　２５２５に
ついてａ）形態学的特徴 胞子形成培地として、スターチ・無機塩寒天培地及び酵
母エキス・麦芽エキス寒天培地を用い、２７°Ｃ１１４
日間培養後観察した。コロニーの色調は白〜青味灰色。

基土菌糸は分枝して伸長し分断は見られない。気菌糸は
対生または疑似輪生分枝が見られる。

胞子鎖の形態は多くのものは長鎖のラセン状を示し、胞
子の分節が明瞭でない。胞子表面はトゲ状の突起におお
われている。

ｂ）各培地上における性状 ＩＳＰ　［インターナショナル・ストレプトマイセス・
プロジェクト（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｓｔｒｅ
ｐｔｏｍｙｃｅｓ　Ｐｒｏｊｅｃｔ　）］規定の各種培
地上で２７°Ｃ１１４日間培養後の性状は次に示すとお
りである。

Ｃン　生理学的性状 １）生育温度性状 ２）生育ｐＨ範囲 ３）ゼラチンの液化 ４）デンプンの加水分解 ５）脱脂乳の凝固 ペプトン化 ６）メラニン様色素の生成 （ペプトン・酵母エキス・鉄寒天。

トリプトン・酵母エキス寒天　　　陽性及びチロシン寒
天培地上） ７）硝酸塩の還元　　　　　　　　　　陽性８）　Ｎａ
Ｃ１耐性　　　　　　　　　７％で弱い生育１０％で２
，３コロニー生育 ９）各種糖類からの酸の生成 り−グルコース Ｌ−アラビノース Ｄ−キシロース Ｄ−フラクトース シュークロース １５〜４５°Ｃ ｐＨ４〜９ ＋ ＋ 陰性 陰性 Ｌ−ラムノース　　　　　　　　　＋ ラフィノース　　　　　　　　　＋ イノシトール　　　　　　　　　＋ Ｄ−マンニトール　　　　　　　＋ ＋；利用する、±：利用が疑わしい、−二利用しないｄ
）菌体成分について ＭＣＩ　２５２５号菌の細胞壁アミノ酸タイプは、全菌
体氷解物の分析のよりり、Ｌ−ジアミノピノリン酸が検
出されたことから、細胞壁タイプＩ型であることが確認
された。また、糖組成についても全菌体水解物中〜グル
コース、ガラクトース、及びリボースが検出されたが、
特徴的なパターンは認められ４かった。

ｅ）分類学的考察 以上の結果から当該放線菌（ＭＣＩ　２５２５号菌戸７
至属に帰属することが判明した。

さらに野々村らによって提案されている、シ翌逆墜二属
のＩＳＰ菌種検索表（Ｊ、Ｆｅｒｍｅｎｔｅｃｈｎｏｌ
、、Ｖｏｌ、　５２．　Ｎｏ、２　、　ｐ　、７８−９
２．１９７４　）から種しｌルの検索を行った。ＭＣＩ
　２５２４号菌は１）コロニーイは青味灰色を里する、
２）ラセン状の胞子鎖を形成し、胞子表面はトゲ状であ
る、３）メラニン様色素を生成する、４）特徴的な可溶
性色素を生成しないなどの特徴を有する。このような特
徴を有する菌種としてＳ、ｃｈａｒｔｒｅｕｓｉｓ　、
　Ｓ、ｃｏｅｒｕｌｅｓｃｅｎｓ、　Ｓ、１ａｎａｔｕ
ｓなどが挙げられる。そこで本菌株とＩＳＰ指定の標準
菌株の各種性状を比較したところ、下表に示すように炭
素源の資化性、ＮａＣ１耐性、その他生理性状において
一致しない点があった。したがって本菌株をジ胆臨四五
匹ｓｐ　、　ＭＣＩ　２５２５号菌と同定した。

Ｉ ＋ ＋ ＋ ＋ 十 ＋ ＋ 十 ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ 本発明で使用する、ストレプトマイセス属に属する細菌
は、通常の微生物が利用しうる栄養物を含有する培地で
培養することにより容易に増殖させることができる。炭
素源としては、グルコース、水飴、テキストノン、シュ
ークロース澱粉、糖蜜、動・植物油等を使用できる。ま
た窒素源として大豆粉、小麦胚芽、コーンステイープリ
カー、綿実粕、肉エキス、ペプトン酵母エキス、硫酸ア
ンモニウム、硝酸ソーダ、尿素等を使用できる。その他
必要に応じ、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグ
ネシウム、コバルト、塩素、燐酸、硫酸及びその他のイ
オンを生成する無機塩類を添加する事は有効である。

本発明においては、キクイモ、ゴボウ等のイヌリン含有
量の高い植物の抽出液及びまたはイヌリンを唯一の炭素
源として含む溶液中で上記ストレプトマイセス属に属す
る細菌、たとえば、ストレプトマイセスエスピ−ＭＣＩ
　２５２４または、ストレプトマイセスエスピーＭＣＩ
　２５２５由来のイヌリン分解酵素を作用させる。

その際、該細菌そのものを作用させても良いし、また該
細菌から該酵素を抽出し、そのまま、あるいは固定化等
を行い作用させても良い。

細菌そのものを作用させる場合、例えば炭素源としての
イヌリンを約１〜１０％含有し、その他、窒素源として
、大豆粉、小麦胚芽、コーンステイープリカー綿実粕、
肉エキス、ペプトン酵母エキス、硫酸アンモニウム、硝
酸ソーダ、尿素等、更に必要に応じナトリウム、カリウ
ム、マグネシウム、コバルト、塩素、燐酸、硫酸及びそ
の他のイオンを生成する事のできる無機塩類等を添加し
た培地に本菌を接種し振どう培養をおこなう。この際培
養温度は２０〜３７°Ｃが、また培養時間は１２〜１２
０時間が好適である。得られた培養液を遠心分離により
除菌し、その上清中の酵素を加熱処理により失活させる
。そして濃縮を行ない、例えばこれを活性炭カラムに吸
着させる。蒸留水でフルクトースを溶出させた後、５％
エタノール水溶液にて溶出を行う。

この分画中にＤＦＡＩが得られるので、その分画を濃縮
乾固すると所望のＤＦＡＩを得ることができる。

また酵素を作用させる場合、例えば前記方法により培養
を行った培養液を遠心分離により除菌し、得られた炉液
を作用させてもよいし、或いは、該炉液を更に硫安（６
５％飽和）を加え塩析を行い、析出した沈殿物を遠心分
離により取得し、少量の水に懸濁させたのち透析を行い
、得られる粗酵素液を作用させてもよい。

この培養炉液又は粗酵素液を例えば、ｐＨ６，０に調節
した０、０１−０．１　Ｍのリン酸緩衝液中で約５％以
上の濃度のイヌリン３０〜６０°Ｃで３０分間以上作用
させる事等によっても所望のＤＦＡＩがえられる。

もとより、精製酵素を作用させてもよく、かかる精製酵
素は例えばＤＥＡＥ　−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ　６５０　
Ｍ　　、　ＳＰ　−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ　６５０　Ｍカ
ラム（東ソー製）によるイオン交換クロマトグラフティ
ーにて精製を行った後Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ　ＨＷ５５Ｆ
でゲル濾過を行うことにより、電気泳動により単一バン
ドを示す酵素標品を得ることができる。

ストレプトマイセス・エスピーＭＣＩ　２５２４由来の
酵素標品は至適ｐＨは６．０であり、また、５５°Ｃで
最大活性を示した。同酵素はｐＨ４，５〜９．０の範囲
で安定である。また、同酵素は３０分間の熱処理では６
５°Ｃまでは安定であり、５ＤＳ−ポリアクリルアミド
電気泳動による分子量は約３６，０００であった。

またストレプトマイセス、エスピーＭＣＩ　２５２５由
来の酵素標品の至適ｐＨは５．３であり、また、５５°
Ｃで最大活性を示した。同酵素はｐＨ５〜１０の範囲で
あり３０分間の熱処理では６０°Ｃまで安定である。ま
た、５ＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動による分子量
は約３５，０００であった。

［実施例］ 以下に実施例をあげて本発明の方法さらに具体的に説明
するが本発明はその要旨を越えない限りこれらに限定さ
れるものではない。

実施例１ 市販イヌリン５％、酵母エキス０．０２％、硝酸ナトリ
ウム０．２％、硫酸マグネシウム０．０５％、塩化カリ
ウム０．０５％、リン酸カリウム０．０５％、塩化第二
鉄０．００１％を含んだ培地１５０ｍ１をｐＨ７，０に
調整して１２０６Ｃ２０分間蒸気滅菌した。この滅菌し
た培地にストレプトマイセス・エスピーＭＣＩ　２５２
４　菌を一白金耳接種し、１６０ｒｐｍで３０°Ｃ１７
２時間培養した。

培養液の６６０　ｎｍでのＯＤは約１２であった。

培養終了後遠心分離により菌体を除去し、培養炉液を得
た。得られた培養炉液を１００　’Ｃで１ｏ分間加熱処
理することにより、酵素を失活させ、約１０ｍ１にまで
減圧濃縮した。この液は活性炭カラム（活性炭５０ｇと
セライトＮｏ、　５３５５０　ｇの混合物を蒸留水にて
充填）に吸着させ、蒸留水１ｅを流したのも５％エタノ
ール水溶液で溶出した。

溶出ピークを集めて減圧濃縮にて乾固してＤＦＡＩの粉
末を得た。得られたＤＦＡＩは原料イヌリンにたいして
収′：＄１３％であった。薄層クロマトグラフィー（シ
リカゲルプレート（Ｍｅｒｃｋ社））：展開溶媒ｎ−ブ
タノール：エタノール：水＝２：１：１（ｖ／ｖ／ｖ）
によると、イヌリンの酸分解により得られた標準のＤＦ
ＡＩと■値（０，６）が一致した。

実施例２ 実施例１で得られた培養炉液４０ｍ１を、１０％のイヌ
リンを含む０．０５　Ｍリン酸緩衝液４０ｍ１に加えて
５０°Ｃで３時間反応させた。

反応液を加熱し酵素を失活させた後、活性炭カラムクロ
マトグラフィーを行い、５％エタノール水溶液にて溶出
させ、溶出液を減圧濃縮にて乾固してＤＦＡＩの粉末を
得た。ＨＰＬＣで定量したところ、得られたＤＦＡＩは
２．２ｇであった。

実施例３ 実施例１と同様な培地にストレプトマイセス・エスピー
ＭＣＩ　２５２５菌を一白金耳接種し１６０ｒｐｍで３
０°Ｃ１７２時間振どう培時間待った。培養液の６６０
ｎｍでのＯＤは約１２であった。培養終了後遠心分離に
より菌体を除去し培養炉液を得た。得られた培養炉液を
１０分間加熱処理する事により、酵素を失活させ、約１
０ｍ１にまで減圧濃縮した。実施例１と同様な方法で、
精製してＤＦＡＩの粉末を得た。収率は原料イヌリンに
対して１８％であった。

実施例４ 実施例３で得られた培養炉液４０ｍ１を２０％のイヌリ
ンを含む０．０５Ｍリン酸緩衝４０ｍ１に加えて５００
Ｃで５時間反応させた。

実施例２と同様な方法で精製し、ＤＦＡＩを得た。

得られたＤＦＡＩはＨＰＬＣで定量したところ５．７ｇ
であった。

実施例５ ストレプトマイセス・エスピーＭＣＩ　２５２４菌を実
施例１と同様な方法で培養し、２ｅの培養液を得た。培
養後遠心分離により除菌し上清を粗酵素液とした。２ｅ
の粗酵素液にハイポーラス型強塩基性陰イオン交換樹脂
ＨＰＡ７５（三菱化成社製）を６７ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４
−ＮａＨＰＯ４（ｐＨ６，９２）リン酸緩衝液で緩衝化
したものを５０　ｍｌ　（湿潤状態）加え、室温で２時
間振盪撹拌し酵素を吸着固定化した。固定化酵素懸濁液
を上記リン酸緩衝液２００ｍ１で３回洗浄後吸引沖過し
て湿潤固定化酵素を得た。この固定化酵素を内径２０ｍ
ｍのカラムに充てんし、５０°Ｃに保温した。この充て
んカラムに毎分０．１　ｍｌで水を流し安定化させた後
、イヌリン３％水溶液１ぞを流速０．１ｍ／ｍｉｎで流
して反応させた。反応後減圧濃縮し実施例１と同様に活
性炭カラムを用いて精製したところ１３．５　ｇのＤＦ
ＡＩを得た。

［発明の効果］ 本発明のストレプトマイセス・エスピー　ＭＣＩ２５２
４　（微工研菌寄第１１７３４号）、及び、ストレプト
マイセス・エスピーＭＣＩ　２５２５　（微工研菌寄第
１１７３５号）等のストレプトマイセス属に属する細菌
由来のイヌリン分解酵素はイヌリンからＤＦＡＩを高収
率で製造することができる。

ＤＦＡＩはダイエツト甘味料などとして広い分野での利
用が期待できる。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）イヌリン含有溶液に、ストレプトマイセス属に属
   する細菌由来のイヌリン分解酵素を作用させてジフルク
   トース・ジアンヒドリド I を生成させることを特徴と
   するジフルクトース・ジアンヒドリド I の製造方法。
2. （２）ストレプトマイセス属に属する細菌がストレプト
   マイセス・エスピーＭＣＩ２５２４（微工研菌寄第１１
   ７３４号）またはストレプトマイセス・エスピーＭＣＩ
   ２５２５（微工研菌寄第１１７３５号）であることを特
   徴とする請求項（１）記載の製造方法。