JP2593710B2 - イヌリナーゼ活性を有する酵素組成物およびその製造法 - Google Patents

イヌリナーゼ活性を有する酵素組成物およびその製造法

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Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、環状イヌロオリゴ糖生成能を有する新規イ
ヌリナーゼ活性を有する酵素組成物およびその製造法に
関するものである。
〔従来の技術〕
イヌリンは、主にキク科植物、キクイモ、ダリアの塊
茎、ゴボウの根、ヤーコンの根などに含まれている多糖
類であって、分子末端にシュクロースを有し、それにβ
−2,1−フラクトフラノシド結合でフラクトースが30〜5
0個結合している。
このイヌリンを分解する酵素・イヌリナーゼとして
は、アスペルギルス・ニガー由来のendo型イヌリナー
ゼ、ペニシリウム属微生物由来のexo型イヌリナーゼな
ど、イヌリンを加水分解してフラクトースおよびイヌロ
オリゴ糖を生成させる酵素や、アースロバクター・ウレ
アファシエンス、アースロバクター・グロビフォーミ
ス、シュウドモナス・フルオレセンスなどに由来するイ
ヌリンフラクトトランスフェラーゼのように、イヌリン
を分解してフラクトース2分子よりなる環状化合物(た
とえばジフラクトフラノース2′,1:2,1′−ジアンヒド
リド、ジフラクトフラノース2′,1:2,3′−ジアンヒド
リドなど)を生成させる酵素が知られている。
〔発明が解決しようとする課題〕
上述のように、イヌリンからフラクトース2分子より
なる環状化合物を生じさせるイヌリナーゼは公知である
が、それ以上に多数のフラクトース分子からなる環状化
合物を生じさせるイヌリナーゼは、見いだされていな
い。そのような多フラクトース環状化合物は、内径の大
きい環を形成しているので、サイクロデキストリンのよ
うに種々の物質を包装し、その物質の物理的化学的性質
を変化させることが期待される。たとえば水難溶性物質
を水に溶けるようにしたり、光や熱に不安定な物質を安
定化したりする可能性がある。
そこで本発明の目的は、イヌリンより多フラクトース
環状化合物を生成させることのできる酵素を提供するこ
とにある。
〔課題を解決するための手段〕
種々検討の結果、本発明者らは、バチルス属に属する
細菌の中に上記本発明の目的達成を可能にする菌株があ
ることを見いだし、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、下記の理化学的性質のイヌリナ
ーゼ活性を有する酵素組成物を提供するものである。
(イ)作用 イヌリンに作用させるとイヌリンのβ−2,1−フラク
トシド結合を切断すると同時に分子内転移反応を生じさ
せ、6〜8個のフラクトース分子がβ−2,1−フラクト
シド結合した環状イヌロオリゴ糖を生成させる。
(ロ)基質特異性 イヌリンなど重合度8以上のβ−2,1結合フラクトー
スポリマーに特異的に作用し、β−2,6結合のフラクト
ースポリマーであるレバンには作用しない。
(ハ)至適pHおよび安定pH範囲 至適pH:約7.2 安定pH範囲:6.5〜8.5 (ニ)至適温度および安定温度範囲 至適温度:45℃ 安定温度範囲:50℃以下。
以下、この新規イヌリナーゼ活性を有する酵素組成物
を、その作用に基づきcycloinulo−oligosaccharide fr
uctanotransferase(略称:CFTase)と呼ぶ。
CFTaseは、バチルス・サーキュランスMZ No.31(微工
研菌寄第9943号)など、この酵素を生産する能力を有す
るバチルス属細菌をフラクトースポリマー含有培地で培
養すると菌体外に生産されるので、培養物を酵素精製の
常法により精製することにより容易に得ることができ
る。
バチルス・サーキュランスMZ No.31は、本発明者らが
イヌリンを唯一の炭素源として含有する培地で多くの細
菌を培養し、培養物中に生産された酵素の性質を調べる
スクリーニングを行なった結果選抜されたものである。
最初、広島県尾道市の土壌より分離された菌株であっ
て、その菌学的性質は次のとおりである。
(a)形態 細胞の形および大きさ:太さ0.5〜0.7μm、 長さ3〜6μmの桿菌 運動性:あり。周毛を有する。
胞子:あり。球形ないし楕円形。端部またはその近く
にある。
グラム染色性:不定 抗酸性:なし (b)生育 肉汁寒天斜面培養:粗面;半透明;クリーム白色。
グルコース寒天斜面培養:発育悪い;透明;クリーム
白色。
肉汁液体培養:少量の沈殿を生じる。
肉汁ゼラチン穿刺培養:変化しない。
リトマスミルク:変化しない。
(c)生理的性質 硝酸塩の還元:する 脱窒素:しない MRテスト:陽性 VPテスト:陰性 インドールの生成:なし 硫化水素の生成:なし でんぷんの分解:する クエン酸の利用:しない 色素の生成:なし カタラーゼ:陽性 酸素要求性:好気性 生育の範囲:pH6〜8(30℃,7日間); 温度15〜35℃;10℃では生育微弱;40℃では生育しない
(pH7.0,7日間) 食塩の影響:3%食塩含有ブイヨンで生育しない。
炭水化物の利用:グルコース、フラクトース、マルト
ース、ガラクトース、マンニット、シュクロース、ラク
トース、エスクリンを利用する。
ソルビット、アドニット、イノシトール、エタノール
を利用しない。
リジン、アルギニン、オルニチンの脱炭酸:しない 尿素分解:しない 以上の諸性状をバージェイのマニュアル・オブ・デタ
ーミナティブ・バクテリオロジー,第8版(1974年)の
記載と照合すると、本菌株は好気性、桿菌、胞子を形成
する点などから、バチルス属に属するものと認められ
た。種については、諸性質が上記マニュアル記載のバチ
ルス・サーキュランスのそれと合致することから、本菌
株はバチルス・サーキュランスと同定された。
〔作用〕
本発明のCFTaseは、前述のように、イヌリンに作用さ
せるとイヌリンのβ−2,1−フラクトシド結合を切断す
ると同時に分子内転移反応を生じさせ、6〜8個のフラ
クトース分子がβ−2,1−フラクトシド結合した下記構
造式の環状イヌロオリゴ糖を生成させる。
この反応を環状イヌロオリゴ糖の製造に利用する場合
は、好ましくはpH6〜8、温度35〜50℃で、最高収率が
達成されるまで反応させればよい。
本発明のCFTaseをCFTase生産菌の培養により製造する
場合は、培地にβ−2,1−フラクトシド結合を有するフ
ラクトースのポリマーを炭素源として、好ましくは唯一
の炭素源として、約0.01〜30%、好ましくは約0.3〜3
%含有させ、本発明のCFTaseを誘導産生させる。使用可
能なフラクトースのポリマーとしては、イヌリン、レバ
ン、イヌロオリゴ糖類、フラクトオリゴ糖類、レバンオ
リゴ糖類、およびこれらを含有する植物抽出物または微
生物培養物などがあるが、特に好ましいのは、イヌリン
およびレバンである。培地には、ほかに酵母エキス、ペ
プトン、肉エキス、コーススティープリカー、大豆粕、
硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウ
ム、尿素などの窒素源のほか、マグネシウム塩、カリウ
ム塩、リン酸塩、鉄塩、ビタミン等の無機塩類、微量栄
養素等を適宜含有させる。培養は、20〜35℃で1〜7日
間、好気的に行う。培地pHが6.0以下に下がると本発明
のCFTaseの活性収量が低下するので、pHは培養中つねに
6.0以上に保つことが望ましい。培養は、回分式、連続
式のいずれによっても行うことができる。
CFTaseは菌体内および菌体外に生産されるが、培養液
中に多量の蓄積されるので、これを利用するのが経済的
には有利である。これを培養液から分離し精製する操作
は、たとえば次のようにして行うことができる。まず、
培養液中の菌体を遠心分離、濾過などの方法で除く。得
られた上澄液は、そのままでも粗酵素液として酵素反応
に使用することができるが、精製する場合は、たとえば
硫酸アンモニウム塩析、アセトン、エタノール、イソプ
ロパノール等による溶媒沈殿法、ゲル濾過法、イオン交
換樹脂精製法等、一般的な酵素精製法を用いることがで
きる。
〔実施例〕
以下、実施例を示して本発明を説明する。なお、各例
において示したCFTaseの活性は、次のようにして測定さ
れたものである。
1%イヌリン溶液(0.1Mリン酸緩衝液溶液;pH6.5)1m
lと酵素液1mlを混合し、45℃で1時間反応させる。生成
した環状イヌロオリゴ糖のうちα−CI(フラクトース6
分子からなるもの)の量を高速液体クロマトグラフィー
で定量し、1分間に1μMのα−CIを生成させる酵素量
を1単位とする。高速液体クロマトグラフィーの条件は
次のとおりにする。
カラム:TSKgel Amide−80 キャリヤー:アセトニトリル/水(65/35) 流速:1.2ml/min カラム温度:42℃ 検出:RI 実施例1 イヌリン1%、酵母エキス0.1%、K2HPO40.1%、NaNO
30.5%、MgSO4・7H2O0.05%を含むpH7.0の培地にバチル
ス・サーキュランスMZ No.31を植菌し、30℃で4日間、
好気的に培養した。培養終了後、10,000rpmで20分間遠
心分離して培養液から菌体を除き、1の上澄液を得
た。
この上澄液を当量の冷アセトン中に投入し、生じた沈
殿を濾別し、10mMリン酸緩衝液(pH6.5)に溶解させ、
1夜4℃で同緩衝液に対して透析した。その後、生じた
沈殿を遠心分離して除き、上清液を同上緩衝液で平衡化
したDEAE−トヨパール650Mに吸着させ、0.1M〜0.5MのNa
Clを含む同上緩衝液を用いる濃度勾配法によって酸素を
溶出させた。溶出した活性画分を集め、同上緩衝液に対
して1夜4℃で透析する。同様の操作をさらに2度繰り
返し、得られた透析内液(酸素組成物I)を、同上緩衝
液で平衡化したセファデックスG−100のゲル濾過カラ
ムクロマトグラフィーを行い、0.1M−NaClを含む同上緩
衝液で酵素を溶出させ、活性画分(酸素組成物II)を集
めた。これにより、収率27%で、比活性が585倍精製さ
れた酵素組成物を得た。
上述の精製の経過を表1に示す。
実施例2 レバン0.5%、酵母エキス0.5%、K2HPO40.1%、NaNO3
0.5%、MgSO3・7H2O0.05%を含むpH7.0の培地100mlを50
0ml容坂ロコルベンに分注し、121℃で15分間加熱殺菌し
た。冷却後、バチルス・サーキュランスMZ No.31を1白
金耳植菌して30℃で4日間振とう培養した。培養終了
後、遠心分離して培養液から菌体を除き、粗酵素液を得
た。そのCFTase活性は0.04単位/mlであった。
〔発明の効果〕
本発明の新規イヌリナーゼ活性を有する酵素組成物を
用いることにより、フラクトース6〜8分子からなる環
状構造の新規オリゴ糖を容易に製造することができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 川村 三志夫 奈良県奈良市左京3―23―3

Claims (4)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】下記理化学的性質のイヌリナーゼ活性を有
    する酵素組成物: (イ)作用 イヌリンに作用させるとイヌリンのβ−2,1−フラクト
    シド結合を切断後ただちに分子内転移反応を生じさせ、
    6〜8個のフラクトース分子がβ−2,1−フラクトシド
    結合した環状イヌロオリゴ糖を生成させる; (ロ)基質特異性 イヌリンなど、重合度8以上のβ−2,1結合フラクトー
    スポリマーに特異的に作用し、β−2,6結合のフラクト
    ースポリマーであるレバンには作用しない; (ハ)至適pHおよび安定pH範囲 至適pH:約7.2 安定pH範囲:6.5〜8.5 (ニ)至適温度および安定温度範囲 至適温度:45℃ 安定温度範囲:50℃以下
  2. 【請求項2】フラクトースのポリマーを含有する培地を
    用いて請求項1記載のイヌリナーゼ活性を有する酵素組
    成物を生産する能力を有するバチルス属細菌を培養し、
    培養物から上記イヌリナーゼ活性を有する酵素画分を採
    取することを特徴とする請求項1記載のイヌリナーゼ活
    性を有する酵素組成物の製造法。
  3. 【請求項3】イヌリナーゼ活性を有する酵素組成物を生
    産するバチルス属細菌としてバチルス・サーキュランス
    MZ No.31(微工研菌寄第9943号)を用いる請求項2記載
    の製造法。
  4. 【請求項4】フラクトースのポリマーがイヌリンまたは
    レバンである請求項2記載の製造法。
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