KR830002250B1 - 사이클로덱스트린(Cyclodextrine)의 제조법 - Google Patents

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Description

사이클로덱스트린(Cyclodextrine)의 제조법

제1도는 본원 발명 효소의 활성에 미치는 pH의 영향(37℃)을 나타내는 도면.

제2도는 본원 발명 효소에 의한 사이클로덱스트린 수량(收量)에 미치는 pH의 영향(37℃)를 나타낸 도면(도면중(1)은 M849주(株), (2)는 B645주의 효소에 의한 수량을 나타냄).

제3도는 본 효소의 pH에 대한 안정성(37℃)을 나타내는 도면.

제4도는 M 849주에 의해서 생산된 효소의 활성에 미치는 온도의 영향(pH 7)을 나타내는 도면.

제5도는 여러가지의 pH와 온도에 있어서 15분간 효소액을 처리한 경우의 본 사이클로덱스트린 트란스 페라아제의 잔존활성을 나타내는 도면.

제6도는 10^-2M 염화칼슘 존재하 및 부존재하에 있어서의 여러가지 온도로 효소액을 15분간 유지한 경우의 동상효소의 잔존활성을 나타내는 도면.

본원 발명은 사이클로덱스트린의 제조방법에 관한 것이다. 상세하게는 미크로코카스(Micrococcus)속에 속하는 사이클로덱스트린·글리코실트랜스페라아제(E.C.2.4.1.19)(Cyclodextrine glycosyl transferase)(이하 본 효소라고 함)를 생성하는 균주(菌株)를 배양해서 생성하는 본 효소 내지는 그 함유물을 전분 또는 전분분해물에 작용시켜서 사이클덱스트린을 생성하고, 필요하다면 이것을 채취하는 사이클로덱스트린의 제조법에 관한 것이다.

여기서 말하는 사이클로덱스트린이란, 샤르딩거·덱스트린(Schardinger dextrine)이라고도 불리우며, 전분에 본 효소를 작용시켜서 생성되는 결정성(結晶性)의 덱스트린으로, 글루크오스잔기 6,7,8개의 α-1,4-결합에 의한 환상올리고당(環狀 Oligo糖)이다. 글루코오스잔기 6,7,8개로 이루어지는 덱스트린이며, 각각 α-사이클로덱스트린, β-사이클로덱스트린, γ-사이클로덱스트린이라고 불리우고 있는 환덱스트린이다.

사이클로덱스트린은 분자내에 각종 유기화합물(게스트분자)를 포접(抱接)할 수 있는 공동(空洞)을 갖는 단분자적 호스트분자로서 알려져 있고, 그 특이한 포접작용(mclusion)은 의약, 농약, 식품, 화장품, 향료 등의 분야에 널리 이용되고 있다.

이들 덱스트린의 제조방법에 대해서는 옛날에는 Tilden, Hudson[J. Am. Chem. Soc. 64, 1432(1942) 및 D. French [J. Am. Chem. Soc. 71, 355(1949)등이 상술되어 있다. 이들 방법은 바틸스·마세란스(Bacillus Macerans)가 생산하는, 이른바 마세란스·아미라아제를 사용하여 전분을 분해하고, 사이클로덱스트린을 제조하는 방법이다.

최근, 이것과 유사한 효소를 생산하는 균주로서 Bacillus Stearothermophilus[Proc. Symp. Amylases(OSAKA), 18, 43(1972)] Bacillus megater : Um [Agr. Biol. Chem 38, 387(1974)](또는 특허공개공보 소48-40996) Bacillus Circulans [Proc Symp. Amylases(OSAKA) 18, 21(1973)] Bacillus ohbensis sp(특허공개공보 소52-31949) Bacillus No. 38-2(ATCC 21783){Die starke 27 410(1975)](또는 특허공개공보 소523-31223)등이 알려져 있지만 Bacillus 속(屬) 이외에는Pneumoniae M5[Arch, Microbiol, 111, 271(1977)]의 1균주가 보고되어 있는 것에 불과하다.

본원 발명자들은 널리 토양으로부터의 미생물을 탐색하고 미크로코카스속에 속하는 2종의 균주를 분리하고, 이들 균주가 바틸스속 및 Klebisiella속의 공지효소에 유사한 본 효소를 생산하는 것을 발견하고, 더구나 미크로코카스속의 균주가 생산하는 본 효소는 중래품의 효소와 비교해서 넓은 pH영역에서 효소활성을 가지며, 또한 높은 열안정성을 나타내며, 사이클로덱스트린 생성농도 크고, 효소의 작용조건에 따라서 α-사이클로덱스트린과 β-사이클로덱스린을 선택적으로 생성할 수 있다는 것이 확인되었으며, 이 본 효소를 사용함으로써, 사이클로덱스트린의 공업적 생산을 유리하게 할 수 있음을 발견하여 본원 발명을 완성하기에 이르렀다.

또한 본원 발명은 그 실시양태의 하나로서, 생성하는 사이클로덱스트린중의 α-와 β-의 비율을 소망의 비(比)로 조절해서 생산하는 방법도 제공한다.

즉, 종래공지의 방법으로는 예를들어 바틸스·마세란스, 바틸스·스테아로사모피러스, 크레브세라·뉴우모니아에 M5의 사이클로덱스트린글리코실·트란스페라아제는 주로 α-사이클로덱스트린을 생성하고, 바틸스·메가테륨, 바틸스·서어큐런스, 바틸스·오오벤시스 SP, 바틸스·NO 38-2의 사이클로덱스트린글리코실·트란스페라아제는 주로 β-사이클로덱스트린을 생산하는 효소로서 취급되어 왔지만, 본원 발명의 사이클로덱스트린 글리코실트랜스페라아제는 통상은 β-사이클로덱스트린을 생성하지만, pH, 기준농도 및 효소활성 농도를 조정함으로써 α-사이클로덱스트린의 생성비율을 높이는 것을 가능하게 한다. 즉 α-와 β-의 비율을 임의로 조정할 수 있는 방법도 제공코자 하는 것이다.

즉, 본원 발명의 요지는 미크로코카스속에 속하는 사이클로덱스트린·글리코실트랜스페라아제 생산균을, 영양배지(榮養培地)에서 배양해서 얻어지는 배양약, 배양여액(培養濾液) 또는 그 농축액이나 그들의 각 단계의 효소제품을 전분 또는 전분 분해물에 작용시켜서, 사이클로덱스트린을 생성시키는 것을 특징으로 하는 사이클로덱스트린의 제조법이다.

먼저, 본원 발명의 방법에 사용되는 미생물은 다음에 설명하듯이 종래 사이클로덱스트린·트랜스페라아제 생산균으로서 알려져 있는 바틸스 속 균주는 아니고 동정(同定)의 결과, 구상세균의 미크로코카스곳에 속하는 균주라는 것이 발견되고, 그들중의 강력한 2균주를 임의로 M 849균주 및 B 645균주라고 명명하고, 그 균학적(菌學的) 성질을 명백히 했다.

또한 이들 균주의 공업기술원 미생물 공업기술연구소의 미생물수탁 번호는 각각 미공연균기(微工硏菌寄) 4912호 및 미공연균기 4913호이다.

이들 미생물의 균학적성질의 기재에 있어서, 시험 및 분류는 기브스 및 스키니(B.M.Gibbs and F.A.Skinner) 편(編), Identification method for Microbiologists J-, (Pare A)(1966년) 속에 바이어드 파아커에 의해서 기술된 Methods for Classifying Staphylococci and Micrococci라는 제목의 논문 및 동씨(同氏)의 the Journal of general Microbiology(J. Gen. Microbiol)의 30, 409페이지(1963년) 및 38권, 363페이지(1965년)에 발표된 보문(報文)을 J.B.Evans와 W.E Kloos Applied Microbiology 23권 326페이지(1972년)에 발표된 보문을 또 M. Kocur와 T. MartineC등의 International J. Systematic Bacteriol 22권, 218페이지 및 228페이지(1972년)의 각각의 보문 및 Btrgy's Manual of Determinative Bacteridogy 제8판(1974년)의 균학적 기재를 팜조해서 행하였다.

(1) M 849균주[미공연균기(微工硏菌奇)4912호] ATCC 31606의 균학적 성질

(a) 형태

① 영양세포는 직경 0.9~1.5미크론 구상(球狀)

② 단독 또는 2개~4개 연쇄하고, 때로 불규칙하게 집합한다.

③ 운동성이 없다.

④ 포자(胞子)를 형성하지 않는다.

⑤ 그램 염색은 양성

(B) 각종 배지에 있어서의 생육상태(특별히 기입하지 않는 한 배양온도는 30℃이다)

① 육즙한천평판배양(內汁寒天平板培養)

집락(集落)은 원형, 주연(周緣)은 전연(全緣), 철원상(凸圓狀)으로 융기하고 표면은 광택이 있으며 평활(平滑), 백색, 불투명하다.

② 육즙한천 사면배양

생육이 양호하고 선상(線狀), 표면은 광택이 있고 평활, 주변은 매끈매끈 하지만 장기간 배양하면 때때로 파상(波狀)이 되는 일이 있다. 균태(菌苔)는 백색, 불투명하고 배지는 불변.

③ 육즙액체배양

혼탁하고, 점질(粘質)의 균체가 침전한다. 관벽(管壁)에 링(ring) 및 균막을 형성하지 않는다. 특별한 취기는 없으며, 배양액은 착색하지 않는다.

④ 육즙젤라틴 천자배양(천자배양) (20℃ 배양)

생육은 지연되고 초기는 표면생육만이며 중부(中部) 및 심부(深部)는 발육하지 않는다. 약 15일 이상이나 경과하면 약간 액화한다. 젤라틴의 액화력을 따른 방법에 의해서 시험한 즉 미약하게 액화했다.

⑤ 리트머스 밀크 배양

배양초기는 불변이지만, 5~10일 후 약간 산성으로 기울고, 이후 점차 산성이 된다. 밀크의 응고 및 펩톤화, 리트머스의 탈색 등은 볼 수 있다.

(C) 생리적 성질

① 질산염의 환원성 : 양성 ④ 아세토인의 생성 : 음성

② 탈질 반응 : 음성 ⑤ 인돌(indole)의 생성 : 음성

③ MR 테스트 : 의양성(擬陽性) ⑥ 황화수소의 생성 : 음성

⑦ 전분의 가수분해 : (0.2~1.0%가 용성전분 첨가 육즙 한천배양에 있어서) pH 7.0의 경우 음성 : pH 9.5라면 양성

⑧ 구연산염의 이용성 : (코오저배지, 크리스텐센배지 및 시몬즈배지를 사용) 모두 음성

⑨ 색소의 형성 : 없음 ⑩ 우레아제 : 양성

⑪ 옥시다제(KOVAC법) : 음성

⑫ 카타라제 : 육즙한천 및 1% 글루코오스 첨가한 천배양의 모두에 있어서도 양성

⑬ 생육의 범위 : 생육최적 pH는 6.8~8.5의 범위이지만, pH 9.5에 있어서도 잘 발육한다. pH 5.0이하에서는 거의 발육하지 않는다. 생육최적 온도는 27~37℃이다. 40℃ 또는 20℃에서 생육하지만, 10℃에서는 겨우 생육하고, 45℃이상에서는 생육하지 않는다.

⑭ 산소에 대한 태도 : 호기성

⑮ OF 테스트 : 산화적, 글루코오스 및 만니톨에서 산화적으로 산을 생성하지만 가스는 생성하지 않는다. 혐기적으로는 산도 가스도 생성하지 않는다.

[(International Subcommittee on Staphylococci and Micrococci)의 위원회 추천의 방법에 따른다.

(Inter Bull. Bact. Nomenol. Taxon 15권 109페이지 1965년)

호기적 배양조건하에 있어서의 각종 당류에서 산의 생성

이상의 모든 탄화수소에서 가스는 생성하지 않는다.

에스클린의 분해 : 음성(장기간 배양에서 때로는 미약한 분해 있음)

마뇨산(馬尿酸)의 분해 : 양성

코아규라아제 : 음성

아르기닌의 분해 : 음성

용혈성(溶血性) : 음성

페닐알라닌의 탈아미노 반응 : 음성

염화나트륨내성 : 15%이하의 식염 함유 육즙배지에는 잘 발육한다. 18% 및 20% 식염 함유 배지에도 뒤늦게 조금 생육한다.

포스파라아제 : 음성

트윈(Tween) 80의 분해 : 음성

무기질소 원한천배지에 있어서의 생육 : 거의 생육하지 않음 크로오스(Kloose)등의 방법(International, J. System. Bacteriol 24권 79페이지 1974년)에 따른다.

젤라틴액화력 : 미약프라지어 젤라틴한천(Frasier gelatin agar)법에 따른다.

카제인분해력 : 음성(스킨밀크한천배지에 있어서의 용해로 판정)

디·엔·아이제(DNase) : 음성

이상의 성질에서 본 효소생산능력을 갖는 세균 849균주는 미크로코카스속에 속하는 세균이라는 것임이 명백하다. 버어쥬즈·오브·디터미내티이브·박테리오로지 제7판(1957년)에는 미크로코카스속 세균으로서 16종이 기재되고, 또 사르시나(Sarcina)속도 별도의 독립된 속으로서 기재되어 있었지만, 그후의 연구의 진보에 의해서, 현재의 동분류서 제8판(1974년)에는 사르시나속은 삭제되고, 미크로코카스속에 속하는 것으로 되었었던 많은 종류도 정리 통합되어서, 미크로코카스·루테우스, 미크로코카스·바리안스 및 미크로코카스·로제우스의 단지 3종류만으로 되었다.

M 849균주의 균학적성질과 이들 3종의 균학적성상기재를 비교하여, 가장 근사한 균종을 선택하면 미크로코카스·바리안스를 들 수 있다. 미크로코카스·바리안스의 균학기재에 의하면, 육즙한천배지를 비롯한 통상의 영양배지상에 발육하는 균태 또는 짐락(Colony)의 색이 황색이다. 이 성질은 미크로코카스·로제우스와 구별하는 성질로서 중요한 성질의 하나로 되어 있다. 그러나, 상기 인용한 바이어드·파아커 등의 참고문헌을 상세히 검토하면, 그들이 분류한 미크로코카스속의 서브구루우프 5중에는 백색짐락의 균주가 많이 포함되어 있고, 이 서브그루우프 5는 미크로코카스·바리안스에 해당하는 것으로 되어 있다. 또 849균주는 에스크린분해력이 통상은 음성이지만, 장기간의 배양에 있어서, 에스크린을 미약하나마 분해하는 일도 있었다. 이들 성질에 있어서, 코쿠르와 마르티네크(M. Kocur and Marinec)의 미크로코카스·바리안스의 네오타이프균주의 기재와 비교하면 조금 상이한 점이 보인다. 그러나 균태 또는 짐락의 색깔이 M849균주는 백색이며, 에스크린분해력에 있어서, 다소의 상이점이 있다고 하더라도 그 외의 형태적, 배양적, 생리적 성질이 미크로코카스·바리안스의 성질과 일치하므로, M 849 균주는 미트로코카스·바리안스와 동일종이라고 동정(同定)함을 타당하다고 하고, 미크로코카스·바리안스, 849로서 미생물공업기술 연구소에 기탁되고, 기탁번호 FERM-P 4912를 얻고 있다. 또 ATCC 31606으로서 American type culture Collection, 12301 Porklaun Drive Rockville Maryland 20852,에 기탁되어 있다.

(2) B 645균[미공연균기 4913호] ATCC 31607의 균학적 성질

(a) 형태

① 영양세포는 크기 직경 1.0~1.8미크론의 구상

② 래키트(packets)상의 집단을 이룬다.

③ 운동성 없고

④ 포자를 형성하지 않는다.

⑤ 그램염색 양성

(b) 각종배지에 있어서의 생육상태(특별히 기입하지 않는 한 배양온도는 30℃이다)

① 육즙한천평판배양

점상(點狀)~소원형, 전선철원형(全線凸圓形), 광택있고, 평활, 어두운 황색~오렌지색, 불투명

② 육즙한천사면배양

생육은 약간 늦어져 중등도(中等度) 또는 약간 불량, 선상으로 발육, 약간 융기, 오렌지 황색~오렌지색, 표면은 평활, 말랑말랑하다, 배지는 불변이다.

③ 육즙액체배양

생육은 늦어지고 균일하게 혼탁한다. 침사(沈渣) 소량생성, 관벽(管壁)에 링(ring) 및 균막은 형성하지 않는다. 취기는 없으며 배양액은 착색하지 않는다.

④ 육즙젤라틴 천자배양(20℃)

생육은 불량. 30℃에서 5일간 배양 후 냉각해도 굳어지지 않으므로 액화력 있음

⑤ 리트머스밀크배양

처음에는 거의 변화하지 않는다. 리트머스의 변색은 없는 채 10일째쯤 응고하기 시작하고, 천천히 펩톤화한다.

(c) 생리적 성질

① 질산염의 환원성 : 음성 ④ 아세토인의 생성 : 음성

② 탈질반응 : 음성 ⑤ 인돌의 생성 : 음성

③ 테스트 : 음성 ⑥ 황화수소의 생성 : 음성

⑦ 전분의 가수분해 : (상기 M 949균의 경우와 같은 방법) pH 5.0의 경우 음성 : pH 9.5의 경우 양성

⑧ 구연산염의 이용법 : 코오저배지, 시몬즈배지에는 음성, 크리스텐센배지에서 양성

⑨ 색소의 생성 : 균태는 황색~오렌지색을 나타내지만 배지중에 수용성색소는 생성하지 않는다.

⑩ 우레아제 : 음성

⑪ 옥시다아제 : 코바크(KOVAC)법 음성

⑫ 카타라아제 : 양성(1% 글루코오스 함유 배지에 배양할 때도 역시 양성)

⑬ 생육의 범위 : 생육최적 pH는 6.0~8.5의 범위이지만, pH 2.5에서도 잘 생육하고, pH 10.5에서도 생육이 가능하다. pH 5.0이하에서는 거의 생육하지 않는다. 생육최적온도는 25°~35℃이다. 40℃이상 또는 17℃ 이하에서 생육하지 않는다.

⑭ 효소에 대한 태도 : 호기성(好氣性)

⑮ OF 테스트 : 상기 M 849균주로 시험했을 때와 마찬가지의 방법에 따른다. 글루코오스 및 만니톨을 탄소원으로 한 조건에 있어서, 호기적으로 생육하지만 혐기적(嫌氣的)으로는 생육하지 않는다. 그리고 산화적으로, 또 혐기적으로 산 및 가스를 생성하지 않는다. 호기적 생육과 혐기조건에서 생육하지 않는 것은 상기한 예반스와 크로오스의 방법에 의해서도 볼 수 있었다.

호기적 배양조건하에 있어서의 각종 당류에서 산의 생성

이들 탄수화물에서 모두 가스는 생성하지 않는다.

에스크린의 분해 : 음성

페닐아라닌의 탈아미노 반응 : 음성

마뇨산의 분해 : 음성

코아규라아제 : 음성

아르기닌의 분해 : 음성

응혈성 : 음성

염화나트륨 내성 : 5% 이하의 식염 함유 육즙배지에 생육한다. 8% 이상으로 생육하지 않는다.

포스파라아제 : 음성

트윈 80의 분해 : 음성

무기질소원한천배지에 있어서의 생육 : 거의 생육하지 않는다(상기 M 849균주와 동일방법으로 시험).

젤라틴액화력 : 양성 (프라지어·젤라틴한천법에 의한다)

카제인의 분해 : 양성 (스킴밀크한천배지법에 의한다)

디·엔·아아제(D.N.ase) : 음성

이상의 결과에서 B 645균도도 역시 미크로코카스속에 속하는 세균이며, 이 균주의 균학적성질은 버어제즈·매뉴알·오브·디터미내티브·박테리올로지 제8판(1974년) 및 상기 인용한 M. Kocur, Z. Pacora 및 T. Martinec등의 인터내셔널, 저어널, 오브, 시스티 매틱, 박테리올로지(Inter J. Syst. Bact) 22권 218페이지(1972)의 보문에 기재된 미크로코카스·루테우스의 네오타이프균주의 균학적성질과 비교하면 잘 일치한다. 따라서 B 445균주는 미크로코카스·루테우스와 동정되고, 미크로코카스·루테우스 B 645로서 미생물공업기술연구소에 기탁되고, 기탁번호 FERM-P 4913을 얻고 있다. 또 ATCC 31607로서 American Type Culture Collection, 12301 PorKlaun Drive, Rockville Maryland 20852, U.S.A에 기탁되어 있다.

(배양법)

본 효소를 발효 생산시킬데는 상기한 본균 등을 통상의 배양법으로 호기적진량배양(好氣的震量培養) 또는 통기교반배양(通氣攪拌培養)으로 행해진다. 사용하는 배지는 상법(商法)의 것, 즉 탄소원으로서 예를들면 코온, 감자, 사탕수수 등의 전분, 가용성전분 : 덱스트린, 산처리 전분, 아미로오스, 아미로펙틴 등의 탄수화물을 4~10% 사용하고, 염소원으로서는 예컨대 대두분(大豆粉), 밀크 카제인, 펩톤, 육에커스, 효모에키스, 코온스틴이브리카, 펩틴함유물, 아미노산류를 단독 내지 적량 혼합 첨가한다. 그밖에 소량의 무기염 예를들어 K₂HPO₄, MgSO₄, 7H₂O등을 적당히 첨가한 배지에 상기 균주를 접종하고, pH 7~10.5로 25~40℃, 바람직하게는 30~37℃로 24~96시간 호기적으로 배양함으로써, 본 효소를 생산 축적시킬 수 있다.

(효소의 채취법)

배양원에서 본 효소를 채취, 정제할데는, 종래 각종의 배양물에서 그 함유효소를 채취, 정제하기 위해서 알려진 상법(常法)을 적절히 사용할 수 있다.

예를들어 배양원액을 감압 또는 한의여과(限外濾過)로 농축하는 방법, 유안, 황산소오다, 식염 등에서의 염석법, 메탄올, 에탄올, 아세톤과 같은 용매에 의한 분획침전법, 적절한 전분 DEAE 셀룰로오스, 교차결합덱스트린 등의 흡착제에 의한 흡착, 용출법(溶出法), 또 단백질침전재에 의한 침전법, , 전기투석법(電氣透析法)등의 정제법을 조합하거나 또는 단독으로 응용할 수 있다.

(효소활성의 측정방법)

사이클로덱스트린 글리코실 트랜스페라아제의 효소활성측정법은 여러가지 방법이 보고되어 있지만, H. Bender에 의한 당전위활성법(糖轉位活性法), [H. bender : Acrch Microbiol 11, 271~282(1977) 및 글루크아밀라제를 사용하는 사이클로덱스트린 생성활성법[M. Matzuzawa등 ∵Die starke, 27 410~413(1975)]의 변법(變法)으로 본 효소의 효소활성을 측정하였던 바, 양자사이에는 상관관계를 볼 수 있었으며, 이하 주로 당전위법에 의해서 활성측정을 했다.

H. Bender에 의한 당전위활성축정법

시클로헵타아밀로오스 0.50%, 말토트리오스 0.025%, CaCl₂5mM을 함유하는 0.05M 인산완충액 (pH 7.0) 1.9ml에 효소액 0.1ml을 가하고, 37℃, 30분간 반응후, 비등수욕중 10분간 가열하여 반응을 정지시킨다. 이것에서 0.5ml를 샘플링하고, B-아밀라아제 40단위를 함유하는 0.2M 인산완충액(pH 6.0) 0.8ml에 주입하고, 37℃, 30분간 반응후, 소모지·넬슨법으로 환원력을 측정하였다. 또 대조로서 효소액 대신에 물을 가한 것을 상기와 완전히 같게 조작한다. 이 양자의 차이의 환원력을 글루코스량으로 환산하여 당전위 활성으로 한다.

활성 1단위는 기질(基質)의 시클로헵타아밀로오스와 말토트리오스에서 37℃, 1분간 글루코오스 1mg에 해당하는 환원력을 발생시키는 효소량으로 한다.

글루코아밀라아제를 사용하는 사이클로덱스트린의 생성활성측정법

1.0% 가용성 전분의 CaCl₂1mM을 함유하는 0.1M베로날 완충액 pH 8.0 1.0ml을 기질로 하고, 이것에 적당한 농도로 희석한 효소액 0.1ml을 가하여, 50℃로 2시간 반응시킨 후, 초산으로 pH 6.0에 조정하고, 전량을 물로 2.0ml로 하여, 100℃로 10분간 가열한다. 다음에 이것에 100μg의 글루코아밀라아제를 가하고 40℃로 1시간 작용시켜,전분 또는 올리고당을 분해한 후, 발생한 글루코오스의 양을 소모지·넬슨법으로 측정한다. 또 대조로서 효소액 대신에 물을 가한 것을 상기와 완전히 마찬가지로 처리한다. 이 양자의 사이를 가지고 사이클로덱스트린의 생성량으로 한다.

신분리균주(新分離菌株)인 미크로코카스·바리안즈 M-849균주와 미크로코카스·루대우스 B-645균주의 사이에서의 효소적 성질에는 거의 차이가 없으므로, 이하 미크로코카스·바리안즈 M-849균주에 대한 효소의 정제 및 이 화학적 성질을 나타낸다.

사용한 효소는 다음의 방법으로 정제했다.

(효소의 정제)

신분리주인 미크로코카스·바이안즈 M-849의 배양액을 원심분리하여 균체를 제거하고, 상징액(上澄液)에 아세톤을 가하여 얻은 효소침전물을 물에 재용해하여, 유안을 가해서 45-65% 포화구분으로 염석하는 효소단백질을 모으고, 이어서 DEAE-세퍼덱스 A-50을 사용하여 컬럼크로마토그래피하고, 다시 세퍼덱스 G-100의 겔분획을 해서 정제효소를얻었다. 본 정제효소는 pH 8.3폴리아크릴아미드겔로 행했다. 디스크전기영동(電氣泳動)으로 1밴드에만 쿠마시이·부릴리언트 블루우(Comassee Brilliant Blue) 단백발색을 나타내고, 또 그 위치에만 효소활성을 나타냈다. 각 공정의 정제의 결과는 표 1과 같다.

[표 1]

(1) 작용 및 기질특이성

본 효소는 각종전분, 예를들어 감자전분, 코온스타아찌, 가용성전분 또는 덱스트린 등에 작용해서 옥도반응을 소설시키지만, 환원력의 증가는 거의 었고, 다량의 사이클로 덱스트린을 생성하며, 최종생상물로서 사이클로덱스트린 외에 말토테트라오사, 말토트리오스, 말토스, 글루코오스 등을 발생시킨다. 또 α-1, 4-글리코시드 결합한 올리고당에 본 효소를 작용시켜도 같은 최종생산물이 얻어진다. 따라서, 본 효소는 사이클로덱스트린·글리코실트랜스페라아제(E.C, 2.4.1.19)라고 말할 수 있다.

그러나, 본 효소는 종래의 사이클로덱스트린·글리코오실트랜스 페라아제가 주로 α- 또는 β-의 어느쪽을 생산하는데 대해서, 본 효소는 통상은 주로 β-사이클로펙스트린을 생성하지만 pH기질농도, 효소활성농도를 조절함으로써 주로 α-사이클로덱스트린을 생성한다고 하는 특징을 지닌다.

(2) 지적(至適) pH 및 안정 pH범위

지적 pH 및 안정 pH범위의 측정에는 초산완충액(pH 4.0~6.0), 베로날완충액(pH 6~8.5), 및 글리신하성소오다완충액(pH 8.5~12.0)을 사용했다. (온도 37℃). 지적 pH의 결과는 제1도 및 제2도에 나타냈다. 제1도는 Bender의 방법을 사용하여 종축(縱軸)에 당전위활성의 상대치를 %로 나태내고, 횡축에 pH를 나타낸다. 제2도는 글루코아밀라아제를 사용하는 방법에 의해 종축에 사이클로펙스트린생성의 대전분 수율을 %로 나타내고, 횡축에 pH를 나타낸다. 또한 흰 동그라미(line 1)는 미크로코카스바리안스 M 849주가 생산하는 효소를, 검은 동그라미(line 2)는 미크로코카스 루테우스 B 645가 생산하는 효소를 나타낸다. 이들 결과에 의하면 본원 발명의 효소는 pH 4.5~10.5의 사이가 상당히 넓은 범위에 걸쳐서 강한 반응을 나타내지만, 지적 pH는 5~8사이에 있고 또한 pH부근에 약간 낮은 피이크의 지적 pH가 있다.

또, 본 효소를 각종 pH로 37℃, 24시간 방치후, 각각의 잔존활성을 측정했던바, 제3도에 나타낸 바와 같이 pH 5~9의 범위에서 거의 실활(失活)하지 않는다.

(3) 작용적온(作用適溫)의 범위

여러 가지 온도(pH=7)에 있어서의 효소활성을 측정한 결과는 제4도에 나타냈다. 제4도는 종축에 상대활성 (37℃)에 있어서의 활성을 100으로 나타낸다. 횡축에 온도 ℃를 나타낸 지적온도 범위곡선, 제3도에 나타낸 바와 같이 40~55℃까지는 온도와 함께 활성을 증대시키고, 지적온도는 55~65℃이다.

(4) pH, 온도 등에 의한 실활(失活)의 조건

pH 5.0, 7.0, 9.0 및 11.0의 효소액(Ca 는 5mM 첨가)을 각 온도로 15분 방치후, 잔존활성을 측정한 결과를 제5도에 나타낸다. 제5도는 종축에 잔존활성 %, 횡축에 온도 ℃를 나타낸다. 결과는 제5도에 나타낸 바와같이 pH 5~9의 범위에서는 50℃까지는 활성을 잃지 않으며, 60℃에 있어서, 약 20~30%가 실활하는 정도이다. 제5도중 곡선 1은 pH5, 곡선 2는 pH7, 곡선 3은 pH 9 및 곡선 4는 pH 9의 곡선이다.

(5) 저해(沮害), 활성화 및 안정화

본 정제효소에 대해서, 0.05M인산환충액(pH7)으로 각종 저해제, 무기염류를 가하고, 37℃, 1시간 방치후, 잔존활성을 측정했던바, 제2표에 나타낸 바와 같이 동, 철, 수은 등의 금속 이온 및 에틸렌디아민테트라 초산에 의해 저해된다. 또 본 효소의 열안정화는 염화칼슘 10^-2M-10^-3M의 첨가로 효과를 볼 수 있으며, 제6도에 나타낸 바와 같이 5℃ 정도의 안정성의 증가가 있었다. 제6도는 종축에 각 온도로 15분간 처리후의 잔존활성%, 횡축에 온도 ℃를 나타내고, 또한 실선(1)은 염화칼슘무첨가, 파선(2)은 염화칼슘 10^-2M첨가의 경우를 나타낸다.

[표 2]

(6) 분자량, 기타

① 본 정제효소에 대해서 초원심침강법에 의한 페터언을 조사한 결과, 좌우대칭의 단일페터언을 부여했다. 효소단백농도 0.5%, 0.3%, 0.2%의 침강계수에서 산출한 침강정수 S20, W는 5.40~5.60×10^-13으로 되고, 계면셀을 사용한 확산정수 D(aV)=5.84×10^-7이 되었다. 이것에서 본 효소의 분자량은 85,000±2,000으로 판정되었다.

② 본 정제효소에 대해서 LKB810 엘렉트로포카싱컬럼을 사용하여, Ampholine pH 3~10 자당(蔗糖)에 의해 밀도구배(型度勾配)를 붙이고 700V, 3mA로 48시간 영동(泳動)시켰던 바, 본 효소는 단일이며, 등전점(等點電)은 4.2라는 것이 판명되었다.

③ 본 정제효소의 아미노산 조성은 표 3과 같다.

(7) 결정구조

본 정제효소는 유안용액중에서 결정화할 수 있다. 결정구조는 정(正) 12면체이며, 그 비효소활성은 45umg of proteint이다.

[표 3]

(사이클로덱스트린의 제조법)

기질(基質), 에를 들어 감자전분, 코온스타아치 등의 전분류 또는 가용성전분, 덱스트린 등의 전분분해물을 가열용해한 후, 전(全) 사이클로덱스트린의 생산을 위해서는 pH 5 10.5, 바람직하게는 4~7이 되도록 pH조정하여 이것에 본 효소를 상기 균주의 배양액, 배양여액 또는 그 농축액이나 정제효소말 등의 본 효소의 각 단계의 효소제품을 가한다. 온도 40~65℃로 소효시간 반응시킨 후, 상법에 의해 생성물을 침전시키고, 그 침전물을 모아서 수세하고, 이것을 상법에 따라서 재결정하면, 사이클로 덱스트린이 결정상으로 얻어진다.

얻어진 사이클로덱스트린을 D.Fremch 등의 방법(J. Am. Chem. Soc. 제71권 353페이지 1949년)에 따라 α, β, : γ-사이클로덱스트린을 분별하고 각기 백색결정으로서 정제결정을 얻을 수 있다. 이들의 이화학적성질중, 결정형, 융점, 비선광도(比旋光度), 옥도정색반응(呈色反應), 환원당량, 적외선흡스수펙트럼을 조사한 경과, 긍지의 α-, β-, γ-사이클로덱스트린의 성질과 일치하는 것이 확인되었다.

(효소량과 사이클로덱스트린의 생성율)

[실험예 1]

가용성 전분 10g CaCl₂, 2H₂O 0.05%를 함유하는 물 100ml을 가해서 가열용해하고, pH 6.0으로 조정한 후, 본 효소액을 가하고 다시 5ml의 트리클로르 에틸렌을 첨가하여, 온도 50℃ 또는 60℃로 2일간 반응 후, 트리클로르 에틸렌 복합체로 하여 침전한 사이클로덱스트린을 분리 회수했다. 그 결과를 표 4에 나타낸다.

[표 4]

즉, 본 효소는 전분 g당 1단위의 효소량의 50~52%의 수율이 얻어지며, 2단위로 60%정도의 높은 수율로 사이클로덱스트린의 생성을 볼 수 있었다.

[실험예 2]

가용성전분에 CaCl₂, 2H₂O 0.05%를 함유하는 물을 가하여 가열 용해하고, 이것을 여러 농도가 되도록 희석하여 각종 pH(다음표에 나타냄)로 조정한 후, 각종 농도의 본 효소량(다음표에 나타냄)을 가하여 온도 50℃로서 2일간 반응했다. 반응종료액을 박층(薄層)크로마토그래피법으로, α-사이클로덱스트린, β-사이클로덱스트린 및 γ-사이클로덱스트린의 생성을 측정했다. 그 결과를 표 5에 나타낸다.

[표 5]

전분에 본 효소를 작용시켜 사이클로덱스트린을 생성할 경우, 그 반응조건 중, 기질농도, 산소첨가량, 반응 pH에 의해서 α-사이클로덱스트린 및 β-사이크로덱스트린 및 γ-사이클로덱스트린의 생성비율이 다르다.

예를들어, 반응 pH 5~6일 경우, 기질농도 3%이상, 효소첨가량 18u/g of Starch의 조건하에서는 β-사이클로덱스트린이 다량으로 생성되는데 대해서, 기질농도 2%이하, 효소첨가량 10u/g of Starch의 조건하에서는 α-사이클로덱스트린의 생성량은 β-사이클로덱스트린을 상회한다.

그런데, 반응 PH가 7~10일 경우는 기질농도, 효소첨가량에는 관계없이, β-사이클로덱스트린의 생성량이 압도적으로 크다.

또 어느 조건하에서도 γ-사이클로덱스트린의 생성량은 매우 소량이다. 즉 반응액의 pH가 5~6일 경우, 기질농도가 그중(重)/용(溶)%이하이고, 효소농도 10u/기질전분의 g이상일 때는 α-사이클로덱스트린의 생성은 β--사이클로덱스트린의 생성을 상회하는 결과가 얻어졌다.

또한 이 경향은 본 효소뿐만 아니라 종래 β-사이클로덱스트린을 생성한다고 하는 균주의 사이클로데스트린 글리코실 트랜스 파리아제에 공통된 경향이라는 것이 발견되었다.

다음에 본원 발명방법의 실시예를 나타낸다.

[실시예 1]

가용성전분 4.0%, 대두분 1.0%, 효모엑키스 0.3%, 글루타민산소오다 0.3% K₂HPO₄0.2%, MgSO₄7H₂O 0.05%, CaCl₂-2H₂O 0.03%로 이루어진 액체배지(pH 8.0)를 500ml용량 프라스코에 60ml씩 분주(分注)하고, 살균한다. 이것에 본원 발명자들에 의해 분리된 미크로코카스 M849주를 스탄트에서 1백금이(白金耳), 접종하여, 32℃로 3일간 진탕배양했다. CaCl₂. 2H₂O 0.1%농도가 되도록 첨가한 후 냉각하고, 2.5배용의 냉아세톤을 첨가하면 효소가 침전한다. 침전물을 원심분리에 의해서 채취하고, 감압건조해서, 9.5g의 조(粗) 효소말이 얻어졌다.

가용성전분 300g을 물 3l(CaCl₂, 2H₂O 6g을 함유함)에 가열용해하고, HCl로 pH6 0에 조절후, 상기 효소말 1g(770u)을 가하고, 60℃로 48시간 반응시킨다. 이어서 액에 활성탄 4g을 가하고, 온도 60℃이상에서 여과하여 여액을 냉각하면 사이클로덱스트린 180(대전분수율 60%)이 백색 결정으로서 얻어진다.

[실시예 2]

실시예 1의 조효소말 1g 대신에 실시예 1과 같은 방법으로 배양한 프로스의 원침상청(遠沈上淸) 100ml(860u)을 사용한 외는 모두 실시예 1에 기재한 방법과 동일한 방법에 의해서, 가용성전분을 분해했던 바 사이클로덱스트린 150g(수율 50%)이 백색결정으로서 얻어진다.

[실시예 3]

상기 미크로코카스바리안스 M849주 대신에 본원 발명자들에 의해 분리된 미크로코카스 루테우스 B645주를 사용한 외는 모두 실시에 1에 기재한 방법에 의해서 조효소말 1.0g(650u)에 의해 가용성전분을 분해하면, 사이클로덱스트린 160g(수율 53%)이 백색의 결정으로서 얻어진다.

[실시예 4]

가용성전분 300g을 물 3l(CaCl₂. 2H₂O 6g을 함유함)에 가열용해하고, HCl로 pH 6.0으로 조절후, 실시예 1로 얻은 조효소말 1.5g(1155u)을 가하고, 50℃로 72시간 반응시킨다. 생긴 결정을 여취하고, 물 0.7l에 가열용해후, 활성탄 3g을 가하여, 온도 60℃이상에서 여과하고, 여액을 냉각시키면 사이클로덱스트린 100g(수율 33%)이 백색의 결정으로서 얻어진다.

[실시예 5]

가용성전분 300g을 물 3l(CaCl₂. 2H₂O6g을 함유함)에 가열용해하고, HCl로 pH 6.0으로 조절후, 실시예 1로 얻은 조효소말 0.5g을(335u)을 가하고, 다시 트리클로르에틸렌 200ml을 가하여 50℃로 48시간 반응시킨다. 이어서, 반응액을 냉각시키면서 혼합교반하여, 생성물을 침전시킨다. 생긴 침전물을 모아서 수세후 물 1l에 현탁시키고 가열하여 트리크로르에틸렌을 제거한다. 이 용해액에 활성탄 4g을 가하고 온도 60℃이상에서 여과하여 여액을 냉각한 후, 같은 양의 이소프로판올을 첨가하고, 하룻밤 방치하면, 사이클로덱스트린 190g(수율 63%)이 백색의 결정으로서 얻어진다. 이 취득결정의 α,β 및 γ-사이클로덱스트린의 혼합비율을 분석하면 α : β : γ- 5 : 8.5 : 10이다.

[실시예 6]

가용성 전분 100gl(CaCl₂. 2H₂O 10g을 함유함)에 가열용해하고, HCl로 pH5.0으로 조절한 후, 실시예 1로 얻은 조효소말1.5g(1155u)를 가하여 50℃로 48시간 반응시킨다. 이어서 반응액을 수냉후, 톨루엔300ml을 가하여 충분히 교반혼합하고 생기침전을여과하여 침전부와 여액부로 분별해서 채취한다.

침전부는 물 60ml에 현탁시키고, 가열해서 톨루엔을 제거한다. 이 용해액에 활성탄 0.3g을 가하여 온도 60℃이상으로 여과하고, 여액을 냉각하면 β-사이클로덱스트린 15g(대전분수율 15%)이 백색의 결정으로서 얻어졌다.

한편, 여액부는 액량 1l까지 감압농축한 후 냉각하여 테트라클로로에탄 30ml을 첨가하고, 충분히 혼합교반하여 생성물을 침전시킨다. 생긴 침전을 여취하고 수세 후, 물 100ml을 첨가해서 가열하여 테트라클로르에탄을 제거한다. 이 용해액에 활성탄 0.5g을 가하여 온도 50℃이상으로 여과하고, 여액을 냉각후, 같은 양의 이소프로판올을 첨가하여 하루밤 방치하면, α-사이클로덱스트린 25g(대전분수율 25%)이 백색분말로서 얻어진다.

상기와 같은 분별해서 채취할 사이클로덱스트린은 융점, 선광도, 옥도에 의한 정색반응 및 박층크로 마토그래피등의 방법에 의해 각각 α-사이클로덱스트린 및 β-사이클로덱스트린이라는 것이 동정(同定)되었다.

[실시예 7]

가용성전분 300g을 물 3l(CaCl₂. 2H₂O6g을 함유함)에 가열용해하고, Na₂CO₃로 pH10으로 조절후, 실시예 3으로 얻은 조효소말0.5g(325u)을 가하여, 다시 톨루엔 200ml을 가해서 55。로 48시간 반응시킨다. 이어서 생긴 침전물을 모아서 수세후, 물 1l에 현탁시켜 가열해서 톨루엔을 제거한다. 이 용해액에 활성탄 4g을 가하여 온도 60℃이상으로 여과하고 여액을 냉각후, 같은 양의 이소프로판올을 첨가하여 하루밤 방치하면 사이클로덱스트린 180g(수율 60%)이 백색의 결정으로서 얻어진다. 이 취득결정의 α,β 및 γ-사이클로덱스트린의 혼합비율을 분석하였더기 α : β : γ=0 : 95 : 5였다.

[실시예 8]

실시예 6의 조효소말 1.5g대신에 실시예 3으로 얻은 조효소말 2.0g(1300u)을 사용한 외는 모두 실시예 6에 기재한 방법과 동일한 방법에 의해서 가용성전분을 분해했던바, α-사이클로덱스트린 30g(대전분수율 30%) 및 β-사이클로덱스트린 12g(수율 12%)이 얻어졌다.

[실시예 9]

감자전분 300g을 물 3l(CaCl₂. 2H₂O 6g을 함유함)에 가열용해하고, HCl로 pH 6.0으로 조절후, α-아밀라아제(네오스피타아제 K) 0.06g을 가하여 80℃로 10분간 처리후, 재차 100℃로 10분간 가열처리한다. 이어서 냉각시켜 실시예 1로 얻은 조효소말 1g(770u)을 가하여 60℃로 48시간 반응시킨다. 반응종료액을 수냉후, 톨루엔 200ml을 가하여 충분히 혼합교반하고, 생성물을 침전시킨다. 생긴 침전을 여취하고 수세후, 물 1l에 현탁시켜 가열해서 톨루엔을 제거한다. 이 용해액에 활성탄 4g을 가하고 온도 60℃이상에서 여액을 냉각시키면 사이클로덱스트린 170g(대전분수율 57%)이 백색의 결정으로서 얻어진다.

Claims (1)

1. 미크로코카스(Micrococcus)속의 미크로코카스배리언스(Micrococcus Varians) M849 (FERM-P No.4912 및 ATCC 31606) 또는 미크로코카스루테우스(Micrococcus Luteus) B645(FERM-P 4913 및 ATCC 31607)에 속하는 사이클로덱스트린·글리코실트랜스페라아제(cyclodextrin glycosyl Transferase) 생성균을 영양배지(榮養培地)에서 배양해서 얻어지는 배양액, 배양여액, 또는 그 농축이나 그들의 각 단계의 효소제품을 전분 또는 전분분쇄물에 작용시켜서, 사이클로덱스트린을 생성시키는 것을 특징으로 하는 사이클로덱스트린의 제조법.

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