FI110518B - Levaanisakkaraasientsyymi, menetelmä sen tuottamiseksi, sitä tuottavia mikro-organismeja ja sitä sisältävä koostumus - Google Patents

Description

110518

Leväänisakkaraasientsyymi, menetelmä sen tuottamiseksi, sitä tuottavia mikro-organismeja ja sitä sisältävä koostumus

Esillä oleva keksintö koskee happostabiilia le-5 vaanisakkaraasientsyymiä, sitä tuottavia mikro-organismeja, menetelmää tämän happostabiilin levaanisakkaraasientsyymin tuottamiseksi, sitä sisältäviä koostumuksia ja sen käyttöä.

Levaanisakkaraasientsyymi katalysoi fruktoosin siirtoa. Täsmällisemmin ilmaistuna levaanisakkaraasientsyy-10 mit (E.C.2.4.1.10) katalysoivat fruktosyylitähteiden siirtoa sakkaroosista, raffinoosista tai stakyoosista sopivaan kosubstraattiin tuottaen polymeerejä, joita yleisesti kutsutaan levaaneiksi, ja jotka sisältävät vaihtelevia määriä p2_>6-sidoksista muodostuneita fruktosyylitähteitä. Levaa-15 neilla on laajat sovellutusalueet kemian- ja elintarviketeollisuudessa sekä lääketieteessä ja tutkimuksessa.

Levaanisakkaraasientsyymejä on eristetty useista mikrobilähteistä, sellaisista mikro-organismeista kuin Äce-tobacter suboxydans, Actinomyces viscosus, Aerobacter le-20 vanicum, Bacillus amyloliguefaciens. Bacillus lichenifor-•mis, Bacillus mesentericus. Bacillus subtilis, Glucobacter oxydans, Streptococcus mutans, Streptococcus salivarius, : Streptomyces griseus, Zymomonas mobilis. Useimmissa tapauk- :·· sissa entsyymi on ekstrasellulaarinen ja lämpölabiili. Le- ! 25 vaanisakkaraasientsyymin tuotannon eräs tärkeimmistä piir teistä on se, että kasvualustaan täytyy lisätä ainakin 5 % sakkaroosia entsyymin synteesin indusoimiseksi tunnetuilla levaanisakkaraasientsyymejä tuottavilla mikro-organismeilla .

30 Tästä johtuen levaanisakkaraasientsyymin eristys kasvatusliemestä vaikeutuu, koska kasvatusliuoksen viskosi-teetti kasvaa, kun levaania syntyy f ermentaation aikana. Niinpä mikro-organismeja, jotka tarvitsevat vähän tai ei ' lainkaan sakkaroosia levaanisakkaraasin tuottamiseen, etsi- : : 35 tään jatkuvasti.

2 110518 JP-patenttihakemuksessa 52-82 781 kuvataan menetelmä ekstrasellulaarisen levaanisakkaraasientsyymin tuottamiseksi matalassa sakkaroosipitoisuudessa (0,3 pai-no/tilavuus-%) käyttäen Bacillus licheniformis -kantaa AJ 5 3982 (Institute of Microbial Engineering -tallennus nro 3373). Kuitenkin tämäkin entsyymi tarvitsee sakkaroosia, jotta se indusoituisi ja sitä voitaisiin tuottaa. Lisäksi tämä levaanisakkaraasientsyymi ei kehitä entsymaattista aktiivisuutta pH 4,0:ssa, kun sitä tuotetaan 55 °C:n lämpöti-10 lassa. Kyseisessä lämpötilassa se saavuttaa vain 50 % maksimaalisesta aktiivisuudestaan noin pH 5,2:ssa ja noin 80 % maksimiaktiivisuudestaan noin pH:ssa 6 - 7,8. Tämä kapea pH-alue rajoittaa tämän levaanisakkaraasientsyymin käyttöaluetta. Lisäksi levaanisakkaraasientsyymin happostabiili-15 suus on erittäin tärkeä entsyymin laajaa kaupallista soveltuvuutta ajatellen.

Esillä olevan keksinnön päämääränä on antaa käyttöön levaanisakkaraasientsyymi, joka saavuttaa entsymaatti-sen aktiivisuuden laajemmalla pH-alueella kuin tunnetut 20 entsyymit ja joka, toisin kuin tunnetut entsyymit, on sta-• biili happamilla pH-arvoilla.

:\· Esillä oleva keksintö antaa tähän tarkoitukseen .·. . happostabiilin levaanisakkaraasientsyymin, joka on saatu ;··. Bacillus-lajiin kuuluvasta mikro-organismista ja joka saa- \ ! 25 vuttaa noin 55 °C:n lämpötilassa ja pH:ssa 4,0 aina kin 50 % maksimaalisesta aktiivisuudestaan mitattuna 55 °C:ssa. Tämä levaanisakkaraasientsyymi saavuttaa lisäksi edullisen entsymaattisen aktiivisuuden laajalla pH-alueella substraatin, kuten sakkaroosin, läsnäollessa. Lisäksi se : 30 saavuttaa pH-alueella noin 5,5 - 6,3 maksimaalisen entsyy- : ” miaktiivisuuden noin 55 °C:ssa. Keksinnön mukaiselle ent- syymille on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksessa 1 esitetään.

110518 3 Täsmällisemmin sanottuna se lisäksi saavuttaa noin 55 °C:n lämpötilassa ja pH-alueella noin 4,0 - 8,4 entsyymiaktiivisuuden, joka on ainakin 50 % maksimaalisesta entsyymiaktiivisuudesta mitattuna 55 °C:ssa. Se saavuttaa 5 kyseisessä noin 55 °C:n lämpötilassa ja pH-alueella noin 4,2 - 8,0 entsyymiaktiivisuuden, joka on ainakin 70 % mak-simiaktiivisuudesta mitattuna 55 °C:ssa. Se saavuttaa kyseisessä lämpötilassa ja pH-alueella noin 4,5 - 7,8 entsyymiaktiivisuuden, joka on ainakin 80 % maksimiaktiivi-10 suudesta 55 °C:ssa. Se saavuttaa noin 55 °C:ssa ja pH-alueella noin 4,7 - 7,2 entsyymiaktiivisuuden, joka on ainakin 90 % maksimiaktiivisuudesta mitattuna 55 °C:ssa.

Keksinnön mukaisella levaanisakkaraasientsyymillä on edullinen lämpöstabiilisuus substraatin, kuten sakka-15 roosin, läsnäollessa. Lisäksi se saavuttaa lämpötila-alueella noin 55 - 64 °C maksimaalisen entsyymiaktiivisuuden pH 5,5:ssä.

Täsmällisemmin sanottuna se lisäksi saavuttaa noin pH 5,5:ssä ja lämpötila-alueella noin 35 - 75 °C entsyymi-_ · 20 aktiivisuuden, joka on ainakin 50 % maksimaalisesta ent- syymiaktiivisuudesta mitattuna pH 5,5:ssä. Se saavuttaa kyseisessä noin pH 5,5:ssä ja lämpötila-alueella noin 45 -'· 68 °C entsyymiaktiivisuuden, joka on ainakin 80 % maksimi- ‘ aktiivisuudesta mitattuna pH 5,5:ssä. Se saavuttaa kysei- : 25 sessä noin pH 5,5:ssä ja lämpötila-alueella noin 50 - 67 °C entsyymiaktiivisuuden, joka on ainakin 90 % maksimi-aktiivisuudesta mitattuna pH 5,5:ssä.

Keksinnön mukainen levaanisakkaraasientsyymi on soluun sitoutunut entsyymi. Sillä on fruktosyylitransfe-. 30 raasiaktiivisuutta ja se kykenee siten tuottamaan sakka- ·.. roosista "levääni"-perheeseen kuuluvia fruktosyylipolymee- ‘! . rejä, jotka koostuvat β-ϋ(2-+6)-kytketyistä fruktooseista.

Keksinnön mukainen levaanisakkaraasientsyymi ei ole sakkaroosilla indusoituva entsyymi, eli se ei tarvitse lv 35 sakkaroosia indusoituakseen ja ollakseen tuotettavissa.

4 110518

Esillä oleva keksintö antaa käyttöön myös menetelmän kyseisen happostabiilin levaanisakkaraasientsyymin tuottamiseksi mikro-organismia käyttäen, ilman että sakkaroosia on lisätty ravintoalustaan.

5 Keksinnön mukainen menetelmä happostabiilin le vaanisakkaraasientsyymin tuottamiseksi sisältää seuraavat vaiheet: (i) kasvatetaan Bacillus-sukuun kuuluvaa mikro-organismia sopivassa ravintoalustassa muodostamalla fermen- 10 tointiliemi, joka sisältää biomassaa, ja (ii) otetaan talteen levaanisakkaraasientsyymi kyseisestä fermentaatioliemestä, jolloin mikro-organismia viljellään ilman sakkaroosia.

Esillä olevan keksinnön päämääränä on antaa käyt-15 töön myös uusi Bacillus-sukuun kuuluva mikro-organismi, joka tuottaa happostabiilia levaanisakkaraasientsyymiä ilman sakkaroosia ravintoalustassa.

Tähän tarkoitukseen esillä oleva keksintö antaa käyttöön uuden Bacillus licheniformis -lajin mikro-20 organismin, joka tuottaa happostabiilia levaanisakka- • raasientsyymiä ilman sakkaroosia ravintoalustassa. Keksin- :\· nön mukainen Bacillus licheniformis -lajin mikro-organismi APMC 84 on tallennettu Agricultural Research Culture Col-;·_· lection -kokoelmaan (NRRL) , Peoria, Illinois, Budapestin .* 25 sopimuksen mukaisesti.

* Talletusnumero on NRRL B-18962.

Esillä olevan keksinnön mukaista levaanisakka raasientsyymiä voidaan tuottaa joko Bacillus licheniformis -kannan NRRL B-18962 tai tämän mikro-organismin luonnollis-./· 30 ten tai keinotekoisten mutanttien tai muiden johdannaisten avulla. Tällaisia mutantteja voidaan saada tunnetuilla tek-.!,* nilkoilla, kuten röntgen- tai ultraviolettisäteilytyksellä, kemiallisilla mutageeneilla ja geeniteknologian avulla.

[ Levaanisakkaraasientsyymiä, joka on tuotettu kek- r·’ 35 sinnön mukaisella menetelmällä, valmistetaan viljelemällä

Bacillus-sukuun kuuluvaa mikro-organismia ravintoalustassa, 5 110518 joka sisältää hiiltä, typpeä ja epäorgaanisia suoloja, aerobisissa olosuhteissa ilman sakkaroosia ja ottamalla siitä talteen levaanisakkaraasientsyymi.

Näiden mikro-organismien viljelyolosuhteet, kuten 5 ravintoalustan komponentit, parametrit, lämpötila, pH, sekoitus, ilmastus, ovat ilmeisiä alan ammattimiehelle.

Sopivia hiililähteitä ovat glukoosi, fruktoosi, maltodekstriini, glyseroli, maissisiirappi, tärkkelys, hydrolysoitu tärkkelys tai kahden tai useamman tällaisen hii-10 lilähteen seokset. Edullisimpia hiililähteitä ovat maissisiirappi ja hydrolysoitu tärkkelys.

Typenlähteitä, joita voidaan käyttää, ovat soijapa-pujauho, maissiliotealkoholi, (corn steep liquor), peruna-jauho, pellavansiemenjauho, kalajauho, hiiva, hiivauute tai 15 kahden tai useamman tällaisen typenlähteen seos. Edullisimpia typenlähteitä ovat soijapapujauho, puuvillansiemenjau-ho, hiivauute sekä soijapapujauhon ja hiivauutteen seos.

Sopivia suoloja ovat kaliumsulfaatti, mangaanisul-faatti, ammoniumsulfaatti, ammoniumsitraatti, kaliumfos-J.l, 20 faatti, natriumvetyfosfaatti, natriumdivetyfosfaatti, kal- : :* siumkloridi, natriumsitraatti tai kahden tai useamman täl- laisen suolan seos. Edullisimpia suoloja ovat natriumvety-fosfaatin, natriumdivetyfosfaatin, kalsiumkloridin ja nat-;·.· riumsitraatin seos.

*. ! 25 Alusta, joka sisältää yllä mainitut komponentit, • · * steriloidaan perinteisellä tavalla ja inokuloidaan sopival la mikro-organismikannalla, edullisesti B. licheniformis -kannalla ja edullisemmin B. licheniformis APMC 84 -kannalla.

30 Kasvatus suoritetaan aerobisesti, ravistamalla tai ilmastussekoituksen avulla, yleensä noin 25 - 46 °C:n läm-pötilassa noin 6-40 tuntia pH:n ollessa noin 5,0 - 8,5. Edullisesti kasvatus tehdään noin 30 - 42 °C:ssa välillä * noin 12 - 30 tuntia pH:n ollessa noin 6,0 - 8,0. Hyviä tu- : 35 loksia saadaan, kun viljely tehdään noin 36 - 40 °C:ssa noin pH:ssa 6,5 - 8,5.

6 110518

Viljelyn jälkeen saadaan fermentaatioliuos, joka sisältää biomassaa. Tämä biomassa, joka sisältää mikro-organismin soluja soluun sitoutuneine levaanisakkaraasient-syymeineen, erotetaan ja otetaan talteen kasvatussuodokses-5 ta käyttäen sellaisia perinteisiä menetelmiä, kuten sentri-fugointia, ulossuolausta, saostamista, suodatusta, ult-rasuodatusta, mikrosuodatusta, sentrifugointia, jota seuraa ultrasuodatus, tai suodatusta, jota seuraa mikrosuodatus.

Eristetty ja talteen otettu biomassa pestään sen 10 jälkeen, edullisesti useita kertoja vedellä, ja edullisemmin deionisoidulla, tislatulla vedellä, ja homogenisoidaan. Toistuvalla biomassan pesulla ei ole mitään vaikutusta soluun sitoutuneen levaanisakkaraasientsyymin aktiivisuuteen, mistä voidaan tehdä se johtopäätös, että entsyymi on lujas-15 ti sitoutunut soluun.

Levaanisakkaraasientsyymiä voidaan edelleen puhdistaa, jos se on tarpeen ja suunnitellun käytön mukaista. Soluun sitoutunut entsyymi voidaan saada liukoiseksi ionisil-la detergenteillä, sellaisilla kuten natriumkolaatilla tai 20 natriumdodekyylisulfaatilla (0,25 % - 2,5 %) , tai suolaliu- • ;* oksilla, kuten Mg++-liuoksella. Entsyymi voidaan myös saos- · taa 65 - 75-%:isella ammoniumsulfaatilla noin 0 °C:ssa. Jos on tarpeen, sonikointia voidaan myös käyttää erottamaan le-vaanisakkaraasientsyymi soluista.

i *. ! 25 Levaanisakkaraasientsyymi voidaan formuloida koos- • » • · * tumuksiksi, jotka sisältävät levaanisakkaraasientsyymiä, ja jotka ovat käyttökelpoisia erilaisilla teollisuuden aloilla, kuten erityisesti elintarviketeollisuudessa ja kemianteollisuudessa .

• t'. 30 Levaanisakkaraasientsyymi voidaan saattaa suunni- teltujen sovellutusten mukaiseen muotoon. Tavallisesti ent-

I I

,!,* syymikoostumukseen lisätään myös stabilisaattoreita ja säilöntäaineita. Entsyymiä voidaan esimerkiksi stabiloida lisäämällä entsyymin vesiliuokseen glyserolia (50 tilavuus-35 %), ammoniumsulfaattia (3,2 mol/1) tai natriumkloridia (3 mol/1) .

7 110518

Elintarvikesovellutuksiin entsyymiä voidaan käyttää immobilisoituna kytkemällä entsyymi kemiallisesti tai fysikaalisesti oleellisesti liukenemattomaan, inerttiin kanta-jamateriaaliin, mikä helpottaa käyttöä läpivirtausreakto-5 reissä. Yleensä entsyymi kiinnitetään kantajaan. Kantajama-teriaaleina käytetään orgaanisia ja epäorgaanisia materiaaleja, kuten huokoista, rakeista piimaata, jota on käsitelty polyamiini- tai glutaraldehydillä, rakeista aktiivihiiltä, pinta-aktiivista materiaalia, kuten alumiinioksidia, hiil-10 tä, savea, zirkoniumdioksidia, titaanidioksidia, ioninvaih-tohartseja, selluloosaa tai lasia, kemiallisesti aktivoituja kantajia, kuten selluloosaa, agaroosia, synteettisiä polymeerejä, esimerkiksi polyakryyliamidi-, silika- ja tärk-kelysgeelejä, jolloin entsyymi siepataan polymeerimatriisin 15 sisään. Edullisesti kokonaisia Bacillus-soluja, jotka sisältävät levaanisakkaraasientsyymiä, voidaan käyttää suoraan immobilisointiprosessissa, ilman, että entsyymiä eristetään ja puhdistetaan.

Koostumuksia, jotka sisältävät esillä olevan kek- • ^ 20 sinnön mukaista levaanisakkaraasientsyymiä, voidaan käyttää 1 :* joko kiinteässä tai liuosmuodossa. Nämä koostumukset voi- daan tehdä lopulliseksi tuotteeksi, joka on liuos, kiinteä ,·. tai rakeinen aine, pulveri tai liete.

;·,· Esillä olevan keksinnön mukaisia koostumuksia voi- \ ! 25 daan käyttää levaanien tuottamiseen fruktosyylitähteitä si- • sältävistä sokereista, kuten sakkaroosista, raffinoosista tai stakyoosista. Näitä sokereita voidaan saada sellaisista raaka-aineista, kuten raa'asta sokerijuurikkaasta, murskattujen tai rikottujen sokerijuurikkaiden puhdistetusta me- !,“· 30 husta, melassista, sokeriruo' osta, juurikas- tai kasvisoke- : ’’ rista.

• · ..V Saadut levaanit voivat olla suurimolekyylipainoisia levaaneja, pienimolekyylipainoisia levaaneja (frukto-oli-gosakkarideja) ja fruktosyylipolymeerejä.

: *’ 35 Esillä olevaa keksintöä kuvataan edelleen seuraavi- :’*, en esimerkkien avulla.

e 110518

Esimerkki 1

Ymppialusta, jota käytetään inokulointiin, valmistetaan seuraavista komponenteista: kalsiumkloridi, 0,02 paino/tilavuus-%, natriumsitraatti, 0,3 %, hydrolysoitu 5 tärkkelys, 2,6 %, jota myydään tavaramerkillä MALTRIN 100 (GPC) , puuvillansiemenjauho, 4,6 %, jota myydään tavaramerkillä PHARMAMEDIA (TRADERS PROTEIN), natriumvetyfosfaatti, 0,21 % ja natriumdivetyfosfaatti, 0,54 %. Tämä ymppialusta steriloidaan 125 °C:ssa 30 minuuttia ymppäyspulloissa, jot-10 ka ovat 250 ml:n väliseinällisiä (triple baffled) Erlen-meyer-pulloja ja sisältävät 50 ml ymppäyslientä. Nämä in-okuloidaan B. licheniformis -kannan APMC 84 jäädytetyillä glyserolivilj elmillä.

Tämän kannan ymppiä viljellään pyörivässä raviste-15 lijassa 37 °C:ssa 24 tuntia, ennen kuin sitä käytetään tuo-tantopulloihin ymppilähteenä.

Levaanisakkaraasientsyymin tuottoon käytettävä alusta valmistetaan seuraavista komponenteista: maissisii-rappi, 10,3 paino/tilavuus-%, jota myydään tavaramerkillä :,j, 20 STALEY 200 -maissisiirappi (A.E. STALEY), soi j apapuj auho,

; 5,5 %, jota myydään tavaramerkillä PROMOSOY 100 (CENTRAL

SOYA), hiivauute (myyjä: UNIVERSAL FOODS CORP) 0,32 %, nat-riumvetyfosfaatti 0,7 % ja natriumdivetyfosfaatti 0,7 %.

;·,· Tätä tuotantoalustaa steriloidaan 125 °C:ssa ! 25 30 minuuttia tuotantopulloissa, jotka ovat 250 ml:n väli- * · ‘ seinällisiä Erlenmeyer-pulloja ja sisältävät 50 ml tuotan toalustaa .

Ympin määrä on kaksi tilavuus/tilavuus-%. Inokuloi-tuja tuotantopulloja inkuboidaan pyörivässä ravistelijassa ',** 30 37 °C:ssa 16 - 20 tuntia.

: Kun levaania tuotetaan fermentaatioliemessä, visko- siteetin kasvua ei havaita.

Tuotettu entsyymi voidaan helposti eristää sen olematta juurikaan tahmea.

il * : i t t 9 110518

Pullojen biomassa erotetaan fermentaatioliemestä sentrifugoimalla, minkä jälkeen solut pestään deionisoidul-la, tislatulla vedellä kaksi kertaa ja homogenisoidaan.

Keksinnön mukainen levaanisakkaraasientsyymi ote-5 taan talteen.

Levaanisakkaraasientsyymiyksikkö (LSU) määritellään sellaisena määränä entsyymiaktiivisuutta, joka tarvitaan tuottamaan menetelmän olosuhteissa yhden mikromoolin glukoosia minuutissa.

10 Entsyymiaktiivisuus mitattiin käyttäen sakkaroosia substraattina. Yhteen millilitraan entsyymiä lisättiin 7,5 ml 0,01 M sitraattipuskuria, pH 5,5, joka sisälsi 60 paino/paino-% sakkaroosia. Sen jälkeen reaktioseoksen tilavuus täydennettiin 10 ml:ksi tislatulla vedellä, ja 15 seosta inkuboitiin 55 °C:ssa yksi tunti. Mainitun ajan kuluttua entsyymireaktio pysäytettiin lämmittämällä 10 minuuttia 95 °C:ssa. Reaktiotuotteen glukoosisisältö määritettiin korkean suorituskyvyn nestekromatografia (HPLC) -analyysillä (Brobst, K. M. ja Schobell, H. D., Starch/ : 20 Starke 34 (1982), 117 - 121.

: .·. pH:n vaikutuksen arviointi levaanisakkaraasientsyy- : min aktiivisuuteen määritettiin tekemällä entsymaattinen ! ! transfruktosylaatioreaktio sen jälkeen, kun entsyymiä oli / inkuboitu tunnin ajan 55 °C:ssa eri pH:issa: 4,0, 4,5, 5,0, : ·’ 25 5, 5, 6,0, 6, 5, 7,0, 7,5 ja 8,0 sopivassa fosfaattipuskuris- ’.· ‘ sa (0,01 M). Muodostuneen glukoosin määrä määritettiin HPLC:llä (korkean suorituskyvyn nestekromatografia). Aktiivisuus laskettiin.

55 °C:ssa maksimiaktiivisuus saavutetaan noin ;\j 30 pH:ssa 5,5 - 6,0.

.··· Kuvio 1 kuvaa pH: n vaikutusta entsyymin aktiivisuu- • · teen 55 °C:n lämpötilassa. Tässä kuviossa X-akseli kuvaa pH:ta ja Y-akseli kuvaa aktiivisuutta esitettynä prosent-teinä maksimaalisesta aktiivisuudesta, joka saavutetaan 35 pH 5,5:ssä ja 55 °C:ssa. 0-symboli kuvaa keksinnön mukaisen 10 110518 entsyymin arvoja ja vertailun vuoksi symboli # edustaa JP-patenttihakemuksen 52-82 781 arvoja.

Esillä olevan keksinnön mukainen entsyymi on stabiilimpi happamalla pH-alueella kuin entsyymi, joka on ku-5 vattu kyseisessä tunnetussa JP-patenttihakemuksessa.

Esillä olevan keksinnön mukainen entsyymi saavuttaa 55 °C:ssa ja pH:ssa 4,0 yli 50 % maksimaalisesta aktiivisuudestaan mitattuna 55 °C:ssa, kun taas tunnetun tekniikan mukainen entsyymi ei osoittanut lainkaan aktiivisuutta pH 10 4,0:ssa ja kyseisessä lämpötilassa.

Kuvio 1 osoittaa, että keksinnön mukainen le-vaanisakkaraasientsyymi saavuttaa huomattavan entsymaatti-sen aktiivisuuden laajalla pH-alueella sakkaroosin läsnäollessa. Se saavuttaa pH-alueella noin 5,5 - 6,3 maksimaali-15 sen entsyymiaktiivisuuden 55 °C:ssa. Täsmällisemmin sanottuna se lisäksi saavuttaa noin 55 °C:n lämpötilassa ja pH-alueella 4,0 - 8,4 entsyymiaktiivisuuden, joka on ainakin 50 % maksimaalisesta entsyymiaktiivisuudesta mitattuna 55 °C:ssa. Se saavuttaa kyseisessä noin 55 °C:n lämpötilas-: 20 sa ja pH-alueella 4,2 - 8,0 entsyymiaktiivisuuden, joka on : ainakin 70 % maksimiaktiivisuudesta mitattuna 55 °C:ssa. Se .·,; saavuttaa kyseisessä lämpötilassa ja pH-alueella noin 4,5 - ! 7,8 entsyymiaktiivisuuden, joka on ainakin 80 % maksimiak- tiivisuudesta mitattuna 55 °C:ssa. Se saavuttaa noin \ 25 55 °C:ssa ja pH-alueella noin 4,7 - 7,2 entsyymiaktiivisuu den, joka on ainakin 90 % maksimiaktiivisuudesta mitattuna 55 °C:ssa.

Lämpötilan vaikutuksen arviointi levaanisakka-raasientsyymin aktiivisuuteen määritettiin tekemällä ent-30 syymireaktio pH:ssa 5,5, sen jälkeen kun oli suoritettu .··· tunnin inkubointi eri lämpötiloissa: 40 °C, 50 °C, 55 °C, · 60 °C, 70 °C ja 80 °C.

Reaktioseos koostui 7,5 ml:sta 60-paino/tilavuus-*”·’ %:ista sakkaroosiliuosta 0,01 M sitraattipuskurissa, pH

.*.* 35 5,5, ja 1,0 ml:sta pestyä biomassaa, jonka entsyymiaktiivi- ,·. : suus oli 30 LSU/ml.

11 110518 pH:ssa 5,5 maksimiaktiivisuus saavutetaan 60 °C:ssa.

Kuviossa 2 esitetään lämpötilan vaikutus le-vaanisakkaraasientsyymin aktiivisuuteen. Tässä kuviossa X-5 akseli kuvaa reaktion lämpötilaa °C:ina ja Y-akseli kuvaa aktiivisuutta esitettynä prosentteina maksimiaktiivisuudes-ta, joka saavutetaan 60 °C:ssa ja pH 5,5:ssa. Symboli O esittää keksinnön mukaisen entsyymin arvoja ja verrokkina symboli # esittää JP-patenttihakemuksesta 52-82 781 otettu-10 ja arvoja.

Kuvio 2 osoittaa, että keksinnön mukaisella le-vaanisakkaraasientsyymillä on sakkaroosin läsnä ollessa edullinen lämpöstabiilisuus.

Se saavuttaa lämpötila-alueella noin 55 - 64 °C

15 maksimaalisen entsyymiaktiivisuuden noin pH:ssa 5,5.

Tarkemmin ilmaistuna se saavuttaa noin pH:ssa 5,5 ja lämpötila-alueella noin 35 - 75 °C entsyymiaktiivisuuden, joka on ainakin 50 % maksimiaktiivisuudesta mitattuna pH 5,5:ssä. Se saavuttaa kyseisessä pH 5,5:ssä ja noin 45 -: 20 68 °C:ssa 80 % pH 5,5:ssä mitatusta maksimiaktiivisuudesta.

: .· Se saavuttaa kyseisessä pH 5,5:ssä ja lämpötila-alueella .·. : noin 50 - 67 °C entsyymiaktiivisuuden, joka on ainakin 90 % ! pH 5,5:ssä mitatusta maksimiaktiivisuudesta.

, . Esimerkki 2 * ; 25 Levaanisakkaraasientsyymin pitoisuuden (LSU/g sak karoosia) vaikutus reaktiotuotteen koostumukseen eri aikajaksoina mitattiin 55 °C:n lämpötilassa ja pH 5,5:ssä.

Tyypillisessä esimerkissä 4,5 g sakkaroosia 9,5 mlrssa vettä inkuboitiin 0,5 ml: n biomassaerien kanssa, 30 jotka sisälsivät eri määriä levaanisakkaraasientsyymiä: .·“ 4,5, 9,0 ja 22,5 LSU 50 °C:ssa. Näytteitä otettiin eri ai- ; · kaväleillä, ja reaktio pysäytettiin lämmittämällä 10 mi- nuuttia 90 °C:ssa.

' Tuotteen koostumus määritettiin korkean suoritusky- ;·.· 35 vyn nestekromatografiällä (taulukko 1) .

» · 12 110518

Taulukko 1

Levaanisakkaraasientsyymin pitoisuuden (LSU/g sakkaroosia) vaikutus reaktiotuotteiden koostumukseen ^ Entsyymipä·^. , , , , . a m. Reaktiotuotteiden koostumus, % tOlSUUS ' LSU/g sakka- (h) ---- roosia

Fruktoosi Glukoosi Sakkaroo- Levääni si 10 1 LSU/g 2 2,48 4,93 86,82 5,77 4 4,13 9,63 76,24 10,00 6 5,50 41,06 66,74 13,70 8 6,94 18,41 58,54 16,56 12 7,49 23,60 47,30 21,61 16 8,60 28,95 37,90 24,55 24 9,79 36,35 23,14 30,71 36 10,90 41,57 13,40 34,14 44 11,24 42,91 10,55 35,29 : ;· 20 2 LSlJ/g 2 3,99 10,10 76,55 9,36 4 6,41 18,59 58,28 16,72 6 7,87 26,09 43,09 22,95 7· 8 9,03 32,33 31,59 27,08 25 12 10,22 39,27 17,74 32,77 :Y 16 10,93 42,93 11,11 35,02 24 11,76 45,25 6,90 36,08 -i_______ 5 LSU/g 2 7,19 23,94 48,02 20,35 30 4 9,76 38,61 19,23 32,39 6 10,98 44,28 8,71 36,02 ·: . 8 11,41 45,65 6,48 36,46 7! 12 12,34 45.32 6,43 35,91 :·' 16 13,01 45,46 6,06 35,47 ;v! 35 L------- : (h) on aika tunteina I » 13 110518

Nopeus, jolla levaanisakkaraasientsyymi muodosti glukoosia sakkaroosista, kasvoi entsyymin konsentraation kasvaessa. Kaikissa tapauksissa syntyi 35 % levaania. 45 % glukoosia tuotettiin kaikissa tapauksissa.

5 Esimerkki 3

Entsyymin lämpöstabiilisuus substraatin läsnäollessa on erittäin tärkeä entsyymin laaja-alaisia kaupallisia sovellutuksia ajatellen. Lämpötilan vaikutus reaktiotuotteiden koostumukseen määritettiin 40 °C:n, 50 °C:n ja 10 60 °C:n lämpötiloissa. Reaktioseos koostui 7,5 ml:sta 60-paino/paino-%:ista sakkaroosiliuosta 0,01 M sitraatti-puskurissa, pH 5,5, ja 2,5 ml:sta entsyymiliuosta, joka sisälsi 40 LSU:a. Näytteitä otettiin eri ajankohtina, ja reaktio pysäytettiin lämmittämällä 90 °C:ssa 10 minuuttia.

15 Tuotteiden koostumus määritettiin korkean suoritus kyvyn nestekromatografiällä (taulukko 2).

Taulukko 2 Lämpötilan vaikutus reaktiotuotteiden koostumukseen . 20 Reaktiotuotteiden koöstumus, % • » · » » • * • · ·

Reaktio- Aika Fruktoosi Glukoosi Sakkaroo- Levääni ( lämpötila (h) - si : 7 25 50 "c * 7,50 23,31 47,33 21,86 7 8 9,15 35,54 24,16 31,15 14 11,28 47,30 7,27 34,15 24 11,09 43,32 10,58 35,01 .·. * 30 55 *c 4 7,92 24,32 45,26 22,50 .7 8 10,63 35,58 23,39 30,41 **: . 14 13,80 46,07 9,07 30,93 24 14,43 46,77 6,20 32,61 :v* 35 60 "C 4 8,65 23,66 46,35 21,34 !·Λ 8 11,51 32,14 29,98 26,36 14 15,11 42,87 18,09 23,93 24 14,55 40,36 14,74 30,36 14 110518

Taulukon 2 tulokset osoittavat sen, että esillä olevan keksinnön mukainen entsyymi on hyvin lämpöstabiili substraatin läsnäollessa 50 - 65 °C:ssa pH 5,5:ssä.

Esimerkki 4 5 Korkeaa substraattipitoisuutta pidetään aina edul lisena minkä tahansa transformaation kaupalliselle onnistumiselle reaktiotuotteiden haihduttamiseen tarvittavan energian korkean hinnan vuoksi.

Sakkaroosipitoisuuden vaikutusta reaktiotuotteisiin 10 tutkittiin eri aikaväleillä sakkaroosin ja entsyymin inku-boinnin aikana 55 °C:ssa pH:ssa 5,5.

Valmistettiin asetaattipuskuri (0,1 M), pH 5,5, joka sisälsi eri määriä sakkaroosia. Sopivat määrät entsyymiä lisättiin lopulliseen pitoisuuteen 10 LSU/g sakkaroosia, ja 15 inkuboitiin 55 °C:ssa.

Näytteitä otettiin eri aikoina, ja entsyymireaktio pysäytettiin lämmittämällä 90 °C:ssa 10 minuuttia.

Sen jälkeen reaktiotuotteiden koostumus määritettiin HPLCrllä (taulukko 3).

20 «· · • · · • · « · • > » t > » • . t » ; * » > * « t » * | * · · » I · I 1 · « ·

* I

i i „ 110518 lb

Taulukko 3

Sakkaroosipitoisuuden vaikutus reaktiotuotteiden koo s tumuk seen 2 Koostumus-% Suhde: ------- -- —...... Levaani/vapac

Sakkaroosi- _ ,.

.fruktoosi konsentraatin g/100 ml Aika, Fruktoo- G.lukoo- Sakka- Levaa- (h) ‘si si roosi ni 30 5 9,75 25,69 43,88 21,57 2,21 8 12,47 32,78 30,09 24,67 1,98 12 16,14 43,04 17,75 23,08 1,43 24 17,67 45,35 6,66 30,33 1,73 15 45 5 8,99 29,44 36,84 24,72 2,75 8 10,71 36,40 22,75 30,13 2,81 12 13,66 44,31 11,03 31,00 2,27 24 13,56 42,75 10,20 33,46 2,46 . .· 20 60 5 6,93 29,47 34,12 29,49 4,26 8 8,46 39,93 20,55 34,05 4,02 12 11,12 44,98 8,78 34,12 3,16 * 24 14,03 44,98 5,37 35,62 2,54 k » ί 25 75 5 6,25 29,15 33,34 31,27 5,00 V 8 7,57 37,30 19,00 36,12 4,77 12 9/45 44,26 8,93 37,34 3;95 24 10,76 43,31 4,96 41,12 3,82 30 Taulukossa 3 esitetyt tulokset osoittavat, että transf ruktosylaatio lisääntyi sakkaroosipitoisuuden kasva-* essa. Kaikilla aikaväleillä muodostuneen levaanin määrän i t * suhde vapaan fruktoosin määrään oli korkeampi korkeilla kuin matalilla substraattipitoisuuksilla. Esimerkiksi le- » · ;·,· 35 vaanin määrän suhde vapaaseen fruktoosiin on 1,4 - 2,2 i » t 16 110518 30 %:n sakkaroosipitoisuudessa, kun taas suhde on 4,5 - 5,0 75 %:n sakkaroosipitoisuudessa. Tämä viittaa siihen, että matala veden aktiivisuus suosii levaanin tuotantoa.

Claims (18)

1. Happostabiili levaanisakkaraasientsyymi, joka on peräisin Bacillus-lajiin kuuluvasta mikro-organismista, 5 tunnettu siitä, että se saavuttaa noin 55 °C:n lämpötilassa ja pH:ssa 4,0 entsyymiaktiivisuuden, joka on ainakin 50 % maksimaalisesta 55 °C:ssa pH:ssa 5,5 - 6,3 mitatusta aktiivisuudesta ja siitä, että entsyymi on saatavissa Bacillus licheniformis NRRL B-18962 kannan avulla.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen happostabiili le vaanisakkaraasientsyymi, tunnettu siitä, että se lisäksi saavuttaa noin pHrssa 5,5 - 6,3 maksimi- entsyymiaktiivisuuden noin 55 °C:ssa.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen levaani- 15 sakkaraasientsyymi, tunnettu siitä, että se lisäksi saavuttaa noin 55 °C:ssa ja pH:ssa noin 4,0 - 8,4 entsyymiaktiivisuuden, joka on ainakin 50 % maksi- miaktiivisuudesta mitattuna 55 °C:ssa.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen levaanisak- 20 karaasientsyymi, tunnettu siitä, että se lisäksi saavuttaa noin 55 °C:ssa ja pH:ssa 4,5 - 7,8 entsyymiaktii-') , visuuden, joka on ainakin 80 % 55 °C:ssa mitatusta maksi- ; '· miaktiivisuudesta.

5. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen levaani- ; 25 sakkaraasientsyymi, tunnettu siitä, että se lisäk- : ·' . si saavuttaa noin pH:ssa 5,5 ja noin 35 - 75 °C:n lämpötilassa entsyymiaktiivisuuden, joka on ainakin 50 % pH 5,5:ssä mitatusta maksimiaktiivisuudesta.

6. Menetelmä patenttivaatimuksen 1 mukaisen happo- ,·.; 30 stabiilin levaanisakkaraasientsyymin tuottamiseksi, tunnettu siitä, että siinä on vaiheet: ‘I . (i) viljellään Bacillus-sukuun kuuluvaa mikro- organismia sopivassa ravintoalustassa muodostamalla fermen-·;··.’ taatioliemi, joka sisältää biomassaa, ja 110518 (ii) otetaan talteen levaanisakkaraasientsyymi kyseisestä fermentaatioliemestä, jossa mikro-organismia kasvatetaan ilman sakkaroosia.

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, 5 tunnettu siitä, että mikro-organismi kuuluu Bacillus licheniformis -lajiin.

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mikro-organismi on Bacillus licheniformis NRRL B-18962.

9. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vaiheessa (ii) on lisäksi vaiheet, joissa (a) erotetaan kasvatussuodoksesta biomassa, joka sisältää mikro-organismin soluja ja siinä olevaa levaa- 15 nisakkaraasientsyymiä, ja (b) pestään siitä erotettu biomassa.

10. Bacillus licheniformis APMC 84, talletettu numerolla NRRL B-18962.

11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen Bacillus 20 licheniformis, tunnettu siitä, että se tuottaa happostabiilia levaanisakkaraasientsyymiä ravintoalustassa, ·;· _ joka ei sisällä sakkaroosia.

’·'· 12. Koostumus käytettäväksi kemianteollisuudessa, tunnettu siitä, että se sisältää patenttivaa-• 25 timuksen 1 mukaista happostabiilia levaanisakkaraasi- : : entsyymiä.

13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen koostumus, tunnettu siitä, että se on liuosmuodossa.

14. Patenttivaatimuksen 12 mukainen koostumus, ; 30 tunnettu siitä, että se on kiinteässä muodossa. I.,

15. Patenttivaatimuksen 12 mukainen koostumus, ’·; t tunnettu siitä, että levaanisakkaraasientsyymi tai : ’ kokonaiset BacilTus-solut, jotka on talletettu numerolla NRRL B-18962 ja jotka sisältävät levaanisakka-35 raasientsyymin, ovat immobilisoituina. 110518

16. Patenttivaatimuksen 12 mukainen koostumus le-vaanien tuottamiseen.

17. Jonkin patenttivaatimuksista 1-5 mukaisen entsyymin käyttö levaanien tuottamiseksi.

17 110518

18. Jonkin patenttivaatimuksista 1-5 mukaisen entsyymin käyttö kemian- tai elintarviketeollisuudessa. 1 · · 2o 110518