FI89077C - Foerfarande foer erhaollande av termostabila -amylaser genom odling av superproduktiva mikroorganismer vid hoeg temperatur - Google Patents
Foerfarande foer erhaollande av termostabila -amylaser genom odling av superproduktiva mikroorganismer vid hoeg temperatur Download PDFInfo
- Publication number
- FI89077C FI89077C FI875567A FI875567A FI89077C FI 89077 C FI89077 C FI 89077C FI 875567 A FI875567 A FI 875567A FI 875567 A FI875567 A FI 875567A FI 89077 C FI89077 C FI 89077C
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- ncib
- thermostable
- microorganism
- ammonium chloride
- strain
- Prior art date
Links
- 244000005700 microbiome Species 0.000 title claims description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 18
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 15
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 9
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 claims description 7
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 claims description 7
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 7
- 241000194110 Bacillus sp. (in: Bacteria) Species 0.000 claims description 6
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 claims description 6
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 claims description 5
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 claims description 5
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 claims description 4
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 claims description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 3
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 claims description 2
- 229940025131 amylases Drugs 0.000 claims description 2
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 claims description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 claims 1
- 238000005266 casting Methods 0.000 claims 1
- 102000004139 alpha-Amylases Human genes 0.000 description 23
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 description 23
- 229940024171 alpha-amylase Drugs 0.000 description 16
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 14
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 14
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 14
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 11
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 8
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 8
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 8
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 8
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 7
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 7
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 description 6
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 206010001497 Agitation Diseases 0.000 description 5
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 5
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 4
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 4
- -1 ammonium ions Chemical class 0.000 description 3
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 description 3
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 3
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 231100000707 mutagenic chemical Toxicity 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002774 Maltodextrin Polymers 0.000 description 2
- VZUNGTLZRAYYDE-UHFFFAOYSA-N N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine Chemical compound O=NN(C)C(=N)N[N+]([O-])=O VZUNGTLZRAYYDE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 2
- 238000012261 overproduction Methods 0.000 description 2
- LJCNRYVRMXRIQR-OLXYHTOASA-L potassium sodium L-tartrate Chemical compound [Na+].[K+].[O-]C(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C([O-])=O LJCNRYVRMXRIQR-OLXYHTOASA-L 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 235000011006 sodium potassium tartrate Nutrition 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- LWFUFLREGJMOIZ-UHFFFAOYSA-N 3,5-dinitrosalicylic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC([N+]([O-])=O)=CC([N+]([O-])=O)=C1O LWFUFLREGJMOIZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229920002245 Dextrose equivalent Polymers 0.000 description 1
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 1
- 239000005913 Maltodextrin Substances 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 235000019764 Soybean Meal Nutrition 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 239000000908 ammonium hydroxide Substances 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000721 bacterilogical effect Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 238000002386 leaching Methods 0.000 description 1
- DHRRIBDTHFBPNG-UHFFFAOYSA-L magnesium dichloride hexahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.[Mg+2].[Cl-].[Cl-] DHRRIBDTHFBPNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940035034 maltodextrin Drugs 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000007320 rich medium Substances 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000001476 sodium potassium tartrate Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000004455 soybean meal Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2405—Glucanases
- C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
- C12N9/2411—Amylases
- C12N9/2414—Alpha-amylase (3.2.1.1.)
- C12N9/2417—Alpha-amylase (3.2.1.1.) from microbiological source
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
1 89077
Menetelmä termostabiilien a-amylaasien saamiseksi viljelmällä superproduktiivisia mikro-organismeja korkeissa lämpötiloissa 5 Tämän keksinnön päämäärä on teollinen prosessi a- amylaasientsyymin saamiseksi käyttäen termofiilisiä mikro-organismeja, jotka huipputuottavat entsyymiä 50°C - 70°C välillä olevissa lämpötiloissa, varsinkin kun viljelyalusta sisältää maissin liotusnestettä ja aramoniumkloridia.
10 Amylaasien käyttö tärkkelyksen hajottamisprosesseis- sa on klassinen menetelmä, jota on käytetty lukuisiin tarkoituksiin, kuten oligosakkaridin, maltoosin ja glukoosi-rikkaiden siirappien tuottamiseen. Erityisesti a-amylaasit ovat yleisesti tunnettuja kaupallisesti hyödynnettäviä ent-15 syymejä, joita käytetään muuttamaan tärkkelystä vesiliukoisiksi sokereiksi, erityisesti näiden sokereiden muuttamiseen glukoosiksi.
Tärkkelyksen hydrolyysin teollinen prosessi vaatii granuloiden täydellisen gelatinisaation saavuttamiseksi 20 voimakkaiden olosuhteiden käyttämistä lämpötilojen vaihdellessa 105°C - 115°C välillä. Kyseiset käyttöolosuhteet ovat johtaneet erilaisten, termostabiileja a-amylaaseja tuottavien Bacillus-lajien valikoimiseen. NOVOn GB-paten-tissa nro 1 296 839 tai ES-patentissa nro 526 406, US-pa-25 tenttinro 4 642 288 ja CEPSAn EP-patenttihakemuksessa nro 843 066 636 on kuvattu erilaisia prosesseja termostabiilien a-amylaasien tuottamiseksi eri Bacillus-lajien viljelmistä. Näiden mikro-organismien tuottamat entsyymit ovat erityisen miellyttäviä käytettäessä tärkkelyksen liuotusprosesseissa. 30 Ne ovat paljon stabiilimpia kuin aikaisemmat, eri Bacillus-muunnoksista saadut α-amylaasit. Noiden kantojen tuottotaso on kuitenkin matala ja siksi on välttämätöntä saada aikaan huipputuottavien mutanttien selektio kuten myös laatia sopiva kasvatusalusta.
35 Tässä on havaittu, että ES-patentissa nro 526 406, US-patentissa nro 4 642 288 ja CEPSAn EP-patenttihakemuk- 2 89077 sessa nro 843 068 636 kuvattu Bacillus sp. kanta NCIB 11 886 kykenee mutatoitumaan eri mutageenisilla agensseil-la, jotka sallivat parentaalikannan termostabiilin a-amy-laasin kaupallisen tuotannon. Sitä paitsi näitä kantoja 5 voidaan viljellä maissin liotusneste- ja ammoniumkloridi-rikkaissa teollisuusviljelyalustoissa.
ES-patentissa nro 526 406/ US-patentissa nro 4 642 288 ja CEPSAn EP-patenttihakemuksessa nro 843 068 636 kuvattujen Bacillus sp. kantojen NCIB 11 886 ja 11 887 10 termostabiilien a-amylaasien kaupallinen tuotanto vaatii ensin huipputuottavien mutanttien kuin myös viljelyalustan ja sopivien puhdistus- ja talteenotto-olosuhteiden aikaansaamisen.
Huipputuottavien mutanttien aikaansaamiseksi Bacillus 15 sp. kannat NCIB 11 886 ja 11 887 on alistettu erilaisille mutageenisille käsittelyille tehokkaimmissa löydetyissä olosuhteissa. Useimmin käytetyt mutageeniset agenssit ovat olleet N-metyyli-N'-nitro-N-nitroso-guanidiini (NG) ja ultraviolettivalo (UV). Kaikki käsittelyt on tehty ekspo-20 nentiaalisilla viljelmillä. Eksponentiaalisten viljelmien käytön sopivuus mutageenikäsittelyssä juontaa alkunsa havaitusta, monien mutageenisten agenssien, varsinkin NG:n, korkeammasta tehokkuudesta eksponentiaalivaiheessa oleviin bakteeriviljelmiin. Käsittelystä eloonjääneiden solujen 25 eristys tehdään kiinteässä viljelyalustassa Petri-maljoissa. Tärkkelysrikkaalla alustalla huipputuottavat mutantit voidaan havaita suoraan, koska ne tekevät amylolyysikehät pesäkkeiden ympärille. Näiden kehien koko osoittaa pesäkkeen a-amylaasisynteesikyvyn.
30 Sopivan selektioalustan valinta on välttämätöntä mutageneesiohjelman kehittämiselle. Menetelmän täytyy olla spesifinen, yksinkertainen ja tehokas. Lukuisat viljely-alustat sallivat a-amylaasiaktiviteetin havaitsemisen edellyttäen, että ne sisältävät tärkkelystä. Mutta havaitak-35 semme suuren määrän pesäkkeitä/malja ja erottaaksemme entsyymin tuottokyvyn eroja, olemme kehittäneet spesifisen 3 89077 viljelyalustan. Tämä alusta sisältää glukoosia erillään tärkkelyksestä, minkä vuoksi amylolyysikehien koko pienenee havaittavasti vaikuttamatta pesäkkeen kasvuun.
Bacillus sp. kannan NCIB 11 886 mutageenikäsittely 5 johti yllä mainituissa olosuhteissa 4 700 pesäkkeen eristykseen. Niiden joukosta eristettiin Bacillus sp. kanta NCIB 12 563, koska sillä oli merkittävästi suurempi amylo-lyysikehä kuin muilla. Kyseinen kanta on tallennettu kokoelmaan National Collection of Industrial Bacteria, Torrey 10 Research Station, 135 Abbey Road, Aberdeen AB9 8DE, Scotland.
Kannan NCIB 12563 a-amylaasin huipputuotto-ominai-suus on vahvistettu monessa nesteviljelyalustassa sekä er-lenmeyerissä että fermentorissa. Yleisesti kannan NCIB 15 12 563 tuottokyky on 2 - 4 kertaa korkeampi kuin lähtö- kannan. Kaikissa tapauksissa a-amylaasientsyymin aktiviteetti määritettiin seuraten protokollaa, joka on kuvattu ES-patentissa nro 526 406, US-patentti nro 4 642 288 ja CEPSAn EP-patenttihakemuksessa nro 843 068 636: 20 4 % (w/v) tärkkelysliuosta 0,02M fosfaattipuskuris sa, pH 5,7, jossa oli NaCl konsentraationa 0,006M, lämmitetään noin 50°C:een. Samalla tavoin viljelylihaliemi, jonka aktiviteetti on tarkoitus määrittää (asianmukaisesti laimennettu samaan lihaliemeen kuin tärkkelys), lämmitetään 25 samaan lämpötilaan. Myöhemmin 0,5 ml tutkittavaa entsyy- misuspensiota ja 0,5 ml tärkkelyssuspensiota, molemmat etu-käteen lämmitettyjä, kaadetaan koeputkeen. Seosta inkuboi-daan 5 minuuttia 50°C:ssa magneettisekoittajalla. Reaktio lopetetaan nopealla lämpötilan alentamisella ja lisäämällä 30 0,1 ml Bernfeldin reagenssia. Kyseinen reagenssi valmistet tiin seuraavasti: 16 g NaOH/200 ml HjO liuos (läpi tämän patentin kaikissa tapauksissa käytettiin tislattua vettä) kaadetaan 300 ml:aan lähes kiehuvaa vettä, sitten lisätään 10 g 3,5-dinitrosalisyylihappoa ja 300 g Rochellen suolaa 35 (natriumkaliumtartraattia) ja seosta lämmitetään, kunnes 4 89077 reagenssit ovat täydellisesti liuenneet ja lopuksi täytetään tilavuus litraksi. Tutkittavat näytteet laitetaan sitten voimakkaasti kiehuvaan vesihauteeseen 5 minuutiksi.
Tämän ajan jälkeen näytteet jäähdytetään ja lisätään 10 ml 5 vettä. Lopuksi jokaisen näytteen adsorptio määritetään vedellä ja Bernfeldin reagenssilla tehtyä standardia vastaan 540 nm:llä.
CEPSA α-amylaasiyksikkö määritetään pelkistyneiden sokereiden, mitattuna maltoosina, mg määränä, joka saadaan 10 minuutissa yllä spesifioiduissa koeolosuhteissa. Näinollen, CEPSA amylaasiyksiköt/nl lihalientä = maltoosisaanto mg/mlxDxd t 15 jossa, D = viljelylihaliemen laimennos d = reaktioalustan oma laimennos t = reaktioaika (minuutteja).
Näin ollen jokaisen näytteen 540 nm adsorbanssiyk-siköt pitää muuttaa mg:ksi pelkistyneitä sokereita maltoo-20 sinä mitattuna. Tätä tavoitetta varten valmistetaan muutamia maltoosistandardeja, joiden konsentraatiot vaihtelevat välillä 0,5 - 5,0 mg/ml/ml ja niiden todellinen pelkistyneiden sokereiden pitoisuus määritetään Bernfeldin reagenssilla. Näin saadaan standardisuora, joka suhteuttaa adsorb-25 tion 540 nm:ssä pelkistyneiden sokereiden pitoisuuteen mal-toosin suhteen mitattuna. Jokaisen näytteen todellinen pelkistyneiden sokereiden pitoisuus määritetään kyseiseltä suoralta interpoloimalla, kun tärkkelyksessä tai viljely-lihaliemessä läsnäolevien sokereiden A540 on vähennetty mit-30 tauksesta jokaisessa tapauksessa. Tämä tarkoittaa, että: ^A540^todellinen -^A540^mitattu~ ^A540^tärkkelys" ^A540^lihaliemi
Kanta NCIB 12 563 säilyttää ES-patentissa nro 526 406, US-patentissa nro 4 642 288 ja CEPSAn EP-patenttihakemuksessa numero 843 068 636 kuvatun parentaalikannan termofiiliset 5 89077 ominaisuudet, mikä mahdollistaa sen viljelyn 50°C - 70°C välillä olevissa ja mieluummin 56°C - 62°C välillä olevissa lämpötiloissa. Viljelyaika voi näin olla huomattavan lyhyt, 16 - 30 tunnin välillä, joka antaa näille mutanteille ja 5 niiden johdannaisille korkean kaupallisen hyödyn.
Käytetty viljelyalusta sisältää hiilenlähteen, typenlähteen ja suoloja. Eniten käytetyt hiilenlähteet ovat monimutkaisia polysakkarideja, kuten tärkkelys tai sen osittaisen hydrolyysin tuloksena syntyneitä tuotteita.
10 NCIB 12 563 kannan viljelyssä maltodekstriinit, joiden D.E. (dekstroosi ekvivalentti) vaihtelee välillä 5 - 20 % ja mieluummin välillä 10 - 15 %, ovat osoittautuneet erityisen käyttökelpoisiksi. Käytetyt määrät vaihtelevat välillä 1 - 4 % w/v ja mieluummin välillä 2 - 3 %. Typenlähteenä 15 on käytetty erilaisia orgaanisia ja epäorgaanisia ravinteita. Edelliseen kuuluu hiivauutteet, soijapapujauho ja maissin liotusneste. Jälkimmäiseen kuuluu erilaisia ammonium-suoloja.
Yksi tämän keksinnön huomattavia puolia on havainto 20 maissin liotusnesteen ja ammoniumionien yhtäaikaisen viljelyalastaan lisäämisen aiheuttamasta positiivisesta vaikutuksesta. Maissin liotusnestettä lisätään konsentraationa 2 - 12 % ja mieluummin 4 - 5 %. Ammoniumioneja puolestaan lisätään ammoniumkloridin muodossa konsentraatioina 1 - 25 10 g/1 ja mieluummin 2-4 g/1. Tämä ammoniumionien anto voidaan suorittaa muilla tavoilla. Näin ollen, jos maissin liotusnestettä halutaan esikäsitellä millä tahansa tavallisesti käytetyllä menetelmällä, on mahdollista käyttää ammo-niumhydroksidia alkalikäsittelyssä.
30 Kantaa NCIB 12 563 viljellään sopivassa alustassa aerobisissa olosuhteissa. Sekoituksella olevia erlenmeye-reitä tai tavallisesti fermentoreita käytetään tähän tarkoitukseen. Tässä tapauksessa tavallinen ilmastus on 1,4 tilavuutta ilmaa/tilavuus alustaa/minuutti.
35 Kannan NCIB 12 563 tuottama entsyymi otetaan talteen viljelylihaliemestä kiinteä-neste erotusvaiheella. Tämä erotus voidaan tehdä sekä suodatuksella että sentrifugaa- 6 89077 tiolla. Talteenotettu entsyymi konsentroidaan sitten joko samanaikaisella puhdistuksella tai ei. Jos tarkoitus on vain konsentroida entsyymi, sentrifugoitu tai suodatettu lihaliemi haihdutetaan vakuumissa. Jos konsentroinnin li-5 saksi halutaan puhdistaa α-amylaasi, sentrifugoitu tai suodatettu lihaliemi voidaan fraktioida käyttäen orgaanisia liuottimia tai ultrasentrifugaatiota.
Seuraavat esimerkit kuvaavat keksintöä olematta rajoittavia. On selvää, että alan tuntevien tekemiä muutok-10 siä ja modifikaatioita voidaan saattaa käytäntöön.
Esimerkki 1
Kanta NCIB 11 886 on mutantoitu, jotta saadaan a-amylaasia huipputuottavia kantoja. Käytetyt viljelyalustat on esitetty taulukossa 1.
15 Taulukko 1. Viljelyalustat AM-8_AM-7 9_AM-138
Liukoinen tärkkelys 40,0 g/1 5,0 D.E. 15 % maltodekstriini 20,0 20 Glukoosi 35,0
Hiivauute 5,0
Proteaasi-peptoni 10,0
Maissin liotusneste 45,0
Trizma emäs 17,8 25 NH4C1 3,0 KC1 0,5 0,5
MgCl2.6H20 3,2 3,2
CaCl2 1,0 1,0
MnS04 0,5 0,5 30 Bakteriologinen agar 20,0 pH 7,5 7,2 6,8 10 ml etukäteen 56°C:een lämmitettyä AM-79 viljely-alustaa inokuloidaan 50 ml erlenmeyerissä kannan NCIB 11 886 pesäkkeellä ja sitä inkuboidaan yli yön 56°C:ssa orbitaali-35 sella sekoituksella 230 kierrosta minuutissa. Tuloksena syntynyt stationäärivaiheen viljelmä laimennetaan 100 kertai- 7 89077 sesti 10 ml:aan AM-79 alustaa samoissa olosuhteissa kuin on kuvattu yllä ja viljellään, kunnes ollaan eksponentiaalisen kasvuvaiheen puolivälissä, nimittäin 6 inkubaatio-tuntia. Kuvio 1 esittää kannan NCIB 11 886 kasvun AM-79 5 viljelyalustassa. Elävien solujen määrä/ml luetaan ordi- naatta-akselilta ja viljelyaika tunteina abskissa-akselilta.
5 ml eksponentiaalista viljelmää sentrifugoidaan ja solut resuspensoidaan 5 ml:aan 56°C:een esilämmitettyä AM-79 alustaa.
10 NG-käsittelyä varten 100 ,ug kyseistä mutageenista
O
agenssia lisätään solususpensioon ja sitä inkuboidaan 56 C:ssa 20 minuuttia. Kanta NCIB 12 563 eristettiin myöhemmin sen korkean amylolyysiaktiviteetin johdosta kasvattamalla AM-8 alustaa sisältävillä Petri-maljoilla.
15 Esimerkki 2
Mutantin NCIB 12 563 ylituotanto verrattuna paren-taalikantaan NCIB 11 886 on tarkistettu erlenmeyerissä kompleksisissa nesteviljelyalustoissa.
Tätä tarkoitusta varten 10 ml 56°C:een esilämmitet-20 tyä AM-79 viljelyalustaa inokuloidaan 50 ml:n erlenmeyerissä kannan NCIB 12 563 peräkkeellä ja sitä inkuboidaan 56°C:ssa orbitaalisella sekoituksella 230 kierrosta minuutissa. Otetaan pieniä nestemääriä inkubaation eri aikoina a-amylaasin tuoton määrittämiseksi. Taulukon 2 tulokset 25 osoittavat, että huipputuottava mutantti NCIB 12 563 tuottaa noin neljä kertaa enemmän α-amylaasia kuin parentaali-kanta NCIB 11 886.
Taulukko 2
Kantojen NCIB 11 886 ja 12 563a-amylaasituotto AM-79 30 nestealustassa erlenmeyerissä.
Viljelyaika(tunteja)
Kanta 24_48 NCIB 11 886 216U/ml 213U/ml NCIB 12 563 917U/ml 878U/ml 8 89077
Esimerkki 3
Mutantin NCIB 12 563 ylituotanto verrattuna paren-taalikantaan NCIB 11 886 on tarkistettu fermentoreissa kompleksisissa nestealustoissa.
5 Sen vuoksi 100 ml 56°C:een esilämmitettyä AM-79 viljelyalustaa inokuloidaan 500 ml:n erlenmeyerissä kannan NCIB 12 563 pesäkkeellä ja sitä inkuboidaan 56°C:ssa orbi-taalisella sekoituksella 230 kierrosta minuutissa yli yön. Tuloksena syntynyt stationääriviljelmä laimennetaan 25 ker-10 taisesti AM-79 viljelyalustaan 2 litran fermentorissa (käyttökelpoinen tilavuus 1 125 ml). Fermentoriviljelmää inkuboidaan 56°C:ssa ilmastuksella 1,3 v/v/minuutti, sekoituksella 1 750 kierrosta minuutissa ja pH pidetään 7,2 yläpuolella 10 % NaOH lisäyksellä. Otetaan pieniä nestemääriä inkubaa- 15 tion eri aikoina α-amylaasin tuoton määrittämiseksi. Kuvio
2 esittää kantojen NCIB 11 886 (käyrä A) ja NCIB (käyrä B) α-amylaasin tuoton, ordinaatta-akselilla on esitetty CEPSA α-amylaasiyksiköt/ml ja viljelyaika tunteina abskissa-akse-lilla. Kuten voidaan nähdä, huipputuottava mutantti NCIB
20 12 563 tuottaa kaksi kertaa enemmän α-amylaasia kuin paren- taalikanta saavuttaen maksimituoton samassa inkubaatioajässä, 36 tunnissa.
Esimerkki 4
Huipputuottavan kannan NCIB 12 563 α-amylaasin tuot-25 to tulee mahdolliseksi yksinkertaisessa teollisuusviljely-alustassa.
Sen vuoksi NCIB 12 563 pesäkettä kasvatetaan 500 ml:n pullossa 100 ml:ssa AM-79 alustaa, kuten on kuvattu esimerkissä 3. Toinen AM-79 pullo inokuloidaan sitten 5 %:n tila-30 vuudella edellistä viljelmää ja sitä inkuboidaan 8 tuntia identtisissä olosuhteissa. AM-138 alustaa sisältävä 2 litran fermentori inokuloidaan tällä viljelmällä. Tähän inoku-laatioon käytetään 10 % tilavuutta. Fermentoriviljelmää kasvatetaan seuraavissa olosuhteissa: pH 6,8 ja 58°C. Livenneen 35 hapen kehitys on vapaa, kun sekoitus on 1 250 kierrosta minuutissa ja ilmastus on 1,4 v/v/minuutti.
9 89077 4 tunnin viljelyn jälkeen siitä otetaan 4 % v/v nestemäärä 15 litran fermentorin inokulointia varten. Jälkimmäinen sisältää myös AM-138 alustaa ja sitä viljellään 58°C:ssa ja pH:ssa 6,8. Livenneen hapen kehitys on vapaa, kun 5 sekoitus on 650 kierrosta minuutissa ja ilmastus on 1,4 v/v/minuutti. 20 tunnin viljelyn jälkeen saadaan 1 100 u/ml.
Esimerkki 5 NCIB 12 563 kannan a-amylaasin konsentroiminen ja 10 puhdistus voidaan tehdä fraktioimalla orgaanisilla liuottimilla. Tätä tarkoitusta varten käytetään sellaista vil-jelyalusta, joka saatiin aikaan esimerkissä 4. Kyseinen alusta sentrifugoidaan levysentrifuugissa, kuten Westfa-lia Equipment Mod. SAOOH-205, virtauksella 301/tunti. Super-15 natantti presipitoidaan asetonilla 4°C:ssa ottaen talteen fraktiot välillä 44 - 60 v/v asetonia. Tuote sisältää 87 %:ia alkuperäisestä a-amylaasista.
Esimerkki 6
Kannan NCIB 12 563 termostabiilin α-amylaasin kon-20 sentrointi voidaan tehdä haihduttamalla vakuumissa korkeissa lämpötiloissa. Tätä tarkoitusta varten käytetään sellaista viljelyalustaa, joka saatiin aikaan esimerkissä 4, se sentrifugoidaan kuten on kuvattu esimerkissä 5 ja saatu supernatantti konsentroidaan haihduttamalla alennetussa pai-25 nessa.
Konsentrointi tehdään pitämällä haihdutuslämpötila 60°C:ssa. Supernatantti konsentroidaan 6 kertaisesti. Lopullinen saanto viljelyalusta on 95 %.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES8703510 | 1987-12-07 | ||
| ES8703510A ES2007758A6 (es) | 1987-12-07 | 1987-12-07 | Un procedimiento para la obtencion de alfa-amilasas termoestables, por cultivo de microorganismos superproductores a altas temperaturas. |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI875567A0 FI875567A0 (fi) | 1987-12-17 |
| FI875567L FI875567L (fi) | 1989-06-08 |
| FI89077B FI89077B (fi) | 1993-04-30 |
| FI89077C true FI89077C (fi) | 1993-08-10 |
Family
ID=8253610
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI875567A FI89077C (fi) | 1987-12-07 | 1987-12-17 | Foerfarande foer erhaollande av termostabila -amylaser genom odling av superproduktiva mikroorganismer vid hoeg temperatur |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0320685B1 (fi) |
| DE (1) | DE3884922T2 (fi) |
| DK (1) | DK680188A (fi) |
| ES (1) | ES2007758A6 (fi) |
| FI (1) | FI89077C (fi) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2326379T3 (es) * | 2005-12-29 | 2009-10-08 | Gnosis S.P.A. | Procedimiento para la preparacion de vitamina k2. |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4473645A (en) * | 1983-03-30 | 1984-09-25 | Nabisco Brands, Inc. | Process for producing thermally stable alpha-amylase |
| ES526406A0 (es) * | 1983-10-11 | 1985-11-01 | Espanola Petrol | Procedimiento para producir -amilasas termoestables por cultivo de microorganismos a altas temperaturas |
-
1987
- 1987-12-07 ES ES8703510A patent/ES2007758A6/es not_active Expired
- 1987-12-17 FI FI875567A patent/FI89077C/fi not_active IP Right Cessation
-
1988
- 1988-11-28 DE DE88119794T patent/DE3884922T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1988-11-28 EP EP88119794A patent/EP0320685B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-12-06 DK DK680188A patent/DK680188A/da not_active Application Discontinuation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2007758A6 (es) | 1989-07-01 |
| FI875567A0 (fi) | 1987-12-17 |
| FI875567L (fi) | 1989-06-08 |
| EP0320685B1 (en) | 1993-10-13 |
| DE3884922D1 (de) | 1993-11-18 |
| DK680188A (da) | 1989-06-08 |
| DK680188D0 (da) | 1988-12-06 |
| FI89077B (fi) | 1993-04-30 |
| DE3884922T2 (de) | 1994-02-10 |
| EP0320685A1 (en) | 1989-06-21 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| WO2016119293A1 (zh) | 一种微生物发酵生产氨基葡萄糖的菌株及方法 | |
| CN118360203A (zh) | 一株高产蛋白酶的耐盐型高地芽孢杆菌及其应用 | |
| CN114644984A (zh) | 一种从土壤中分离产淀粉酶的微生物的方法 | |
| CN106754486B (zh) | 一株高产海藻糖合酶的假单胞菌及其发酵产酶方法 | |
| CN102757914B (zh) | 一株解木聚糖类芽孢杆菌及用其制备木葡聚糖酶的方法 | |
| CN101544958B (zh) | 一种高产甲壳素脱乙酰酶的解淀粉芽孢杆菌csuft F14及其应用 | |
| CN107118980B (zh) | 来自海洋的解角质素微杆菌mcda02及其产酶方法与产品 | |
| FI89077B (fi) | Foerfarande foer erhaollande av termostabila -amylaser genom odling av superproduktiva mikroorganismer vid hoeg temperatur | |
| CN103305481B (zh) | 一种发酵齿毛菌生产漆酶的方法 | |
| CN100575478C (zh) | 一种新的弧菌科弧菌属菌株及其应用 | |
| FI110518B (fi) | Levaanisakkaraasientsyymi, menetelmä sen tuottamiseksi, sitä tuottavia mikro-organismeja ja sitä sisältävä koostumus | |
| JP3026312B2 (ja) | キチン分解物の製造法 | |
| CN116024126B (zh) | 一株产环糊精葡萄糖基转移酶的产酸克雷伯氏菌 | |
| CN106929456B (zh) | 一种天目不动杆菌mcda01及其制备几丁质脱乙酰酶的方法 | |
| JP2707093B2 (ja) | 新規微生物 | |
| UA75352C2 (en) | STRAIN OF BACTERIUM BACILLUS CIRCULANS B-65 û PRODUCER OF CYCLOMALTODEXTRINGLUKANOTRANSFERASE, METHOD FOR ISOLATION THEREOF AND USE FOR THE PREPARATION OF ?-CYCLODEXTRIN | |
| JP2785323B2 (ja) | β―グルコシダーゼ及びその製造法 | |
| CN113151060B (zh) | 一种延长赖氨酸芽孢杆菌zcgt05及其应用 | |
| US4591561A (en) | Process for the preparation of maltopentaose | |
| JP3642344B2 (ja) | クレアチンアミジノハイドロラーゼの製造法 | |
| JPH04211369A (ja) | 好塩性アルカリアミラーゼおよびその製造方法 | |
| JPH02265478A (ja) | 新規なザルコシンオキシダーゼおよびその製法 | |
| JP2008167718A (ja) | 新規ウリカーゼの製造方法 | |
| CN109294949B (zh) | 结冷胶裂解酶产生菌及其用途 | |
| JP2530998B2 (ja) | サ―マス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）属に属する新菌株 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| BB | Publication of examined application | ||
| MM | Patent lapsed | ||
| MM | Patent lapsed |
Owner name: COMPANIA ESPANOLA DE PETROLEOS, S.A. |