ES2326379T3 - Procedimiento para la preparacion de vitamina k2. - Google Patents

Abstract

Procedimiento para la preparación de vitamina K2 (MK - 7) que comprende el cultivo de la cepa mutante de Bacillus subtilis GN13/72 - DSM 17766 depositada el 5 de diciembre de 2005 en la DSMZ.

Description

Procedimiento para la preparación de vitamina K2.

La presente invención se refiere a la producción fermentativa de vitamina K2 (menaquinona - 7: MK - 7), usando un microorganismo de Bacillus.

La invención se refiere a un mutante del microorganismo Bacillus subtilis depositado en virtud del Tratado de Budapest, que puede producir MK - 7 en grandes cantidades, en condiciones de cultivo específicas.

Técnica anterior

La vitamina K es un cofactor esencial para la formación de residuos de ácido \gamma-carboxiglutámico (Gla) en proteínas (Olson, R.E., 1984^{1} - Suttie, J.W., 1985^{2}). Las proteínas que contienen Gla se unen a los iones de calcio e influyen, por ejemplo, en la coagulación sanguínea y la calcificación tisular (por ejemplo, osteocalcina encontrada en tejidos óseos) (Hauschka P.V. et al. 1978^{3}- Price, P.A. et al., 1976^{4}). Se ha involucrado la deficiencia de vitamina K en diversas dolencias clínicas tales como la hemorragia intracraneal en bebés recién nacidos (Ferland, G. et al., 1993^{5} - Shearer, M.J., 1995^{6}) y la posible fractura ósea resultante de osteoporosis (Knapen, M.H. et al., 1989^{7}).

La vitamina K se produce de manera natural en dos formas, concretamente, K1 (filoquinona) en plantas verdes y K2 (menaquinonas -MK) en animales y algunas bacterias (Collins, M.D. et al., 1981^{8} - Conly, J.M. et al. 1992^{9} - Ramotar, K. et al., 1984^{10}- Taber, H. 1980^{11} - Watanuki, M. et al. 1972^{12}), incluyendo las bacterias intestinales. La MK tiene una longitud de cadena lateral variable de 4 - 13 unidades de isopreno. Se denominan MK - \eta, donde \eta indica el número de residuos de isoprenoide. Las MK son constituyentes de la membrana plasmática bacteriana y actúan como reactivos redox en los sistemas de fosforilación

\hbox{oxidativa y transporte de electrones (Taber, H. 1980 -
Ramotar, K.  et al . 1984).}

Las bacterias del ácido láctico se han usado como cultivos de partida para fabricar diversos alimentos y pueden considerarse generalmente como seguras (GRAS), y un estudio cualitativo ha mostrado que algunas bacterias del ácido láctico producen MK. En muchos países, la necesidad diaria de vitamina K es de aproximadamente 1 \mug/kg de peso corporal.

Rowland, B.M. y Taber, H.W. (1996)^{13}- Rowland, B. et al. (1995)^{14} - Taber H.W. et al. (1981)^{15} han estudiado exhaustivamente los mecanismos de formación de MK en Bacillus subtilis. Sin embargo, no se han notificado estudios para aumentar la producción de MK mediante B. subtilis. Tani, Y. y Sakurai, N. (1987)^{16} - Tani, Y. y Taniguchi, H. (1989)^{17} notificaron la producción eficaz de MK - 4, MK - 5 y MK - 6 mediante Flavobacterium y que la concentración máxima de MK producida alcanzó 192 mg/l (Tani, Y. et al. - 1989). Por otro lado, la producción industrial de MK con cadenas laterales de isopreno más largas no se notificó hasta hace poco tiempo por Morishita, T. et al. (1999)^{18}. En su estudio, se producían 29 - 123 \mug/l de MK - 7 mediante bacterias del ácido láctico. La soja fermentada "natto", cuya producción requiere B. subtilis, es popular en Japón y contiene una cantidad excepcionalmente grande de MK (600 - 900 \mug/100 g) (Sakano, T. et al. 1988)^{19}. Dado que las cepas de B. subtilis usadas para fabricar natto son comestibles, están entre las fuentes más ventajosas de MK en la industria alimentaria.

Yoshinori Tsukamoto et al. (2001) han recuperado un mutante resistente análogo de B. subtilis "natto" que tiene una productividad de 1719 \mug/100 g de peso seco. Según varias patentes o solicitudes de patente existentes, algunas de las cuales se enumeran en lo sucesivo, se produce K2 (MK - 7) en cantidades de 1,0 \mug/g de peso seco o inferiores (documentos US 2004/043015; US 2005/0025759; US 2002/0146786; US 2001/0046697).

Se ha encontrado ahora, y éste es el objeto de la presente invención, una cepa mutada de Bacillus subtilis que tiene una productividad que oscila desde 1.000 hasta 25.000 ppm de materia seca, con un ciclo de producción (desde la presiembra hasta la fermentación) de 160 - 200 horas, más precisamente de 170 - 185 horas. El mutante de Bacillus subtilis GN13/72 se obtuvo mediante tratamientos con NTG o, alternativamente, UV y se recuperó en un medio sólido de harina de soja micronizada.

La cepa se depositó según los términos del Tratado de Budapest en la Deutsche Sammlung von Mikrorganismen und Zellkulturen (DSMZ) (Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares) el 5 de diciembre de 2005 con el número de registro DSM 17766.

La biomasa con alto contenido en MK - 7 se prepara según técnicas de fermentación conocidas por medio de medios de cultivo que contienen fuentes de carbono (tal como glucosa, sacarosa, glicerol, hidrolizado de almidón y similares); fuentes de nitrógeno (tal como extracto de levadura o autolisado, peptonas de origen diverso, harina de soja y similares); diversas sales (tal como fosfato de potasio, cloruro de sodio, sulfato de magnesio, sulfato de manganeso, sulfato de zinc y similares).

El pH oscila desde 6,0 hasta 8,5, más precisamente desde 6,5 hasta 7,8; el flujo de aire oscila desde 0,1 hasta 2,0 vvm, más precisamente desde 0,25 hasta 1,0 vvm; la tasa de agitación en el fermentador varía desde 100 hasta 250 rpm; la presión oscila entre 0,1 y 1,2 bares, más precisamente entre 0,25 y 1,0 bares. La fermentación se lleva a cabo en un modo discontinuo o semicontinuo; se usan fermentadores de RCTA (=reactor continuo tipo tanque agitado) o RTA (= reactor de tanque agitado) convencionales.

La biomasa se recoge mediante centrifugación o microfiltración, se lava dos veces con agua purificada y se resuspende en agua purificada. Las cremas resultantes se secan mediante liofilización o secado por pulverización, entonces se envasan al vacío.

La invención se ilustra en detalle mediante los siguientes ejemplos.

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Ejemplo 1

Se hace crecer Bacillus subtilis GN13/27 - DSM 17766 en condiciones aerobias en un fermentador (geométrico) de 30 l que contiene 20 l de medio de fermentación "F10" que tiene la siguiente composición:

\bullet

Harina de soja micronizada 15,00 g/l

\bullet

Extracto de levadura 1,00 g/l

\bullet

Glicerol 10,00 g/l

\bullet

K_{2}HPO_{4} 0,05 g/l

\bullet

NaCl 5,00 g/l

\bullet

pH 7,3 (\pm 0,1)

\bullet

esterilización a 121ºC x 30 minutos.

Se inocula el fermentador con un 8% (1600 ml) de siembra de 16 h (\pm 2 h), cuyo medio "S3" tiene la siguiente composición:

\bullet

Peptona de soja 10,00 g/l

\bullet

Glicerol 5,00 g/l

\bullet

pH 7,2 (\pm 0,1).

Se inoculó a su vez la siembra con 5 ml de suspensión de B. subtilis de un cultivo inclinado lavado con 10 ml de agua purificada.

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Condiciones de crecimiento

\bullet Siembra:

Matraz con agitación de 3 l con 800 ml de medio

Temperatura de incubación 37ºC

Agitación 90 rpm

Tiempo 17 h (\pm 2 h)

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\bullet Fermentador:

Agitación 120 rpm

Aire 0,6 vvm

Presión 0,25 bares

Temperatura 37ºC

Antiespumante de silicio

Tiempo 144 h (\pm 4 h)

La biomasa obtenida en dichas condiciones era de 8 (\pm 1) g/l de peso seco con un contenido en MK - 7 de 1100 (\pm 100) ppm.

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Ejemplo 2

Se cultiva Bacillus subtilis GN13/72 - DSM 17766 como en el ejemplo 1, teniendo el medio de fermentación "F12" la siguiente composición:

\bullet

Peptona de soja 10,00 g/l

\bullet

Glicerol 10,00 g/l

\bullet

Extracto de levadura 1,00 g/l

\bullet

K_{2}HPO_{4} 0,05 g/l

\bullet

NaCl 5,00 g/l

Duración de la fermentación 140 h (\pm 2 h).

Se obtienen 10 (\pm 1 g) g/l de peso seco con un contenido en MK - 7 de 3000 (\pm 100) ppm.

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Ejemplo 3

Se cultiva Bacillus subtilis GN13/72 - DSM 17766 como en el ejemplo 1, teniendo el medio de fermentación "F13" la siguiente composición:

\bullet

Peptona de soja 12,00 g/l

\bullet

Extracto de levadura 0,50 g/l

\bullet

Dextrina 60,00 g/l

\bullet

K_{2}HPO_{4} 0,05 g/l

\bullet

NaCl 5,00 g/l

Duración de la fermentación 140 h (\pm 1 h).

Se obtienen 9,0 (\pm 1,0) g/l de peso seco con un contenido en MK - 7 de 7800 (\pm 200) ppm.

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Ejemplo 4

Se cultiva Bacillus subtilis GN13/72 - DSM 17766 como en el ejemplo 3, consistiendo la fuente de carbono en maltodextrina en lugar de dextrina.

Duración de la fermentación 140 h (\pm 3 h).

Se obtienen 8,0 (\pm 1,0) g/l de peso seco con un contenido en MK - 7 de 8500 (\pm 150) ppm.

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Ejemplo 5

Se cultiva Bacillus subtilis GN13/72 - DSM 17766 como en el ejemplo 4, siendo el agente antiespumante aceite de soja.

Duración de la fermentación 144 h (\pm 4 h).

Se obtienen 11 (\pm 1) g/l de peso seco con un contenido en MK - 7 de 11700 (\pm 300) ppm.

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Ejemplo 6

Se cultiva Bacillus subtilis GN13/72 - DSM 17766 en un fermentador de 300 l, con un volumen útil de 225 l, medio "F13", pH mantenido de manera automática a 7,2 (\pm 0,1) con NaOH; agitación 100 rpm; aire 0,5 vvm; presión 0,3 bares; antiespumante aceite de soja controlado de manera automática.

Se obtuvo un inóculo al 4% en una siembra de un total de 30 l con 20 l de volumen útil y medio "S3" (véase el ejemplo 1).

Duración de la fermentación 142 h (\pm 4 h). Biomasa obtenida 11 (\pm 1,0) g/l de peso seco. MK - 7 obtenida: 15150 (\pm 200) ppm.

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Ejemplo 7

Se cultiva Bacillus subtilis GN13/72 - DSM 17766 como en el ejemplo 6. Se detuvo la fermentación antes de alcanzar la fase estacionaria. Se obtienen 7,0 (\pm 1,5) g/l de peso seco, con una productividad de MK - 7 = 21000 ppm. Se dividió la biomasa en 2 partes: se liofilizó una parte para obtener un polvo que tenía 17000 (\pm 350) ppm; se secó por pulverización la otra parte para obtener 20000 (\pm 500) ppm.

Condiciones de funcionamiento de la secadora por pulverización:

\bullet

Temperatura de entrada del aire 200ºC

\bullet

Temperatura de salida del aire 80ºC.

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Ejemplo 8

Se sigue el procedimiento del ejemplo 7, en el que el volumen útil de fermentación era de 2 m^{3}. Se envasó el producto final secado por pulverización en bolsitas de 250 g a vacío.

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Bibliografía

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Claims (7)

1. Procedimiento para la preparación de vitamina K2 (MK - 7) que comprende el cultivo de la cepa mutante de Bacillus subtilis GN13/72 - DSM 17766 depositada el 5 de diciembre de 2005 en la DSMZ.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la fuente de carbono usada es dextrina.

3. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la fuente de carbono usada es maltodextrina.

4. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el cultivo se lleva a cabo en presencia de aceite de soja como agente antiespumante.

5. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la biomasa obtenida a partir del cultivo se seca mediante secado por pulverización.

6. Procedimiento según las reivindicaciones 1 y 5, en el que la biomasa secada por pulverización se envasa a vacío.

7. Bacillus subtilis GN13/72 - DSM 17766 depositada el 5 de diciembre de 2005 en la DSMZ.