KR20070072383A

KR20070072383A - 비타민 ｋ２의 제조 방법

Info

Publication number: KR20070072383A
Application number: KR1020060135200A
Authority: KR
Inventors: 알베르또 베네데띠; 시모나 달리; 로베르또 사이쯔; 헤르메스 빠가니
Original assignee: 그노시스 에스.피.에이.
Priority date: 2005-12-29
Filing date: 2006-12-27
Publication date: 2007-07-04
Also published as: US20070154998A1; EP1803820B1; EP1803820A1; JP5043425B2; US7718407B2; PT1803820E; CA2572373C; DE602005015133D1; JP2007181461A; RS51172B; ES2326379T3; ATE434666T1; PL1803820T3; HRP20090507T1; SI1803820T1; CA2572373A1; KR101439473B1; DK1803820T3; CY1109266T1

Abstract

DSMZ에 2005.12.5. 기탁된 바실루스 서브틸러스(Bacillus subtilis) 변이 GN13/72-DSM17766의 배양을 포함하는 비타민 K2(MK-7)의 제조 방법이 개시된다.

Description

비타민 Ｋ２의 제조 방법{A process for the preparation of vitamin K2}

본 발명은 바실루스(Bacillus) 균을 이용한, 비타민 K2(메나퀴논 -7:MK-7)의 발효 제품에 관한 것이다.

본 발명은 부다페스트 조약에 의해 기탁된 미생물 바실루스 서브틸러스(Bacillus subtilis)의 변종에 관한 것으로, 본 발명은 특정 배양 조건에서 다량으로 MK-7을 생산할 수 있다.

비타민 K는 단백질에서 감마-카르복시글루탐산(Gla) 잔기의 형성을 위한 주요 인자이다(Olson,R.E.,1984 ¹ - Suttie,J.W.,1985 ² ). 단백질에 함유되는 감마-카르복시글루탐산은 칼슘 이온과 결합하여 예를 들어, 혈액 응고 및 조직 석회에 영향을 미친다(예를 들어, 오스테오칼신(osteocalcin) 뼈 조직에서 발견된다)(Hauschka P.V. 등 1978 ³ - Price, P.A. 등, 1976 ⁴ ). 비타민 K의 결핍은 신생아의 두개(頭蓋)내의 출혈과 같은 몇 가지 질병을 유발하는데 영향을 미친다(Ferland,G. 등, 1993 ⁵ - Shearer, M.J., 1995 ⁶ ). 또한, 비타민 K의 결핍은 골다공증으로부터 생긴 골절을 일으킨다(Knapen, M.H. 등, 1989 ⁷ ).

비타민 K는 자연적으로 두 가지 형태, 즉 녹색 식물에 있는 K1(필로키논)과 동물 및 장내 세균을 포함하는 일부 박테리아에 있는 K2(메나퀴논-MK)가 존재한다(Collins, M.D. 등, 1981 ⁸ - Conly, J.M. 등 1992 ⁹ - Ramotar, K. 등, 1984 ¹⁰ - Taber, H. 1980 ¹¹ - Watanuki, M. 등 1972 ¹² ). MK는 4-13 이소프렌 단위의 다양한 곁가지들을 갖는다. 그것들은 MK-η에 대응하고, 여기서, η은 이소프레노이드 잔기의 수를 의미한다. MK는 전자 수동 및 산화적 인산화 시스템에서 산화환원 반응물로 작용하고 박테리아 플라즈마 세포막을 구성한다(Taber, H. 1980 - Ramotar, K. 등 1984).

젖산 박테리아는 초기 배양에 사용되어 다양한 음식들을 제조하며 일반적으로 안전한 것으로 인식될 수 있다(GRAS). 그리고 한 정성적인 연구를 통해 일부 젖산 박테이라가 MK를 생성함을 보여준다. 많은 나라에서, 비타민 K에 대한 하루 요구량은 체중의 1kg당 약 1 ㎍이다.

로랜드(Rowland), B.M. 와 타버(Taber), H.W. (1996) ¹³ - 로랜드(Rowland), B. 등 (1995) ¹⁴ - 타버(Taber) H.W. 등 (1981) ¹⁵ 에서는 바실루스 서브틸러스(Bacillus subtilis)에서 MK 형성 메커니즘을 연구하였다. 그러나 바실루스 서브틸러스(Bacillus subtilis)로써 MK 생성을 증가시키는 연구는 보고되지 않고 있다. 타니(Tani), Y.와 사쿠라이(Sakurai), N. (1987) ¹⁶ - 타니(Tani), Y.와 타니쿠치(Taniguchi), H. (1989) ¹⁷ 에서는 플라보박테리움(Flavobacterium)에 의해 MK-4, MK-5 및 MK-6의 효과적인 생산이 보고되고 있으며, 생산된 MK-4의 최대 농도는 192mg/l이다(Tani, Y. et al. 1989). 다른 한편으로, 모리시타(Morishita), T. 등 (1999) ¹⁸ 에 따르면, 긴 이소프렌 곁가지(side chain)를 갖는 MKs의 산업상 생산은 최근까지 보고되지 않았다. 상기 연구에 따르면, 젖산 박테리아로부터 MK-7 29 -123㎍/l이 생산되었다. 바실루스 서브틸러스(Bacillus subtilis)로부터 생산된 발효된 콩식품인 "나또" 는 일본에서 인기가 있는 것으로, MK(600~900㎍/100g)을 다량 함유한다(Sakano, T. 등 1988) ¹⁹ . 나또를 제조하는 데 사용되는 바실루스 서브틸러스(Bacillus subtilis)는 식용이 가능하며, 그것은 식품 산업에서 MK의 가장 유리한 원료들 중 하나이다.

요시노리 주카모토(Yoshinori Tsukamoto) 등 (2001)에 따르면, 건조 중량을 기준으로 1719㎍/100g의 생산량을 갖는 바실루스 서브틸러스(Bacillus subtilis) "나또"의 유사 방지 변이(analogous resistant mutant) 를 발견하였다. 다음과 같은 목록의 몇몇 특허 또는 특허 출원에 따르면, K2(<K-7)는 건조 중량을 기준으로 약 1.0 ㎍/g 또는 그 이하로 생산된다(US 2004/043015; US 2005/0025759; US 2002/0146786; US 2001/0046697).

본 발명의 목적은 160-200 시간, 보다 정확하게는 170-185 시간의 생산 주기(예비-시드(pre-seed)부터 발효까지)를 갖고, 건조 상태로 1,000 내지 25,000 ppm의 생산량을 갖는 바실루스 서브틸러스(Bacillus subtilis)의 변종을 제공하는 것이다.

바실루스 서브틸러스(Bacillus subtilis) 변이 GN13/72는 NTG 처리 또는 U.V. 처리에 의해 얻어지고, 미립자의 대두식 고체 배지(micronised soy meal solid medium)에서 회수되어 졌다.

상기 변종은 부다페스트 조약에 따라 2005.12.5. DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikrorganismen und Zellkulturen)에 승인번호 DSM 17766으로 기탁되었다.

MK-7 고함량 바이오매스(biomass)는 탄소원들(예를 들어, 글루코스, 수크로오스, 글리세롤, 녹말 가수분해물 등); 질소원(예를 들어 효모 추출물 또는 자가용해물, 다양한 출처의 펩톤, 대두식 등); 다양한 염들(인산 칼륨, 염화 나트륨, 황산 마그네슘, 황산 망간, 황산 아연 등)을 함유하는 배지를 이용하여 공지의 발효 기술에 따라 제조된다.

발효기의 pH는 6.5 내지 8.5, 보다 정확하게는 6.5 내지 7.8; 기류는 0.1 내지 2.0 vvm, 보다 정확하게는 0.25 내지 1.0vvm; 발효조의 교반 속도는 100에서 250rpm로 변화하고; 압력은 0.1과 1.2 bars, 더욱 상세하게 0.25와 1.0 bars 범위를 갖는다. 발효는 배치(batch) 방식 또는 공급-배치 방식(fed-batch mode)에서 행해진다; 종래 교반 탱크 반응기(Stirred Tank Reactor; STR) 또는 연속 교반 탱크 반응기(Continuous Stirred Tank Reactor; CSTR) 발효기들이 사용된다.

바이오매스는 원심분리 또는 미세여과에 의해 수집하고, 정수로 2번 헹구고, 정수에서 재현탁(resuspended)한다. 그로부터 결과된 크림을 동결 건조 또는 분사 건조에 의해 건조하고 진공 포장한다.

본 발명은 이하 실험예들에 의해 상세히 설명된다.

실험예 1

바실루스 서브틸러스(Bacillus subtilis) GN13/27-DSM 17766를 다음의 성분을 포함하는 발효 배지 "F10" 20 l을 함유하는 30 l(기하학적(geometrical) 발효기에서 호기성 배양을 한다.

?미립자의 대두식(soy meal) 15.00 g/l

?효모 추출물 1.00 g/l

?글리세롤 10.00 g/l

?K₂ HPO₄ 0.05 g/l

?NaCl 5.00 g/l

?pH 7.3 (±0.1)

?121℃에서, 30 분 동안 살균

발효기는 16h (±2 h) 시드 8% (1600 ml)가 주입되고, "S3" 배지는 다음과 같은 성분을 함유한다.

?대두 펩톤 10.00 g/l

?글리세롤 5.00 g/l

?pH 7.2 (± 0.1)

시드는 차례로 10 ml의 정수로 씻겨진 경사(slant)에 바실루스 서브틸러스(Bacillus subtilis) 현탁액 5 ml가 주입되었다.

배양 조건

?시드: 800 ml 배지를 갖는 쉐이커(shaker) 플라스크 3 l

인큐베이션 온도 37℃

교반 속도 90 rpm

17 시간 (±2 시간)

?발효기: 교반 속도 120 rpm

기류 0.6 vvm

압력 0.25 bar

온도 37℃

실리콘 소포제

144 시간 (±4 시간)

상기 조건 하에서 얻어진 바이오매스는 1100 (±100) ppm을 함유하는 MK-7을 건조 중량을 기준으로 8 (±1) g/l 얻었다.

실험예 2

바실루스 서브틸러스(Bacillus subtilis) GN13/72-DSM 17766는 실험예 1과 같이 배양된다. "F12" 발효 배지는 다음과 같은 성분을 함유한다.

?대두 펩톤 10.00 g/l

?글리세롤 10.00 g/l

?효모 추출물 1.00 g/l

?K₂ HPO₄ 0.05 g/l

?NaCl 5.00 g/l

발효 시간 140 시간 (±2 시간).

3000(±100) ppm 함유하는 MK - 7을 건조 중량을 기준으로 10 (±1 g) g/l 얻었다.

실험예 3

바실루스 서브틸러스(Bacillus subtilis) GN13/72 - DSM 17766는 실험예 1과 같이 배양된다. "F13" 발효 배지는 다음과 같은 성분을 함유한다.

?대두 펩톤 12.00 g/l

?효모 추출물 0.50 g/l

?덱스트린 60.00 g/l

?K₂ HPO₄ 0.05 g/l

?NaCl 5.00 g/l

발효 시간 140 시간 (±1 시간).

7800 (±200) ppm을 함유하는 MK - 7을 건조 중량을 기준으로 9.0 (±1.0) g/l 얻었다.

실험예 4

바실루스 서브틸러스(Bacillus subtilis) GN13/72 - DSM 17766는 실험예 3과 같이 배양된다. 탄소원은 덱스트린 대신 말토덱스트린을 사용한다.

발효 시간 140 시간 (±3 시간).

8500 (±150) ppm을 함유하는 MK - 7을 건조 중량을 기준으로 8.0 (±1.0) g/l 얻었다.

실험예 5

바실루스 서브틸러스(Bacillus subtilis) GN13/72 - DSM 17766는 실험예 4에서와 같이 배양된다. 소포제로 대두유를 사용하였다. .

발효 시간 144 시간 (±4 시간).

11700 (±300) ppm을 함유하는 MK - 7을 건조 중량을 기준으로 11 (±1) g/l 얻었다.

실험예 6

바실루스 서브틸러스(Bacillus subtilis) GN13/72 - DSM 17766는 300l 발효기에서 배양된다. 상기 발효기는 225 l 부피; pH는 NaOH를 이용하여 자동으로 7.2 (±0.1)를 유지하고; 교반 속도는 100 rpm; 기류는 0.5 vvm; 압력은 0.3 bar; 소포제는 대두유로 자동으로 조절되는 배지 "F13"을 포함한다.

접종원(inoculum)은 "S3" 배지를 포함하고 20 l 부피를 갖는 전체 30 l 시드에서 4% 얻어졌다(실험예 1 참조).

발효 시간 142 시간 (±4 시간). 바이오매스는 건조 중량 기준으로 11 (±1.0) g/l 얻었다. MK -7은 15150 (±200) ppm 얻었다.

실험예 7

바실루스 서브틸러스(Bacillus subtilis) GN13/72 - DSM 17766는 실험예 6과 같이 배양된다. 발효는 고정상(stationary phase)에 도달하기 전에 정지시켰다. MK -7을 21000 ppm 포함하는 바이오매스는 건조 중량을 기준으로 7.0 (±1.5) g/l 얻었다. 바이오매스는 두 개 부분으로 구분된다.: 일 부분은 동결 건조하여 1700(±350)ppm을 갖는 분말로 얻고, 나머지는 분사 건조하여 20000(±350)ppm 얻었다.

분사 건조기의 작동 조건:

?유입부(Inlet) 기온 200℃

?유출부(Outlet) 기온 80℃.

실험예 8

실험예 7의 과정 다음에 이어졌으며, 유용한 발효 부피는 2 m³ 이었다. 건조된 최종 생성물을 250g 팩으로 진공 포장하였다.

참조 문헌

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본 발명은 160-200 시간, 보다 정확하게는 170-185 시간의 생산 주기(예비- 시드(pre-seed)부터 발효까지)를 갖고, 건조 상태로 1,000 내지 25,000 ppm의 생산량을 갖는 바실루스 서브틸러스(Bacillus subtilis)의 변종을 제공한다.

Claims

DSMZ에 2005.12.5.에 기탁된 바실루스 서브틸러스(Bacillus subtilis) 변이 GN13/72-DSM 17766의 배양을 포함하는 비타민 K2(MK-7)의 제조 방법.
제 1 항에 있어서, 탄소원은 덱스트린인 비타민 K2(MK-7)의 제조 방법.
제 1 항에 있어서, 탄소원은 말토덱스트린인 비타민 K2(MK-7)의 제조 방법.
제 1 항에 있어서, 소포제는 대두유인 비타민 K2(MK-7)의 제조 방법.
제 1 항에 있어서, 바이오매스는 분사 건조에 의해 건조되는 비타민 K2(MK-7)의 제조 방법.
제 1 항 및 제 5 항에 있어서, 분사 건조된 바이오매스는 진공 포장되는 비타민 K2(MK-7)의 제조 방법.
2005.12.5. DSMZ에 기탁된 바실루스 서브틸러스(Bacillus subtilis) GN13/72-DSM 17766.