JP6411586B2 - 骨代謝改善剤 - Google Patents

Description

本発明は、バチルス属微生物の菌体及び／又はその培養物を含む骨代謝・骨密度改善剤、飲食品又は飼料、及び医薬組成物に関する。

ビタミンＫは骨の基質となるオステオカルシンのカルボキシル化を促進することが知られている。例えば、健康な閉経後女性に３６０μgのビタミンＫ₂（メナキノン）を１年間摂取させると、骨代謝マーカーである血中ｕｃＯＣ（非カルボキシル化オステオカルシン）濃度が改善することが報告されている（非特許文献１）。

また、大豆イソフラボンは骨吸収を行う破骨細胞を抑制することが知られている。例えば、健康な閉経後女性に５４ｍｇの大豆イソフラボンを１年間摂取させると、骨代謝マーカーである血中ＤＰＤ（デオキシピリジノリン）濃度が改善することが報告されている（非特許文献２）。

しかし、これらの従来技術においては、骨代謝の改善には有効成分を長期間継続的に摂取する必要があった。また、有効成分を食品から摂取することは、摂取量の点から現実的ではないという問題もあった。

バチルス・ズブチリス Ｃ−３１０２株を鶏に摂取させることで、腸管からのカルシウム吸収が促進されることを報告した特許文献があるが（特許文献１）、この文献の目的はカルシウム吸収の増加により鶏の卵殻厚を増強することにある。鶏において、腸管から吸収されたカルシウムは一端大腿骨に蓄積されて、必要に応じて血中へ骨芽細胞の型で放出され卵殻形成に関与する。カルシウムの吸収代謝を促進することで鳥類の卵殻厚を増強していることから、結果として血中へのカルシウムの放出を促進する可能性を示唆するものと言える。

ビタミンＫを１０〜２００ｍｇ／１００ｇ真空熱乾菌体含む枯草菌及び一日に４５ｍｇ以上という多量のビタミンＫの投与で骨量を増す効果があることが臨床試験により証明されていることが記載されている（特許文献２）。

また、ラクトバチルス・ガセリ ＳＢＴ２０５５株の乳酸菌菌体及び／又は乳酸菌培養物を有効成分とする骨吸収抑制剤に関する特許文献もある（特許文献３）。本特許文献で使用される乳酸菌は生菌であることが必要と考えられるが、乳酸菌は熱に対して耐性が低いため、生菌で使用する場合、枯草菌（バチルス・ズブチリス）に比べてハンドリングが悪い。また、骨吸収マーカーの尿中NTxがガイドラインの薬効判断基準値（最少有意変化）を超えて動いておらず、効果が十分とは言えない。

骨粗鬆症は低骨量により骨の脆弱性が増加し、骨折の危険性が増大する疾患である。その患者数は年々増加しており、１３００万人と推定される。骨粗鬆症は寝たきりや患者のQOLを著しく減少させる要因となるため、その治療は社会的に重要な課題である。通常、骨では古い骨が破骨細胞により吸収され、骨芽細胞が新しい骨を作り出す骨リモデリングが行われているが、典型的な高代謝回転型の骨粗鬆症はこの骨リモデリングのバランスが崩れることにより発症する。発症機序としては、血中の炎症性サイトカインが増加し、破骨細胞数および活性が大きくなり、骨形成を上回ることで骨量が減少していく。

骨粗鬆症の治療には、女性ホルモン薬、ビスホスホネート薬などが使用され、食品素材においては、大豆イソフラボン、ビタミンＫ、カルシウム等に骨代謝や骨密度改善作用が報告されている。しかし、骨代謝や骨密度の改善には長期間の服用が必要となる場合が多く、費用負担や副作用への不安、服薬の不便さから、１年以内にその４５％が処方通りの服薬ができなくなり、５年以内に５２％が脱落するとされる。また、骨代謝の改善は、骨粗鬆症の予防と治療のガイドライン２０１５年版に定められる最少有意変化（有意な変化があったと判断するのに必要な最小の変化）を超えた改善がみられるかどうかで評価されるが、過去に短期間で最少有意変化を超えて骨代謝を改善する食品素材はなかった。

特開平１０−１０８６２８号 特開２００１−１３６９５９号 特開２００４−３１５４７７号

N. Emaus, et al., Osteoporos Int. 2010 Oct;21(10):1731-40. H. Marini, et al., Ann Intern Med. 2007 Jun 19;146(12):839-47.

本発明の課題は、経口摂取等により、安全かつ簡便に骨代謝を改善し、骨密度を有意に改善するための手段を提供することにある。

上記課題を解決するために鋭意検討し、発明者らは、バチルス・ズブチリスの菌体及び／又は培養物を経口摂取することで、骨吸収が有意に改善され、骨密度が有意に増加することを見出した。

すなわち、本発明は以下の（１）〜（１２）を提供する。
（１）バチルス属微生物の菌体及び／又は培養物を有効成分とする骨代謝又は骨密度改善剤。
（２）培養物が大豆培養物である、上記（１）に記載の骨代謝又は骨密度改善剤。
（３）バチルス属微生物の芽胞を含む、上記（１）又は（２）に記載の骨代謝又は骨密度改善剤。
（４）バチルス属微生物がバチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）又はバチルス・アミロリクファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）である、上記（１）〜（３）のいずれかに記載の骨代謝又は骨密度改善剤。
（５）バチルス属微生物がバチルス・ズブチリス Ｃ−３１０２株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０９６）である、上記（１）〜（４）のいずれかに記載の骨代謝又は骨密度改善剤。
（６）経口摂取される、上記（１）〜（５）のいずれかに記載の骨代謝又は骨密度改善剤。
（７）１日あたり２．０×１０⁸〜２．５×１０¹¹ＣＦＵのバチルス属菌体を摂取できるように製剤化されている、上記（１）〜（６）のいずれかに記載の骨代謝又は骨密度改善剤。
たとえば、本発明の骨代謝又は骨密度改善剤が錠剤（素錠でも、糖衣錠でもよい）である場合、１錠あたり２．０×１０⁸〜５．０×１０¹⁰ＣＦＵのバチルス属微生物の菌体を含むことが好ましく、１錠あたり４．０×１０⁸〜９．０×１０⁹ＣＦＵのバチルス属微生物の菌体を含むことが、より好ましい。また、前記錠剤は１日あたり１〜５錠服用されることが好ましい。
（８）１日あたり２．０×１０⁹〜２．０×１０¹⁰ＣＦＵのバチルス属菌体を摂取できるように製剤化されている、上記（１）〜（７）のいずれかに記載の骨代謝又は骨密度改善剤。
（９）ビタミンＫ含有量が１日あたりの摂取量として４５ｍｇ未満となるように、例えば３６ｍｇ未満、２７ｍｇ未満、１８ｍｇ未満、９ｍｇ未満、５ｍｇ以下、１ｍｇ以下、５００μｇ以下、１００μｇ以下となるように製剤化されている、上記（１）〜（８）のいずれかに記載の骨代謝又は骨密度改善剤。
たとえば、本発明の骨代謝又は骨密度改善剤が錠剤（素錠でも、糖衣錠でもよい）である場合、ビタミンＫ含有量は１錠あたり９ｍｇ未満、好ましくは５ｍｇ以下、１ｍｇ以下、５００μｇ以下、１００μｇ以下、あるいは７０μｇ以下となるように製剤化される。
（１０）バチルス属微生物の菌体及び／又は培養物を含む、骨代謝又は骨密度改善作用を有する飲食品又は飼料。
（１１）バチルス属微生物の菌体及び／又は培養物を含む、骨代謝又は骨密度改善用の医薬組成物。
（１２）過剰な骨吸収を抑制する、上記（１）〜（９）のいずれかに記載の骨代謝又は骨密度改善剤、上記（１０）に記載の飲食品又は飼料、あるいは上記（１１）に記載の医薬組成物。
なお、上記（１０）に記載の飲食品又は飼料、及び上記（１１）に記載の医薬組成物は、上記（２）〜（９）に記載された骨代謝又は骨密度改善剤と同じ特徴を有し得る。

本発明の骨代謝又は骨密度改善剤は、微量かつ２か月という短期間で骨代謝を改善し、６か月で骨密度を改善することができる。有効成分であるバチルス属微生物は古くから食品等に使用されており、長期にわたって安全に経口摂取することができる。それゆえ、本発明によれば、経口摂取という簡便な方法で、しかも安全に骨代謝や骨密度を改善させることができる。

図１は、バチルス・ズブチリス Ｃ−３１０２株を含む錠剤を投与した閉経後女性（Ｎ＝１３）における骨量変化（０週、４週、８週、１３週）を示す。 図２は、バチルス・ズブチリス Ｃ−３１０２株を含む錠剤を投与した閉経後女性（Ｎ＝１３）における血中ＴＲＡＣＰ−５ｂの濃度の変化（０週、４週、８週、１３週）を示す。 図３は、バチルス・ズブチリス Ｃ−３１０２株を含む錠剤を投与した閉経後女性（Ｎ＝１３）における（Ａ）血中オステオカルシン、（Ｂ）血中ペントシジン、（Ｃ）血中総ホモシステインの濃度の変化（０週、４週、８週、１３週）を示す。 図４は、各種バチルス・ズブチリス及びバチルス・アミロリクファシエンス菌株の培養上清の細胞毒性（細胞生存率）を示す。縦軸は、コントロール（ＤＭＥＭ）の細胞生存率を１００％とした場合の相対値（平均値±ＳＥ）を示す。 図５は、バチルス・ズブチリス及びバチルス・アミロリクファシエンス各種菌株（培養上清）の破骨細胞分化に対する影響を示す。（Ａ）分化用培地、コントロール、Ｃ−３１０２株（培養上清添加）の７２時間培養後のＴＲＡＰ染色像である。（Ｂ）顕微鏡下で計数した３核以上の破骨細胞数をコントロール群の破骨細胞数を１００％とした場合の相対値（平均値±ＳＥ）を示すグラフである。 図６は、骨粗鬆症モデルラットにおけるＣ−３１０２株の骨代謝改善効果（血中ＣＴｘ量、平均値±ＳＥ）を示す。グラフ左から、Ｓｈａｍ群（Ｎ＝８）、対照群（Ｎ＝８）、Ｃ−３１０２群（Ｎ＝８）。 図７は、バチルス・ズブチリス Ｃ−３１０２株を含む素錠を投与した閉経後女性（Ｎ＝７６）における、（Ａ）投与６か月後の腰椎の骨密度、及び（Ｂ）大腿骨近位部の骨密度を示す（平均値±ＳＥ）。左：プラセボ群（Ｎ＝３０）、右：Ｃ−３１０２株群（Ｎ＝３１）。 図８は、バチルス・ズブチリス Ｃ−３１０２株を含む素錠を投与した閉経後女性（Ｎ＝６１）における（Ａ）尿中ＮＴｘ及び（Ｂ）血中ＴＲＡＣＰ−５ｂの変化（ベースライン、３か月後、６か月後）を示す（平均値±ＳＥ）。実線：Ｃ−３１０２株群（Ｎ＝３１）、破線：プラセボ群（Ｎ＝３０）。

１．本発明の骨代謝又は骨密度改善剤
１．１ 有効成分
本発明の骨代謝又は骨密度改善剤は、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属微生物の菌体又は培養物を有効成分として含む。バチルス属微生物は、酵素の生産や食品の生産など、古くからヒトの生活に深くかかわっており、その機能性についての情報は多いが、骨代謝や骨密度については、ビタミンＫ高含有の枯草菌が骨粗鬆症改善効果を有することについて報告されているにすぎない（前掲）。バチルス属微生物は、偏性好気性のグラム陽性細菌で、芽胞（胞子）を形成し、芽胞は高温や消化酵素に対して耐久性を有する。本発明の骨代謝又は骨密度改善剤は、このバチルス属微生物を芽胞状態で含み、それゆえ、経口摂取しても生きたまま腸に届き、その効果を発揮することができる。

バチルス属微生物としては、バチルス・ズブチリス（枯草菌）、バチルス・アミロリクファシエンス、バチルス・コアグランス、バチルス・リケニホルミス、バチルス・プミルス、バチルス・クラウシー等が挙げられる。好ましいバチルス属微生物はバチルス・ズブチリス又はバチルス・アミロリクファシエンスである。

バチルス・ズブチリスの菌学的性質はバージーズ・マニュアル・オブ・バクテリオロジー Ｖｏｌ．１１（１９８６）等に記載されており、具体的には例えば以下の特徴を有する。
（１）グラム陽性
（２）卵円形の芽胞を形成
（３）桿菌
（４）運動性：あり
（５）好気性
（６）カタラーゼ：陽性
（７）５０℃における発育：＋
（８）ｐＨ５．７における発育：＋
（９）クエン酸塩の利用：＋
（１０）糖類からの酸生成の有無：アラビノース、グルコース、キシロース、マンニット：＋
（１１）ＶＰ反応：＋
（１２）デンプンの加水分解：＋
（１３）硝酸塩の還元性：＋
（１４）インドールの生成：−
（１５）ゼラチンの加水分解：＋
（１６）カゼインの加水分解：＋
（１７）液体培地での被膜形成：＋
（１８）牛乳の凝固：−
（１９）牛乳のペプトン化：＋

本発明に用いるバチルス・ズブチリスとしては、例えば、バチルス・ズブチリス Ｃ−３１０２株（１９８５年１２月２５日付にて受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０９６として生命工学工業技術研究所に寄託されている（現 独立行政法人製品評価技術基盤機構特許生物寄託センター：千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８ １２２室））を挙げることができるが、これに限定されるものではない。

バチルス・ズブチリス Ｃ−３１０２株については、整腸作用（ＷＯ２０１１／１１１７８３号、脂質代謝改善作用（ＷＯ２００８／２３６０８号）、腎機能改善作用（特表２００８−２３６０７号）等、さまざまな有用な効果が知られている。すでに、バチルス・ズブチリス Ｃ−３１０２株を含む食品も市販されており、長期摂取による安全性も確立されている。

バチルス・ズブチリス Ｃ−３１０２株の大豆培養物は、鳥類や家畜に対して、腸内細菌叢改善、増体、感染防御、卵殻強化、肉質改善、便臭改善等の効果があり、添加物（特公平４−２４０２２）や、鳥類の卵殻強度増強剤（特開平１０−１０８６２８号）などの飼料として利用されている。またこの株の保健効果として、整腸作用、腸内腐敗産物の減少などが知られている（腸内細菌学会誌 第18巻 第二号 93-99（2004））。

バチルス・ズブチリス Ｃ−３１０２株は、下記配列１及び配列２のＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲ反応を行うと約７００ｂｐｓの断片が増幅するという特徴を持つ。この２つのＰＣＲプライマーの両方で増幅が起こるバチルス・ズブチリスは他にはない。バチルス・ズブチリスＣ−３１０２株のゲノムをテンプレートとして増幅される約７００ｂｐｓの断片は、アミラーゼの配列と相同性を有しないという特徴をもち、この点においてＣ−３１０２株はバチルス・ズブチリスの他の株と明確に識別される。
配列１：５'−ＧＣＣＣＣＧＣＡＣＡＴＡＣＧＡＡＡＡＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＡ−３'（配列番号１）
配列２：５'−ＧＧＡＴＣＣＣＡＣＧＴＴＧＴＧＡＴＴＡＡＡＡＧＣＡＧＣＧＡＴ−３'（配列番号２）

さらに、バチルス・ズブチリス Ｃ−３１０２株は以下の性質を有する：
（１）プラスミドＤＮＡを有しない。
（２）ゲノムＤＮＡを調製し、制限酵素ＮｏｔＩまたはＳｆｉＩで消化してアガロース電気泳動により分離したときの消化パターンは、既報（ＷＯ２００８／０２３６０７の図１、ＷＯ２００８/０２３６０８の図１）に示されるとおりである。
（３）アンピシリン、クロラムフェニコール、シプロフロキサシン、エリスロマイシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、リネゾリド、キヌプリスチン／ダルフォプリスチン、リファムピン、ストレプトマイシン、テトラサイクリン、トリメトプリム、バンコマイシンに対して耐性を有しない（いずれも最小阻害濃度０．０３〜４μｇ／ｍｌ）。

バチルス・アミロリクファシエンスは、好気性のグラム陽性菌であり、遺伝子配列に基づいた分類ではバチルス・ズブチリスの近縁種にあたる（Front Microbiol. 2017, 8:22.）。生育上の至適温度は約３０〜約４０℃であり、αアミラーゼやプロテアーゼの生産に関与していることから、農業用途、洗剤等への応用が報告されているものもある（特表２０１３−５２４８５２号等）。また、味噌などの発酵食品や土壌からも検出される細菌である。

１．２ バチルス属微生物の培養物
バチルス属微生物は、培地として微生物培養に通常使用される炭素源、窒素源、無機物等を含む液体培地又は固体培地を用いて培養することができる。炭素源としては、バチルス属微生物が資化可能な炭素源であればよく、例えばグルコース、フルクトース、スクロース、スターチ、糖蜜等を、また窒素源としては、例えばペプトン、カゼイン加水分解物、肉エキス、硫安等を挙げることができる。更に、必要に応じて燐酸、カリウム、マグネシウム、カルシウム、ナトリウム、鉄およびマンガン等の塩類、ビタミン類、アミノ酸類、界面活性剤等を添加することもできる。また、これらの合成培地の他、大豆油かすなどの天然物由来物質を用いて培養してもよい。培養条件としては、好気的条件が好ましく、培養装置としては例えばジャーファーメンターによる通気撹拌液体培養等が好ましい。培養温度は２０〜５０℃、特に３０〜４５℃が好ましく、培養時間は１２時間〜７日間、培養初発ｐＨはｐＨ５〜９、特に好ましくはｐＨ６〜８である。

このようにして得られた培養物は、バチルス属微生物の菌体、培地および発酵生成物を含む。培養物は、骨代謝又は骨密度改善剤としてそのまま用いてもよく、培養物を濃縮してもよく、またはこれらに賦形剤等を加えて乾燥粉末、顆粒、錠剤等の製剤として用いてもよい。また、培養物から分離した菌体を用いてもよく（例えば、芽胞）、培養物から菌体を除去して用いてもよく（例えば、培養上清）、菌体を含む形の培養物を用いてもよい。ある態様においては、バチルス属微生物は、大豆油かす、大豆煮豆、小豆煮豆、米飯、麦飯、小麦ふすま、煮とうもろこし、その他の穀類などの食用に適した天然物由来物質を用いて培養し、培養物から菌体を分離することなく、そのまま飲食品や飼料等に配合する。別な態様においては、バチルス属微生物の培養上清を分離して、これを食品や医薬品等に配合する。さらに別な態様においては、バチルス属微生物の菌体（芽胞）を食品や医薬品等に配合する。

１．３ 効果及び用法用量
本発明の骨代謝又は骨密度改善剤は、経口摂取により、安全かつ簡便に骨代謝・骨密度を改善する。
骨では、骨芽細胞による骨形成と破骨細胞による骨吸収が常に繰り返されており（骨代謝）、この骨吸収と骨形成のバランスにより骨の正常な骨代謝が維持される。そして、そのバランスが乱れると、最終的に骨粗鬆症等の骨代謝異常疾患を生じる。本発明の骨代謝又は骨密度改善剤は、とくに骨吸収を行う破骨細胞の活性を抑制し、過剰な骨吸収を抑制することによって、骨代謝を改善し、骨密度を改善するものである。

本発明に係る「骨密度」とは、単位体積あたりの骨量を意味し、ＢＭＤ（Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒａｌ Ｄｅｎｓｉｔｙ）と表記されることもある。骨密度は、通常（ｇ／ｃｍ²）で示されるが、若年成人平均値（ＹＡＭ）を基準とした割合値（％）を指標として示されることもある。骨吸収が異常に活性化し、骨代謝が乱れ、吸収された骨量を骨形成によって十分補充できなくなると、骨密度が低下し、骨粗鬆症等の発症につながる。骨粗鬆症は、骨密度の低下と骨質の劣化により骨強度が低下する疾患であり、骨密度の改善はその治療に重要である。

本発明の骨代謝又は骨密度改善剤は、薬理学的に許容される担体や添加物とともに適宜製剤化され、液体、粉末、造粒物、カプセル剤、錠剤等の形で投与されてもよいし、あるいは飲食品や飼料に添加して用いてもよい。

本発明の骨代謝又は骨密度改善剤を、錠剤として製剤化する場合、使用される薬理学的に許容しうる担体としては、例えば賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、矯味剤等が挙げられるが、これらに制限されず、その他常用の担体が適宜使用できる。

賦形剤としては、乳糖、白糖、Ｄ−マンニトール、Ｄ−ソルビトール、デンプン、α化デンプン、デキストリン、結晶セルロース、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、アラビアゴム、プルラン、軽質無水ケイ酸、合成ケイ酸アルミニウム、メタケイ酸アルミン酸マグネシウムが挙げられる。

滑沢剤としては、例えば、ショ糖脂肪酸エステルやグリセリン脂肪酸エステルなどのシュガーエステル類、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、ステアリルアルコール、粉末植物油脂などの硬化油、サラシミツロウなどのロウ類、タルク、ケイ酸、ケイ素、等が挙げられる。

結合剤としては、α化デンプン、ショ糖、ゼラチン、アラビアゴム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、結晶セルロース、白糖、Ｄ−マンニトール、トレハロース、デキストリン、プルラン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドンが挙げられる。

崩壊剤としては、乳糖、白糖、デンプン、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、軽質無水ケイ酸、低置換度ヒドロキシプロピルセルロースが挙げられる。

防腐剤としては、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸が挙げられ。また、抗酸化剤としては、亜硫酸塩、アスコルビン酸塩等が挙げられる。

着色剤としては、水溶性食用タール色素、水不溶性レーキ色素、β−カロチン、クロロフィル、ベンガラ等の天然色素が挙げられる。

甘味剤としては、サッカリンナトリウム、グリチルリチン酸二カリウム、アスパルテーム、ステビアが挙げられる。

上記のほか、例えば、ビタミン類、ミネラル類、アミノ酸類、カテキンや甜茶などの茶抽出物、グルコサミン、コンドロイチン、ノコギリヤシやりんごなどの植物抽出物、ぶどうやりんごなどに含まれるポリフェノール類、乳酸菌、ビフィズス菌、酪酸菌、納豆菌、糖化菌、酵母、デンプン、デキストリン、アラビアゴム、マンニトールやキシリトールなどの糖アルコール類、結晶セルロースやヒドロキシプロピルセルロースなどのセルロース誘導体、ゼラチン、グリセリン、発酵乳、ラクトフェリン、食物繊維、フレーバー等を含んでいてもよい。

特に、本発明の骨代謝又は骨密度改善剤を含む錠剤は、グルコースやフルクトースなどの単糖、スクロースやラクトースなどの二糖、イソマルトやシクロデキストリンなどのオリゴ糖、グラニュー糖、麦芽糖、乳糖などの糖類、及びでんぷんを含むことが好ましく、とくに麦芽糖及びでんぷんを含むことが好ましい。

本発明の骨代謝又は骨密度改善剤は、ビタミンＫの含量が少なくてもよく、１日あたりの摂取量として、４５ｍｇ未満となるように、例えば３６ｍｇ未満、２７ｍｇ未満、１８ｍｇ未満、９ｍｇ未満、５ｍｇ以下、１ｍｇ以下、５００μｇ以下、１００μｇ以下となるように製剤化される。錠剤の場合には、１錠あたり９ｍｇ未満、好ましくは５ｍｇ以下、より好ましくは１ｍｇ以下、さらに好ましくは５００μｇ以下、とくに好ましくは１００μｇ以下、最も好ましくは７０μｇ以下である。

錠剤は、糖衣錠であっても素錠であってもよい。糖衣錠は、素錠に比べて一般的には崩壊性は低いが、有効成分の風味や臭いを感じにくいという利点がある。

本発明の骨代謝又は骨密度改善剤は、１日あたり１．０×１０⁸〜２．５×１０¹¹ＣＦＵ、好ましくは１日あたり１．０×１０⁹〜１．０×１０¹¹ＣＦＵ、より好ましくは１日あたり１．０×１０⁹〜４．０×１０¹⁰ＣＦＵ、さらに好ましくは１日あたり２．０×１０⁹〜２．０×１０¹⁰ＣＦＵのバチルス属微生物を摂取できるように服用され、好ましくは１日１回〜５回、より好ましくは１回〜４回、さらに好ましくは１日１回〜３回に分けて服用するか、あるいは１日１回服用することが好ましい。それゆえ、そのような服用に適した錠剤として製剤化されることが望ましい。

例えば、錠剤として製剤化する場合、１錠あたり２．０×１０⁷〜２．５×１０¹¹ＣＦＵ、好ましくは１錠あたり２．０×１０⁸〜９．０×１０¹⁰ＣＦＵ、より好ましくは１錠あたり４．０×１０⁸〜４．０×１０¹⁰ＣＦＵ、さらに好ましくは１錠あたり４．０×１０⁸〜２．０×１０¹⁰ＣＦＵのバチルス属微生物を含むように調製される。

本発明の骨代謝又は骨密度改善剤の対象は、本剤の服用を必要とする者、すなわち、骨代謝や骨密度の異常・乱れに伴う症状を有する者や、高齢や妊娠に伴う骨量減少予防・改善の必要のある者、急速な成長に伴い、骨がもろくなりやすい成長期の子供である。

本発明の骨代謝又は骨密度改善剤の有効成分であるバチルス属微生物、とくにバチルス・ズブチリス及びバチルス・アミロリクファシエンスは微量かつ短期間で有効で、保存性と耐酸性にもすぐれ腸内に到達して増殖しやすく、持続的な骨代謝・骨密度改善作用が期待できる。一方、本発明のバチルス属微生物、とくにバチルス・ズブチリスは長期にわたって安全に摂取することができる。それゆえ、本発明の骨密度改善剤は２ヶ月以上、好ましくは６ヶ月以上、より好ましくは１年以上継続して使用するとよい。

２．骨代謝又は骨密度改善用の飲食品
本発明はバチルス属微生物の菌体及び／又は培養物を含む、骨代謝又は骨密度改善作用を有する飲食品も提供する。飲食品の種類は特に限定されず、例えば、飲料、製菓錠菓、ペースト、パン、魚肉加工製品、乳製品、ゼリー、キャンディ、レトルト食品、クッキー、カステラ、ビスケット、チョコレートなどが挙げられる。あるいは、本発明の骨代謝又は骨密度改善剤をこれらの様々な食品素材に添加してもよい。本発明の飲食品は、健康飲料、健康食品あるいは機能性食品として提供することができる。

飲食品中に含まれるバチルス属微生物の菌体及び／又は培養物の量は、飲食品の種類や目的に応じて適宜決定される。飲食品の通常の摂取量から考慮して、１日あたり１．０×１０⁸〜２．５×１０¹¹ＣＦＵ、好ましくは１日あたり１．０×１０⁹〜１．０×１０¹¹ＣＦＵ、より好ましくは１日あたり１．０×１０⁹〜４．０×１０¹⁰ＣＦＵ、さらに好ましくは１日あたり２．０×１０⁹〜２．０×１０¹⁰ＣＦＵのバチルス属微生物を摂取できるように配合されるとよい。

１日の摂取回数も、飲食品の種類や目的に応じて適宜決定されるが、健康食品や機能性食品の場合は、１日１回〜５回、好ましくは１回〜４回、より好ましくは１日１回〜３回に分けて摂取するか、あるいは１日１回摂取することが好ましい。本発明の飲食品は、継続して摂取することで、骨代謝を改善し、骨密度を改善することができる。

３．骨代謝又は骨密度改善用の飼料
本発明は、バチルス属微生物の菌体及び／又は培養物を含む、骨代謝又は骨密度改善作用を有する飼料も提供する。飼料の対象としては、ニワトリなどの鳥類、牛、豚、羊、ヤギ等の哺乳動物、魚類等を挙げることができるが、特に限定されない。飼料は、前記した本発明の骨代謝又は骨密度改善剤を既存の飼料に添加して製造してもよい。

飼料中に含まれるバチルス属微生物の菌体及び／又は培養物の量は、飼料の対象や目的に応じて適宜決定される。たとえば、牛の場合であれば、１日あたり１×１０⁶ＣＦＵ／Ｋｇ以上、とくに５×１０⁶〜６×１０⁸ＣＦＵ／Ｋｇとなるように添加・配合することが好ましい。鳥類の場合であれば、例えば１０³〜１０¹¹ＣＦＵ／ｇ、１０³〜１０⁷ＣＦＵ／ｇ、とくに１０⁴〜１０⁶ＣＦＵ／ｇとなるように添加・配合することが好ましい。

飼料には、対象に応じて、適宜、ビタミン類、ミネラル類、アミノ酸類、香料、酸味料、重曹、乳化剤、安定剤等を適宜添加してもよい。本発明の飼料を、継続して家畜等に与えることで、その骨代謝を改善し、骨密度を改善することができる。

４．骨代謝又は骨密度改善用の医薬組成物
本発明は、バチルス属微生物の菌体及び／又は培養物を含む、骨代謝又は骨密度改善用の医薬組成物も提供する。

本発明の医薬組成物は、過剰な骨吸収を抑制し、骨吸収と骨形成のバランスを正常化し（骨代謝を改善し）、骨密度を改善することで、骨量減少の防止や骨量増加を達成しうる。

本発明の医薬組成物は、骨代謝の異常を伴う種々の症状や疾患の予防または治療に使用される。たとえば、閉経、妊娠、高齢に伴う骨代謝の乱れ、骨量減少のほか、骨粗鬆症、高カルシウム血症、線維性骨炎、骨軟化症、慢性関節リウマチ、変形性腰椎症、変形性膝関節症等の骨代謝異常疾患の予防または治療に使用し得る。

本発明の医薬組成物の投与経路は特に限定されないが、前述したように、バチルス属微生物（とくにバチルス・ズブチリス及びバチルス・アミロリクファシエンス）の菌体又はその培養物は、微量かつ短期間で有効で、経口投与での安全性も担保されており、保存性と耐酸性にもすぐれ腸内に到達して増殖しやすく、持続的な骨代謝改善作用と骨密度の改善が期待できるため、経口投与が簡便で好ましい。

経口投与する場合、本発明の医薬組成物は、薬理学的に許容される担体や添加物とともに適宜製剤化され、液体、粉末、造粒物、カプセル剤、錠剤等の形で投与される。使用される薬理学的に許容しうる担体としては、例えば賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、矯味剤等が挙げられるが、これらに制限されず、その他常用の担体も適宜使用できる。上記担体の具体例は、骨代謝又は骨密度改善剤において詳述したとおりである。

本発明の医薬組成物は、１日あたり１．０×１０⁸〜２．５×１０¹¹ＣＦＵ、好ましくは１日あたり１．０×１０⁹〜１．０×１０¹¹ＣＦＵ、より好ましくは１日あたり１．０×１０⁹〜４．０×１０¹⁰ＣＦＵ、さらに好ましくは１日あたり２．０×１０⁹〜２．０×１０¹⁰ＣＦＵのバチルス属微生物を摂取できるように服用され、好ましくは１日１回〜５回、より好ましくは１回〜４回、さらに好ましくは１日１回〜３回に分けて服用するか、あるいは１日１回服用することが好ましい。

例えば、錠剤として製剤化する場合、１錠あたり２．０×１０⁷〜２．５×１０¹¹ＣＦＵ、好ましくは１錠あたり２．０×１０⁸〜９．０×１０¹⁰ＣＦＵ、より好ましくは１錠あたり４．０×１０⁸〜４．０×１０¹⁰ＣＦＵ、さらに好ましくは１錠あたり４．０×１０⁸〜２．０×１０¹⁰ＣＦＵのバチルス属微生物を含むように調製される。

本発明の医薬組成物の投与期間は特に限定されないが、２ヶ月以上、好ましくは６ヶ月以上、より好ましくは１年以上継続して使用するとよい。

本発明の骨代謝又は骨密度改善剤、医薬組成物、飲食品は、他の骨代謝や骨密度改善用の医薬品・飲食品と併用されてもよい。併用可能な骨代謝や骨密度改善用医薬品としては、例えば、カルシウム製剤、活性型ビタミンＤ３剤（カルシトリオール、アルファカルシドール、エルデカルシトール）、カルシトニン製剤、ビスホスホネート製剤（アレンドロン酸、リセドロン酸、ミノドロン酸、エチドロン酸、イバンドロン酸）、ビタミンＫ₂製剤（メナテトレノン）、エストロゲン製剤（エストラジオール、エストリオール）、選択的エストロゲン受容体モジュレーター(ラロキシフェン、バゼドキシフェン)、副甲状腺ホルモン製剤（テリパラチド）、ヒト型抗ＲＡＮＫＬモノクローナル抗体製剤（デノスマブ）等を挙げることができる。

以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが，これらの実施例は本発明の範囲を制限するものではない。

実施例においては、バチルス属に属する細菌の例として、バチルス・ズブチリス Ｃ−３１０２株（１９８５年１２月２５日付にて受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０９６として生命工学工業技術研究所に寄託されている（現 独立行政法人製品評価技術基盤機構特許生物寄託センター：千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８ １２２室））を用いた。

実施例１：バチルス・ズブチリスの骨吸収に対する効果
１．糖衣錠の調製
市販大豆油かす造粒品１０ｋｇに水５ｋｇを加えて１２１℃、６０分間殺菌し、予め前培養しておいたバチルス・ズブチリス Ｃ−３１０２株（生命工学工業技術研究所寄託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−１０９６）の培養液を接種し、３７℃程度で、６０．５時間培養することにより、バチルス・ズブチリス Ｃ−３１０２株の大豆培養物を製造した。このようにして得られた培養物を乾燥粉砕し、下記の表に示す他の成分を配合して、糖衣錠を製造した。糖衣錠の組成を表１、２に示す。

２．試験方法・結果
健康な閉経後女性１３名を対象とし、３錠あたり３．６×１０⁹ＣＦＵのバチルス・ズブチリス Ｃ−３１０２株を含む糖衣錠を１日３錠、１３週間摂取させた。４週、８週、１３週目に、骨量、骨吸収マーカーであるＴＲＡＣＰ−５ｂ、骨形成マーカーであるオステオカルシンおよび骨マトリックス関連マーカーであるペントシジン、ホモシステインの測定を実施した。

０週目と比較して摂取８週目および１３週目において、骨量の有意な増加（図１）及び血中ＴＲＡＣＰ−５ｂの有意な減少（図２）が確認された。一方、０週目と比較して１３週目において、骨形成マーカーのオステオカルシンおよび骨マトリックス関連マーカーであるペントシジン、ホモシステインに有意な変動は見られなかった（図３）。

なお、糖衣錠中に含まれる他の成分の影響を確認するため、骨代謝や骨密度への影響が報告されているビタミンＫ₂、イソフラボン、カルシウムの含有量を財団法人日本食品分析センターにて分析したところ、下表のとおりであった。

ビタミンＫ₂は、単独投与の場合、４５ｍｇの摂取が骨密度の上昇に必要であることが報告されている（Shinyaku to Rinsho 1992 41(6):1249-1279）。イソフラボンは、メタ解析の結果、８７ｍｇの摂取では骨密度に有意な影響を与えないことが報告されている（Bone. 2009 May;44(5):948-53）。カルシウムは、単独投与の場合、５００ｍｇ、６か月の投与で骨密度が上昇することが報告されている（Osteoporos Int. 2013 Nov;24(11):2871-7）。したがって、骨量、骨吸収マーカーの改善は、糖衣錠に含まれるこれらの成分による効果ではないことが確認された。

ＴＲＡＣＰ−５ｂは骨を分解する破骨細胞が分泌する酵素であり、骨吸収の亢進に伴い血中に増加する。破骨細胞のみに由来し、日内変動が小さく、食事や腎機能の影響も受けないため、骨吸収の状態を特異的かつ正確に反映すると思われる。ガイドライン（骨粗鬆症の予防と治療のガイドライン２０１５）によれば、投与開始３〜６か月後の骨吸収マーカーが最少有意変化を超えて変化すれば薬効ありと判断し、治療を継続することが記載されている。Ｃ−３１０２株を含む糖衣錠３か月投与により、ＴＲＡＣＰ−５ｂは２１．１％の変化率を示し、ガイドラインのＴＲＡＣＰ−５ｂの最少有意変化（１２．４％）を超え、医薬品と同等の効果を有することが示唆された。

実施例２：複数菌株での骨代謝改善効果の検証結果
バチルス・ズブチリス及びバチルス・アミロリクファシエンス菌株の骨代謝改善効果を、ラット破骨細胞初代培養系を用いて検証した。

１．バチルス・ズブチリス培養上清の調製
表４に示す各種バチルス・ズブチリス及びバチルス・アミロリクファシエンスの菌株を３％（ｗ／ｖ）のＢＤ ＢＢＬ^TMトリプチケース^TMソイブロス（日本ＢＤ）液体培地（ＴＳ液体培地）にて、初期菌数１×１０⁸ＣＦＵ／ｍｌ、３７℃の好気条件下で８時間振盪培養した。培養後、培養液を遠心分離し、上清を０．２０μｍの滅菌フィルターを通した後、使用するまで−８０℃下で凍結保存した。

２．細胞毒性試験
各培養上清の細胞毒性を確認するため、マウスマクロファージＲＡＷ２６４．７細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）の生存率を測定した。１０％（ｖ／ｖ）のＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ社）、１％（ｖ／ｖ）ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｈｙｃｌｏｎｅ社）を含むＤＭＥＭ培地（シグマアルドリッチ社）で前培養したＲＡＷ２６４．７細胞を５０００ｃｅｌｌｓ／１００μｌとなるよう希釈し、９６穴培養プレートに１００μｌずつ播種した。ＴＳ液体培地及び前記培養上清をそれぞれ０．０１％（ｖ／ｖ）で添加し、３７℃、５％ＣＯ₂の条件で４８時間培養した。水溶性のホルマザンを生成するテトラゾリウム塩ＷＳＴ−８を発色基質として含むＣｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ−８（同仁化学研究所）を各ウェルに１０μｌずつ添加し、３７℃、５％ＣＯ₂の条件で２時間反応させた。マイクロプレートリーダーを用いて、各ウェルの４５０ｎｍにおける吸光度を測定することにより細胞生存率を測定し、細胞毒性を評価した。コントロール（ＤＭＥＭ）の細胞生存率を１００％とした場合の相対値を図４に示す。ＴＳ液体培地及び前記培養上清に細胞毒性は確認されなかった。

３．破骨細胞培養
ＳＤ（Ｓｐｒａｇｕｅ―Ｄａｗｌｅｙ）ラット由来の破骨細胞培養キット（コスモバイオ社）を用いた。破骨前駆細胞を１０％（ｖ／ｖ）の血清、５０ｎｇ／ｍｌのＭ−ＣＳＦ（マクロファージコロニー刺激因子）及び１５ｎｇ／ｍｌのＲＡＮＫＬ（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ ｋａｐｐａ−Ｂ ｌｉｇａｎd）を含むα−ＭＥＭ培地（分化用培地）に懸濁し、９６穴培養プレートに２×１０⁵ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように分注した。３７℃、５％ＣＯ₂の条件で４８時間前培養した後、各種バチルス・ズブチリスの培養上清を０．０１％（ｖ／ｖ）添加した分化用培地に交換した。コントロール群は、ＴＳ液体培地を０．０１％（ｖ／ｖ）添加した分化用培地に交換した。培地交換後、３７℃、５％ＣＯ₂の条件で７２時間培養した。

４．破骨細胞の染色
細胞を１×ＰＢＳで洗浄し、Ｍｉｌｄｆｏｒｍ（登録商標） １０Ｎ（和光純薬工業）で３分間固定した。超純水で３回洗浄した後、ＴＲＡＰ染色キット（コスモバイオ社）で破骨細胞を染色した。分化用培地群、コントロール群、Ｃ−３１０２株培養液添加群の染色像を図５Ａに示す。分化用培地群、コントロール群では多核化し、ＴＲＡＰ染色陽性の破骨細胞が確認されたが、Ｃ−３１０２株培養液添加群においては明らかにその数が減少していた。また、顕微鏡下で３核以上の破骨細胞数を計数し、コントロール群の破骨細胞数を１００％とした相対値を図５Ｂに示す。

コントロール群と分化用培地群の間に統計学的に有意な差はみられず、ＴＳ液体培地は破骨細胞の分化に影響を与えないことが確認された。一方、バチルス・ズブチリス Ｃ−３１０２株を含む各種バチルス・ズブチリス及びバチルス・アミロリクファシエンス菌株の培養上清は破骨細胞分化を有意に抑制することが確認された。

５．成分分析
細胞実験に用いたバチルス・ズブチリス Ｃ−３１０２株培養上清に既知の破骨細胞分化抑制因子であるメナキノン−４、メナキノン−７、ダイゼイン、ゲニステインが含まれるかどうかを検討するため、財団法人日本食品分析センターに定量を依頼した。その結果、Ｃ−３１０２株培養上清にはメナキノン−７が０．０５μｇ/ｍｌ含まれることが確認された（表５）。破骨細胞培養時に培養上清は０．０１％添加しているため、その濃度は５ｐｇ/ｍｌである。メナキノン−７は、破骨細胞分化抑制能を有することが報告されているが、０.１μＭ（６４．９ｎｇ/ｍｌ）の濃度においては効果を示さない（Ｆｏｏｄ Ｆｕｎｃｔ． ２０１５ Ｏｃｔ；６（１０）：３３５１−８）。したがって、バチルス・ズブチリスの培養上清に含まれる破骨細胞分化抑制因子は新規の成分である可能性が示唆された。

実施例３：バチルス・ズブチリス Ｃ−３１０２株の骨代謝改善効果
バチルス・ズブチリス Ｃ−３１０２株の骨代謝改善効果を、卵巣摘出による骨粗鬆症モデルラットを用いて検証した。

１．材料・方法
動物
２４匹の６週齢Ｗｉｓｔａｒ系雌性ＳＰＦラット（日本エスエルシー株式会社）を用いた。２週間の馴化期間後、卵巣摘出前日に、２４匹の動物からＳｈａｍ群８匹と卵巣摘出モデル作製群１６匹を選択した。更に、卵巣摘出モデル群は対照群及びバチルス・ズブチリス Ｃ−３１０２株摂取群（以下、Ｃ−３１０２株群と記す）に群分けした（１群８匹）。群分けは、体重層別化無作為抽出法により、各群の体重範囲が平均体重±２０％以内になるように行った。

卵巣摘出モデルの作製
麻酔はキャリアーガスに純酸素を用いて、日本薬局方イソフルラン (マイラン製薬株式会社)をＶ１型吸入麻酔器 (ＶｅｔＥｑｕｉｐ社)を用いて吸入麻酔を行った。左右側腹部の鎌部の周囲を中心とした広い範囲を電気バリカンで刈毛し、動物用イソジン及び消毒用エタノールで消毒した。卵巣摘出は、まず一方の腹部鎌部の皮膚，筋肉，腹膜を切開し，卵巣を外部に引き出し，卵管と血管をはさみ，鋏もしくはメスで卵巣を周囲の脂肪と共に摘出した。電気ゴテで止血を兼ねて術部を焼き，出血や卵巣の取り残しがないことを確認した後に、腹腔内に戻し、皮膚を縫合した。もう一方の卵巣を同じ方法で摘出した。Ｓｈａｍ群の動物は麻酔後、卵巣摘出動物と同様の操作で皮膚を切開し、卵巣を外部に露出した後に卵巣を摘出せずに腹腔内にもどし、皮膚を縫合した。術後は化膿の防止のために術部を動物用イソジンで消毒し、プブレノルフィン(大塚製薬株式会社)を２０μｇ/０．１ｍＬ/ｋｇの用量で卵巣摘出モデル作製後から皮下投与した。手術翌日以降は、術野及び動物の状態を確認しながら３日間投与した。

飼育環境
試験期間中は、温度 ２４±３℃、湿度 ５０±２０％、換気回数約１２回／時間 （オールフレッシュエアー供給）及び照明時間 １２時間/日（７：００点灯、１９：００消灯)に設定された飼育室で１ケージ当たり１匹ずつ飼育した。

バチルス・ズブチリス Ｃ−３１０２株芽胞粉末の調製
予め前培養しておいたバチルス・ズブチリス Ｃ−３１０２株の培養液をトリプチケースソイ寒天培地（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ）に塗布し、３７℃、７２時間通気撹拌培養を行った。培養後、菌体をコンラージ棒でかき集め、５０ｍＬの滅菌水に溶解した。１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心した後、上清を除き、５０μｇ/ｍＬのリゾチーム溶液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．２）を２０ｍＬ添加し、よく撹拌した。撹拌後、３７℃で２時間インキュベートした。１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心した後、上清を除き、２０ｍＬの１Ｍ ＮａＣｌを添加し、よく撹拌した。１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心した後、上清を除き、２０ｍＬの滅菌水を添加し、よく撹拌した。１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心した後、上清を除き、２０ｍＬの０．０５％（ｗ／ｖ）のドデシル硫酸ナトリウムを添加し、よく撹拌した。１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心した後、上清を除き、２０ｍＬの滅菌水を添加し、よく撹拌した。この滅菌水による洗浄操作を３回繰り返したのち、５ｍＬの滅菌水に菌体を希釈した。滅菌した金属製のバットに菌体の希釈液を滴下し、７０℃で２０時間乾燥させた。乾燥した芽胞粉末を滅菌した乳鉢に移してすりつぶし、４６６ｍｇのバチルス・ズブチリス Ｃ−３１０２株芽胞粉末（４．１５×１０¹¹ＣＦＵ／ｇ）を得た。

飼料及び飲用水
Ｓｈａｍ群及び対照群は未滅菌のラット・マウス用実験動物用飼料（ＣＥ−２、日本クレア株式会社）を摂取させた。Ｃ−３１０２株群はバチルス・ズブチリス Ｃ−３１０２株芽胞粉末を２．４８×１０⁵ＣＦＵ／ｇとなるようにラット・マウス用実験動物用飼料に配合した飼料を８週間自由摂取させた。給餌は１週間に１回以上行い、容器は１週間に１回交換した。飲用水は、２５μmフィルターで濾過した水道水を自動給水装置を用いて、それぞれ自由に摂取させた。

採血
卵巣摘出前日、８週目に頚静脈から約０．６ｍＬ採血後、血清を分離した。採血時は日本薬局方イソフルランによる軽麻酔下で頸静脈からディスポーザブル注射器を用いて採血した。採取した血液は１５〜３０分間室温に放置した後に、直ちに氷冷下に移し、３,０００ｒｐｍ、１５ｍｉｎ、４℃で遠心し、血清を分離した。分離した血清サンプルは、測定まで−６０℃以下で保存した。

血中ＣＴｘの測定
採血した血清中のＩ型コラーゲンＣ末端テロペプチド（ＣＴｘ）をＲＡＴＬａｐｓ^TM（ＣＴＸ−１）ＥＩＡ（Ｉｍｍｕｎｏｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍ Ｌｔｄ.）を用いてＥＬＩＳＡ法によって測定した。Ｉ型コラーゲンは骨基質の９０％以上を占める蛋白質であり、破骨細胞による骨吸収の際にその分解産物であるＣＴｘが血中に放出される。そのため、血中ＣＴｘ濃度は骨吸収量を反映する指標と考えられている。

２．結果
対照群はＳｈａｍ群と比較し、血中ＣＴｘ値が有意に増加しており、ＯＶＸにより骨吸収が亢進していることが確認された。一方、Ｃ−３１０２株群では対照群と比較し、血中ＣＴｘ値の有意な抑制がみられ、Ｃ−３１０２株芽胞による骨吸収抑制作用が確認された（図６）。

実施例４：バチルス・ズブチリスの骨密度に対する効果

１．素錠の調製
実施例１にしたがい、バチルス・ズブチリス Ｃ−３１０２株の大豆培養物を製造した。得られた培養物を乾燥粉砕し、下記の表に示す他の成分を配合して、糖衣を施さない素錠
を製造した。素錠の組成を表６に示す。

２．試験方法・結果
バチルス・ズブチリス Ｃ−３１０２株の骨密度への影響を調べるため、二重盲検ランダム化プラセボ対照並行群間比較試験を実施した。被験者は、閉経後２年以上経過した５０〜６９歳の健康な女性から募集した。医師による診断、アンケート及び骨密度の測定を実施し、骨粗しょう症の診断基準（Ｊ Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ Ｍｅｔａｂ．２０１３ Ｍａｙ；３１（３）：２４７−５７）に当てはまらず、健康に問題のない７６名を被験者として選抜した。被験者は骨密度、ＴＲＡＣＰ−５ｂ、ＢＡＰ、年齢、ＢＭＩが均一になるよう無作為にＣ−３１０２株群、プラセボ群に群分けした。

試験食品として、Ｃ−３１０２株群には、３錠あたり３．４×１０⁹ＣＦＵのバチルス・ズブチリス Ｃ−３１０２株を含む素錠を、プラセボ群には、発酵大豆粉末の代わりにデキストリンを配合したプラセボ錠をそれぞれ１日３錠、６か月間摂取させた。試験期間中、自己都合による脱落および抗生物質を摂取した被験者が見られたため、Ｃ−３１０２株群３１名、プラセボ群３０名を解析対象とした。

骨密度の測定
ベースライン及び６か月後の腰椎（Ｌ２−Ｌ４）、大腿骨近位部（Ｔｏｔａｌ ｈｉｐ）の骨密度をＤｉｓｃｏｖｅｒｙ ＤＸＡ ｓｙｓｔｅｍ（Ｈｏｌｏｇｉｃ社）を用いて測定した。その結果、Ｃ−３１０２株群において大腿骨近位部骨密度の変化率がプラセボ群と比較して有意に増加していることが明らかになり、Ｃ−３１０２株の骨密度増加作用が確認された（図７Ａ：腰椎、図７Ｂ：大腿骨近位部）。

骨代謝マーカーの測定
ベースライン、３か月後、６か月後において骨吸収マーカーである尿中ＮＴｘ及び血中ＴＲＡＣＰ−５ｂについて測定した（図８Ａ：尿中ＮＴｘ、図８Ｂ：血中ＴＲＡＣＰ−５ｂ）。その結果、Ｃ−３１０２株群において、摂取３か月後の尿中ＮＴｘの変化率がプラセボ群と比較して有意に改善していることが明らかとなった（図８Ａ）。Ｃ−３１０２株群においては、１２週後および２４週後に尿中ＮＴｘの最少有意変化（２７．３％）を超えて改善した被験者がそれぞれ７名、６名であったのに対し、プラセボ群においてはそれぞれ０名、１名のみであった。

摂取３か月後の血中ＴＲＡＣＰ-５ｂ変化率についてはＣ−３１０２株群において、プラセボ群と比較して改善の傾向が見られた。また、プラセボ群については摂取６か月後のＴＲＡＣＰ−５ｂがベースラインと比較して有意に増加しており、骨吸収の促進が示唆されたが、Ｃ−３１０２株群ではＴＲＡＣＰ−５ｂの増加は見られなかった。（図８Ｂ）。Ｃ−３１０２株群においては、１２週後および２４週後にＴＲＡＣＰ−５ｂの最少有意変化（１２．４％）を超えて改善した被験者がそれぞれ１０名、５名であったのに対し、プラセボ群においてはそれぞれ５名、１名のみであった。

素錠中に含まれる他の成分の影響
素錠中に含まれる他の成分の影響を確認するため、骨代謝や骨密度への影響が報告されているビタミンＫ₂、イソフラボン、カルシウムの含有量を財団法人日本食品分析センターにて分析したところ、下表８のとおりであった。

実施例１に記載したとおり、ビタミンＫ₂は、単独投与の場合、４５ｍｇの摂取が骨密度の上昇に必要であることが報告されている（前掲）。イソフラボンは、メタ解析の結果、８７ｍｇの摂取では骨密度に有意な影響を与えないことが報告されている（前掲）。カルシウムは、単独投与の場合、５００ｍｇ、６か月の投与で骨密度が上昇することが報告されている（前掲）。したがって、骨量、骨吸収マーカーの改善は、素錠に含まれるこれらの成分による効果ではないことが確認された。

以上の結果から、Ｃ−３１０２株は骨吸収を抑制することで骨密度を増加させることが明らかになった。

製剤例１：カプセル剤
バチルス・ズブチリス Ｃ−３１０２株大豆培養物と食用油脂を混合し、常法により下記成分からなるソフトカプセル剤皮の中に充填し、１粒３８０ｍｇのソフトカプセルを得た。
内容物
バチルス・ズブチリス Ｃ−３１０２株大豆培養物 １００ｍｇ
食用油脂 １５０ｍｇ
剤皮
ゼラチン １００ｍｇ
グリセリン ３０ｍｇ

製剤例２：粉末剤
下記成分を配合し、常法に従って造粒し、５ｇ入りスティック顆粒を製造した。
配合
バチルス・ズブチリス Ｃ−３１０２株大豆培養物 ５％
ＣＭＣＮａ 適宜
デキストリン 適宜

製剤例３：液剤
下記成分を配合し、常法に従って、水１０ｋｇを加えて液剤を調製した。
配合
バチルス・ズブチリス Ｃ−３１０２株大豆培養物 １００ｇ
液糖 ４０００ｇ
ＤＬ−酒石酸ナトリウム １ｇ
クエン酸 ５０ｇ
ビタミンＣ ５０ｇ
ビタミンＥ １５０ｇ
シクロデキストリン ２５ｇ
塩化カリウム ５ｇ
硫酸マグネシウム ２ｇ

本発明の骨代謝又は骨密度改善剤は、微量かつ２か月という短期間で骨代謝を改善し、６か月で骨密度を改善することができる。有効成分であるバチルス属微生物は古くから食品等に使用されており、長期にわたって安全に経口摂取することができる。よって、本発明の骨密度改善剤は、医薬品のみならず、骨代謝又は骨密度改善を目的とした医薬部外品、食品として有用である。

配列番号１：合成ＤＮＡ（フォワードプライマー）
配列番号２：合成ＤＮＡ（リバースプライマー）

ＦＥＲＭ ＢＰ−１０９６

Claims (11)

1. バチルス・ズブチリスの菌体及び／又は培養物を有効成分とする骨代謝又は骨密度改善剤。
2. 培養物が大豆培養物である、請求項１に記載の骨代謝又は骨密度改善剤。
3. バチルス・ズブチリスの芽胞を含む、請求項１又は２に記載の骨代謝又は骨密度改善剤。
4. バチルス・ズブチリスがバチルス・ズブチリス Ｃ−３１０２株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０９６）である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の骨代謝又は骨密度改善剤。
5. 経口摂取される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の骨代謝又は骨密度改善剤。
6. １日あたり２．０×１０⁸〜２．５×１０¹¹ＣＦＵのバチルス・ズブチリスを摂取できるように製剤化されている、請求項１〜５のいずれか１項に記載の骨代謝又は骨密度改善剤。
7. １日あたり２．０×１０⁹〜２．０×１０¹⁰ＣＦＵのバチルス・ズブチリスを摂取できるように製剤化されている、請求項１〜６のいずれか１項に記載の骨代謝又は骨密度改善剤。
8. ビタミンＫ含有量が１日あたりの摂取量として４５ｍｇ未満となるよう製剤化されている、請求項１〜７のいずれか１項に記載の骨代謝又は骨密度改善剤。
9. バチルス・ズブチリスの菌体及び／又は培養物を含む、骨代謝又は骨密度改善用の飲食品又は飼料。
10. バチルス・ズブチリスの菌体及び／又は培養物を含む、骨代謝又は骨密度改善用の医薬組成物。
11. 過剰な骨吸収を抑制する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の骨代謝又は骨密度改善剤、請求項９に記載の飲食品又は飼料、あるいは請求項１０に記載の医薬組成物。