KR101279852B1 - 골다공증 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

골다공증 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 하나 이상의 칼슘 보충제 및 하나 이상의 마그네슘 보충제를 포함하는 무기질 혼합물; 및 스트렙토코쿠스 서모필루스 ST3(Streptococcus thermophilus ST3)(KCTC 11870BP), 락토바실루스 람노수스 LR3 (Lactobacillus rhamnosus LR3)(KCTC 11868BP) 및 락토바실루스 파라카제이 LPC4 (Lactobacillus paracasei LPC4) (KCTC 11866BP)를 포함하는 골다공증 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 조성물은 칼슘과 같은 무기질 성분의 체내 흡수를 촉진하여 골 밀도 감소를 완화시킬 뿐만 아니라 부작용도 예방할 수 있는 약품 또는 식품으로 응용가능한 조성물에 관한 것이다.

Description

골다공증 예방 또는 치료용 조성물{COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING OSTEOPOROSIS COMPRISING MULTI-SPECIES POBIOTIC MIXTURE}
본 발명은 골다공증의 예방 또는 치료에 유용한 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 무기질 혼합물과 특유의 유산균 균주들을 포함하여 골다공증의 예방 및 치료에 유용한 복합 유산균 함유 골다공증 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
골다공증은 골 강도의 손상을 야기하는 골질량의 손실 및 골격의 미세 구조의 악화로 특징지어지는 손상 질환이다. 구체적으로 골다공증은 조골세포에 비하여 파골 세포의 활성이 증가함으로써 총 골량(total bone mass)이 감소하면서 경미한 충격에도 뼈가 쉽게 부서지게 되는 질환을 의미한다.
골다공증의 원인으로는 노령, 운동 부족, 저체중, 흡연, 저칼슘 식이,
폐경, 난소 절제 등이 알려져 있는데, 특히 여성의 경우 폐경기 이후 에스트로겐 결핍으로 인하여 파골세포(osteoclast)의 수와 활성도가 증가하기 때문에, 남성보다 골 손실이 빠르게 진행된다. 최근 급속한 고령 인구 비율의 증가에 수반하여, 골다공증과 같은 골 대사 질환의 발생 빈도와 발병률이 급격하게 증가하고 있기 때문에, 골다공증 및 그 치료제에 대한 관심이 점차 증가되고 있다.
현재 골다공증의 예방 및 치료에 대한 치료학적 접근법은 복합적이며, 칼슘과 같은 무기질, 비타민, 예를 들어 비타민 D, 또는 칼시토닌의 사용을 포함하나, 가장 널리 퍼진 치료법은 호르몬 대체 요법(HRT)이다. 그러나 호르몬 대체 요법은 혈전색전성 질환 및 발암의 위험성 뿐만 아니라 체중 증가, 두통, 오심, 울증, 및 유방 팽창 등의 부작용을 초래하는 문제점이 있다.
또한 골다공증을 치료하기 위해 골조직으로 칼슘 흡수를 유도 및 강화하는 방법이 연구되고 있다. 일례로 L-아스코르브산칼슘이 제안되었으나, L-아스코르브산 부분이 흡수되기 때문에, 과잉 섭취에 의해 요로 결석을 유발한다는 안전성 상의 문제점이 있다. 또한 칼슘의 소화관 흡수를 촉진시키는 물질로서 갈락토 올리고당, 프락토 올리고당, α-글루코시다아제 저해제 등이 알려져 있지만, 이들의 효과는 불충분하다.
골다공증은 약물을 단기간 복용함으로써 치료할 수 없고 약물의 장기 복용이 필수적인 질환이므로, 장기 복용할 경우에도 상기와 같은 부작용이 없고 우수한 약효를 발휘할 수 있는 새로운 골다공증 치료제의 개발이 요구되고 있다.
본 발명은 상술한 본 발명이 속하는 기술 분야의 기술적 요구에 부응하기 위한 것으로, 본 발명의 하나의 목적은 칼슘 보충제와 칼슘 흡수를 자극하는 복합 유산균을 포함하는 골다공증 예방 또는 치료를 위한 개선된 효과를 가지는 새로운 조성물을 제공하는 것이다.
상술한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양상은
하나 이상의 칼슘 보충제 및 하나 이상의 마그네슘 보충제를 포함하는 무기질 혼합물; 및
스트렙토코쿠스 서모필루스 ST3(Streptococcus thermophilus ST3)(KCTC 11870BP);
락토바실루스 람노수스 LR3 (Lactobacillus rhamnosus LR3)(KCTC 11868BP); 및
락토바실루스 파라카제이 LPC4(Lactobacillus paracasei LPC4) (KCTC 11866BP)를 포함하는 골다공증 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 복합 유산균을 포함하는 골다공증 예방 또는 치료용 조성물은 기타 유산균, 미량의 무기질 화합물, 비타민 및/또는 제약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형체를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 칼슘 흡수를 자극하는 프로바이오틱 유산균 또는 그 배양물을 포함하므로, 특발성 골다공증, 폐경후 골다공증, 및 갱년기 또는 노인성 골다공증 등을 포함하는 모든 유형의 골다공증을 예방 또는 치료하기 위한 약품 또는 식품으로 이용될 수 있다.
발명의 조성물을 포함하는 약품 또는 식품은 칼슘의 흡수율이 향상되어 골다공증에 있어서 저하되고 있는 골 무기질량을 증가시키고 골절의 리스크를 감소시키면서도, 또한 소화장애, 결석 등의 칼슘 보충제의 부작용을 최소화할 수 있다. 또한 본 발명의 조성물은 항염증(Anti-inframmatory) 및 항산화(Antioxidant) 효능을 갖기 때문에 염증성 골 질환의 치료에도 유용하게 적용될 수 있다.
도 1은 실시예 및 비교예의 조성물 투여 후의 체중 변화를 나타낸 그래프이다.
도 2는 실시예 및 비교예의 조성물 투여 후 대퇴골 조직을 컴퓨터단층촬영한 사진이다.
도 3은 실시예 및 비교예의 조성물 투여 후의 대퇴골의 micro-CT 촬영 사진이다.
도 4a는 실시예 및 비교예의 조성물 투여 후의 골 무기질량(bone mineral contnet, BMC) 측정 결과를 도시한 막대그래프이고, 및
도 4b는 실시예 및 비교예의 조성물 투여 후의 골 무기질 밀도(bone mineral density, BMD) 측정 결과를 도시한 막대그래프이다.
본 명세서에 사용되는 경우에, "치료" 및 "예방 또는 치료"라는 용어는 본 명세서에서 혼용되는데, 별다른 표시가 없는 한, 골다공증 환자 또는 골다공증의 발병 위험이 있는 환자의 골 무기질 밀도를 증가시키거나, 골 무기질 밀도 감소의 속도 또는 개시를 지연시키거나, 현재의 골 무기질 밀도를 유지시키는 방식 또는 다른 방식으로 골 무기질 밀도 감소 또는 부족을 예방, 감소, 경감 또는 제거하는 것을 의미한다.
본 발명의 골다공증 예방 또는 치료용 조성물에는 아래와 같은 유산균 균주들이 포함되는데, 이러한 유산균 균주들은 한국생명공학연구원 유전자은행(Korean Collection for Type Culture; KCTC)에 아래와 같이 특허기탁되었다.
스트렙토코쿠스 서모필루스 ST3(Streptococcus thermophilus ST3 )(KCTC 11870BP);
락토바실루스 람노수스 LR3 (Lactobacillus rhamnosus LR3)(KCTC 11868BP); 및
락토바실루스 파라카제이 LPC4(Lactobacillus paracasei LPC4) (KCTC 11866BP)
본 발명에서 무기질 혼합물은 하나 이상의 칼슘 보충제 및 하나 이상의 마그네슘 보충제를 포함하는 것으로, 이러한 무기질 혼합물은 다양한 미량 미네랄(trace minerals)이 풍부한 해조류로부터 추출될 수 있다.
본 발명의 조성물에서 상기 세 종류의 유산균들의 기능은 유산균이 생성하는 대사산물 또는 효소 또는 비타민들의 형성을 통하여 발생되고, 장내에서 칼슘 흡수를 자극한다.
본 발명의 조성물은 조성물 총 중량에 대해, 유효성분으로서 상기 세 종류의 유산균 균주들의 혼합물을 108 내지 1012 cfu/g의 함량으로 포함하거나, 동등한 수의 생균을 가진 배양물을 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 상술한 유산균 이외에 락토바실루스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실루스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 비피도박테리움 브레브(Bifidobacterium breve), 비피토박테리움 락티스 (Bifidobacterium lactis), 비피도박테리움 롱굼(Bifidobacterium longum),
락토바실루스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius), 락토바실루스 시도필루스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실루스 브레비스(Lactobacillus brevis), 락토바실루스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus), 락토바실루스 퍼멘툼(Lactobacillus fermentum), 락토바실루스 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실루스 델브루에키(Lactobacillus delbrueckii), 락토바실루스 레우테리(Lactobacillus reuteri), 락토바실루스 부츠네리(Lactobacillus buchneri), 락토바실루스 가세리(Lactobacillus gasseri), 락토바실루스 존스니(Lactobacillus johonsonii), 락토바실루스 케피르(Lactobacillus kefir), 락토코쿠스 락티스(Lactococcus lactis), 비피도박테리움 비피듐(Bifidobacterium bifidum), 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis), 비피도박테리움 수도롱굼(Bifidobacterium pseudolongum), 비피도박테리움 서모필룸 (Bifidobacterium themophilum), 비피도박테리움 아돌센티스 (Bifidobacterium adolescentis)로 구성되는 군에서 선택되는 1종 이상의 유산균을 추가로 포함할 수 있다.
상기 유산균 균주들은 유산균을 위한 일반적인 배양 방법으로 성장되고, 원심분리 같은 분리 과정으로 회수되며, 건조, 예컨대, 동결건조에 의해 생균제 형태로 제조하여 이용될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 하나 이상의 칼슘 보충제와 하나 이상의 마그네슘 보충제를 포함하는 무기질 혼합물을 포함한다. 상기 칼슘 보충제는 바람직하게는 칼슘 원소 및 칼슘 화합물로부터 선택된다. 칼슘 화합물은 칼슘 옥사이드 및 유기 또는 무기산의 칼슘염으로부터 선택될 수 있다. 바람직한 칼슘염의 예로는 탄산칼슘과 같은 무기산의 칼슘염, 구연산칼슘, 젖산칼슘, 글루콘산칼슘과 같은유기산의 칼슘염, 특히 글리신산칼슘, 라이신산칼슘과 같은 아미노산의 칼슘염을 예로 들 수 있으나, 반드시 이들로 제한되는 것은 아니다.
상기 마그네슘 보제는 바람직하게는 마그네슘 원소 및 마그네슘 화합물로부터 선택된다. 마그네슘 화합물로, 마그네슘 옥사이드 및 유기 또는
무기산의 마그네슘염이 보편적으로 사용된다. 바람직한 마그네슘염의 예로는, 마그네슘 글리세로포스페이트 및 염화마그네슘과 같은 무기산의 마그네슘염, 구연산마그네슘, 젖산마그네슘 및 글루콘산마그네슘과 같은 유기산의 마그네슘염, 특히 글리신산마그네슘 및 타우린산마그네슘과 같은 아미노산의 마그네슘염을 예시할 수 있으나, 반드시 이들로 제한되는 것은 아니다.
상기 무기질 혼합물 내의 마그네슘에 대한 칼슘의 중량비는 0.5:1 내지 4:1, 구체적으로, 1:1 내지 2:1일 수 있다. 본 발명의 조성물은 성인의 일일 칼슘 권장량의 40~80%, 즉, 50 내지 500 mg의 칼슘을 포함할 수 있고, 25 내지 500 mg의 마그네슘을 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 상술한 필수 유효 성분 뿐만 아니라 본 명세서에 기술되거나 기재되지 않은 영양 또는 약제학적 용도에 유용한 임의의 추가 또는 선택 성분을 포함할 수 있다. 이러한 다수의 선택 성분은 경구 투여에 안전하고 효과적이며 본 발명의 조성물의 필수 및 다른 선택 성분과 상용성이 있다면, 본 발명의 조성물에도 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 칼슘 보충제 및 마그네슘 보충제 이외에 1종 이상의 미량의 무기질(trace mineral)을 포함할 수 있는데, 그 예에는 아연, 셀레늄, 인, 나트륨, 클로라이드, 망간, 철, 구리, 요오드, 칼슘, 칼륨, 크롬, 몰리브덴, 바이오플라보노이드(bioflavonoid) 및 이들의 임의의 배합물이 있으나, 반드시 이들로 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 또한 1종 이상의 비타민을 함유하는 것이 바람직하며, 그 예로는 카로티노이드(예, 베타-카로틴, 제아잔틴, 루테인, 리코펜), 비오틴, 콜린, 이노시톨, 엽산, 판토텐산, 콜린, 비타민 A, 티아민(비타민 B1), 리보플라빈(비타민B2), 니아신(비타민 B3), 피리독신(비타민 B6), 시아노코발라민(비타민 B12), 아스코르브산(비타민 C), 비타민 D, 비타민E, 비타민 K 및 이의 다양한 염, 에스테르 또는 다른 유도체, 및 이들의 배합물이 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 이러한 비타민들은 칼슘 대사산물과 골기질(bone matrix)의 형성에 포함되며, 비타민 D와 C 또는 K 또는 엽산은 골생성에 요구된다.
본 발명의 조성물은 아르기닌, 시스테인, 및 카르니틴으로 구성되는 군에서 선택되는 성분을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 일실시예의 조성물은
칼슘 보충제 25 중량% ~40중량%,
마그네슘 보충제 2중량% ~ 10중량%,
스트렙토코쿠스 서모필루스 ST3(Streptococcus thermophilus ST3)(KCTC 11870BP) 0.5중량% ~ 10중량%,
락토바실루스 람노수스 LR3 (Lactobacillus rhamnosus LR3)(KCTC 11868BP) 0.5중량% ~ 10중량%,
락토바실루스 파라카제이 LPC4 (Lactobacillus paracasei LPC4) (KCTC 11866BP) 0.5중량% ~ 10중량%, 및
잔량의 부형제를 포함할 수 있다.
비타민과 미량의 무기질들을 모두 포함하는 또 다른 예의 본 발명의 골다공증 예방 또는 치료용 조성물은
400 mg 내지 2,500mg의 칼슘 보충제;
30mg 내지 60 mg의 마그네슘 보충제;
7.5mg 내지 150mg의 스트렙토코쿠스 서모필루스 ST3(Streptococcus thermophilus ST3 )(KCTC 11870BP);
7.5mg 내지 150mg의 락토바실루스 람노수스 LR3 (Lactobacillus rhamnosus LR3)(KCTC 11868BP); 및
7.5mg 내지 150mg의 락토바실루스 파라카제이 LPC4(Lactobacillus paracasei LPC4) (KCTC 11866BP)
25mg 내지 500mg의 철;
25mg 내지 500mg의 비타민 C 화합물을 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 상기 유효 성분 이외에 통상적인 제약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 부형제를 추가로 포함할 수 있으며, 이 외에도 바인더, 분해제, 코팅제, 윤활제, 방부제, 산화방지제, 완충제, 다른 약제학적 활성제, 감미료, 착색제, 향미료, 향미료 증강제, 증점제 및 안정화제, 유화제 등과 같은 제약학적으로 통상적으로 사용되는 다양한 선택 성분들과 함께 제형화되어 조제될 수 있다.
본 발명의 조성물은 칼슘 보충제 및 마그네슘 보충제를 포함하는 무기질 혼합물 및 상기 세 종류의 유산균들과 적절한 담체, 부형제, 보조 유효 성분 등과의 혼합에 의하여 당업계에 공지된 방법을 이용하여 분말제, 과립제, 정제, 테블릿, 캡슐, 환약 또는 액상의 형태로 제형화될 수 있다.
본 발명에서 사용가능한 부형제는 수크로오스, 락토오스, 만니톨, 글루코오스 등과 같은 설탕 및 옥수수 전분, 감자 전분, 쌀 전분, 부분적으로 전젤란틴화된 전분 등의 전분을 포함한다. 바인더는 덱스트린, 소듐알지네이트, 카라지난, 구아검, 아카시아, 아가 등의 폴라사카라이드, 트라가칸트, 젤라틴, 글루텐 등의 천연-발생 거대분자 물질, 히드록시프로필셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 히드록시프로필에틸셀룰로오스, 카복시메틸셀룰로오스소듐 등의 셀룰로오스 유도체 및 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐알코올, 폴리비닐아세테이트, 폴리에틸렌글리콜, 폴리아크릴산, 폴리메타크릴산 및 비닐아세테이트 수지 등의 고분자를 포함한다.
분해제로는 카복시메틸셀룰로오스, 카복시메틸셀룰로오스칼슘, 저치환 히드록시프로필셀룰로오스 등의 셀룰로오스 유도체 및 소듐카복시메틸 전분, 히드록시프로필 전분, 옥수수 전분, 감자 전분, 쌀 전분 및 부분적으로 전젤라틴화된 전분 등의 전분을 사용할 수 있다.
본 발명에서 사용가능한 윤활제의 예들은 활석, 스테아르산, 칼슘스테아레이트, 마그네슘스테아레이트, 콜로이드성 실리카, 히드로스실리콘다이옥사이드, 다양한 종류의 왁스 및 히드로게네이티드 오일 등을 포함한다.
코팅제로는 디메틸아미노에틸메타크릴레이트-메타크릴산 공중합체, 폴리비닐아세탈디에틸아미노아세테이트, 에틸아크릴레이트-메타크릴산 공중합체, 에틸아크릴레이트-메틸메타크릴레이트-클로로트리메틸암모늄에틸메타크릴레이트 공중합체, 에틸셀룰로오스 등의 수불용성 중합체, 메타크릴산-에틸아크릴레이트 공중합체, 히드록시프로필메틸셀룰로오스프탈레이트, 히드록시프로필메틸셀룰로오스아세테이트석시네이트 등의 장성 중합체 및 메틸셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 폴리에틸렌글리콜 등의 수용성 중합체를 포함하나, 반드시 이들로 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 경구용으로 제형화되는 경우에 유산균들이 위산 또는 담즙 산에 의해 사멸되어 본래의 생리활성 기능을 소실하지 않고, 소장에서 충분히 분해되어 활성성분이 소장 내에 방출될 수 있도록 장용 코팅될 수 있다. 일례로 본 발명의 조성물에는 단백질 및 다당류로 2중 코팅된 유산균이 이용될 수 있고, 필요에 따라서 2중 코팅된 유산균 위에 나노입자 코팅층이 형성된 3중 코팅된 유산균이 이용될 수 있다. 2중 코팅된 유산균은 단백질 수용액에 단백질 분해효소제를 가하여 효소 처리한 후, 효소 처리된 단백질 수용액에 포도당, 효모추출물, 육엑기스, 이온성분 및 유산균을 첨가한 후 발효시켜 단일 코팅된 유산균을 제조하고나서, 단일 코팅된 유산균에 다당류 수용액을 코팅하여 제조할 수 있다. 3중 코팅된 유산균은 2중 코팅된 유산균에 나노입자를 코팅하여 제조할 수 있다.
본 발명의 골다공증 예방 또는 치료용 조성물에서 유효성분인 상기 유산균 균주들의 투여량은 치료나 예방의 목적, 치료 또는 예방하려는 환자의 종류, 환자의 증상, 체중, 연령이나 성별 등을 고려하여 적절하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 성인 환자의 경우, 1× 106 살아있는 세포 이상, 바람직하게는 1× 108 내지 1 × 1012 살아있는 세포가 필요에 따라 한번 또는 나눠서 투여될 수 있다.
각각의 환자의 특정한 복용량은 다양한 요인, 예를 들면, 적용되는 특정 화합물의 활성, 나이, 체중, 일반적인 건강 상태, 성, 식이, 투여시간 및 경로, 배설율, 의약 물질의 조합 및 치료되는 특정 질환의 심각성에 의존한다.
본 발명의 유산균 함유 골다공증 예방 또는 치료용 조성물은 사람 또는 동물에 약품 또는 식품으로 투여 또는 섭취될 수 있다. 본 발명의 유산균 함유 골다공증 예방 또는 치료용 조성물을 함유하는 약품은 본 발명의 하나의 실시형태이고, 본 발명의 유산균 함유 골다공증 예방 또는 치료용 조성물을 함유하는 식품 또한 본 발명의 다른 실시형태이다. 이러한 식품의 예로는 요구르트 및 유제품을 들 수 있지만, 반드시 이들로 제한되는 것은 아니다.
이하에서 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해서 한정되는 것은 아니다.
실시예
1. 스트렙토코쿠스 서모필루스 ST3 ( Streptococcus thermophilus ST3 ) ( KCTC 11870BP)의 동정 및 특성화
1-1. 미생물 분리
목장에서 채취한 산양유를 멸균 혐기수에 연속 희석법으로 희석한 후 각 희석액 1㎖을 ManRogosaSharpe(MRS. BD. USA) 고체 배지에 부어 혐기 조건에서 37℃에서 3일간 배양하였다. 생성된 콜로니를 다시 MRS에 BCP (Bromocresol purple, 0.17g/L)를 첨가한 락토바실루스 선택배지에 골라낸 후 같은 조건에서 다시 3일간 배양하였다. 상기 배지에서 유산균을 선별하여 생화학적, 분자생물학적 동정을 진행하였고, 이후 균주의 물리적 특성이 가장 우수한 균주 1종을 최종 선발하였다.
1-2. 미생물의 동정
1) 당 이용성 분석
분리한 균주에 대해 API CHL50 키트를 이용하여 당 이용성을 확인하였다. 분리된 균주의 당 이용성은 하기 표 1에 나타내었다. 당 이용도를 바탕으로 한 생화학적 특성은 락토바실루스 델브루에키 락티스(Lactobacillus delburueckii spp lactis) 및 스트렙토코쿠스 서모필루스(Streptococcus thermophilus)와 유사한 것으로 나타났으나, 분리된 균주가 형태상으로 구균 형태이기 때문에 스트렙토코쿠스 서모필루스(S. thermophilus)로 동정하였다.
기질 반응 기질 반응
에스쿨린 -
글리세롤 - 살리신 -
에리트리톨 - 셀로비오스 -
D-아라비노오스 - 말토오스 -
L-아라비노오스 - 락토오스 +
리보오스 - 멜리비오스 -
D-자일로스 - 사카로오스 +
L-자일로스 - 트레할로오스 -
안도니톨 - 이눌린 -
β-메틸-자일로사이드 - 멜레지토오스 -
갈락토오스 + D-라피노오스 -
D-글루코오스 + 아미돈 -
D-프럭토오스 + 글리코겐 -
D-만노오스 + 자일리톨 -
L-소르보오스 - β-겐티오비오스 -
람노오스 - D-투라노오스 -
덜시톨 - D-릭소오스 -
이노시톨 - D-타가토오스 -
만니톨 - D-푸코오스 -
소르비톨 - L-푸코오스 -
α-메틸-D-만노사이드 - D-아라비톨 -
α-메틸-D-글루코사이드 - L-아라비톨 -
N-아세틸 글루코사민 - 글루코네이트 -
아미그달린 - 2-케토-글루코네이트 -
알부틴 - 5-케토-글루코네이트 -
2) 16s rRNA 동정
분리된 균주로부터 지놈 DNA를 추출하여 16s rRNA 염기서열을 분석하였다. 분리한 DNA를 주형으로 16s rRNA 영역을 프라이머 F (5‘-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3’)와 프라이머 R (5‘-AAGGAGGTGATCCAGCC 3’)을 이용하여 PCR (MyCycler, BIO-RAD, USA)을 수행하였다. PCR 산물은 pGEM-Teasy 벡터(Promega, USA)에 연결하여, 이. 콜라이(E. coli) 균주 DH5α에 형질전환시킨 후 LB/x-gal/amp 플레이트에 도말하여 37℃에서 밤새 배양하였다. 스크리닝을 통하여 형질전환체로부터 삽입체(insert)를 포함하는 재조합 플라스미드를 분리한 후, DNA 시퀀싱을 진행하였다. DNA 염기서열 분석은 DNA star program의 Cluster V 방법을 이용하여 스트렙토코쿠스 서모필루스T(S. thermophilus T)(ATCC19258) 균주와의 상동성를 확인하였다. 본 발명의 스트렙토코쿠스 서모필루스 ST3 균주(KTCC )와 스트렙토코쿠스 서모필루스T(ATCC19258) 유산균의 16s rRNA 서열을 비교하여 보면, 분리 균주의 16s rRNA 염기서열은 스트렙토코쿠스 서모필루스T(ATCC19258)와 99.5%의 상동성을 보여, 분리 균주가 스트렙토코쿠스 서모필루스 종에 속하는 균주임을 확인하였다.
3) RAPD ( Random Amplified Polymorphic DNA ) 분석
분리된 균주로부터 지놈 DNA를 추출하여, 분리한 DNA를 주형으로 (GTG)5 (5’- GTGGTGGTGGTGGTG 3’) 프라이머를 이용하여 PCR-RAPD (MyCycler, BIO-RAD, USA)를 수행하였으며, PCR 산물은 Et-Br(Ethidium bromide)로 염색 후 G:BOX (SYNGENE, UK)로 관찰하였다. 분리된 균주의 밴드 패턴은 스트렙토코쿠스 서모필루스T(ATCC 19258)와 유사하지만, 동일한 균주가 아님을 확인하였다.
위 결과를 토대로 상기 균주를 “락토바실루스 서모필루스 ST3(Streptococcus thermophilus ST3)로 명명하고, 2011년 3월 2일자로 대한민국 특허균주 기탁기관인 미생물자원센터(KCTC)에 기탁하여 수탁번호 KCTC11870BP를 부여받았다.
1-3. 내산성 평가
내산성 평가는 MRS 액체 배지에서 사전 배양된 스트렙토코쿠스 서모필루스 ST3을 인공 위액 (NaCl 2g, 펩신 3.2g, 진한 염산 5.8㎖/1L, pH=2.1) 10㎖에 1% 접종 후 30분 단위로 2시간 동안 MRS 고체배지에서 생균수를 측정하였다. 내산성 평가 결과 본 발명의 분리 균주인 스트렙토코쿠스 서모필루스 ST3은 산성 조건에서도 안정하게 생균수가 유지되고 있어, 균주의 내산성을 확인할 수 있었다.
1-4. 항생제 내성
항생제 내성 평가는 European Food Safety Authority (EFSA) 에서 추천하는 micro-dilution 방법을 이용하여 수행하였으며, 각 항생제는 Sigma 및 Fluka사로부터 구입하여 사용하였다.
항생제의 농축액은 MRS 배지를 이용하여 256, 128, 64, 32, 16, 8, 4, 2, 1, 0.5 μg/㎖의 농도로 희석하였으며, 항생제가 포함된 희석액을 96 웰 플레이트에 100 ㎕씩 분주하고 MRS 액체 배지에서 사전 배양된 스트렙토코쿠스 서모필루스 ST3을 1% 접종 후 37℃ 에서 16시간 배양 후 성장도를 측정함으로써 각 항생제 별 최소성장저해농도 (Minimal Inhibition Concentration, MIC)를 측정하였다. 실험의 오차를 줄이기 위하여 모든 실험은 3 세트로 구성하였고, 이들의 평균값을 취한 후 최소성장저해농도(MIC)값을 최종 측정하였다.
각 균주에 대한 MIC는 다음의 방법으로 결정하였다. 실험군과 동일한 실험시간에 항생제가 포함되지 않은 MRS 배양액 100㎕에 균주를 1% 접종한 후 곧바로 -4℃에 보관하였다. 16시간 후 -4℃에서 균주의 성장을 억제시킨 군의 OD값을 기준으로 하여 실험군에서 그 이하의 OD값을 보이는 항생제의 농도를 MIC로 정의하였다. 본 발명의 스트렙토코쿠스 서모필루스 ST3 균주의 각 항생제에 대한 MIC 값을 하기 표 2에 나타내었다. 스트렙토코쿠스 서모필루스 ST3는 세포벽 합성 및 단백질 합성을 저해하는 항생제에 대해서 대분분 낮은 농도에서 생육이 억제되었다.
항생제 최소 성장 저해 농도(MIC)
암피실린(AMP) <0.5
카나마이신(KAN) <32
클로람페니콜(CP) <0.5
반코마이신(VAN) <0.5
젠타마이신(GEN) <8
테트라사이클린(TET) <0.5
네오마이신(NM) <64
스트렙토마이신(ST) <16
2. 락토바실루스 람노수스 LR3 ( Lactobacillus rhamnosus LR3 ( KCTC 11868 BP ))의 동정 및 특성화
2-1.미생물의 분리
목장에서 채취한 산양유를 멸균 혐기수에 연속 희석법으로 희석한 후 각 희석액 1㎖을 ManRogosaSharpe(MRS. BD. USA) 고체 배지에 부어 혐기 조건에서 37℃에서 3일간 배양하였다. 생성된 콜로니는 다시 유산균 선택 배지인 MRS에 BCP (bromocresol purple, 0.17g/L)를 첨가한 고체배지에 집어낸 후 같은 조건에서 다시 3일간 배양하였다. 상기 배지에서 유산균을 선별하여 생화학적, 분자생물학적 동정을 진행하였고, 이후 균주의 물리적 특성이 가장 우수한 균주 1종을 최종 선발하였다.
2-2. 미생물의 동정
1) 당 이용성 분석
상기와 같이 선별 분리된 유산균 균주는 API CHL50 키트로 분석한 결과, 하기 표 3에서와 같이, 락토바실루스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus)와 99.6% 유사한 생화학적 특성을 가지는 것으로 동정되었다.
기질 반응 기질 반응
에스쿨린 +
글리세롤 - 살리신 +
에리트리톨 - 셀로비오스 +
D-아라비노오스 - 말토오스 +
L-아라비노오스 - 락토오스 +
리보오스 + 멜리비오스 -
D-자일로스 - 사카로오스 -
L-자일로스 - 트레할로오스 +
안도니톨 - 이눌린 -
β-메틸-자일로사이드 - 멜레지토오스 +
갈락토오스 + D-라피노오스 -
D-글루코오스 + 아미돈 -
D-프럭토오스 + 글리코겐 -
D-만노오스 + 자일리톨 -
L-소르보오스 - β-겐티오비오스 +
람노오스 + D-투라노오스 -
덜시톨 - D-릭소오스 -
이노시톨 + D-타가토오스 +
만니톨 + D-푸코오스 -
소르비톨 + L-푸코오스 -
α-메틸-D-만노사이드 - D-아라비톨 -
α-메틸-D-글루코사이드 + L-아라비톨 -
N-아세틸 글루코사민 + 글루코네이트 +
아미그달린 + 2-케토-글루코네이트 -
알부틴 + 5-케토-글루코네이트 -
2) 16s rRNA 동정
분리된 균주의 순수 배양액 1㎖에서 Accuprep 지놈 추출 키트 (Bioneer, Korea)를 이용하여 지놈 DNA를 추출하였다. 추출한 DNA를 주형으로 16s rRNA 영역을 프라이머 F (5‘-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3’)와 프라이머 R (5‘-AAGGAGGTGATCCAGCC 3’)을 이용하여 PCR (MyCycler, BIO-RAD, USA)을 수행하였다.
PCR 산물은 pGEM-Teasy 벡터 (Promega, USA)에 연결한 후 E.coli DH5α에 형질전환시킨 후 X-gal 및 암피실린을 포함하는 LB 평판에 도말하여 37℃에서 약 16시간 배양하였다. LB 평판 상에 자라난 콜로니로부터 PCR 산물을 포함하는 재조합 플라스미드를 분리한 후, DNA 시퀀싱을 진행하였다. DNA 염기서열 분석은 DNA star program의 Cluster V 프로그램을 이용하여 엘. 람노수스T(L. rhamnosusT )(ATCC 7469)와 상동성을 확인하였다. 락토바실루스 람노수스 LR3 (Lactobacillus rhamnosus LR3)(KCTC 11868BP)와 락토바실루스 람노수스T (ATCC7469) 균주의 16S rRNA 서열을 비교한 결과, 분리 균주의 16s rRNA 염기서열은 엘. 람노수스T(L. rhamnosusT ) (ATCC 7469)와 99.2%의 상동성을 보여, 상기 분리 균주가 락토바실루스 람노수스 종에 속하는 균주임을 확인하였다.
3) RAPD ( Random Amplified Polymorphic DNA ) 분석
락토바실루스 람노수스 LR3 균주로부터 지놈 DNA를 추출한 후 이를 주형으로 하고 (GTG)5 (5’- GTGGTGGTGGTGGTG 3’)를 프라이머로 이용하여 PCR-RAPD (MyCycler, BIO-RAD, USA)를 수행하였다. PCR 산물은 0.8% 아가로스 겔 상에서 전기영동한 후 EtBr로 염색하여 G:BOX (SYNGENE, UK)로 관찰하였다. 상기 락토바실루스 람노수스 LR3의 RAPD 밴드 패턴은 엘. 람노수스T(L. rhamnosus T)(ATCC 7469)와 상이하게 나타났으며, 이러한 결과로부터 두 균주가 동일 균주가 아닌 것을 확인할 수 있었다.
위 결과를 토대로 상기 분리된 균주는 락토바실루스 람노수스 LR3(Lactobacillus rhamnosus LR3)로 명명하였으며, 2011년 3월 2일자에 대한민국 특허균주 기탁기관인 미생물자원센터(KCTC)에 기탁하여 수탁번호 KCTC11868BP를 부여받았다.
2-3. 내산성 및 내담즙성 평가
내산성 평가는 MRS 액체 배지에서 사전 배양된 락토바실루스 람노수스 LR3를 인공위액 (NaCl 2g, 펩신 3.2g, 진한 염산 5.8㎖/1L, pH=2.1) 10㎖에 1% 첨가한 후 2시간 동안 방치하였다. 이 기간 중 30분 단위로 일정량을 취하여 MRS 고체배지에서 도말하여 생균수를 측정함으로써 내산성을 측정하였다.
내담즙성 평가는 MRS 액체 배지에서 사전 배양된 락토바실루스 람노수스 LR3를 oxgall (0%, 0.25%, 0.5%, 0.75%, 1%)이 포함된 MRS에 1% (v/v) 되도록 접종한 후 2시간 방치하였다. 이 후 20분 간격으로 일정량을 취하여 MRS 평판에 도말하여 생균수를 측정하였다. 내산성 및 내담즙성 평가에서 락토바실루스 람노수스 LR3는 두 조건에서 안정하게 생균수가 유지되고 있어, 상기 분리된 균주의 내산성 및 내답즙성이 우수함을 확인할 수 있었다.
2-4. 장 정착성 평가
락토바실루스 람노수스 LR3의 장 정착성에 대한 평가는 사람의 장상피 세포인 Caco2를 이용하였고, 락토바실루스 람노수스 GG를 대조군으로 사용하였다. Caco2 세포주에 락토바실루스 람노수스 LR3를 1시간 처리 후 생균수를 측정함으로써 두 균주의 장 정착능력을 비교하였다. 장 정착성이 좋은 균주로 알려진 락토바실루스 람노수스 GG는 75.2%의 정착성을 보인 반면, 락토바실루스 람노수스 LR3는 86.4% 보여 약 10% 정도 더 우수한 장 정착성을 나타내었다.
이상에서 확인한 바와 같이, 본 발명의 락토바실루스 람노수스 LR3 (Lactobacillus rhamnosus LR3 (KCTC 11868BP)) 균주는 엘. 람노수스T(L. rhamnosus T)(ATCC 7469)와 분자생물학적으로 차이를 보이는 신규 균주이다. 본 발명의 락토바실루스 람노수스 LR3 균주는 내산성과 내담즙성이 우수하여 섭취 후 위장을 거쳐 소장 및 대장까지 도달할 가능성이 높을 것으로 판단된다. 특히 장 정착성이 좋은 균주로 알려진 락토바실루스 람노수스 GG (Lactobacillus rhamnosus GG) 보다 우수한 정착성을 나타내기 때문에 프로바이오틱스 (probiotics)로서 더 우수한 효과를 나타낼 수 있다.
3. 락토바실루스 파라카제이 LPC4 ( Lactobacillus paracasei LPC4 ) KCTC 11866 BP 의 동정 및 특성화
3-1. 미생물 분리
목장에서 채취한 산양유를 멸균 혐기수에 연속 희석법으로 희석한 후 각 희석액 1㎖을 ManRogosaSharpe(MRS. BD. USA) 고체 배지에 부은 후 혐기 조건에서 3일간 배양하였다. 생성된 콜로니는 다시 유산균 선택배지인 MRS에 BCP(Bromocresol purple, 0.17g/L)를 첨가한 고체배지에 집어낸 후 같은 조건에서 다시 3일간 배양하였다. 상기 배지에서 유산균을 선별하여 생화학적, 분자생물학적 동정을 진행하였고, 이후 균주의 물리적 특성이 가장 우수한 균주 1종을 최종 선발하였다.
3-2. 미생물의 동정
1) 당 이용성 분석
상기와 같이 선별 분리된 유산균 균주는 API CHL50 키트로 분석한 결과, 하기 표 4에서와 같이, 락토바실루스 파라카제이(L. paracasei spp paracasei (API50CHL)와 95.2% 유사한 생화학적 특성을 가지는 것으로 동정되었다.
기질 반응 기질 반응
- 에스쿨린 +
글리세롤 - 살리신 +
에리트리톨 - 셀로비오스 +
D-아라비노오스 - 말토오스 +
L-아라비노오스 - 락토오스 +
리보오스 + 멜리비오스 -
D-자일로스 - 사카로오스 +
L-자일로스 - 트레할로오스 +
안도니톨 - 이눌린 +
β-메틸-자일로사이드 　 멜레지토오스 +
갈락토오스 + D-라피노오스 -
D-글루코오스 + 아미돈 -
D-프럭토오스 + 글리코겐 -
D-만노오스 + 자일리톨 -
L-소르보오스 + β-겐티오비오스 +
람노오스 - D-투라노오스 +
덜시톨 + D-릭소오스 +
이노시톨 + D-타가토오스 +
만니톨 + D-푸코오스 -
소르비톨 + L-푸코오스 -
α-메틸-D-만노사이드 - D-아라비톨 -
α-메틸-D-글루코사이드 + L-아라비톨 -
N-아세틸 글루코사민 + 글루코네이트 +
아미그달린 + 2-케토-글루코네이트 -
알부틴 + 5-케토-글루코네이트 -
2) 16s rRNA 동정
분리된 균주의 순수 배양액 1㎖에서 Accuprep 지놈 추출 키트(Bioneer, Korea)를 이용하여 지놈 DNA를 추출하였다. 추출한 DNA를 주형으로 16s rRNA 영역을 프라이머 F (5‘-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3’)와 프라이머 R (5‘-AAGGAGGTGATCCAGCC 3’)를 이용하여 PCR (MyCycler, BIO-RAD, USA)을 수행하였다.
PCR 산물은 pGEM-Teasy vector(Promega, USA)에 연결한 후 이. 콜라이 균주 DH5α에 형질전환시킨 후 LB/x-gal/amp 플레이트에 도말하여 37℃에서 밤새 배양하였다. 스크리닝을 통하여 형질전환체로부터 삽입체를 포함하는 재조합 플라스미드를 분리한 후, DNA 시퀀싱을 진행하였다. DNA 염기서열 분석은 DNA star program의 Cluster V 방법을 이용하여 락토바실루스 파라카제이 분리주 아키랄(Lactobacillus paracasei subsp. paracasei isolate Akira1)과 본 발명의 균주의 16S rRNA 서열을 비교하였다. 상기 분리된 균주의 16s rRNA 염기서열은 락토바실루스 파라카제이 분리주 아키랄(Lactobacillus paracasei subsp. paracasei isolate Akira1)과 99.7%의 상동성을 보여, 상기 분리 균주가 락토바실루스 파라카제이 종에 속하는 균주임을 확인하였다.
3) RAPD ( Random Amplified Polymorphic DNA ) 분석
순수 배양된 락토바실루스 파라카제이 LPC4에서 지놈 DNA를 추출하여, 분리한 DNA를 주형으로 (GTG)5 (5’- GTGGTGGTGGTGGTG 3’) 프라이머를 이용하여 PCR-RAPD (MyCycler, BIO-RAD, USA)를 수행하였으며, PCR 산물은 Et-Br로 염색 후 G:BOX (SYNGENE, UK)로 관찰하였다. 본 발명에서 분리된 락토바실루스 파라카제이 LPC4 균주의 DNA 밴드 패턴은 락토바실루스 파라카제이T(L. paracasei T (ATCC 25302)와 다르게 나타았으며, 이 결과로 두 균주가 동일 균주가 아닌 것을 확인할 수 있었다.
위 결과를 토대로 본 발명에서 분리된 균주는 락토바실루스 파라카제이 LPC4(Lactobacillus paracasei LPC4)로 명명하였으며, 2011년 3월 2일자에 대한민국 특허균주 기탁기관인 미생물자원센터(KCTC)에 기탁하여 수탁번호 KCTC11866BP를 부여받았다.
3-3. 내담즙성 평가
상기 락토바실루스 파라카제이 LPC4 균주에 대한 내담즙성 평가는 MRS 액체 배지에서 사전 배양된 락토바실루스 파라카제이 LPC4를 Oxgall 농도가 다르게 첨가된 MRS 액체 배지에 1% 접종하였고, 접종 2시간 경과 후 MRS 고체 배지를 이용하여 생균수를 측정하였다. 이때 사용한 Oxgall 농도는 0%, 0.25%, 0.5%, 0.75%, 1%이다. 내담즙성 평가 결과, 분리 균주인 락토바실루스 파라카제이 LPC4는 다양한 Oxgall 농도에서 안정하게 생균수가 유지되고 있음을 확인할 수 있었다.
4. 난소절제 모델을 이용한 동물실험
( 1) 유산균 분말의 제조
본 발명의 조성물에 포함되는 유산균 균주의 배양을 위한 발효 배지는 탈지분유와 대두 분리 단백질을 각각 단독 혹은 혼합하여 1%-10% (w/v) 수용액으로 만든 후 스트렙토코쿠스 서모필루스 ST3 및 락토바실루스 람노수스 LR3에 대해서 단백질 대비 0.01%-1% (w/w) 범위의 단백분해 효소 (Delvolase; DSM, 네덜란드) 용액을 가하여 효소처리하였다. 락토바실루스 파라카제이 LPC4의 유산균종에 대해서는 효소처리 단계를 생략하였다.
효소처리 후 상기 효소처리 반응액에 0.1%-5% (w/v) 범위의 포도당, 유당, 과당, 혹은 자당 등의 당류, 0.1%-5% (w/v) 범위의 효모추출물, 0.1%-5% (w/v) 범위의 소이펩톤, 0.01%-0.1% (w/v) 범위의 암모니움 시트레이트, 소디움 아세테이트, 디포타시움 포스테이트, 마그네슘 설페이트, 망간 설페이트, 소디움 클로라이드의 이온성분을 첨가하고 용해시켜 유산균 배양배지를 준비하였다. 준비된 유산균 배양배지는 열교환기 (Heat exchanger)를 이용하여 살균하였다.
상기 배양 배지 성분에서 전배양한 유산균 종균을 0.1%-1% (v/v) 농도로 배양 배지에 접종하고 37℃, pH 5.0-6.0 범위에서 유지되도록 하여 유산균종에 따라 8시간-18시간 동안 발효배양하였다. 유산균 배양이 종료된 후 유산균체를 연속식 원심분리기(Separator)를 이용하여 분리 및 농축하였다. 분리된 유산균체는 동결보호제 등을 첨가하여 동결건조시킨 후 분쇄기를 이용하여 유산균체를 분쇄하여 일정한 입도를 가지게 한 후 유산균 원말로 제조하였다.
전단계에서 수득된 유산균 원말은 다음과 같은 생균수를 가지는 것으로 측정되었다:
스트렙토코쿠스 서모필루스 ST3 유산균 (1X1011 CFU/g 이상),
락토바실루스 람노수스 LR3 유산균 (1X1011 CFU/g 이상),
락토바실루스 파라카제이 LPC4 유산균 (1X1011 CFU/g 이상).
( 2) 동물 및 실험 디자인
본 실험예에서는 난소 절제로 인한 에스트로겐 결핍 및 칼슘 결핍 사료에 의해 유도된 조건의 골다공증 생체내 실험(in vivo) 모델에 대하여 칼슘-마그네슘이 풍부한 해조류로부터 추출된 멀티미네랄 보충제 및 3 종류의 유산균(락토바실루스 카제이, 락토바실루스 람노누스, 스트렙토코쿠스 서모필루스)의 병용 투여 효능을 여러 가지 대조군과 비교 평가하였다
본 실험예에는 난소절제되어, 골감소증 유도된 암컷 실험쥐(OVX) 및 이와 비교되는 거짓수술된 정상군(SHAM)이 포함되고, 이들 모두에게 칼슘 보충제, 마그네슘 보충제 및 유산균의 여러 배합물을 함유하는 조성물을 14주간 경구 투여하였다.
동물(암컷 실험쥐)에게는 검사 조성물을 투여하기 전에 골감소증의 유도를 위하여 거짓 수술을 하거나 난소를 절제하였다. 실험 동물은 출생 6주된 암컷 Sprague Dawley Rat 36마리로, SLC사에서 구입하였다. 이들 중에 30마리는 난소절제되고, 6마리는 거짓 수술한 정상군(sham-operated)이다. 칼슘결핍 식이요법을 위하여, 칼슘 제거된 시료가 사용되었으며 무기질 혼합물과 유산균이 Marigot사 (Ireland) 와 쎌바이오텍사로부터 제공되었다.
실험 동물들을 실험실에 도착 후 1주일간 환경에 적응시켰고, 이 기간 동안 특별한 증상을 보이지 않는 동물들만 실험에 사용하였다. 적응기간 동안, 동물들은 온도는 섭씨 22± 2도, 상대습도 50± 20퍼센트, 명/암 사이클은 12시간/12시간에서 사육하였다. 시판되는 설치류 사료 및 물은 자유롭게 섭취할 수 있게 하였다.
동물들은 실험 목적에 따라 하기 표 5에 표기된 바와 같이 각 그룹당 5 마리씩 6개의 그룹으로 분류하였다. 비교예 3의 OVX 그룹은 난소를 수술로 제거하였고, 비교예 4의 LAB 그룹 및 비교예 5의 MIN 그룹은 식염수에 의해서 희석되거나 비히클로 채워진 LAB와 MIN는 구강을 통하여 투여되었다. 실험기간 동안, 정상군과 비교예 2, 비교예 3(OVX)들에는 동일한 양과 루트의 생리식염수만이 투여되었다.
구분 실험 재료 동물 식사
실시예 1 (LAB+MIN) 무기질 혼합물+유산균 난소절제 칼슘 결핍
비교예 1 (Sham) 비히클 거짓 절제 정상
비교예 2(Ca_D) 비히클 거짓 절제 칼슘 결핍
비교예 3 (OVX) 비히클 난소 절제 칼슘 결핍
비교예 4 (LAB) 유산균 난소 절제 칼슘 결핍
비교예 5 (MIN) 무기질 혼합물 난소 절제 칼슘 결핍
실시예 1에서는 각 유산균종을 동일한 비율로 혼합하여 총 생균수 1X107 CFU/kg이 되도록 투여하고, 탄산칼슘, 탄산마그네슘, 철을 포함하는 해조류에서 추출된 무기질 혼합물을 50mg/kg으로 경구로 강제투여하였다.
비교예 3-5, 및 실시예 1의 난소를 수술로 제거한 동물 모델의 에스트로겐 결핍 골감소증의 존재를 확실히 하기 위하여 수술로 난소를 제거한 후 1개월 경과 후에 검사 조성물의 투여를 시작하였다.
(3) 체중 변화 분석
검사 조성물의 투여 개시 후 14주 동안 정기적으로 1주일에 한 번씩 체중의 변화를 측정하여 비교 평가하였다. 14주 간의 체중 변화를 도 1에 그래프로 나타내었고, 14주 검사 후의 체중 값을 하기 표 6에 나타내었다.
구분 체중(g)
실시예 1 (LAB+MIN) 356± 31
비교예 1 (Sham) 270± 19
비교예 2(Ca_D) 274± 14
비교예 3 (OVX) 347± 20
비교예 4 (LAB) 323± 14
비교예 5 (MIN) 363± 11
상기 표 6 및 도 1로부터 확인되는 바와 같이, 비교예 1(Sham)과 비교예 3(OVX)들 사이에서 상당한 체중의 차이가 나타났다. 반면에, 난소절제된 그룹(비교예 3 내지 비교예 5)들 사이에서는 비교예 3(OVX)이 비교예 4 보다 체중이 더욱 두드러진 변화를 보였으며, 다른 그룹들(비교예 5 및 실시예 1)은 비교예 3(OVX)만큼 두드러진 체중의 변화를 보이지는 않았다.
난소절제된 쥐에서 체중이 증가하는 것은 난소절제에 의해 유발된 에스트로겐 결핍으로 인한 지질단백질 분해효소의 활성도 감소 및 호르몬-감수성 리파제(HSL; hormone-sensitive lipase)의 감소로 인한 체지방 축적의 비-억제 때문에 나타난 것으로 보여진다.
(4) 혈청의 생화학적 분석
부갑상선 호르몬(parathyroid hormone)의 표적효소(target enzyme)그룹에 속하는 ALP(Alkaline Phosphatase)는 조골세포-분비 당단백질로서, 골 형성의 표지로 가장 널리 이용되고 있다. 따라서 실시예와 비교예의 조성물을 14주간 처리한 후에 실험쥐의 혈청 내의 ALP, 칼슘 및 IP(Ignore phosphorus)의 농도를 측정하여 비교평가하였다.
4개월간 상기 6 타입의 그룹에 대한 연구를 진행하고, 연구가 완료되었을 때, 쥐들은 디에틸에테르로 마취하여 쥐의 혈액을 채취하였다. 채취된 혈액을 4℃에서 1,000× g로 20분간 원심분리하여 혈청 시료를 회수한 후, 사용될 때까지 분취된 샘플을 ―70℃에서 보관하였다. Fuji DRI-CHEM 4000i(Fuji Photo Film Co., Ltd, 제품)를 이용하여 혈청 내의 칼슘, 무기인(IP), 알카린 포스파타제(ALP) 활성의 농도를 측정하여 하기 표 7에 나타내었다.
구분 ALP 값 (IU/L) CA(mg/dL) IP (mg/dL)
실시예 1 (LAB+MIN) 683± 46.7 10.8± 0.3 3.7± 0.5
비교예 1 (Sham) 593± 19.9 11.1± 0.7 5.2± 0.7
비교예 2(Ca_D) 666± 80.3 10.5± 0.3 4.4± 0.1
비교예 3 (OVX) 1159± 103.6 9.8± 0.2 5.8± 0.5
비교예 4 (LAB) 927± 63.4 10.1± 0.3 4.7± 0.2
비교예 5 (MIN) 880± 89.3 10.4± 0.2 3.9± 0.3
상기 표 7표 8과를 통해서 확인되는 바와 같이, 혈청의 생화학적인 분석결과, 비교예 3(OVX)은 비교예 1(Sham) 보다 알카린 포스파타제(ALP) 농도가 2배나 높았고, 또한 비교예 4(LAB) 및 비교예 5(MIN)에서도 높은 ALP 농도가 측정되었다. 특히, 실시예 1에서는 ALP 농도의 가장 급격한 감소를 보였다. 칼슘(CA) 및 무기인(IP) 농도 측정에서는, 비교예 1(Sham)과 비교예 3(OVX)간에 두드러진 차이가 없었고, 비교예 3(OVX)과 실시예 1 사이의 두드러진 차이는 없었다.
이런 결과들은 무기질 혼합물 및 세 종류의 유산균들이 각각 골다공증에 효능이 있다고 해도, 무기질 혼합물과 세 종류의 유산균 혼합물을 함께 투여하면 무기질 혼합물과 유산균들을 단독으로 투여하는 경우 보다 골다공증에 더 효과적임을 입증한다.
(5) 골 조직병리학 및 밀도측정법
경골 또는 대퇴골의 해면골조직의 조직병리학적 관찰은 뼈의 재구성(bone remodeling) 상태를 평가하는데 유용한데, 이는 골대사가 비정상적일 때 해면골조직은 1년에 25퍼센트의 골흡수율을 가지기 때문이다. 골조직의 미세구조에 무기질 혼합물 및/또는 유산균이 어떤 영향을 미치는지 조사하기 위해서, 대퇴골 원위 골단에서 해면골조직(TbB)의 형태학적인 변화를 관찰하였다.
난소절제후 1개월이 경화한 후부터 검사 물질을 14주 동안 경구 투여한 후에, 각 실험 동물로부터 대퇴골을 분리하여 10%의 NBF(중성 버퍼 포르말린)용액 내에 보관하였다. 골 조직병리학 연구는 다음과 같이 수행하였다: 표본을 고정시킨 후, 30mm의 단면적으로 대퇴골을 준비하여 10%의 질산 용액에 6시간 동안 넣어 석회질을 제거한다. 그 후 표본은 일반적인 조직 처리 과정을 이용하여 처리하고, 파라핀에 삽입한 후, 4μm의 두께로 절단하여 헤마톡실린과 에오신(H&E)으로 순차적으로 염색하였다. 골의 모폴로지는 올림퍼스 사의 광학 현미경으로 조사하여 도 2에 나타내었다.
대퇴부 골단의 해면골조직(trabecular)의 미세구조를 Explore Locus SP Pre-clinical Specimen Micro-CT (GE Healthcare, USA)를 사용해 조사하였다. 골무기질량 및 골밀도를 측정하기 위하여, 경골을 10%의 NBF 용액 내에 고정하여 처리한 후, 복셀 크기 0.1x0.1x1㎣ 크기로 XCT Research SA+ (Stratec, Germany)로 스캐닝하였다. 각각의 경골에 대해서 뼈끝 연골의 2mm 떨어진 곳부터 시작하여 0.2mm 간격으로 이격된 4개의 연속된 슬라이스를 스캐닝하였다.
도 2에서 A는 비교예 1(거짓수술된 정상군)의 결과이고, B는 비교예 2(거짓수술되고 칼슘 결핍 식이가 제공된 그룹)의 결과이며, C는 비교예 3(난소절제되고, 칼슘-결핍 식이가 제공된 대조군)의 결과이며, D는 비교예 4(난소절제되고 유산균만 제공된 대조군)의 결과이며, E는 비교예 5 (난소절제되고 무기질 혼합물만 제공된 대조군)의 결과이며, F는 실시예 1(난소절제되고, 무기질 혼합물과 유산균 모두 제공된 실시예)의 결과이다.
도 2를 참조하면, 비교예 1(Sham)보다 비교예 3(OVX)에서 헤마톡실린과 에오신(H&E)으로 염색된 해면골조직(TbB)이 덜 발전된 것으로 나타났고, 반면에 비교예 5(무기질 혼합물만 투여) 또는 실시예 1(무기질 혼합물과 유산균 병영 투여)은 염색된 면적이 증가하는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 실시예와 같이 무기질 혼합물과 본 발명의 특유의 세 종류의 유산균을 병용하는 경우 난소제거로 인한 쥐의 골 손실을 회복시키는데 효과가 있음을 입증하는 것이다.
실시예 1과 같이 유산균과 무기질 혼합물을 함께 투여한 경우의 골의 미세조직의 회복여부를 조사하기 위해서 각 그룹의 실험 동물들의 대퇴골의 원위 골단내 해면골조직(TbB)을 micro-CT 촬영하여 도 3에 나타내었다.
도 3에서 A는 비교예 1(거짓수술된 정상군)의 결과이고, B는 비교예 2(거짓수술되고 칼슘 결핍 식이가 제공된 그룹)의 결과이며, C는 비교예 3(난소절제되고, 칼슘-결핍 식이가 제공된 대조군)의 결과이며, D는 비교예 4(난소절제되고 유산균만 제공된 대조군)의 결과이며, E는 비교예 5 (난소절제되고 무기질 혼합물만 제공된 대조군)의 결과이며, F는 실시예 1(난소절제되고, 무기질 혼합물과 유산균 모두 제공된 실시예)의 결과이다.
도 3의 결과를 통해서 확인되는 바와 같이, 비교예 1(Sham)보다 비교예 3(도 3의 C)에서 더욱 심각한 해면골조직의 재흡수가 관찰되었고, 유산균만을 투여한 그룹(도 3의 D)에서는 쥐의 골 조직에 크게 영향을 미치지 않았다. 반면에, 무기질 혼합물만 투여(도 3의 E)하거나 무기질 혼합물과 유산균을 모두 투여한 경우(도 3의 F)는 해면골조직이 훨씬 더 잘 발달되었다.
대퇴골두의 형태학적인 관찰은 비교예 3(OVX)의 해면골조직의 주목할만한 흡수가 나타나는 H&E 염색과 micro-CT스캐닝을 사용하여 관찰하였다. 해면골조직의 이러한 흡수가 비교예 4(유산균만 투여)에서는 개선되지 않았지만, MIN 및 실시예 1은 비교예 1(Sham)만큼 낮았다. 게다가, BMD와 BMC의 측정결과는 형태학 적인 분석결과와 일치하였다.
이러한 결과들은 실시예 1과 같이 무기질 혼합물과 세 종류의 유산균을 병용 투여한 경우가 무기질 혼합물만을 투여한 경우 보다 골밀도 개선에 더욱 효과적임을 증명하는 것이다g.
(6) 골 무기질화(mineralization)에 대한 효능
실시예와 비교예 사이의 골 무기질화에 대한 효능을 비교평가하기 위해서, 검사 물질을 14주간 처리한 후 XCT Research SA+를 이용하여 쥐의 경골의 골 무기질량(BMC)과 골밀도(BMD)를 측정하고 비교평가하여 하기 표 8에 나타내었고, 골 무기질량(BMC) 측정 결과는 도 4a에, 골밀도(BMD) 측정 결과는 도4b에 각각 막대 그래프로 도시하였다.
표 8 및 도 4에서 확인되는 바와 같이, 비교예 3(OVX)의 BMC는 비교예 1(Sham) 보다 현저하게 감소하였다. 비록 비교예 4(LAB)는 현저한 차이를 보여주지 않았지만, 비교예 5(MIN)와 실시예 1(MIN+LAB)들은 두드러지게 증가하였다(각각에 대하여 P〈0.0001). 비교예 5(MIN)와 실시예 1의 BMC 농도를 비교하여 보면, 실시예 1이 비교예 5 보다 대략 30%가량 BMC가 증가되었음을 확인할 수 있다(도 4a, P〈0.0001).
반면에, 도 4b에 도시된 바와 같이, 난소절제로 인하여 비교예 3(OVX)의 BMD 농도는 비교예 1(Sham)의 BMD 농도에 비해 현저하게 감소하였다. 세 종류의 유산균만을 단독으로 투여한 경우 BMD에 대하여 미치는 효능은 거의 없었다. 그러나 비교예 5(MIN)와 실시예 1은 비교예 3(OVX)에 비하여 더욱 두드러진 BMD 농도 증가를 보였다. 더욱이, 실시예 1의 BMD 농도는 비교예 5 보다 18%나 높게 나타났다(도 4b 참조, P=0.0764).
구분 BMC BMD
실시예 1 (LAB+MIN) 9.43± 0.81mg/mm 603.38± 50.41mg/mm2
비교예 1 (Sham) 11.79± 0.47mg/mm 709.53± 6.47mg/mm2
비교예 2(Ca_D) 5.56± 0.06mg/mm 383.73± 21.50mg/mm2
비교예 3 (OVX) 5.22± 0.53mg/mm 288.03± 29.66mg/mm2
비교예 4 (LAB) 5.00± 0.36mg/mm 285.35± 10.49mg/mm2
비교예 5 (MIN) 7.87± 0.43mg/mm 498.13± 79.62mg/mm2
이상의 결과를 종합하면, 난소절제된 쥐에 칼슘과 마그네슘이 풍부한 무기질 혼합물과 세 종류의 유산균을 포함하는 본 발명의 조성물을 병용 투여 하였을 때 효과적으로 골손실을 억제하였고, 골형성의 생체지표(biomarker)인 혈청 APL 농도를 현저하게 감소시켰다. 이로서, 본 발명의 조성물이 골다공증에 의한 골손실의 예방과 치료에 무기질 혼합물을 단독으로 투여하는 것보다 무기질 혼합물과 세 종류의 유산균을 병용 투여하는 것이 더 효과적임을 알 수 있다.
본 발명은 그 사상 및 범위로부터 벗어남 없이 다양하게 변형 및 변화되어 실시될 수 있고, 이러한 사실은 당업자에게 자명할 것이다. 본 명세서에 기재된 구체적 실시예는 단지 본 발명의 바람직한 구현예를 설명하기 위한 것으로, 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 보호범위는 첨부된 특허청구범위에 의해서 정해져야 하며, 상기의 다양한 변형 및 변화는 본 발명의 보호범위에 포함되는 것으로 의도된다. 예컨대,이상에서 본 발명의 조성물의 골다공증의 예방 또는 치료에 대한 효능 위주로 설명하였으나, 본 발명의 조성물은 골다공증 이외에 류마티스성 관절염, 퇴행성 관절염, 구루병, 골 연화증 및 파제트 골 질환(Paget's disease of bone)과 같은 골 대사성 질환의 예방 또는 치료에도 효과적으로 이용될 수 있다.
한국생명공학연구원 KCTC11870BP 20110302 한국생명공학연구원 KCTC11868BP 20110302 한국생명공학연구원 KCTC11866BP 20110302

Claims (16)

  1. 하나 이상의 칼슘 보충제 및 하나 이상의 마그네슘 보충제를 포함하는 무기질 혼합물; 및
    스트렙토코쿠스 서모필루스 ST3(Streptococcus thermophilus ST3)(KCTC 11870BP);
    락토바실루스 람노수스 LR3 (Lactobacillus rhamnosus LR3)(KCTC 11868BP); 및
    락토바실루스 파라카제이 LPC4(Lactobacillus paracasei LPC4) (KCTC 11866BP)를 포함하는 골다공증 예방 또는 치료용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 칼슘 보충제는 칼슘 원소이거나 칼슘 옥사이드, 유기산의 칼슘, 무기산의 칼슘 및 아미노산의 마그네슘으로 구성되는 군에서 선택되는 칼슘 화합물인 것을 특징으로 하는 골다공증 예방 또는 치료용 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 마그네슘 보충제는 마그네슘 원소이거나 마그네슘옥사이드, 유기산의 마그네슘, 무기산의 마그네슘 및 아미노산의 마그네슘으로 구성되는 군에서 선택되는 마그네슘 화합물인 것을 특징으로 하는 골다공증 예방 또는 치료용 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 아연, 셀레늄, 인, 나트륨, 클로라이드, 망간, 철, 구리, 요오드, 칼슘, 칼륨, 크롬, 몰리브덴, 바이오플라보노이드 (bioflavonoid) 및 이들의 임의의 배합물로 구성되는 군에서 선택되는 무기질을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 골다공증 예방 또는 치료용 조성물.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 조성물은 카로티노이드, 비오틴, 콜린, 이노시톨, 엽산, 판토텐산, 콜린, 비타민 A, 비타민 B1, 비타민B2, 비타민 B3, 비타민 B6, 비타민 B12, 비타민 C, 비타민 D, 비타민 D3, 비타민 E, 비타민 K 및 이들의 임의의 배합물로 구성되는 군에서 선택되는 비타민을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 골다공증 예방 또는 치료용 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 아르기닌, 시스테인, 및 카르니틴으로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상의 성분을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 골다공증 예방 또는 치료용 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 세 종류의 유산균 균주들은 단백질 및 다당류에 의해 2중 코팅되거나 단백질, 다당류 및 나노입자에 의해 3중 코팅된 것임을 특징으로 하는 골다공증 예방 또는 치료용 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 조성물이 조성물 총 중량에 대해, 유효성분으로서 상기 세 종류의 유산균 균주들의 혼합물을 108 내지 1012 cfu/g의 함량으로 포함하거나, 동등한 수의 생균을 가진 배양물을 포함하는 것을 특징으로 하는 골다공증 예방 또는 치료용 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 락토바실루스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실루스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 비피도박테리움 브레브(Bifidobacterium breve), 비피토박테리움 락티스 (Bifidobacterium lactis), 비피도박테리움 롱굼(Bifidobacterium longum), 락토바실루스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius), 락토바실루스 시도필루스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실루스 브레비스(Lactobacillus brevis), 락토바실루스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus), 락토바실루스 퍼멘툼(Lactobacillus fermentum), 락토바실루스 파라카제이(Lactobacillus paracasei), 락토바실루스 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실루스 델브루에키(Lactobacillus delbrueckii), 락토바실루스 레우테리(Lactobacillus reuteri), 락토바실루스 부츠네리(Lactobacillus buchneri), 락토바실루스 가세리(Lactobacillus gasseri), 락토바실루스 존스니(Lactobacillus johonsonii), 락토바실루스 케피르(Lactobacillus kefir), 락토코쿠스 락티스(Lactococcus lactis), 비피도박테리움 비피듐(Bifidobacterium bifidum), 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis), 비피도박테리움 수도롱굼(Bifidobacterium pseudolongum), 비피도박테리움 서모필룸 (Bifidobacterium themophilum), 비피도박테리움 아돌센티스 (Bifidobacterium adolescentis)로 구성되는 군에서 선택되는 1종 이상의 유산균을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 골다공증 예방 또는 치료용 조성물.
  10. 제 1 항에 있어서,상기 조성물이 제약학적 허용되는 담체 또는 부형제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 골다공증 예방 또는 치료용 조성물.
  11. 제1항에 있어서, 상기 조성물은
    칼슘 보충제 25 중량% ~ 40중량%,
    마그네슘 보충제 2중량% ~ 10중량%,
    스트렙토코쿠스 서모필루스 ST3(Streptococcus thermophilus ST3)(KCTC 11870BP) 0.5중량% ~ 10중량%;
    락토바실루스 람노수스 LR3 (Lactobacillus rhamnosus LR3)(KCTC 11868BP) 0.5중량% ~ 10중량%,
    락토바실루스 파라카제이 LPC4(Lactobacillus paracasei LPC4) (KCTC 11866BP) 0.5중량% ~ 10중량%, 및
    잔량의 부형제를 포함하는 것을 특징으로 하는 골다공증 예방 또는 치료용 조성물.
  12. 제5항에 있어서, 상기 조성물은
    400 mg 내지 2,500mg의 칼슘 보충제;
    30mg 내지 60 mg의 마그네슘 보충제;
    7.5mg 내지 150mg의 스트렙토코쿠스 서모필루스 ST3(Streptococcus thermophilus ST3 )(KCTC 11870BP);
    7.5mg 내지 150mg의 락토바실루스 람노수스 LR3 (Lactobacillus rhamnosus LR3)(KCTC 11868BP); 및
    7.5mg 내지 150mg의 락토바실루스 파라카제이 LPC4 (Lactobacillus paracasei LPC4) (KCTC 11866BP)
    25mg 내지 500mg의 철;
    25mg 내지 500mg의 비타민 C 화합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 골다공증 예방 또는 치료용 조성물.
  13. 제1항에 있어서, 상기 유산균 균주들을 동결-건조하여 생균제 형태로 제조된 것임을 특징으로 하는 골다공증 예방 또는 치료용 조성물.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 골다공증 예방 또는 치료용 조성물로 이루어진 것을 특징으로 하는 약품.
  15. 제14항에 있어서, 상기 약품은 골다공증, 류마티스성 관절염, 퇴행성 관절염, 구루병, 골 연화증 및 파제트 골 질환(Paget's disease of bone)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 증상의 치료에 유용한 것임을 특징으로 하는 약품.
  16. 하나 이상의 칼슘 보충제 및 하나 이상의 마그네슘 보충제를 포함하는 무기질 혼합물; 및
    스트렙토코쿠스 서모필루스 ST3(Streptococcus thermophilus ST3)(KCTC 11870BP);
    락토바실루스 람노수스 LR3 (Lactobacillus rhamnosus LR3)(KCTC 11868BP); 및
    락토바실루스 파라카제이 LPC4(Lactobacillus paracasei LPC4) (KCTC 11866BP)를 포함하는 식품.
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