JP6214162B2 - 新規の低温耐性ラクトバチルス・ガセリ株 - Google Patents
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本発明は、上記の低温耐性ラクトバチルス・ガセリ株又はその処理物を有効成分として含む、ストレス性腸障害の軽減剤に関する。
(1) ラクトバチルス・ガセリCP2305s株(NITE BP-1405)、又はラクトバチルス・ガセリCP2305株(FERM BP-11331)もしくはCP2305s株から派生した低温耐性派生株。
(2) ラクトバチルス・ガセリCP2305s株(NITE BP-1405)、又はラクトバチルス・ガセリCP2305株(FERM BP-11331)もしくはCP2305s株から派生した低温耐性派生株、それらの菌体処理物、或いはそれらの混合物、を有効成分として含有することを特徴とする、腸管での水分過剰分泌、ストレス性腸障害、過敏性腸症候群、下痢型過敏性腸症候群又は、炎症性腸疾患の軽減剤。
(3) 上記CP2305s株、又はCP2305株もしくはCP2305s株から派生した低温耐性派生株が、生菌体又は殺菌体である、上記(2)に記載の軽減剤。
(4) 上記菌体処理物が、乾燥菌体、破壊菌体、破砕菌体又は発酵乳である、上記(2)又(3)に記載の軽減剤。
(5) ストレスによる骨盤(副交感)神経活動の抑制を阻害する作用を有する、上記(2)〜(4)のいずれかに記載の軽減剤。
(6) 大腸クロライドチャネルを抑制することによって水分分泌を抑制する作用を有する、上記(2)〜(5)のいずれかに記載の軽減剤。
(7) ストレス性下痢の改善剤である、上記(2)〜(6)のいずれかに記載の軽減剤。
(8) 上記(2)〜(7)のいずれかに記載の軽減剤を動物飼料成分と配合して、ストレス性腸障害軽減効果を有する動物飼料を製造することを含む、動物飼料の製造方法。
(9) ラクトバチルス・ガセリCP2305s株(NITE BP-1405)、又はラクトバチルス・ガセリCP2305株(FERM BP-11331)もしくはCP2305s株から派生した低温耐性派生株、の生菌体又は殺菌体、それらの菌体処理物、或いはそれらの混合物、を含有する動物飼料。
(10) 上記(2)〜(7)のいずれかに記載の軽減剤を含有する食品添加剤又は動物飼料添加
剤。
(12) ラクトバチルス・ガセリCP2305s株(NITE BP-1405)、又はラクトバチルス・ガセリCP2305株(FERM BP-11331)もしくはCP2305s株から派生した低温耐性派生株、の生菌体又は殺菌体、それらの菌体処理物、或いはそれらの混合物、を含有する飲食品。
(13) 機能性食品である、上記(12) に記載の飲食品。
(14) 上記(2)〜(7)のいずれかに記載の軽減剤を食品用の担体、賦形剤又は希釈剤と混合し、場合により食品添加剤をさらに混合して、ストレス性腸障害軽減効果を有する機能性飲食品を製造することを含む、機能性飲食品の製造方法。
(15) ラクトバチルス・ガセリCP2305s株(NITE BP-1405)、又はラクトバチルス・ガセリCP2305株(FERM BP-11331)もしくはCP2305s株から派生した低温耐性派生株、の生菌体又は殺菌体、それらの菌体処理物、或いはそれらの混合物、を有効成分として含有することを特徴とする、ストレス性腸障害を予防、軽減又は治療するための医薬組成物。
(16) 上記(2)〜(7)のいずれかに記載の軽減剤と、薬学的に許容されうる担体、賦形剤又は希釈剤とを含む、ストレス性腸障害を予防、軽減又は治療するための医薬組成物。
(17) ラクトバチルス・ガセリCP2305株(FERM BP-11331)又はラクトバチルス・ガセリCP2305s株(NITE BP-1405)と同等以上のストレス性腸障害の軽減作用を有し、かつCP2305株と異なる乳酸菌。
(18) 上記ストレス性胃腸障害の軽減作用が、後述の実施例3記載の下痢スコアで上記株と同等以上のストレス性下痢抑制作用を有する、上記(17)に記載の乳酸菌。
(19) 後述の実施例3記載の方法によって下痢スコアを評価した場合においてプラセボと比較して有意(p<0.05vsプラセボ)にストレス性下痢を抑制しかつCP2305株と異なる乳酸菌。
(20) 氷上で5時間保持したときの生存率が、60%以上である低温耐性を有する、上記(17)〜(19)に記載の乳酸菌。
(22) 大腸クロライドチャネルを抑制することによって水分分泌を抑制する作用を有する、上記(17)〜(21)のいずれかに記載の乳酸菌。
(23) 上記乳酸菌がラクトバチルス・ガセリ種に属する乳酸菌であることを特徴とする、上記(17)〜(22)のいずれかに記載の乳酸菌。
(24) 上記乳酸菌がラクトバチルス・ガセリCP2305s株(NITE BP-1405)、ラクトバチルス・ガセリCP2305株(FERM BP-11331)の派生株又はラクトバチルス・ガセリCP2305s株(NITE BP-1405)の派生株である上記(17)〜(23)のいずれかに記載の乳酸菌。
(25) 腸管での水分過剰分泌、ストレス性腸障害、過敏性腸症候群、下痢型過敏性腸症候群又は炎症性腸疾患の予防又は軽減に用いるための上記(17)〜(24)のいずれかに記載の乳酸菌。
(26) 乳酸菌を10℃以下、7℃以下、5℃以下、3℃以下、2℃以下、1℃以下、又は氷上、の温度に曝露し、生存した低温耐性株を選抜し、育種すること、必要に応じてこの操作を繰り返すこと、及び生存した低温耐性株を回収することを含む、乳酸菌低温耐性株の製造方法。
(27) 上記乳酸菌がラクトバチルス・ガセリ種に属する乳酸菌又は、ラクトバチルス・ガセリCP2305株(FERM BP-11331)である、上記(26)に記載の方法。
(28) 氷上で5時間保持したときの生存率が、60%以上である低温耐性を有する、乳酸菌。
(29) 上記乳酸菌がラクトバチルス・ガセリ種に属する乳酸菌であることを特徴とする、上記(28)記載の乳酸菌。
<低温耐性ラクトバチルス・ガセリ株>
本発明は、ラクトバチルス・ガセリCP2305s株(NITE BP-1405)、又はラクトバチルス・ガセリCP2305株(FERM BP-11331)もしくはCP2305s株から派生した低温耐性派生株、を提供する。
リCP2305s株は、本出願人により、ブダペスト条約の規定に基づく国際寄託機関である独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター(〒292-0818日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8)に、2012年8月14日付でNITE BP-1405として国際寄託されている。
本発明は、第2の態様により、ラクトバチルス・ガセリCP2305s株(NITE BP-1405)又はラクトバチルス・ガセリCP2305株(FERM BP-11331)もしくはCP2305s株から派生した低温耐性派生株、それらの菌体処理物、或いはそれらの混合物、を有効成分として含有することを特徴とする、腸管での水分過剰分泌、ストレス性腸障害、過敏性腸症候群、下痢型過敏性腸症候群又は、炎症性腸疾患の軽減剤を提供する。
CP2305s株、又はCP2305株からの低温耐性派生株は、生菌体又は殺菌体のいずれでもよい。
かに異なる株である。
したがって、明細書中、「ストレス性腸障害の下痢症状」とは、ストレス性下痢の症状を意味する。
本発明は、第3の態様により、上記のラクトバチルス・ガセリCP2305s株(NITE BP-1405)、又はCP2305株もしくはCP2305s株からの低温耐性派生株などの派生株、の生菌体又は殺菌体、それらの菌体処理物、或いはそれらの混合物、或いは、上記軽減剤を含有する食品添加剤又は動物飼料添加剤を提供する。
本発明はさらに、ラクトバチルス・ガセリCP2305s株(NITE BP-1405)、又はCP2305株又はCP2305株もしくはCP2305s株からの低温耐性派生株などの派生株、の生菌体又は殺菌体、それらの菌体処理物、或いはそれらの混合物、を有効成分として含有することを特徴とする、ストレス性腸障害を予防、軽減又は治療するための医薬組成物を提供する。
本発明の医薬組成物は、腸管での水分過剰分泌、ストレス性腸障害、過敏性腸症候群又は、炎症性腸疾患の予防、ストレス時の下痢症状の悪化、の予防、軽減又は治療に有効である。
<低温耐性株の育種>
内径15mmのpolypropylene製の容量15mlの試験管に入った10mlの培養液(食添培地)にラクトバチルス・ガセリCP2305株(菌数103個〜104個)を接種し、37℃、19時間培養を行った。
なお、本明細書で使用する「食添培地」の組成は下記のとおりである(表1)。
本発明の低温耐性株の評価における上記低温耐性株の生存性の評価を、下記の式のように、低温曝露前後の生菌率(本明細書において「生存率」ともいう。)で評価した。具体的には、評価対象株(菌数103個〜104個)を内径15mmのpolypropylene製の容量15mlの試験管に入った10mlの培養液(食添培地)に接種し、37℃、19時間培養を行った。19時間の培養後、この内径15mmのpolypropylene製の容量15mlの試験管を、試験管内の液面以上となる十分な量の氷の中に試験管を挿入して(氷上)にて急速冷却し、氷上で5時間保持した後、急速冷却前(低温暴露前)の生菌数と氷上で5時間保持後(低温曝露後)の生菌数を比較し下記式で生菌率を評価する。
生菌率(%)=低温曝露後の生菌数/低温曝露前の生菌数×100
上記生菌数のカウント方法は、培養液をMRS寒天培地またはBCP加プレートカウント寒天培地に塗抹し、37℃微好気で48時間培養を行い、コロニーをカウントし生菌数を測定し評価した。
<低温耐性株の製造方法>
なお、低温耐性株の製造方法としては、例えば、CP2305株は10℃以下で生存率が低くなる傾向を示す。このため、低温耐性株の製造方法としては、対象株を、培養液(例:食添培地)にて適度な培養温度(例:37℃程度)で程度な培養時間(例:19時間程度)培養し、その後、培養液を10℃以下、好ましくは7℃以下、より好ましくは5℃以下、さらに好ましくは3℃以下、2℃以下、1℃以下の温度に適度な時間(例:5時間)曝露して、また、必要に応じ、これらの培養、低温曝露を繰り返すことによって、目的とする温度である低温に耐性がある株を製造する。
SD雄ラット(4週齢、日本チャールス・リバー社製)を12時間毎の明暗周期下(8時より12時間点灯)で1週間飼育後、試験菌体配合餌を以下のように3週間自由摂取させた。
a)餌は、オリエンタル酵母株式会社のCRF-1粉末餌を使用した。
b)上記餌(CRF−1)25gに対し、菌数2.0×1010個が含まれる試験菌体の凍結乾燥粉末を配合(餌CRF-1:25gに対し、凍結乾燥粉末0.25g)し、試験菌体配合餌とした。
c)試験菌体配合餌を3週間自由摂取させた。
d)この試験による菌体摂食量はおおよそ2.0×1010個/日と推定された。
e)各群19匹に摂取させた。
(a)CRF投与後の100分間の糞便を10分間隔で10回採取する。
(b)各回で採取した糞便の重量をg単位で測定する(各回の糞便重量(i値))。例えば、ある回の糞便重量が0.4gであった場合は、i値=0.4とする。
(c)各回で採取した糞便について、糞便の水分状況及び形状から図5に示す糞便スコア基準により、各回の糞便スコアとして数値化する(各回の糞便スコア(ii値))
(d)各回の糞便重量(i値)×各回の糞便スコア(ii値)を求める。
(e)各回で求めた、糞便重量(i値)×糞便スコア(ii値)の10回分の総和を「下痢スコア」と定義する。
(f)これによって、CRF投与後100分間の糞便状況を、プラセボ(CRF-1のみ)も含めて評価した(Dunnetの多重比較により評価)。
上記実験および定義された下痢スコアに基づいて、下記の効果を確認した。
その結果、ラクトバチルス・ガセリCP2305s株(殺菌体)は、プラセボ(CRF-1のみ)と比較して、有意にストレス性下痢を抑制した(図2)。下痢抑制効果は、CP2305株(生菌体及び殺菌体)と比べて同等の効果を有している。
比較対象とした寄託菌株A菌体の結果は、CP2305株と同菌数投与した結果である。また、市販生菌製剤Bの結果は、ヒト1日分の摂取用量の重量をラットの体重換算で、単位体重あたり同量となるよう投与した結果である(図6)。本結果から従来下痢抑制作用があるとされている市販生菌剤などよりストレス性下痢を抑制する作用がCP2305株であることが証明され、CP2305s株もCP2305株と同様のストレス性下痢の抑制効果があることからCP2305s株の優位性が証明された。
さらにまた、CRF投与4時間後に解剖を実施し、結腸組織をISOGEN(ニッポンジーン)およびRNeasy Mini Kit(Qiagen,USA)にて総RNAを抽出後、遺伝子発現をRat whole genome ver. 3 (G4847B,Agilent,USA)で網羅的に解析を行った。その結果、プラセボ群でCRF投与後に増加するクロライド・チャネル関連遺伝子を、CP2305株投与群では抑制することを確認した(図3)。従って、CP2305株はクロライドチャネルを抑制し、水分の移動を制御していると考えられ、また、同様の下痢抑制効果を有するCP2305s株もクロライドチャネルを抑制し、水分の移動を制御していると考えられる。
SD系雄ラット(4週齢、株式会社紀和動物製)を12時間毎の明暗周期下(8時より12時間点灯)で1週間飼育後、CP2305株配合餌もしくは未配合対照粉餌を3週間自由摂食させた。実験当日はラットを3時間絶食させた後、ウレタン麻酔し、頚静脈に静脈投与用のカニューレを挿入し、その後、下部大腸を神経支配する骨盤(副交感)神経を銀電極で吊上げ、その電気活動を測定した。測定値が安定した時期にCRF溶液(1μg/kg)を頚静脈投与し骨盤神経の電気活動(PNA)の変化を電気生理学的に測定した。データは5分間毎の5秒あたりの発火頻度の平均値にて解析し、頚静脈投与直前の値(0分値)を100%として百分率で示した。その結果、ストレスホルモン(CRF)投与することで、ラット大腸を神経支配する骨盤(副交感)神経活動が抑制されることを確認した。更にはCP2305株の投与がストレス誘発の骨盤(副交感)神経抑制を阻害することを確認した(図4)。従って、CP2305株の投与により、ストレス時の腸管機能が正常に保たれるものと考えられ、また、同様の下痢抑制効果を有するCP2305s株も同様の効果があると考えられる。
Claims (16)
- ラクトバチルス・ガセリCP2305s株(NITE BP-1405)、又は
ラクトバチルス・ガセリCP2305株(FERM BP-11331)もしくはCP2305s株から派生した派生株であって、低温耐性を有し、ラクトバチルス・ガセリCP2305株(FERM BP-11331)もしくはラクトバチルス・ガセリCP2305s株(NITE BP-1405)と同等以上のストレス性腸障害の軽減作用を有し、かつCP2305株と異なる派生株。 - 氷上で5時間保持したときの生存率が、60%以上である低温耐性を有する、請求項1に記載の株。
- ストレスによる骨盤(副交感)神経活動の抑制を阻害する作用を有する、請求項1又は2に記載の株。
- 大腸クロライドチャネルを抑制することによって水分分泌を抑制する作用を有する、請求項1〜3のいずれか1項に記載の株。
- ラクトバチルス・ガセリCP2305s株(NITE BP-1405)、又は
ラクトバチルス・ガセリCP2305株(FERM BP-11331)もしくはCP2305s株から派生した低温耐性派生株であって、ラクトバチルス・ガセリCP2305株(FERM BP-11331)もしくはラクトバチルス・ガセリCP2305s株(NITE BP-1405)と同等以上のストレス性腸障害の軽減作用を有し、かつCP2305株と異なる派生株、
それらの菌体処理物、或いはそれらの混合物、
を有効成分として含有することを特徴とする、腸管での水分過剰分泌、ストレス性腸障害、過敏性腸症候群又は、炎症性腸疾患の軽減剤。 - ストレスによる骨盤(副交感)神経活動の抑制を阻害する作用を有する、請求項5に記載の軽減剤。
- 大腸クロライドチャネルを抑制することによって水分分泌を抑制する作用を有する、請求項5又は6に記載の軽減剤。
- ストレス性下痢の改善剤である、請求項5〜7のいずれか1項に記載の軽減剤。
- 前記CP2305s株、又はラクトバチルス・ガセリCP2305株(FERM BP-11331)もしくはCP2305s株から派生した低温耐性派生株が、生菌体又は殺菌体である、請求項5〜8のいずれか1項に記載の軽減剤。
- 前記菌体処理物が、乾燥菌体、破壊菌体、破砕菌体又は発酵乳である、請求項5〜9のいずれか1項に記載の軽減剤。
- ラクトバチルス・ガセリCP2305株(FERM BP-11331)を10℃以下の温度に曝露し、生存した低温耐性株を選抜し、育種すること、この操作を繰り返すこと、及び生存した低温耐性株を回収することを含む、乳酸菌低温耐性株の製造方法。
- 請求項1〜4のいずれか1項に記載の株の生菌体又は殺菌体、それらの菌体処理物、或いはそれらの混合物、を含有する飲食品又は動物飼料。
- 請求項1〜4のいずれか1項に記載の株の生菌体又は殺菌体、それらの菌体処理物、或いはそれらの混合物、を含有する食品添加剤又は動物飼料添加剤。
- 請求項1〜4のいずれか1項に記載の株の生菌体又は殺菌体、それらの菌体処理物、或いはそれらの混合物、を含有する食品添加物。
- 請求項1〜4のいずれか1項に記載の株の生菌体又は殺菌体、それらの菌体処理物、或いはそれらの混合物、を含有する機能性飲食品。
- 請求項1〜4のいずれか1項に記載の株の生菌体又は殺菌体、それらの菌体処理物、或いはそれらの混合物、を含有する医薬組成物。
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