WO2018030837A1 - 락토바실러스 아시도필루스를 포함하는 갱년기 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

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WO2018030837A1
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menopause
lactobacillus acidophilus
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lactobacillus
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PCT/KR2017/008737
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남영도
김윤태
신희순
이소영
김재구
임은영
송은지
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한국식품연구원
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    • C12R2001/225—Lactobacillus
    • C12R2001/23—Lactobacillus acidophilus

Definitions

  • the present invention is a novel Lactobacillus acidophilus ( Lactobacillus acidophilus ) YT1 (Accession No .: KCCM11808P) strain, and preventing, improving, or treating menopausal years comprising Lactobacillus asidophyllus comprising the novel strain as an active ingredient. It relates to a composition for.
  • the intestinal microorganisms possessed by living organisms can be classified by individual, and these microorganisms are known to be involved in various metabolisms in the intestine.
  • the intestinal microorganism associated with obesity is one of the well-known fields, and the obese person has been reported to have an intestinal microorganism richly involved in metabolism of carbohydrates, fats and amino acids.
  • substances such as butyrate and acetate produced by the metabolism of intestinal microorganisms are important factors for intestinal immunity, which are caused by pathogens through the regulation of helper T cell production or reaction with G-protein receptor 43 (GPR43). It is known to protect the living body from infection.
  • GPR43 G-protein receptor 43
  • intestinal microorganisms are pointed out as a cause of autism, atopy, etc., in addition to various diseases in the large intestine such as inflammatory bowel disease or colon cancer.
  • the intestinal microorganisms influence serotonin production from enterochromaffin cells in the intestinal tract, affecting the mood of the living body, and the nervous system as well.
  • intestinal microorganisms can be regulated through indirect methods such as exercise control or intestinal permeability control and direct methods such as secretion of hormones in the intestine, secretion of signal substances in the nervous system or immune cells. This means that changes in intestinal microorganisms can even control the emotions of living organisms.
  • menopausal symptoms can be prevented through proper diet, and according to WHO, one-third of the menopausal symptoms can be prevented by eating foods such as vegetables and fruits. It is recommended to eat natural-derived foods rather than hormone replacement therapy (HRT).
  • HRT hormone replacement therapy
  • isoflavones which are used as synthetic hormone replacements, are effective in reducing menopausal symptoms.
  • isoflavones which are used as synthetic hormone replacements
  • Excessive intake is associated with endometrial hyperplasia and breast epithelium. Since there are reports of inducing cell proliferation, further research is needed to develop a technology capable of satisfying the criteria with a new natural-derived hormone replacement agent.
  • the present inventors have established a menopausal animal model through ovarian extraction to analyze the intestinal microbial changes due to menopause, and as a result of earnestly researching for the development of microbial material for improving menopausal symptoms, the distribution of the menopausal animal model was significantly changed compared to the control group.
  • a novel Lactobacillus acidophilus YT1 (Accession Number: KCCM11808P) strain was identified and isolated from a single intestinal microorganism, and the effect of improving the menopausal symptoms of the Lactobacillus asidophilus strain including the new strain was confirmed. As described above, the present invention has been completed.
  • an object of the present invention is to provide a Lactobacillus acidophilus YT1 strain (Accession Number: KCCM11808P) having a menopausal prevention or treatment effect.
  • an object of the present invention is to provide a composition for preventing, improving, or treating menopausal years, including Lactobacillus acidophilus as an active ingredient, including the novel strain.
  • the present invention provides a novel Lactobacillus acidophilus YT1 strain (Accession Number: KCCM11808P) having a menopausal preventive or therapeutic effect.
  • the present invention comprises Lactobacillus acidophilus ( Lactobacillus acidophilus ) including the novel strain as an active ingredient, a pharmaceutical composition for preventing or treating menopause, a food composition for improving menopause, and / or a cosmetic composition for improving menopause To provide.
  • Lactobacillus acidophilus Lactobacillus acidophilus
  • a pharmaceutical composition for preventing or treating menopause a food composition for improving menopause
  • a food composition for improving menopause / or a cosmetic composition for improving menopause To provide.
  • the present invention also provides a Lactobacillus acidophilus ( Lactobacillus acidophilus ) as an active ingredient, a pharmaceutical composition for preventing or treating menopause, a food composition for improving menopause, and / or a cosmetic composition for improving menopause.
  • Lactobacillus acidophilus Lactobacillus acidophilus
  • the food composition may include a health functional food composition.
  • the Lactobacillus acidophilus may be a Lactobacillus acidophilus YT1 strain or Lactobacillus acidophilus KCTC 3164 strain.
  • the composition may inhibit the increase of body fat caused by menopause.
  • the composition may inhibit the decrease in bone density caused by menopause.
  • the composition may inhibit an increase in sensitivity of pain caused by menopause.
  • the composition may relieve depression by menopause.
  • the present invention provides a method for preventing or treating menopausal years, comprising administering to a subject a pharmaceutical composition comprising Lactobacillus acidophilus as an active ingredient.
  • the present invention provides the use of Lactobacillus acidophilus ( Lactobacillus acidophilus ), preventing or treating menopausal.
  • the present inventors have established a menopausal animal model through ovarian extraction to confirm the change in the distribution of intestinal microorganisms, and have identified and isolated a novel Lactobacillus asidophilus strain among lactic acid bacteria whose distribution in the menopausal model is significantly reduced.
  • the new strain and the previously reported Lactobacillus asidophilus strains confirmed the effects of improving menopausal symptoms such as inhibiting the increase of body fat, suppressing bone density, inhibiting the increase in sensitivity of pain, and alleviating depression, according to the present invention.
  • Compositions comprising Bacillus asidophilus are expected to be useful for the prevention, improvement, or treatment of menopause.
  • Figure 2 is a result of measuring the femoral bone mineral density of the control group (Sham) and ovarian extraction group (OVX) after performing ovarian extraction surgery on female rats (Area: area, BMC: bone weapon mass, BMD: bone density).
  • FIG. 3 shows blood alkaline phosphate dehydrogenase (ALP) and aspartic acid aminotransferase (AST) from the control group (Sham) and ovarian extraction group (OVX) at 18 weeks after ovarian extraction surgery in female rats. The results are shown by measuring the content.
  • ALP blood alkaline phosphate dehydrogenase
  • AST aspartic acid aminotransferase
  • OVX ovarian extraction group
  • Figure 4 shows the results obtained by measuring the blood estradiol content of blood from the control group (Sham) and ovary extraction group (OVX) at 18 weeks after ovarian extraction surgery in female rats.
  • Figures 5a and 5b analyzed the cytokine concentration in the immune organs of the control group (Sham) and ovary extraction group (OVX) at 18 weeks after ovarian extraction surgery in female rats
  • Figure 5a is a variety of cytokines in the Peyers patch It is a result of measuring the concentration of the Cain (IL-1 ⁇ , 1 ⁇ , 2, 4, 6, 10, 12, 13, INF- ⁇ , TNF- ⁇ , GM, RANTES)
  • Figure 5b is the IL in the Peyers patch and spleen This is the result of measuring -10 concentration.
  • FIG. 6 shows PCA plotting total intestinal microbial changes in control (Sham) and ovary extraction groups (OVX) at 0, 1, 3, 6, 10, 14, and 18 weeks after ovarian extraction surgery in female rats. This is the result.
  • Figure 8 is to measure the weight change with time of each experimental group after ovarian extraction surgery in order to evaluate the effect of improving menopausal symptoms by administration of Lactobacillus asidophilus.
  • FIG. 10a and 10b is a food intake (Fig. 10a) and drinking water intake (Fig. 10a) of each experimental group from 1 to 16 weeks after ovarian extraction to evaluate the effect of improving menopausal symptoms by administration of Lactobacillus asidophilus This is the result shown by measuring.
  • 11A to 11C are to evaluate the effect of improving menopausal symptoms by Lactobacillus asidophilus administration, respectively, at 8 (FIG. 11A), 12 (FIG. 11B), and 16 weeks (FIG. 11C) after ovarian extraction surgery. This is a result of measuring the femoral bone mineral density of the experimental group.
  • 12A to 12D are 4 (FIG. 12A), 8 (FIG. 12B), 12 (FIG. 12C), and 16 weeks after ovarian extraction for evaluating the effect of improving menopausal symptoms by administration of Lactobacillus asidophilus.
  • D von Frey filament test for each experimental group to measure the sensitivity of the pain is shown.
  • Figure 13a and Figure 13b is to evaluate the effect of improving the menopausal symptoms by the administration of Lactobacillus asidophilus, immunization time by conducting a forced swimming behavior test for each experimental group 16 weeks after ovarian extraction surgery
  • FIG. 13a and the swimming time are measured and shown.
  • Figures 14a and 14b shows the femoral bone mineral density (Fig. 14a) and pain sensitivity (Fig. 14a) of rats 12 weeks after ovarian extraction, in order to compare the efficacy of Lactobacillus asidophilus strains and other strains of the genus Lactobacillus 14b) was measured and shown.
  • the present invention relates to a novel Lactobacillus asidophilus strain isolated from feces of a menopausal rat model and a composition for preventing, improving, or treating menopausal age, including Lactobacillus asidophilus comprising the strain as an active ingredient. .
  • the present inventors have established a menopausal animal model through ovarian extraction to analyze the intestinal microbial changes due to menopause and to study the development of microbial material for improving menopausal symptoms, Lactobacillus asydo significantly decreased in the menopausal animal model.
  • the present invention was completed by identifying and separating Filus strains and confirming the effect of improving menopausal symptoms by Lactobacillus asidophilus comprising the strains.
  • the present invention provides a Lactobacillus acidophilus YT1 strain (Accession Number: KCCM11808P) having a menopausal prevention or treatment effect.
  • the inventors named the novel strain Lactobacillus acidophilus YT1, and deposited it on January 20, 2016 at the Korea Microorganism Conservation Center under accession number KCCM11808P.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating menopausal period comprising Lactobacillus acidophilus ( Lactobacillus acidophilus ) including the novel strain as an active ingredient.
  • prophylaxis means any action that suppresses menopausal symptoms or delays the onset by administration of a pharmaceutical composition according to the present invention.
  • treatment refers to any action in which symptoms for menopause improve or benefit from administration of the pharmaceutical composition according to the present invention.
  • the Lactobacillus asidophilus having a menopausal preventive or therapeutic effect is not only a novel strain (YT1) isolated and identified in feces of the menopausal rat model of the present invention, but also known Lactobacillus asidophilus.
  • the present invention is the first to identify the menopausal preventive or therapeutic effect of Lactobacillus asidophilus.
  • Menopausal which is a disease targeted by the present invention, also referred to as menopause, refers to a period of menstrual abolition that appears as a sign of loss of female reproductive function.
  • menopausal dysfunction of the ovary irregular amounts and cycles of menstruation, menstruation is abolished by a decrease in the secretion of follicle hormone (estrogen) for several months to three years, and acts on the autonomic nervous system of the brain brain causess menopausal disorders.
  • dysfunction of the anterior pituitary gland increases adrenal cortex function, resulting in masculinity, and dysfunction characteristic of menopausal periods such as obesity caused by abnormal thyroid function under the influence of thyroid hormones. For example, hot flashes, palpitations, and heartbeats that are more severe than normal, dizziness, tinnitus, high blood pressure, digestive problems, headaches, memory loss, depression, etc. Symptoms may occur.
  • the rats were extracted from the ovary to produce a menopausal model, and by analyzing the intestinal microbial changes in comparison with the normal control, a new strain of Lactobacillus asidophilus was significantly reduced in the menopausal model. The effect of Lactobacillus asidophilus was confirmed to improve menopausal symptoms.
  • a menopausal model from which the ovaries were extracted and compared with the normal control group, the weight, bone density, organ weight and length change, blood biochemical indicators, blood estradiol, cytokine concentrations of immune organs by measuring the menopause It was confirmed that the model was well established (see Example 2).
  • the change in intestinal microbial distribution was confirmed by metagenomic analysis compared to the normal control group using the established menopausal animal model, and the distribution in the menopausal model was reduced among the 32 types of intestinal microorganisms finally discovered. Microorganisms of the species were identified (see Example 3).
  • Lactobacillus acidophilus showing the largest difference among the lactic acid bacteria significantly decreased in the ovarian extraction menopause model based on the results of Example 3, feces The strain was isolated from the sample (see Example 4).
  • each of the novel Lactobacillus asidophilus strain (YT1) and the known Lactobacillus asidophilus strain (KCTC 3164) isolated from the present invention is orally administered to a menopausal model, By analyzing the weight and body fat mass, dietary behavior change, femoral bone density, pain sensitivity, and depression-like behavior, it was confirmed that the menopausal symptoms were improved by administration of the strains (see Example 5).
  • the Lactobacillus asidophilus strain (KCTC 3164) is a representative strain of the Lactobacillus asidophilus strain based on List of prokaryotic names with standing in nomenclature (LPSN) and Korean Collection for Type Collection (KCTC). .
  • the novel Lactobacillus asidophilus strain (YT1) isolated from the present invention and Lactobacillus strains of different species (Lactobacillus ruteri (L. Reuteri)), respectively, in the climacteric model By oral administration and analyzing femoral bone mineral density and pain sensitivity, it was confirmed that the menopausal symptoms were improved by administration of the Lactobacillus asidophilus strain (YT1) (see Example 6).
  • Lactobacillus asidophilus strain according to the present invention can be usefully used for the prevention, improvement, or treatment of menopause.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may include Lactobacillus asidophilus as an active ingredient, and may further include a pharmaceutically acceptable carrier.
  • Such pharmaceutically acceptable carriers are conventionally used in the preparation, and include, but are not limited to, saline solution, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, cyclodextrin, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol, liposomes, and the like. If necessary, other conventional additives such as antioxidants and buffers may be further included.
  • diluents, dispersants, surfactants, binders, lubricants and the like may be additionally added to formulate into injectable formulations, pills, capsules, granules or tablets such as aqueous solutions, suspensions, emulsions and the like.
  • Suitable pharmaceutically acceptable carriers and formulations can be preferably formulated according to the individual components using methods disclosed in Remington's literature.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited in formulation, but may be formulated as an injection, inhalant, or external skin preparation.
  • compositions of the present invention can be administered orally or parenterally (eg, applied intravenously, subcutaneously, intraperitoneally or topically) according to the desired method, and the dosage is determined by the condition and weight of the patient, Depending on the extent, drug form, route of administration, and time, it may be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is administered in a pharmaceutically effective amount.
  • the pharmaceutically effective amount means an amount sufficient to treat the disease at a reasonable benefit / risk ratio applicable to the medical treatment, and the effective dose level refers to the disease type, severity, drug activity, and drug sensitivity of the patient. , Time of administration, route of administration and rate of release, duration of treatment, factors including concurrently used drugs, and other factors well known in the medical arts.
  • the pharmaceutical compositions according to the present invention may be administered as individual therapeutic agents or in combination with other therapeutic agents, may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents, and may be administered as single or multiple doses. Taking all of the above factors into consideration, it is important to administer an amount that can obtain the maximum effect in a minimum amount without side effects, which can be easily determined by those skilled in the art.
  • the effective amount of the pharmaceutical composition of the present invention may vary depending on the age, sex, condition, weight of the patient, the absorption of the active ingredient in the body, the inactivation rate and excretion rate, the type of disease, the drug used in general 0.001 to 150 mg, preferably 0.01 to 100 mg per kg of body weight may be administered daily or every other day, or divided into 1 to 3 times a day.
  • the dosage may be increased or decreased depending on the route of administration, the severity of obesity, sex, weight, age, etc., and the above dosage does not limit the scope of the present invention in any way.
  • the present invention provides a food composition for menopausal improvement comprising Lactobacillus acidophilus including the novel strain as an active ingredient.
  • the food composition may include a health functional food composition, but is not limited thereto.
  • the term " improvement" means any action that at least reduces the parameters associated with the condition being treated, such as the extent of symptoms.
  • the health functional food composition may be used simultaneously or separately with the medicament for treatment before or after the onset of the disease for improvement of the menopausal period.
  • the term, functional food composition is a formulation selected from the group consisting of tablets, pills, powders, granules, powders, capsules, and liquid formulations, including one or more of carriers, diluents, excipients, and additives. It is characterized by.
  • Foods which can be added to the composition of the present invention include various foods, powders, granules, tablets, capsules, syrups, beverages, gums, teas, vitamin complexes, and health functional foods.
  • additives which may be further included in the present invention, natural carbohydrates, flavoring agents, nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), flavoring agents (synthetic flavoring agents, natural flavoring agents, etc.), colorants, fillers, pactic acid and salts thereof, One or more components selected from the group consisting of alginic acid and salts thereof, organic acids, protective colloidal thickeners, pH adjusting agents, stabilizers, preservatives, antioxidants, glycerin, alcohols, carbonating agents and pulp can be used.
  • natural carbohydrates examples include monosaccharides such as glucose, fructose and the like; Disaccharides such as maltose, sucrose and the like; And conventional sugars such as polysaccharides such as dextrin, cyclodextrin, and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol, and erythritol.
  • natural flavoring agents tauumatin, stevia extract (for example, rebaudioside A, glycyrrhizin, etc.) and synthetic flavoring agents (saccharin, aspartame, etc.) can be advantageously used.
  • compositions according to the invention include various nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), flavors such as synthetic and natural flavors, colorants and neutralizers, fact acids and their salts, alginic acids and their salts, organic acids, protective colloidal thickeners , pH adjusters, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohols, carbonation agents used in carbonated beverages, etc.
  • other compositions of the present invention may contain flesh for the production of natural fruit juices and vegetable beverages.
  • carrier examples include, but are not limited to, lactose, dex , Sucrose, sorbitol, mannitol, erythritol, starch, acacia rubber, calcium phosphate, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, polyvinylpyrrolidone, methylcellulose, water It is preferable to use at least one selected from the group consisting of sugar syrup, methyl hydroxy benzoate, propyl hydroxy benzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
  • the present invention provides a cosmetic composition for menopausal improvement comprising Lactobacillus acidophilus as an active ingredient including the novel strain.
  • the cosmetic composition of the present invention may include not only Lactobacillus asidophilus, but also components commonly used in cosmetic compositions, and include, for example, conventional agents such as antioxidants, stabilizers, solubilizers, vitamins, pigments, and perfumes. Adjuvants, and carriers.
  • composition of the present invention may be used in addition to Lactobacillus asidophilus, a mixture of organic sunscreens that have been conventionally used insofar as it does not impair the skin protective effect by reacting with Lactobacillus asidophilus.
  • organic sunscreen examples include glyceryl pava, drometrizole trisiloxane, drometrizole, digaloyltrioleate, disodium phenyldibenzimidazole tetrasulfonate, diethylhexyl butamidotriazone, diethylamino Hydroxybenzoylhexylbenzoate, die-methoxycinnamate, a mixture of lowson and dihydroxyacetone, methylenebis-benzotriazolyltetramethylbutylphenol, 4-methylbenzylidene camphor, menthyl anthranilate, benzophenone -3 (oxybenzone), benzophenone-4, benzophenone-8 (dioxyphenbenzone), butylmethoxydibenzoylmethane, bisethylhexyloxyphenol methoxyphenyltriazine, synoxate, ethyldihydroxypropylpava, Oct
  • Examples of products to which the cosmetic composition of the present invention may be added include, for example, cosmetics such as astringent cosmetics, soft cosmetics, nourishing cosmetics, various creams, essences, packs, foundations, and the like, cleansing agents, soaps, treatments, and essences.
  • Specific formulations of the cosmetic composition of the present invention include skin lotion, skin softener, skin toner, astringent, lotion, milk lotion, moisture lotion, nutrition lotion, massage cream, nutrition cream, moisture cream, hand cream, essence, nutrition essence, pack, Formulations such as soaps, shampoos, cleansing foams, cleansing lotions, cleansing creams, body lotions, body cleansers, emulsions, lipsticks, makeup bases, foundations, press powders, loose powders, eye shadows and the like.
  • the content of Lactobacillus asidophilus of the present invention is 0.00001-30% by weight, preferably 0.5-20%, more preferably 1.0-10% by weight of the total weight of the composition. %to be.
  • the content of the Lactobacillus asidophilus is less than 0.00001% by weight, the ultraviolet absorbing effect is greatly reduced, and when it exceeds 30% by weight, skin irritation may occur, and formulation problems may occur.
  • Sprague-Dawley (SD) rats (4 weeks old, 100-120 g, female) were distributed at Samtako Co., Ltd. and used for 4 weeks in the experimental animal breeding box and used in the experiment. Animals were kept under the conditions of temperature 22 ⁇ 1 °C, humidity 55 ⁇ 5%, light / dark cycle day / night cycle (12 hours day / 12 hours night), and roughness of 300 Lux. Feed and water were freely fed. In addition, all animals were managed according to the Guidelines for the Use of Laboratory Animals by the Korea Food Research Institute, Institutional Animal Care and Use Committee (KFRI-IACUC).
  • the incision was cut 1cm away from the last left and right ribs, and then the adipose tissue was held around the ovary to expose the uterus.
  • the surgical site was gently compressed and bleeding, and the skin was sutured with nylon 4-0 suture and disinfected with 10% povidone solution.
  • Antibiotic ointment was applied to prevent infection after surgery and transferred to a cage for recovery. Observation of the condition of the experimental animals for 24 hours after surgery to confirm the abnormality.
  • Example 1-1 After performing ovarian extraction in rats according to the method of Example 1-1, the weight change was measured every week for 10 weeks, and fecal samples were taken, and from 12 weeks after surgery to 2 weeks until the end of the experiment (18 weeks after surgery). Body weight was measured once and fecal samples were taken and then analyzed.
  • the femoral bone density of the animals was measured and analyzed by bone density measurement equipment (pDEXATM, Norland). Bone density change (BD), BMC (bone mineral mass), BMD (bone density), etc. were measured using bone density measuring equipment (pDEXATM, Norland) x-ray, The effect on bone mineral density was analyzed.
  • von Frey filament test was performed 4, 12, 16 and 18 weeks after surgery. After the animals were placed in an acrylic box equipped with a wire mesh test bench for more than 15 minutes, and the movement of the animals became quiet, the von Frey filament (Stoelting, USA) of continuous thickness was used to evaluate the mechanical withdrawal threshold (g) value. It was. The filament was vertically contacted with the left affected plantar foot and maintained for 5-6 seconds, indicating that the animal had a rapid avoidance response or was positive if it fled immediately or licked the plantar while releasing the filament. In the central part, von Frey filament stimulated positive filament and positive filament. The minimum stimulus size indicating a positive response was used as the threshold, and the upper limit was used when no response was performed even at 15 g or more.
  • fecal samples of Sham and OVX rats were recovered, and the metagenome was extracted. More specifically, 0.5g of the sample was homogenized using LN2, and after adding STES buffer, the cells were lysed at 60 ° C. overnight to lyse the cells. After cell lysis, metagenome was extracted using phenol extraction (PCI: phenol-chloroform-isoamylalcohol). Next, in order to remove RNA present on the crude metagenome, 10 ⁇ l (100 mg / ml) of RNase was incubated for 1 hour, and the purity available for sequencing using a DNA purification column was additionally determined. Eggplants obtained purified metagenome.
  • PCI phenol-chloroform-isoamylalcohol
  • G-spin Genomic DNA purification was performed on the acquired metagenome. Quantitative and qualitative characterization of DNA was performed. Using a universal primer (9F, 5'-GAGTTTGATCATGGCTCAG-3 '(SEQ ID NO: 1); 356R, 5'-TGCTGCCTCCC GTAGGAGT-3' (SEQ ID NO: 2)) targeting the bacterial Ribosomal DNA to the extracted / purified DNA Then, the gene was amplified, and at this time, the 8 'barcode sequence of each sample specific was added to 5' of the universal primer so that the sequences derived from each sample could be divided in subsequent analysis.
  • a universal primer (9F, 5'-GAGTTTGATCATGGCTCAG-3 '(SEQ ID NO: 1); 356R, 5'-TGCTGCCTCCC GTAGGAGT-3' (SEQ ID NO: 2)
  • the sequence from each sample is aligned with the Mothur program, the sequences that do not match the barcode sequence or the primer sequence are removed, and the sequence read with the N base (ambiguous) sequence among the analyzed sequences. Only valid sequences were secured through the process of removing. Valid sequence reads were computed for multiple alignment of each sequence, and finally only base sequences with the same comparison sequence length were obtained. Since the number of sequence reads of each sample is different and it is impossible to make an absolute comparison, random subsampling was performed through random suffling on the sequence reads obtained from each sample and used for the final analysis of 1000 sequence reads for each sample.
  • sequences from each sample were mapped to a reference database to identify the nearest microorganism and statistical analysis was performed using the STAMP program based on this data.
  • statistical analysis the distribution patterns of microorganisms at each period were confirmed by PCA analysis, and microbial species with significant differences in major microbial changes and final analysis were obtained.
  • Example 1-1 Female rats subjected to ovarian extraction according to the method of Example 1-1 were weighed for 1 to 18 weeks after the operation according to the method of Example 1-2.
  • the area (Area) appeared at the same level with no difference between the sham and OVX group, while the bone mineral mass (BMC) was significantly reduced in the OVX group compared to the Sham group ( * p ⁇ 0.05) and BMD analysis also showed a significant decrease in OVX group compared to Sham group (*** p ⁇ 0.001).
  • the results are interpreted as a phenomenon of osteoporosis, one of the menopausal symptoms caused by ovarian extraction, and can be used as an index of establishing a menopausal animal model with weight gain.
  • rats were sacrificed to determine the difference in organ weight and length changes between the control group and the ovary extraction group (OVX) .
  • OVX ovary extraction group
  • the liver, spleen, and large intestine were examined. Extraction was carried out to check the weight and length.
  • the blood ALP and AST concentrations of the OVX group were 360.1 ⁇ 53.7 U / L and 226.4 ⁇ 127.0 U / L, respectively, which were significantly increased by 26.3% and 50.9% compared to the Sham group ( * p ⁇ 0.05).
  • ALP is an enzyme produced during bone formation of osteoblasts, which is a useful indicator for bone remodeling activity, and shows an increase in bone diseases.
  • AST is distributed in large amounts in the liver, and when hepatocytes are damaged, blood levels are elevated.
  • Serum Parameter Groups Sham OVX GGT (U / L) 4.1 ⁇ 1.1 5.9 ⁇ 3.8 GLU (mg / dL) 157.3 ⁇ 40.0 154.9 ⁇ 13.6
  • BUN (mg / dL) 15.3 ⁇ 4.2 15.8 ⁇ 3.4 CRE (mg / dL) 0.3 ⁇ 0.1 0.2 ⁇ 0.1 TP (g / dL) 6.0 ⁇ 1.4 6.1 ⁇ 0.2
  • estradiol levels changed after ovarian extraction
  • rats were sacrificed 18 weeks after ovarian extraction in the same manner as in Example 2-3, and the control group (Sham) and the ovary extraction group (OVX) Blood was collected and measured using Estradiol RIA kit (ES180S-100, SIEMENS, Calbiotech Inc).
  • the blood estradiol concentration of the OVX group was significantly reduced by 47% compared to the control group at a concentration of 15.4 ⁇ 4.2 pg / mL, which is a postmenopausal woman due to hormone deficiency due to ovarian extraction You can determine that you have a similar metabolic condition that may occur.
  • the spleen and Peyers patch were isolated from rats of control group (Sham) and ovary extraction group (OVX), and then cultured for 72 hours. The supernatant was taken for cytokine analysis.
  • T cells were activated by treatment with Concanavalin A (2 ⁇ g / ml).
  • Cytokine analysis was performed using the Multi-Analyte LISArray for Rat Kit (Cat. 336161, QIAGEN), IL-1 ⁇ , 1 ⁇ , 2, 4, 6, 10, 12, 13, INF- ⁇ , TNF- ⁇ , GM, The value of RANTES was measured.
  • the degree of color development was compared to re-analyze the cytokines showing a difference from the control group.
  • Rat IL-10 ELISA set (cat No. 555134, BD biosciences) was used for IL-10 analysis. As shown in FIG. 5B, IL-10 was significantly decreased in the Peyers patch as in FIG. 5A. On the other hand, as measured by the spleen, IL-10 was significantly increased in the OVX group, unlike the Peyers patch. Based on previous studies, we have investigated the possibility of increasing IL-10 and regulatory T cell induction of systemic immunity in ovarian extraction model. Confirmed.
  • Example 1-1 the control group (Sham) and ovaries collected during the corresponding period of 0 weeks (weak), 1 week, 3 weeks, 6 weeks, 10 weeks, 14 weeks, and 18 weeks from the ovary extraction surgery
  • Fecal samples of the isolated group (OVX) were used for intestinal microbial change analysis due to estrogen reduction following OVX surgery according to the method of Example 1-6.
  • the distribution difference ratios of the representative microorganisms showing significant differences in the intestinal microbial analysis of the 18th week menopausal model animals are shown in Table 3 below.
  • 12 of the 32 microbial species were found to be decreased in the OVX group, 20 were rather increased in the OVX group.
  • microorganisms found to decrease in OVX group were identified and secured.
  • the changes of microorganisms over time were observed in major microorganisms.
  • Example 3 Based on the results of Example 3, the largest difference as lactic acid bacteria among the microorganisms significantly decreased in the ovary extraction group (OVX) than in the control group (sham) (the presence of more than 3% in the intestine, more than twice the quantitative difference between the two groups ), That is, Lactobacillus acidophilus ( Lactobacillus acidophilus ) was set as a target, and was attempted to isolate the microorganism by varying the culture conditions, such as MRS / Rogosa medium, pH5 / 6.4, anaerobic / aerobic. The microorganisms were isolated using week 18 fecal samples of the Sham and OVX groups, and 101 microorganism colonies were isolated and identified by their 16S rDNA sequencing. .
  • OVX ovary extraction group
  • sham the control group
  • Lactobacillus genus namely 23 Lactobacillus reuteri , 38 Lactobacillus johnsonii , Lactobacillus animalis , and Lactobacillus vaginalis ), Lactobacillus pontis , Lactobacillus taiwanensis , Lactobacillus intestinalis , and Lactobacillus acidophilus set as targets, respectively. Separation was completed one by one.
  • the isolated Lactobacillus asidophilus strain was named as Lactobacillus acidophilus YT1 as a novel strain, and the strain was deposited at the Korea Microorganism Conservation Center (Accession Number KCCM11808P).
  • the rats of each experimental group were administered estradiol or each Lactobacillus asidophilus strain for 16 weeks from 1 week after ovarian extraction surgery, and weighed at weekly intervals.
  • the ovarian extraction surgery group (OVX + PBS) and the OVX surgery-Lactobacillus asidophilus administration group (Sham + PBS) were continuously administered from 2 weeks after the ovarian extraction operation (Sham + PBS).
  • OVX + L. acidophilus KCTC 3164, OVX + L. acidophilus YT1 increased significantly (*** p ⁇ 0.001).
  • Body weight of the estradiol group (OVX + Estradiol) was significantly reduced compared to the OVX surgical group (*** p ⁇ 0.001).
  • Postoperative weight gain means that OVX surgical animal models are well established.
  • the purpose of the present invention was to determine whether femoral bone mineral density was increased by Lactobacillus asidophilus administration.
  • rats were inhaled at 8, 12, and 16 weeks of surgery for each group of rats, and bone density (BMD) of the thigh was measured using a bone density measuring device (pDEXATM, Norland).
  • the mechanical withdrawal threshold (g) value that is, pain sensitivity
  • g the mechanical withdrawal threshold
  • the threshold value of pain-sensing force in the ovarian extraction group (OVX + PBS) was significantly decreased ((p ⁇ 0.001) compared to the control group (Sham + PBS).
  • pain thresholds in estradiol-treated (OVX + Estradiol) and all Lactobacillus asidophilus-treated groups increased significantly compared to ovarian extraction groups. This means that the sensitivity of pain is reduced.
  • the experiment was divided into groups. All samples were orally administered once a day, and as indicated in the experimental group, Lactobacillus luteri was orally administered at a concentration 10 times higher than Lactobacillus asidophilus YT1.
  • the ovary extraction group (OVX + PBS) was confirmed that the pain sensitivity increased through the significant decrease in the threshold value of the pain-sensing force .
  • the threshold value of pain-sensing force was significantly increased compared to the ovarian extraction group, which means that the sensitivity of pain was reduced.
  • Lactobacillus luteri-administered group was administered at 10 times higher concentration than Lactobacillus asidophilus YT1 group, pain threshold did not show statistically significant increase compared to ovarian extraction group. .
  • the inventors have identified and isolated a novel Lactobacillus asidophilus strain, inhibiting the increase in body fat, inhibition of bone density, increased sensitivity of pain, and depression by the new strain and the previously reported Lactobacillus asidophilus strains. The effects of improving menopausal symptoms, such as alleviation, have been confirmed.
  • the composition comprising the Lactobacillus asidophilus according to the present invention is expected to be usefully used as a prophylactic, improvement, or therapeutic use of menopause.

Abstract

본 발명은 신규한 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus) YT1(수탁번호: KCCM11808P) 균주, 및 상기 신규 균주를 포함한 락토바실러스 아시도필루스를 유효성분으로 포함하는 갱년기의 예방, 개선, 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명자들은 난소적출을 통해 갱년기 동물모델을 정립하고 이로부터 장내 미생물의 분포 변화를 확인하고, 갱년기 모델에서 분포가 유의하게 감소하는 유산균 중에서 신규한 락토바실러스 아시도필루스 균주를 동정 및 분리하였으며, 상기 신규 균주 및 종래 보고된 락토바실러스 아시도필루스 균주에 의한 체지방 증가 억제, 골밀도 감소 억제, 통증의 민감도 증가 억제, 및 우울증 완화 등의 갱년기 증상 개선효과를 확인하였는바, 본 발명에 따른 상기 락토바실러스 아시도필루스를 포함하는 조성물은 갱년기의 예방, 개선, 또는 치료 용도로써 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

락토바실러스 아시도필루스를 포함하는 갱년기 예방 또는 치료용 조성물
본 발명은 신규한 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus) YT1(수탁번호: KCCM11808P) 균주, 및 상기 신규 균주를 포함한 락토바실러스 아시도필루스를 유효성분으로 포함하는 갱년기의 예방, 개선, 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
생체가 가지고 있는 장내 미생물체는 개인별로 분류가 가능하며, 이들 미생물체는 장관 내에서 여러 대사(metabolism)에 관여하는 것으로 알려져 있다. 특히 비만과 관련한 장내미생물체는 잘 알려져 있는 분야 중의 하나이며 비만인 사람의 경우 탄수화물, 지방 및 아미노산 등의 대사에 풍부하게 관련된 장내미생물체를 가지고 있는 것으로 보고되었다. 또한, 장내미생물의 대사에 의해 생산되는 부티르산(butyrate)이나 아세테이트(acetate)와 같은 물질들은 장관 면역의 중요 인자로서 helper T cell의 생산 조절이나 G-protein receptor 43(GPR43) 등과의 반응을 통해 병원균 감염으로부터 생체를 보호하는 것으로 알려져 있다. 뿐만 아니라 장내 미생물은 장염(inflammatory bowel disease)이나 대장암(colon cancer)과 같은 대장 내의 각종 질병 외에도 자폐증(autism), 아토피(atopy) 등의 원인으로 지목되고 있다. 장내 미생물과 중추신경계와의 communication을 통해 장내미생물은 장관에 존재하는 장크롬친화성 세포(enterochromaffin cell)로부터의 세로토닌(serotonin) 생성 등을 조절하여 생체의 기분 (mood)에 영향을 미치고 신경계 또한 장관운동 조절이나 장 투과성 조절 등의 간접적 방법과 장관에 존재하는 호르몬 분비세포, 신경계 또는 면역세포에서의 신호 물질 분비 등의 직접적 방법을 통해 장내미생물을 조절할 수 있는 것으로 보고되었다. 이는 장내미생물의 변화가 생체의 감정까지도 조절할 수 있다는 것을 의미한다.
최근에는 인체를 대상으로 한 연구에서 폐경 전과 폐경 후 여성들의 호르몬 수치와 장내미생물의 상관성을 규명하고자 하는 연구가 있었다. 그러나 구체적인 미생물 변화를 찾기보다는 전체적인 미생물 수의 감소 정도만을 확인하는데 그쳤다. 하지만 이 연구를 통해 호르몬의 변화가 장내미생물의 유의적인 변화를 야기한다는 결과를 얻었다(Jour. Transl. Med. 2012;10: 253).
많은 연구를 통해 갱년기 증상은 적절한 식이를 통해 예방할 수 있음이 보고되고 있으며, 특히 WHO에 따르면 갱년기 대표적인 증상의 1/3은 채소, 과일과 같은 식품의 섭취를 통해 예방할 수 있다고 알려져 있으며, 이를 위해 합성 호르몬 대체 요법(Hormone Replacement Therapy; HRT) 보다는 천연물 유래 식품의 섭취를 권고하고 있다. 합성 호르몬 대체제로 사용되고 있는 이소플라본(isoflavone)이 갱년기 증상 경감에 효과적이라는 연구 결과가 일부 보고되고 있지만, 합성 호르몬 제제보다 우수한 효능의 근거는 부족하며, 과도한 양의 섭취는 자궁내막 증식과 유방의 상피세포 증식을 유도한다는 보고가 있으므로, 심도 있는 연구를 통해 새로운 천연물 유래 호르몬 대체 제제로 그 기준을 만족시킬 수 있는 기술 개발이 필요하다.
생체에서 높은 레벨의 에스트로겐은 유방암의 발병률을 높이며, 낮은 레벨의 에스트로겐은 골다공증의 발병률을 높이는 것으로 알려져 있어 체내에 적정량의 에스트로겐 수치를 조절하는 것이 중요하게 생각된다. 최근의 연구결과에서 장내 미생물이 장간순환(enterohepatic circulation)을 통해 생체의 에스트로겐을 조절하는데 영향을 미치는 것을 확인하였으며 이는 생체와 장내 미생물의 상호작용의 결과로 생체에 부족한 estrogen을 보충하기 위해 장내로 유입된 conjugated estrogen을 대사, soluble estrogen을 변환시켜 재사용함으로서 생체의 estrogen homeostasis를 유지하기 위한 결과로 해석되어진다. 폐경기의 에스트로겐 호르몬 감소가 장내미생물에 어떤 영향을 주는지, 핵심 미생물의 변화가 생체에 어떤 영향을 주는지 등을 확인하여 폐경기 이후에 나타나는 골다공증, 인지력 저하, 우울증과 같은 증상들이 에스트로겐 자체의 영향인지 혹은 장내미생물을 매개로 한 영향인지를 명확히 규명할 필요가 있으며, 폐경으로 인한 장내미생물 변화를 확인하고 핵심미생물의 변화가 host의 건강에 어떤 영향을 주는지 명확히 규명하여야 할 필요가 있다.
본 발명자들은 난소 적출을 통해 갱년기 동물모델을 정립하여 폐경으로 인한 장내 미생물 변화를 분석하고, 갱년기 증상 개선을 위한 미생물 소재 개발을 위해 예의 연구한 결과, 대조군에 비하여 갱년기 동물 모델에서 유의하게 분포가 변화한 장내 미생물 중에서 신규한 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus) YT1(수탁번호: KCCM11808P) 균주를 동정 및 분리하였고, 상기 신규 균주를 포함하는 락토바실러스 아시도필루스 균주의 갱년기 증상 개선 효과를 확인하였는바, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명은 갱년기 예방 또는 치료효과를 갖는 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus) YT1 균주(수탁번호: KCCM11808P)를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 신규 균주를 포함한 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus)를 유효성분으로 포함하는, 갱년기 예방, 개선, 또는 치료용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 갱년기 예방 또는 치료효과를 갖는 신규한 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus) YT1 균주(수탁번호: KCCM11808P)를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 신규 균주를 포함한 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus)를 유효성분으로 포함하는, 갱년기 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 갱년기 개선용 식품 조성물, 및/또는 갱년기 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus)를 유효성분으로 포함하는, 갱년기 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 갱년기 개선용 식품 조성물, 및/또는 갱년기 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 식품 조성물에는 건강기능성 식품 조성물이 포함될 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus)는 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus) YT1 균주 또는 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus) KCTC 3164 균주일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 조성물은 갱년기에 의한 체지방 증가를 억제할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 조성물은 갱년기에 의한 골밀도 감소를 억제할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 조성물은 갱년기에 의한 통증의 민감도 증가를 억제할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 조성물은 갱년기에 의한 우울증을 완화시킬 수 있다.
또한, 본 발명은 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus)를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 갱년기 예방 또는 치료방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus)의, 갱년기 예방 또는 치료용도를 제공한다.
본 발명자들은 난소적출을 통해 갱년기 동물모델을 정립하여 이로부터 장내 미생물의 분포 변화를 확인하고, 갱년기 모델에서 분포가 유의하게 감소하는 유산균 중에서 신규한 락토바실러스 아시도필루스 균주를 동정 및 분리하였으며, 상기 신규 균주 및 종래 보고된 락토바실러스 아시도필루스 균주에 의한 체지방 증가 억제, 골밀도 감소 억제, 통증의 민감도 증가 억제, 및 우울증 완화 등의 갱년기 증상 개선효과를 확인하였는바, 본 발명에 따른 상기 락토바실러스 아시도필루스를 포함하는 조성물은 갱년기의 예방, 개선, 또는 치료 용도로써 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 암컷 랫트에 난소 적출수술을 실시한 후 18주 동안 2주 간격으로 대조군(Sham) 및 난소 적출군(OVX)의 체중을 측정하여 비교한 결과이다.
도 2는 암컷 랫트에 난소 적출수술을 실시한 후 대조군(Sham) 및 난소 적출군(OVX)의 대퇴부 골밀도를 측정하여 나타낸 결과이다(Area: 면적, BMC: 골무기질량, BMD: 골밀도).
도 3은 암컷 랫트에 난소 적출수술을 실시한 후 18주째에 대조군(Sham) 및 난소 적출군(OVX)의 혈액을 채취하여 혈중 알칼리성 인산가수분해효소(ALP), 아스파르트산 아미노기전달효소(AST)의 함량을 측정하여 나타낸 결과이다.
도 4는 암컷 랫트에 난소 적출수술을 실시한 후 18주째에 대조군(Sham) 및 난소 적출군(OVX)의 혈액을 채취하여 혈중 에스트라디올(estradiol) 함량을 측정하여 나타낸 결과이다.
도 5a 및 도 5b는 암컷 랫트에 난소 적출수술을 실시한 후 18주째에 대조군(Sham) 및 난소 적출군(OVX)의 면역기관 내 사이토카인 농도를 분석한 것으로, 도 5a는 Peyers patch에서의 다양한 사이토카인(IL-1α, 1β, 2, 4, 6, 10, 12, 13, INF-γ, TNF-α, GM, RANTES)의 농도를 측정한 결과이고, 도 5b는 Peyers patch 및 비장에서의 IL-10 농도를 측정한 결과이다.
도 6은 암컷 랫트에 난소 적출수술을 실시한 후 0, 1, 3, 6, 10, 14, 및 18주(week)에 대조군(Sham) 및 난소 적출군(OVX) 내의 전체 장내 미생물 변화를 PCA plotting으로 나타낸 결과이다.
도 7은 암컷 랫트에 난소 적출수술을 실시한 후 0, 1, 3, 6, 10, 14, 및 18주(week)에 대조군(Sham) 및 난소 적출군(OVX)에서 장내 미생물 변화를 종(species) 수준에서 분석하여 분포가 변화한 주요 미생물들의 시간에 따른 분포 변화를 측정하여 나타낸 것이다.
도 8은 락토바실러스 아시도필루스 투여에 의한 갱년기 증상 개선효과를 평가하기 위하여, 난소 적출수술 후 각 실험군의 시간에 따른 체중변화를 측정하여 나타낸 것이다.
도 9는 락토바실러스 아시도필루스 투여에 의한 갱년기 증상 개선효과를 평가하기 위하여, 난소 적출수술 후 16주째에 각 실험군의 체지방량을 측정하여 나타낸 결과이다.
도 10a 및 도 10b는 락토바실러스 아시도필루스 투여에 의한 갱년기 증상 개선효과를 평가하기 위하여, 난소 적출수술 후 1주부터 16주까지 각 실험군의 사료섭취(도 10a) 및 식수섭취량(도 10b)을 측정하여 나타낸 결과이다.
도 11a 내지 도 11c는 락토바실러스 아시도필루스 투여에 의한 갱년기 증상 개선효과를 평가하기 위하여, 난소 적출수술 후 각각 8(도 11a), 12(도 11b), 16주(도 11c)째에 각 실험군의 대퇴부 골밀도를 측정하여 나타낸 결과이다.
도 12a 내지 도 12d는 락토바실러스 아시도필루스 투여에 의한 갱년기 증상 개선효과를 평가하기 위하여, 난소 적출수술 후 각각 4(도 12a), 8(도 12b), 12(도 12c), 및 16주(도 12d)째에 각 실험군에 대하여 von Frey filament test를 실시하여 통증의 민감도를 측정하여 나타낸 결과이다.
도 13a 및 도 13b는 락토바실러스 아시도필루스 투여에 의한 갱년기 증상 개선효과를 평가하기 위하여, 난소 적출수술 후 16주째에 각 실험군에 대하여 강제수영법 행동실험을 실시하여 부동유지시간(Immobility time)(도 13a) 및 수영시간(Swimming time)(도 13b)을 측정하여 나타낸 결과이다.
도 14a 및 도 14b는 락토바실러스 아시도필루스 균주와 락토바실러스 속 다른 종의 균주와의 효능을 비교하기 위하여, 난소 적출 후, 시료 투여 12주의 랫트의 대퇴부 골밀도(도 14a) 및 통증 민감도(도 14b)를 측정하여 나타낸 결과이다.
본 발명은 갱년기 랫트 모델의 분변에서 분리한 락토바실러스 아시도필루스 신규 균주 및 상기 균주를 포함하는 락토바실러스 아시도필루스를 유효성분으로 포함하는 갱년기의 예방, 개선, 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명자들은 난소 적출을 통해 갱년기 동물모델을 정립하여 폐경으로 인한 장내 미생물 변화를 분석하고, 갱년기 증상 개선을 위한 미생물 소재 개발을 위해 연구한 결과, 갱년기 동물모델에서 분포가 유의하게 감소한 락토바실러스 아시도필루스 균주를 동정 및 분리하고, 상기 균주를 포함하는 락토바실러스 아시도필루스에 의한 갱년기 증상 개선효과를 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명은 갱년기 예방 또는 치료효과를 갖는 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus) YT1 균주(수탁번호: KCCM11808P)를 제공한다.
본 발명자들은 상기 신규한 균주를 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus) YT1으로 명명하고, 2016년 01월 20일자로 한국미생물보존센터에 수탁번호 KCCM11808P으로 기탁하였다.
또한, 본 발명은 상기 신규 균주를 포함한 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus)를 유효성분으로 포함하는 갱년기 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어, 예방이란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 갱년기 증상을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어, 치료란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 갱년기에 대한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 갱년기 예방 또는 치료효과를 갖는 락토바실러스 아시도필루스는 본 발명의 갱년기 랫트 모델의 분변에서 분리 및 동정한 신규 균주(YT1)뿐만 아니라, 종래 공지된 락토바실러스 아시도필루스 균주를 모두 포함하는 것으로, 본 발명에서는 락토바실러스 아시도필루스의 갱년기 예방 또는 치료효과를 최초로 규명한 것이다.
본 발명에서 대상으로 하는 질환인 갱년기(climacterium)란, 폐경기라고도 하며, 여성의 생식기능이 소실하는 징후로 나타나는 월경폐지의 시기를 의미한다. 갱년기가 되면 난소 기능의 실조로 월경의 양이나 주기가 불규칙하게 되고, 수개월에서 3년에 걸친 여포호르몬(에스트로겐)의 분비저하로 월경이 폐지되며, 간뇌의 자율신경중추에 작용하여 자율신경계의 실조를 일으켜 갱년기장애의 원인이 된다. 또한 뇌하수체 전엽의 기능실조로 부신피질 기능을 항진시켜 남성화를 보이며, 갑상선호르몬의 영향으로 갑상선 기능에 이상을 가져와 비만을 초래하는 등 갱년기 특유의 기능실조가 나타난다. 예컨대, 일과성열감(一過性熱感), 동계(動悸:심장의 고동이 보통 때보다 심하여 가슴이 울렁거리는 일), 현기, 이명(耳鳴), 고혈압, 소화기장애, 두통, 기억력감퇴, 우울증 등의 증세가 나타날 수 있다.
본 발명에서는 암컷 랫트에서 난소를 적출하여 갱년기 모델을 제작하고, 정상 대조군과 비교하여 장내 미생물 변화를 분석함으로써 갱년기 모델에서 분포가 유의하게 감소하는 락토바실러스 아시도필루스 신규 균주를 동정 및 분리하였고, 락토바실러스 아시도필루스의 투여에 의한 갱년기 증상 개선효과를 확인하였다.
본 발명의 일실시예에서는, 난소를 적출한 갱년기 모델을 제작하고 정상 대조군과 비교하여 체중, 골밀도, 장기무게 및 길이변화, 혈중 생화학지표, 혈중 에스트라디올, 면역기관의 사이토카인 농도를 측정함으로써 갱년기 모델이 잘 정립되었음을 확인하였다(실시예 2 참고).
본 발명의 다른 실시예에서는, 정립된 갱년기 동물모델을 이용하여 정상대조군과 비교해 장내 미생물 분포 변화를 메타게놈 분석을 통해 확인하였으며, 최종적으로 발굴된 32종의 장내 미생물 가운데 갱년기 모델에서 분포가 감소한 10종의 미생물을 확인하였다(실시예 3 참고).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 실시예 3의 결과를 바탕으로 난소 적출 갱년기 모델에서 유의적으로 분포가 감소한 유산균 중에서 가장 큰 차이를 보인 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus)를 선별하였으며, 분변 샘플로부터 상기 균주를 분리하였다(실시예 4 참고).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 본 발명에서 분리한 상기 신규한 락토바실러스 아시도필루스 균주(YT1) 및 공지된 락토바실러스 아시도필루스 균주(KCTC 3164)를 각각 갱년기 모델에 경구 투여하고, 체중 및 체지방량, 섭식행동 변화, 대퇴부 골밀도, 통증 민감도, 우울증 유사행동을 분석함으로써 상기 균주들의 투여에 의해 갱년기 증상이 개선됨을 확인하였다(실시예 5 참고).
상기 락토바실러스 아시도필루스 균주(KCTC 3164)는 LPSN (List of prokaryotic names with standing in nomenclature) 및 KCTC (Korean Collection for Type Collection)에 의거하여 볼 때, 락토바실러스 아시도필루스 균주의 대표균주이다.
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 본 발명에서 분리한 상기 신규한 락토바실러스 아시도필루스 균주(YT1) 및 락토바실러스 속 다른 종의 균주(락토바실러스 루테리(L. Reuteri))를 각각 갱년기 모델에 경구 투여하고, 대퇴부 골밀도 및 통증 민감도를 분석함으로써 상기 락토바실러스 아시도필루스 균주(YT1)의 투여에 의해 갱년기 증상이 개선됨을 확인하였다(실시예 6 참고).
상기 결과들로 비추어 볼 때, 본 발명에 따른 락토바실러스 아시도필루스 균주는 갱년기의 예방, 개선, 또는 치료를 위해 유용하게 이용될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 락토바실러스 아시도필루스를 유효성분으로 포함하며, 약학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 사이클로덱스트린, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 등을 포함하지만 이에 한정되지 않으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 등 다른 통상의 첨가제를 더 포함할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제, 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제화에 관해서는 레밍턴의 문헌에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 제형에 특별한 제한은 없으나 주사제, 흡입제, 피부 외용제 등으로 제제화할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서 약학적으로 유효한 양은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 다른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래 의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
구체적으로 본 발명의 약학적 조성물의 유효량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에 활성 성분의 흡수도, 불활성률 및 배설속도, 질병종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1 ㎏ 당 0.001 내지 150 ㎎, 바람직하게는 0.01 내지 100 ㎎을 매일 또는 격일 투여하거나, 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 상기 신규 균주를 포함한 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus)를 유효성분으로 포함하는 갱년기 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명에서 상기 식품 조성물은 건강기능성 식품 조성물을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에서 사용되는 용어, "개선"이란 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다. 이때 상기 건강기능성 식품 조성물은 갱년기의 개선을 위하여 해당 질환의 발병 단계 이전 또는 발병 후, 치료를 위한 약제와 동시에 또는 별개로서 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, 건강기능성 식품 조성물은 담체, 희석제, 부형제, 및 첨가제 중 하나 이상을 포함하여 정제, 환제, 산제, 과립제, 분말제, 캡슐제, 및 액제 제형으로 이루어진 군에서 선택된 하나로 제형된 것을 특징으로 한다. 본 발명의 조성물에 첨가할 수 있는 식품으로는, 각종 식품류, 분말, 과립, 정제, 캡슐, 시럽제, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강기능성 식품류 등이 있다. 상기 본 발명에 더 포함될 수 있는 첨가제로는, 천연 탄수화물, 향미제, 영양제, 비타민, 광물(전해질), 풍미제(합성 풍미제, 천연 풍미제 등), 착색제, 충진제, 팩트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH조절제, 안정화제, 방부제, 산화 방지제, 글리세린, 알코올, 탄산화제 및 과육으로 이루어진 구으로부터 선택된 1종 이상의 성분을 사용할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토오스, 수크로오스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올이다. 상기 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 외에 본 발명에 따른 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제, 팩트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명에 다른 조성물은 천연 과일 주스 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 상기 담체, 부형제, 희석제, 및 첨가제의 구체적인 예로는 이에 한정하는 것은 아니나, 락토오스, 덱스트로즈, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 에리스리톨, 전분, 아카시아 고무, 인산칼슘, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 미세결정성 셀룰로즈, 폴리비닐키롤리돈, 셀룰로즈, 폴리비닐피로리돈, 메틸셀룰로즈, 물, 설탕시럽, 메틸 하이드록시 벤조에이트, 프로필하이드록시 벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1종 이상이 사용되는 것이 바람직하다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 신규 균주를 포함한 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus)를 유효성분으로 포함하는 갱년기 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 상기 화장료 조성물은 락토바실러스 아시도필루스뿐만 아니라, 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료, 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 락토바실러스 아시도필루스 이외에, 락토바실러스 아시도필루스와 반응하여 피부보호 효과를 손상시키지 않는 한도에서 종래부터 사용되어오던 유기 자외선 차단제를 혼합하여 사용할 수도 있다. 상기 유기 자외선 차단제로는 글리세릴파바, 드로메트리졸트리실록산, 드로메트리졸, 디갈로일트리올리에이트, 디소듐페닐디벤즈이미다졸테트라설포네이트, 디에틸헥실부타미도트리아존, 디에틸아미노하이드록시벤조일헥실벤조에이트, 디이에이-메톡시신나메이트, 로우손과 디하이드록시아세톤의 혼합물, 메틸렌비스-벤조트리아졸릴테트라메칠부틸페놀, 4-메틸벤질리덴캠퍼, 멘틸안트라닐레이트, 벤조페논-3(옥시벤존),벤조페논-4, 벤조페논-8(디옥시페벤존), 부틸메톡시디벤조일메탄, 비스에틸헥실옥시페놀메톡시페닐트리아진, 시녹세이트, 에틸디하이드록시프로필파바, 옥토크릴렌, 에틸헥실디메틸파바, 에틸헥실메톡시신나메이트, 에틸헥실살리실레이트, 에틸헥실트리아존, 이소아밀-p-메톡시신나메이트, 폴리실리콘-15(디메치코디에틸벤잘말로네이트), 테레프탈릴리덴디캠퍼설포닉애씨드 및 그 염류, 티이에이-살리실레이트 및 아미노벤조산(파바)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 사용할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물을 첨가할 수 있는 제품으로는, 예를 들어, 수렴화장수, 유연화장수, 영양화장수, 각종 크림, 에센스, 팩, 파운데이션 등과 같은 화장품류와 클렌징, 세안제, 비누, 트리트먼트, 미용액 등이 있다. 본 발명의 화장료 조성물의 구체적인 제형으로서는 스킨로션, 스킨 소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양로션, 마사지크림, 영양크림, 모이스쳐 크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액, 립스틱, 메이크업 베이스, 파운데이션, 프레스파우더, 루스파우더, 아이섀도 등의 제형을 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 락토바실러스 아시도필루스의 함량은 조성물 총 중량에 대하여 0.00001-30중량%이며, 바람직하게는 0.5-20%이며, 보다 바람직하게는 1.0-10중량%이다. 상기 락토바실러스 아시도필루스의 함량이 0.00001중량% 미만이면 자외선 흡수 효과가 크게 감소되고, 30중량%를 초과하는 경우에는 피부 자극을 초래할 수 있으며, 제형상의 문제점이 발생할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[ 실시예 ]
실시예 1. 실험방법 및 준비
1-1. 실험동물 및 갱년기 동물모델 제작
갱년기 동물 모델을 제작하기 위해, Sprague-Dawley(SD) 랫트(4주령, 100-120 g, female)를 (주)Samtako에서 분양받아 실험동물용 사육 상자에 4주일간 적응시킨 후 실험에 사용하였다. 동물 사육은 온도 22±1℃, 습도 55± 5%, light/dark cycle 밤낮주기(12 시간 낮/ 12 시간 밤), 조도 300 Lux의 조건하에 이루어졌으며, 사료 및 음수는 자유 급여하였다. 또한, 모든 동물들은 KFRI-IACUC(Korea Food Research Institute, Institutional Animal Care and Use Committee)의 실험동물 사용지침에 의해 관리되었다.
갱년기 동물 모델 제작은 난소적출 모델을 이용하였다. 이를 위해, 상기 랫트의 적응 사육 후 정상으로 판단된 동물에 대하여 체중을 측정하고 무작위적으로 실험군을 분리하였으며, 장기사육을 위하여 실험동물의 개체식별은 피모색소표시법과 ear tag를 사용하였다. 실험에는 성숙기에 접어드는 시기의 SD 암컷 랫트(8주령, 200-250 g)를 사용하였으며, 개체 수는 그룹당 최소 10마리(n=10) 이상이 되게 설정하였다.
난소 적출을 위해 좌우측 마지막 늑골부터 1cm 떨어진 위치를 삭모하여 절개한 후 난소를 둘러싼 지방조직을 잡고 자궁을 노출하고, 난소 부분을 적출한 후 자궁을 원위치 시켰다. 수술 부위는 부드럽게 압박하여 지혈하고, 피부는 nylon 4-0 봉합사로 봉합 후 10% 포비돈액으로 소독하였다. 수술 후 감염방지를 위해 항생제 연고를 도포하였으며, 사육케이지에 옮겨 회복시켰다. 수술 후 24시간 동안 실험동물의 상태를 관찰하여 이상 유무를 확인하였다.
1-2. 체중 측정 및 분변시료 채취
상기 실시예 1-1의 방법에 따라 랫트에서 난소적출을 실시한 후 10주 동안 매주 체중변화를 측정하고 분변 시료를 채취하였으며, 수술 후 12주 이후부터는 실험 종료(수술 후 18주)까지 2주에 한번 씩 체중을 측정하고 분변 시료를 채취하여 이후 분석 실험을 진행하였다.
1-3. 골밀도 측정
난소 적출수술 후 장기간 체중변화 관찰과 더불어 골밀도 측정을 위하여 시기별로 골밀도 측정장비(pDEXATM, Norland)를 이용하여 실험동물의 대퇴부 골밀도를 측정하여 분석하였다. 골밀도 측정장비(pDEXATM, Norland) x-ray를 이용하여 대퇴부의 측정 Area(면적), BMC(골무기질량), BMD(골밀도) 등을 측정하여 OVX에 의한 골밀도 변화와, 후보 장내미생물 처리군의 골밀도 변화에 대한 영향을 비교 분석하였다.
1-4. von Frey filament test
난소 적출수술 후 장기간 체중변화 확인과 분변시료 채취 후 실험동물의 기계적 이질통의 정도를 측정하기 위해, 수술 후 4, 12, 16, 18주에 von Frey filament test를 실시하였다. 실험동물을 철망 실험대가 설치된 아크릴 상자에 넣고 15분 이상 적응시킨 뒤, 실험동물의 움직임 등이 조용해지면 연속된 굵기의 von Frey filament(Stoelting, USA)를 사용하여 mechanical withdrawal threshold(g) 값을 평가하였다. Filament를 좌측 환부 발바닥에 수직으로 접촉시키고 5-6 초간 유지시켜 실험동물이 신속한 회피반응을 보이거나 또는 filament를 떼면서 즉시 움찔하거나 발바닥을 핥으면 양성반응을 보인 것으로 간주하였다. 중앙부의 von Frey filament부터 자극하여 양성반응을 보이면 약한 filament로 자극하고, 양성반응이 없으면 강한 filament로 자극하며 진행하였다. 양성반응을 나타내는 최소의 자극 크기를 역치로 하며, 15 g 이상에서도 반응이 없을 때를 상한선으로 하여 더 이상 적용하지 않았다.
1-5. 강제수영 행동실험(Forced swim test; FST)
실험동물을 난소 적출수술 18주 후 강제수영 행동실험(Forced swim test: FST)을 실시하였다. 이를 위해, 높이 50 cm, 지름 25 cm의 투명한 아크릴 원통형 수조에 물(23-25℃)을 채워 랫트의 꼬리가 바닥에 닿지 않을 정도의 물 높이에 강제로 빠뜨린 다음 15분간 강제수영을 시켰다. 24시간 후에 6분간 같은 환경에서 강제 수영을 시키고 녹화한 후 Smart 3.0 프로그램을 사용하여 기어오르기(Climbing), 수영(Swimming), 부동(Immobility)의 시간을 비교분석하였다. 여기서 기어오르기는 가장 격렬한 운동 상태로, 앞발을 적극적으로 사용하여 아크릴 원통 위로 올라오려고 사지를 다 쓰는 상태를 말하며, 수영은 수면 위를 돌면서 움직이고, 간혹 물밑으로 잠수하기도 하는 상태를 말한다, 또한 부동이란 머리를 포함한 상체의 일부분만 수면 위로 드러낸 채 움직임이 없는 상태인데, 이는 생존 포기에 따른 급격한 우울증 상태를 의미한다. 각각에 해당되는 상태의 시간을 측정함으로써 난소 적출수술 전, 후의 행동변화를 FST를 통해 비교분석 하였다.
1-6. 장내 미생물의 메타게놈 분석
갱년기 동물 모델의 장내 미생물 메타게놈 분석을 위해, 먼저 Sham군 및 OVX(난소적출) 군 랫트의 분변 시료를 0.5g 씩을 회수하여 메타게놈을 추출하였다. 보다 구체적으로, 0.5g의 시료를 LN2를 이용하여 균질화하고, STES buffer를 첨가한 후 60℃에서 밤새 배양하여 세포를 용해시켰다. 세포 용해 후 phenol extraction(PCI: 페놀(phenol)-클로로포름(chloroform)-이소아밀알코올(isoamylalcohol)) 방법을 이용하여 메타게놈을 추출하였다. 다음으로, Crude metagenome상에 존재하는 RNA를 제거하기 위하여 10 ㎕(100 ㎎/㎖)의 RNase를 처리하여 1시간 동안 배양하고, 추가적으로 DNA purification column을 이용하여 서열분석(sequencing)에 이용 가능한 순도를 가지는 정제된 메타게놈을 획득하였다.
확보한 메타게놈을 대상으로 G-spin Genomic DNA purification을 이용하여 정제하고. DNA의 정량적/정성적 특성분석을 진행하였다. 추출/정제한 DNA에 대하여 세균의 Ribosomal DNA를 타겟하는 universal primer(9F, 5'-GAGTTTGATCATGGCTCAG-3'(서열번호 1); 356R, 5'-TGCTGCCTCCC GTAGGAGT-3'(서열번호 2))를 이용하여 해당 유전자를 증폭시켰으며, 이때 universal primer의 5'에 각 샘플 특이적인 8 base의 바코드 서열을 첨가하여 이후의 분석에서 각 샘플 유래 서열들을 나눌 수 있도록 하였다. 다음으로, 16S rDNA 증폭 산물들을 100 ng씩 pooling한 mixture를 만들고, 추가 정제한 후 말단을 blunt end로 repair하고, Ion-torrent sequencing adaptor를 이용하여 각 pooled amplicon의 5' 및 3' 말단에 specific 50mer oligo adaptor를 연결하였다. Adaptor ligation 후에 sequencing target length인 400bp의 adapter ligated fragment들을 회수하기 위하여 pippin prep의 2% etidium free gel을 이용하여 size selection을 하고 adaptor sequence의 양끝 쪽 말단의 primer binding site를 이용하여 5 cycle amplification을 통해 전체 생성물의 양을 증폭 시켰다. 최종 산물의 확인을 위하여 각 단계마다의 산물을 bioanalyzer high sensitivity DNA chip을 이용하여 정량-정성분석한 후, Ion torrent PGM을 이용하여 amplicon sequencing을 진행하였다.
확보된 동물모델의 amplicon sequence를 이용하여 Mothur program으로 각 샘플 유래의 sequence들을 정렬하고, 바코드 서열 혹은 프라이머 서열이 맞지 않는 서열들을 제거하고, 분석한 서열 중에 N base(ambiguous) 서열이 있는 sequence read등을 제거하는 과정 등을 통해 유효한 서열만을 확보하였다. 유효한 sequence read들을 대상으로 computing하여 각 서열들을 multiful alignment하고 최종적으로 비교 서열 길이가 같은 염기서열만을 확보하였다. 각 샘플의 sequence read 수가 달라 절대적인 비교가 불가능하기 때문에 각 샘플에서 확보된 sequence read를 대상으로 random suffling을 통해 무작위적인 subsampling을 진행하여 각 샘플당 1000 sequence read를 대상으로 최종 분석에 이용하였다. 이후 각 샘플 유래의 sequence들을 reference database에 mapping하여 가장 가까운 미생물을 동정하고 이 data를 기반으로 STAMP program을 이용하여 통계분석을 진행하였다. 통계분석을 통해 각 기간별의 미생물 분포 양상을 PCA 분석을 통해 확인하고, 주요 미생물의 변화 및 마지막 분석에서 유의적으로 차이가 나는 미생물 종들을 확보하였다.
1-7. 통계분석
실험결과는 평균과 표준오차(mean±SEM)로 나타내었고, 두 그룹 간의 유의적인 차이는 students t-test를 통해 평가되었으며, p<0.05를 통계적으로 유의성이 있는 것으로 간주하고, p<0.05 (*), p<0.01 (**), p<0.001 (***)로 표시하였다. 각 군과 대조군과의 통계적인 비교는 각 실험군 간 분류하여 일원분산분석(one-way ANOVA) 방법을 사용하였으며, 통계적 분석은 Statview(ver. 5.01, The SAS Institute, CA) 프로그램을 이용하였다.
실시예 2. 난소적출을 통한 갱년기 동물모델 분석
2-1. 체중변화 및 골밀도 측정
상기 실시예 1-1의 방법에 따라 난소 적출수술을 실시한 암컷 랫트에 대하여 실시예 1-2의 방법대로 상기 수술 후 1주부터 18주 동안 체중을 측정하였다.
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 대조군(sham) 랫트에 비하여 난소 적출수술을 시행한 OVX군이 경우 수술 1주 후부터 지속적으로 체중이 유의하게 증가하였다(***p<0.001). 상기 결과는 난소 적출수술에 의한 갱년기 동물모델이 잘 정립되었음을 보여주는 하나의 결과이다.
이에 더하여, 또 다른 갱년기 동물모델의 지표로써 상기 실시예 1-3의 방법에 따라 대조군(Sham)과 난소 적출 군(OVX)의 골밀도를 측정하였다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 면적(Area)은 sham과 OVX군의 차이가 없는 동일한 수준으로 나타난 반면, 골무기질량(BMC)의 경우에는 Sham군에 비하여 OVX군에서 유의성 있게 감소하였으며(*p<0.05), 골밀도(BMD) 분석결과에서도, Sham군에 비하여 OVX군에서 유의성 있게 감소한 것을 확인하였다(***p<0.001). 상기 결과는 난소적출에 의한 갱년기 증상의 하나인 골다공증의 현상으로 해석되어지며, 체중증가와 함께 갱년기 동물모델 정립의 지표로 사용될 수 있는 결과이다.
2-2. 장기 무게 및 길이변화 확인
난소 적출수술 18주 후 랫트를 희생시켜 대조군(Sham)과 난소적출 군(OVX)의 장기 무게 및 길이 변화의 차이를 알아보기 위하여 간(liver), 비장(spleen), 대장(large intestine) 등을 적출하여 무게와 길이를 확인하였다.
그 결과, 하기 표 1에 나타낸 바와 같이, Sham군과 OVX군의 장기 무게 및 길이에는 차이가 없음을 확인하였다.
Group Liver(g) Spleen(g) Large intestine(cm)
Sham (n=10) 7.863±0.225 0.710±0.021 17.050±0.431
OVX (n=18) 8.193±0.233 0.696±0.024 16.606±0.327
2-3. 혈중 생화학지표 분석
난소 적출수술 후 변화되는 혈중 생화학 지표를 측정하기 위하여, 난소 적출수술 18주 후 랫트를 희생시키고, 대조군(Sham)과 난소 적출 군(OVX)의 복대 동맥을 통해 혈액을 채취한 후 자동혈액 분석장비(FUJI DRY-CHEM 3500s)를 통해 혈중 알칼리성 인산가수분해효소(alkaline phosphatase; ALP), 아스파르트산 아미노기전달효소(aspartate aminotransferase; AST), 감마 글루타밀전이효소(gamma-glutamyltransferase; GGT), 포도당(glucose; GLU), 총 단백질(total protein; TP), 혈액 요소질소(blood urea nitrogen; BUN), 크레아티닌(creatinine; CRE) 농도를 비교측정 하였다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, OVX군의 혈중 ALP 및 AST 농도는 각각 360.1 ± 53.7 U/L, 226.4 ± 127.0 U/L로 Sham군 대비하여 유의적으로 26.3%, 50.9% 증가한 것으로 나타났다(*p <0.05). ALP는 골아세포가 골형성을 하는 동안 생성되는 효소로 골 재형성 활동에 유용한 지표이며, 골질환 등에 증가를 나타낸다. AST는 간장에 다량 분포하여, 간세포가 손상되면 혈중 농도가 상승하게 된다. 따라서 상기 결과를 통해 OVX군의 유의적인 ALP, AST 증가는 랫트의 난소적출 수술로 호르몬 결핍에 의해 폐경기 여성에게 나타날 수 있는 유사한 대사 상태가 되었음을 판단할 수 있다. 반면 표 2에 나타낸 바와 같이, OVX군의 혈중 GGT 농도는 Sham군 대비 약 43% 증가하였으나 통계적으로 유의적이지 않았으며, 혈중 GLU, TP, BUN, CRE 농도는 Sham군 대비 변화가 나타나지 않았다.
Serum Parameter Groups
Sham OVX
GGT(U/L) 4.1±1.1 5.9±3.8
GLU(㎎/dL) 157.3±40.0 154.9±13.6
BUN(㎎/dL) 15.3±4.2 15.8±3.4
CRE(㎎/dL) 0.3±0.1 0.2±0.1
TP(g/dL) 6.0±1.4 6.1±0.2
2-4. 혈중 에스트라디올 분석
난소 적출수술 후 변화되는 혈중 에스트라디올(estradiol) 수치를 측정하기 위하여, 상기 실시예 2-3과 동일한 방법으로 난소 적출수술 18주 후 랫트를 희생시키고, 대조군(Sham)과 난소 적출 군(OVX)의 혈액을 채취한 후 Estradiol RIA kit(ES180S-100, SIEMENS, Calbiotech Inc)를 이용하여 측정하였다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, OVX군의 혈중 에스트라디올 농도는 15.4 ± 4.2 pg/mL 농도로 대조군 대비 유의적으로 47% 감소가 나타났으며, 이는 난소적출 수술로 호르몬 결핍에 의해 폐경기 여성에게 나타날 수 있는 유사한 대사 상태가 되었음을 판단할 수 있다.
2-5. 면역기관에서의 사이토카인 분석
난소 적출수술 18주 후 대조군(Sham)과 난소 적출 군(OVX) 해부 시 랫트에서 비장과 Peyers patch를 분리하여 단세포화 한 후 72시간 동안 배양하여 그 상등액을 취해 사이토카인 분석에 사용하였다. 세포 배양 시에는 Concanavalin A(2μg/ml)를 처리하여 T 세포를 활성화하였다. 사이토카인 분석은 Multi-Analyte LISArray for Rat Kit(Cat.336161, QIAGEN)를 사용하였으며, IL-1α, 1β, 2, 4, 6, 10, 12, 13, INF-γ, TNF-α, GM, RANTES의 수치를 측정하였다. 또한, 사이토카인 농도 측정 후 그 발색 정도를 비교하여 대조군과 차이를 보이는 사이토카인을 재분석하였다.
먼저, Peyers patch에서의 사이토카인 분석 결과, 도 5a에 나타낸 바와 같이, 항염증성 사이토카인인 IL-10이 자극 유무에 관계없이 모두 감소되는 것을 확인하였다. 이를 바탕으로 장관면역의 항염증효과에 가능성을 두고 전신면역에서의 IL-10의 변화에 주목하여 IL-10을 분석하였다.
IL-10 분석에는 Rat IL-10 ELISA set(cat No. 555134, BD biosciences)를 사용하였다. 측정결과, 도 5b에 나타낸 바와 같이, 도 5a의 결과와 마찬가지로 Peyers patch에서 IL-10이 유의적으로 감소하였다. 반면 비장에서 측정한 결과 Peyers patch에서의 결과와 달리 OVX군에서 IL-10이 유의적으로 증가하는 결과를 나타내었다. 선행연구 조사를 바탕으로 난소적출 모델에서 전신면역의 IL-10의 증가와 조절 T 세포의 유도 가능성에 대해 연구된 바를 확인하였고 현재 연구결과와 비교하여 IL-10의 증가와 조절 T세포 유도 가능성을 확인하였다.
상기 결과들을 통해, 암컷 랫트에서 난소 적출수술을 통해 갱년기 동물모델이 잘 정립되었음을 확인하였으며, 상기 모델을 이용하여 갱년기에 따른 장내 미생물 변화를 분석하고자 하였다.
실시예 3. 갱년기 동물모델의 장내 미생물 변화 분석
상기 실시예 1-1의 방법에 따라 난소 적출수술 후 부터 0주(weak), 1주, 3주, 6주, 10주, 14주, 및 18주의 해당 기간에 수집한 대조군(Sham)과 난소 적출군(OVX)의 분변샘플을 이용하여 상기 실시예 1-6의 방법에 따라 OVX 수술에 따른 에스트로겐 감소에 의한 장내미생물 변화 분석에 사용하였다.
OVX군과 Sham군의 시간에 따른 전체 미생물의 변화를 PCA plotting으로 확인해 본 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 3주까지는 OVX군과 Sham군의 장내 미생물 차이를 확인할 수 없었으나, 6주부터는 장내 미생물차이가 확인되기 시작하여 10주부터는 OVX군과 Sham군의 장내 미생물의 분리가 확연히 나타나고, 18주경과 후에는 두 군의 장내 미생물의 분포가 분리 양상을 보이는 것을 확인하였다.
나아가 종(species) 수준에서 장내 미생물 변화를 분석한 결과, 각 OVX군 및 Sham군의 장내에는 평균적으로 356종의 세균이 존재하는 것으로 나타났으며, OVX군에서 Sham군 보다 상대적으로 많은 수의 세균종이 발견되었다(Sham군 평균: 324종, OVX군 평균 : 387종). 이에, 각 미생물 종에 대한 통계분석을 진행하여 18주차에서 두 군 간에 유의적인 차이가 있는 미생물을 발굴하였다. 그 결과, 최종 32개의 미생물종을 발굴하였으며 이중 비분리된 미생물 10종을 제외한 22종은 기존에 분리가 되어 있는 세균 종이었다. 18주차 갱년기 모델 동물의 장내 미생물 분석에서 유의적인 차이를 보이는 대표적인 미생물들의 분포차이 비율을 하기 표 3에 나타내었다. 보다 상세하게, 상기 32개의 미생물종 중에서 12종은 OVX군에서 감소하는 것으로 나타났고, 20종은 OVX군에서 오히려 증가하는 양상을 보였다. 이에, OVX군에서 감소하는 것으로 나타난 미생물을 발굴/확보하고 이를 OVX군에서의 갱년기 완화 장내미생물로 활용하여 연구를 진행하였다. 이에 더하여, 주요 미생물의 경우에 시간변화에 따른 미생물의 변화 양상을 관찰하였다.
그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, Prevotella sp. DJF B116, Eubacterium _ tenue, Ruminococcus_bromii, Lactobacillus acidophilus YT1, Lactobacillus sp. ZS2-15, Clostridium_disporicum, Lactobacillus_ murinus, 및 Turicibacter _ sanguinis와 같이 사육 기간이 지남에 따라 dramatic한 변화를 보이는 미생물을 확인할 수 있었다.
Sham OVX
Closest bacteria Mean (%) STDV (%) Mean (%) STDV (%) p-values
Lactobacillusmurinus 9.82 5.01 29.8 14.06 0
Lactobacillusjohnsonii 1.85 1.85 3.67 2.88 0.069
Ruminococcusbromii 0.14 0.11 0.92 1.08 0.008
Marinilabiliasalmonicolor 0.14 0.13 0.35 0.41 0.059
Papillibactercinnamivorans 0.1 0.12 0.58 0.88 0.04
Clostridiumindolis 0.03 0.07 0.43 0.53 0.007
Catabacterhongkongensis 0 0 0.04 0.06 0.015
Uncultured swine fecal bacterium FPC63 0 0 0.12 0.21 0.024
Uncultured bacterium ii1306 0 0 0.06 0.1 0.028
Clostridiales bacterium DJF CP67 0 0 0.03 0.06 0.059
Clostridiumdisporicum 11.1 6.98 1.56 2.23 0.005
Lactobacillus acidophilus 7.4 9.58 0.58 1.41 0.079
Eubacterium tenue 4.18 2.41 1.42 1.66 0.013
Lactobacillus intestinalis 3.16 3.2 0.08 0.15 0.026
Clostridiumlituseburense 2.32 1.06 1.19 1.83 0.064
Clostridiumsp .ID4 0.98 1.08 0.03 0.06 0.038
Uncultured human intestinal firmicute CJ6 0.15 0.08 0.08 0.08 0.062
Clostridiumsp .BG-C36 0.12 0.13 0.01 0.03 0.034
Clostridiaceae bacterium SH032 0.06 0.05 0.01 0.03 0.041
Helicobactersp.WYS-2001/2 0.05 0.05 0 0 0.035
Clostridiumsp . CYP2 0.05 0.05 0.01 0.02 0.062
Ruminococcussp .CO47 0.04 0.05 0.15 0.13 0.006
실시예 4. 갱년기 증상 완화용 장내 미생물 발굴
상기 실시예 3의 결과를 바탕으로, 대조군(sham)에서보다 난소 적출군(OVX)에서 유의적으로 분포가 감소한 미생물 중 유산균으로써 가장 큰 차이(장내 3% 이상 존재, 두군 간에 2배 이상의 양적 차이)를 보이는 미생물, 즉 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus)를 타겟으로 설정하였으며, MRS/Rogosa 배지, pH5/6.4, 혐기/호기 등의 배양 조건을 달리하여 해당 미생물의 분리를 시도하였다. Sham군 및 OVX군의 장내미생물 변화 확인 샘플의 18주차 분변을 이용하여 해당 미생물의 분리를 진행하였으며, 101개의 미생물 콜로니를 단일 분리하고 이들의 16S rDNA 염기서열 분석을 통해 해당 미생물의 동정을 진행하였다.
그 결과, 8종류의 락토바실러스 속 균종 즉, 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri) 23종, 락토바실러스 존소니이(Lactobacillus johnsonii) 38종, 락토바실러스 아니말리스(Lactobacillus animalis), 락토바실러스 바지날리스(Lactobacillus vaginalis), 락토바실러스 폰티스(Lactobacillus pontis), 락토바실러스 타이와네시스(Lactobacillus taiwanensis), 락토바실러스 인테스티날리스(Lactobacillus intestinalis), 및 타겟으로 설정한 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus)를 각각 1종씩 분리 완료하였다. 상기에서 분리된 락토바실러스 아시도필루스 균주는 신규한 균주로써 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus) YT1으로 명명하였으며, 한국미생물보존센터에 균주를 기탁하였다(수탁번호 KCCM11808P).
실시예 5. 락토바실러스 아시도필루스 균주 투여에 따른 갱년기 개선 효능 검증
상기 실시예 4를 통해 분리한 타겟 후보 장내 미생물인 락토바실러스 아시도필루스 YT1 균주 및 종래 공지된 또 다른 락토바실러스 아시도필루스(KCTC 3164)를 이용하여 락토바실러스 아시도필루스에 의한 갱년기 증상 개선 효과를 알아보기 위해, 실시예 1-1의 방법에 따라 제작한 갱년기 동물모델을 이용하여 하기와 같은 방법으로 실험을 실시하였다.
4주령의 암컷 랫트를 4주 동안 순환(rotation)시켜 실험동물 장내 미생물의 균질화를 진행하고 생후 8주에 난소적출을 실시하였다. 전술한 바와 같이 랫트의 분변으로부터 분리한 락토바실러스 아시도필루스 신규 균주 및 공지된 균주를 각각 이용하여 실험을 설계하였으며, 실험군은 1) 대조군(Sham) + PBS(n=10), 2) 난소 적출군(OVX) + PBS(n=10), 3) 난소 적출군(OVX) + 에스트라디올(Estradiol) 20 ㎍/kg(n=10), 4) 난소 적출군(OVX) + 락토바실러스 아시도필루스(L. acidophilus) KCTC 3164(n=11), 5) 난소 적출군(OVX) + 락토바실러스 아시도필루스(L. acidophilus) YT1(n=11)의 총 5개 군으로 나누어 실험에 진행하였다. 모든 시료는 2일에 1번씩 투여했으며, 장내미생물시료는 1x109 CFU/㎖/head 용량으로 경구 투여하였고, 에스트라디올은 20 ㎍/kg/3㎖ 용량으로 복강 투여하였다.
5-1. 체중 및 체지방량 변화 분석
상기 방법에 따라 각 실험군의 랫트들에 대하여 난소 적출수술 1주일 후부터 16주 동안 에스트라디올 또는 각 락토바실러스 아시도필루스 균주를 투여하였으며, 일주일 간격으로 체중을 측정하였다.
그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, 난소 적출수술 후 2주부터 지속적으로 대조군(Sham+PBS)의 체중에 비하여 난소 적출수술군(OVX+PBS) 및 OVX 수술-락토바실러스 아시도필루스 투여군(OVX + L. acidophilus KCTC 3164, OVX + L. acidophilus YT1)의 체중이 유의성 있게 증가하였다(***p<0.001). 에스트라디올을 투여한 군(OVX + Estradiol)의 체중은 OVX 수술군 대비 유의성 있게 감소하였다(***p<0.001)). 수술 후 체중의 증가는 OVX 수술 동물모델이 잘 정립됨을 의미하는 것이다.
다음으로, 난소 적출수술 후 16주에 대퇴부 체지방량을 분석한 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, Sham + PBS군에 대비하여 OVX + PBS군의 체지방량이 유의적으로 증가함을 확인하였으며, 에스트라디올 투여군(OVX + Estradiol) 및 락토바실러스 아시도필루스 신규 균주 투여군(OVX + L. acidophilus YT1)의 체지방량은 OVX + PBS군 대비 유의적으로 감소하는 것을 확인하였다.
5-2. 섭식행동 변화 분석
갱년기 동물모델에서 락토바실러스 아시도필루스 투여에 따른 섭식행동 변화를 평가하기 위해, 난소 적출수술 후 1주부터 16주 동안 사료와 식수 섭취량을 확인하였다.
먼저, 섭식행동 분석 결과, 도 10a에 나타낸 바와 같이, 대조군(Sham + PBS)에 비하여 난소 적출군(OVX + PBS)의 경우 사료섭취량이 감소한 반면, 에스트라디올 투여군(OVX + Estradiol)의 경우 난소 적출군에 비해 유의하게 증가하였으며, 락토바실러스 아시도필루스 투여군의 경우 다소 증가된 사료섭취량을 보였다.
식수섭취량의 경우, 도 10b에 나타낸 바와 같이, 대조군(Sham + PBS)에 비하여 난소 적출군(OVX + PBS)의 경우 식수섭취량이 현저히 감소한 반면, 에스트라디올 투여군(OVX + Estradiol) 및 모든 락토바실러스 아시도필루스 투여군에서 식수섭취량이 유의하게 증가하는 것을 확인하였다. 상기 결과를 통해 락토바실러스 아시도필루스의 영향으로 난소 적출에 의한 갱년기 증상 및 통증에 의한 섭식행동의 감소가 개선되는 것을 알 수 있었다.
5-3. 대퇴부 골밀도 분석
상기 실시예 결과에 더하여, 락토바실러스 아시도필루스 투여에 의해 대퇴부 골밀도가 증가하는지 알아보고자 하였다. 이를 위해, 난소 적출 후, 각 군의 랫트에 대하여 수술 8, 12, 및 16주에 랫트를 흡입마취하고 골밀도 측정장비(pDEXATM, Norland)를 이용하여 대퇴부의 골밀도(BMD)를 측정하였다.
그 결과, 도 11a 내지 도 11c에 나타낸 바와 같이, 난소 적출 8주부터 16주까지 난소 적출군(OVX + PBS)의 경우 대조군(Sham + PBS)에 비해 지속적으로 골밀도가 감소하였다. 이에 반하여, 에스트라디올 투여군(OVX + Estradiol) 및 모든 락토바실러스 아시도필루스 투여군에서는 난소적출군에 비하여 8, 12, 및 16주에 골밀도가 유의하게 증가되었음을 확인하였다.
5-4. 통증 민감도 분석
종래 연구된 보고에 따르면, 난소 적출수술 후 mechanical withdrawal threshold(g) 값 즉, 통증의 민감도가 높아진다고 알려져 있다. 따라서 갱년기 동물모델에서 락토바실러스 아시도필루스 투여에 의한 통증의 민감도 변화를 확인하기 위해, 난소 적출수술 4, 8, 12, 및 16주에 상기 실시예 1-4의 방법에 따라 von Frey filament test를 실시하여 통증의 민감도를 측정하였다.
실험 결과, 도 12a 내지 도 12d에 나타낸 바와 같이, 대조군(Sham + PBS)에 비하여 난소 적출군(OVX + PBS)의 경우 통증을 느끼는 힘의 역치 값이 유의적((p<0.001)으로 감소한 것을 통해 통증의 민감도가 증가한 것을 확인하였다. 이에 반하여, 에스트라디올 투여군(OVX + Estradiol) 및 모든 락토바실러스 아시도필루스 투여군에서는 통증을 느끼는 힘의 역치 값이 난소 적출군에 비해 유의적으로 증가하였으며, 이는 통증의 민감도가 감소한 것을 의미한다.
5-5. 우울증 유사행동 분석
갱년기의 증상으로 나타나는 우울증이 락토바실러스 아시도필루스의 투여에 의해 개선될 수 있는지 알아보기 위해, 난소 적출수술 16주 후에 우울증과 유사한 행동이 나타나는지 상기 실시예 1-5의 방법에 따라 강제수영법 행동실험을 실시하였다.
실험 결과, 도 13a 및 도 13b에 나타낸 바와 같이, 대조군(Sham + PBS)에 비하여 난소 적출군(OVX + PBS)에서 부동유지시간(Immobility time)이 증가하였고, 수영시간(Swimming time)은 유의적으로 감소한 것으로 나타났다. 이에 반하여, 에스트라디올 투여군(OVX + Estradiol) 및 공지된 락토바실러스 아시도필루스 투여군(OVX + L. acidophilus KCTC 3164)에서 부동유지시간은 난소 적출군에 비해 유의적으로 감소하였으며, 수영시간은 증가하는 결과를 나타내었다. 또한, 랫트의 분변에서 분리한 락토바실러스 아시도필루스 신규균주 투여군(OVX + L. acidophilus YT1)에서도 부동유지시간 및 수영시간이 다소 변화한 것을 확인하였다. 이러한 결과는 난소 적출에 따른 호르몬 결핍에 의해 나타내는 우울증과 같은 유사한 행동이 락토바실러스 아시도필루스 투여에 의해 개선됨을 의미한다.
상기 난소적출을 통한 갱년기 동물모델에서 락토바실러스 아시도필루스의 공지균주 및 신규 균주 모두 갱년기 증상 개선효과를 나타냄을 확인하였는바, 상기 결과들을 통해 락토바실러스 아시도필루스 균주의 갱년기 증상 개선 효과를 알 수 있었다.
실시예 6. 락토바실러스 아시도필루스 균주와 락토바실러스 속 다른 종의 균주와의 효능 비교
상기 실시예 5를 통해 검증된 락토바실러스 아시도필루스 균주의 효능과 락토바실러스 속 다른 종의 균주 (락토바실러스 루테리(L. Reuteri))와의 효능 비교를 위해 갱년기 동물모델을 이용하여 하기와 같은 방법으로 실험을 실시하였다.
9주령의 암컷 랫트를 3주 동안 순환(rotation)시켜 실험동물 장내 미생물의 균질화를 진행하고 생후 12주에 난소적출을 실시하였다. 실험군은 1) 대조군(Sham) + PBS(n=9), 2) 난소 적출군(OVX) + PBS(n=10), 3) 난소 적출군(OVX) + 락토바실러스 루테리 (L. Reuteri) 3.7X106/head/day(n=10), 및 4) 난소 적출군(OVX) + 락토바실러스 아시도필루스(L. acidophilus) YT1 3.7X105/head/day(n=10)의 총 4개 군으로 나누어 실험을 진행하였다. 모든 시료는 하루에 1번씩 경구투여 하였으며, 실험군에 표기한 바와 같이 락토바실러스 루테리는 락토바실러스 아시도필루스 YT1보다 10배 높은 농도로 경구 투여하였다.
6-1. 대퇴부 골밀도 분석
갱년기 동물 모델에서 락토바실러스 아시도필루스 균주의 효능과 락토바실러스 속 다른 종의 균주 (락토바실러스 루테리(L. Reuteri))와의 효능 비교를 위해, 난소 적출수술 후, 시료 투여 12주의 랫트를 흡입마취하고 골밀도 측정 장비(pDEXATM, Norland)를 이용하여 대퇴부의 골밀도(BMD)를 측정하였다.
그 결과, 도 14a에 나타낸 바와 같이, 난소 적출군(OVX + PBS)의 경우 대조군(Sham + PBS)에 비해 지속적으로 골밀도가 감소하였다. 이에 반하여, 락토바실러스 아시도필루스 YT1 투여군에서는 난소적출군에 비하여 골밀도가 유의하게 증가되었으나, 락토바실러스 루테리 투여군에서는 락토바실러스 아시도필루스 YT1 투여군에 비해 10배 높은 농도로 투여하였음에도 불구하고 통계적으로 유의한 증가를 보이지 않음을 확인하였다.
6-2. 통증 민감도 분석
갱년기 동물 모델에서 락토바실러스 아시도필루스 균주의 효능과 락토바실러스 속 다른 종의 균주 (락토바실러스 루테리(L. Reuteri))와의 통증의 민감도 변화 효능을 비교하기 위해, 난소 적출수술 후, 시료 투여 12주의 랫트에 대하여 상기 실시예 1-4의 방법에 따라 von Frey filament test를 실시하여 통증의 민감도를 측정하였다.
그 결과, 도 14b에 나타낸 바와 같이, 대조군(Sham + PBS)에 비하여 난소 적출군(OVX + PBS)의 경우 통증을 느끼는 힘의 역치 값이 유의적으로 감소한 것을 통해 통증의 민감도가 증가한 것을 확인하였다. 이에 반하여, 락토바실러스 아시도필루스 YT1 투여군에서는 통증을 느끼는 힘의 역치 값이 난소 적출군에 비해 유의적으로 증가하였으며, 이는 통증의 민감도가 감소한 것을 의미한다. 하지만, 락토바실러스 루테리 투여군에서는 락토바실러스 아시도필루스 YT1 투여군에 비해 10배 높은 농도로 투여하였음에도 불구하고 통증을 느끼는 힘의 역치 값이 난소 적출군에 비해 통계적으로 유의한 증가를 보이지 않음을 확인하였다.
상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
본 발명자들은 신규한 락토바실러스 아시도필루스 균주를 동정 및 분리하였으며, 상기 신규 균주 및 종래 보고된 락토바실러스 아시도필루스 균주에 의한 체지방 증가 억제, 골밀도 감소 억제, 통증의 민감도 증가 억제, 및 우울증 완화 등의 갱년기 증상 개선효과를 확인하였는바, 본 발명에 따른 상기 락토바실러스 아시도필루스를 포함하는 조성물은 갱년기의 예방, 개선, 또는 치료 용도로써 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
Figure PCTKR2017008737-appb-I000001

Claims (19)

  1. 갱년기 예방 또는 치료효과를 갖는 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus) YT1 균주(수탁번호: KCCM11808P).
  2. 제1항의 균주를 포함한 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus)를 유효성분으로 포함하는, 갱년기 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 조성물은 갱년기에 의한 체지방 증가를 억제하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  4. 제2항에 있어서,
    상기 조성물은 갱년기에 의한 골밀도 감소를 억제하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  5. 제2항에 있어서,
    상기 조성물은 갱년기에 의한 통증의 민감도 증가를 억제하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  6. 제2항에 있어서,
    상기 조성물은 갱년기에 의한 우울증을 완화시키는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  7. 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus)를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 갱년기 예방 또는 치료방법.
  8. 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus)의, 갱년기 예방 또는 치료용도.
  9. 제1항의 균주를 포함한 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus)를 유효성분으로 포함하는, 갱년기 개선용 식품 조성물.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 조성물은 건강기능성 식품 조성물인 것을 특징으로 하는, 식품 조성물.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 조성물은 갱년기에 의한 체지방 증가를 억제하는 것을 특징으로 하는, 식품 조성물.
  12. 제9항에 있어서,
    상기 조성물은 갱년기에 의한 골밀도 감소를 억제하는 것을 특징으로 하는, 식품 조성물.
  13. 제9항에 있어서,
    상기 조성물은 갱년기에 의한 통증의 민감도 증가를 억제하는 것을 특징으로 하는, 식품 조성물.
  14. 제9항에 있어서,
    상기 조성물은 갱년기에 의한 우울증을 완화시키는 것을 특징으로 하는, 식품 조성물.
  15. 제1항의 균주를 포함한 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus)를 유효성분으로 포함하는, 갱년기 개선용 화장료 조성물.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 조성물은 갱년기에 의한 체지방 증가를 억제하는 것을 특징으로 하는, 화장료 조성물.
  17. 제15항에 있어서,
    상기 조성물은 갱년기에 의한 골밀도 감소를 억제하는 것을 특징으로 하는, 화장료 조성물.
  18. 제15항에 있어서,
    상기 조성물은 갱년기에 의한 통증의 민감도 증가를 억제하는 것을 특징으로 하는, 화장료 조성물.
  19. 제15항에 있어서,
    상기 조성물은 갱년기에 의한 우울증을 완화시키는 것을 특징으로 하는, 화장료 조성물.
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