JP6734472B2

JP6734472B2 - ラクトバチルス・アシドフィルスを含む更年期の予防または治療用組成物

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Publication number: JP6734472B2
Application number: JP2019507317A
Authority: JP
Inventors: ナム、ヨン−ト; キム、ユン−テ; スンシン、ヒ; イ、ソ−ヨン; キム、チェ−ク; イム、ウン−ヨン; ソン、ウン−チ
Original assignee: コリアフードリサーチインスティテュート
Priority date: 2016-08-12
Filing date: 2017-08-11
Publication date: 2020-08-05
Anticipated expiration: 2037-08-11
Also published as: EP3498821A1; KR20180052569A; KR20190014056A; KR101867768B1; JP2019524138A; KR20180018422A; US11260087B2; US20190192591A1; EP3498821A4

Description

本発明は、新規のラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）ＹＴ１（受託番号：ＫＣＣＭ１１８０８Ｐ）菌株、および前記新規の菌株を含むラクトバチルス・アシドフィルスを有効成分として含む更年期の予防、改善、または治療用組成物に関する。

生体が有している腸内微生物体は、個人別に分類が可能であり、これらの微生物体は、腸管内で様々な代謝に関与するものと知られている。特に肥満と関連した腸内微生物体は、よく知られている分野の一つであり、肥満であるヒトの場合、炭水化物、脂肪およびアミノ酸等の代謝に豊富に関連した腸内微生物体を有しているものと報告された。また、腸内微生物の代謝により生産される酪酸や酢酸のような物質は、腸管免疫の重要因子であって、ヘルパーＴ細胞の生産調節やＧタンパク質受容体４３（ＧＰＲ４３）等との反応を通じて病原菌の感染から生体を保護するものと知られている。それだけでなく、腸内微生物は、炎症性腸疾患や大腸癌のような大腸内の各種疾病の他にも、自閉症、アトピー等の原因として指摘されている。腸内微生物と中枢神経系とのコミュニケーションを通じて腸内微生物は、腸管に存在する腸クロム親和性細胞からのセロトニン生成等を調節して生体の感情（ｍｏｏｄ）に影響を及ぼし、神経系も、腸管運動の調節や腸透過性の調節等の間接的方法と、腸管に存在するホルモン分泌細胞、神経系または免疫細胞での信号物質分泌等の直接的方法を通じて腸内微生物を調節できるものと報告された。これは、腸内微生物の変化が生体の感情までも調節できることを意味する。

最近、人体を対象とする研究において閉経前と閉経後の女性のホルモン数値と腸内微生物の相関性を究明しようとする研究が行われた。しかしながら、具体的な微生物の変化を探すよりは、全体的な微生物数の減少程度のみを確認するにとどまった。しかしながら、この研究を通じてホルモンの変化が腸内微生物の有意的な変化を引き起こすという結果を得た（Jour.Transl.Med.2012;10:253）。

多くの研究を通じて更年期症状は適切な食事を通じて予防できることが報告されており、特にＷＨＯによれば、代表的な更年期症状の１／３は、野菜、果物のような食品の摂取を通じて予防することができると知られており、このために、合成ホルモン補充療法（ＨｏｒｍｏｎｅＲｅｐｌａｃｅｍｅｎｔＴｈｅｒａｐｙ；ＨＲＴ）よりは、天然物由来食品の摂取を勧告している。合成ホルモン補充剤に使用されているイソフラボンが更年期症状の軽減に効果的であるという研究結果が一部報告されているが、合成ホルモン製剤より優れた効能の根拠は不十分であり、過度な量の摂取は、子宮内膜の増殖と乳房の上皮細胞の増殖を誘導するという報告があるので、綿密な研究を通じて新しい天然物由来ホルモン補充剤としてその基準を満足させることができる技術開発が必要である。

生体で高いレベルのエストロゲンは、乳癌の発病率を高め、低いレベルのエストロゲンは、骨粗しょう症の発病率を高めるものと知られているので、体内に適正量のエストロゲン数値を調節することが重要であると考えられる。最近の研究結果において、腸内微生物が腸肝循環（ｅｎｔｅｒｏｈｅｐａｔｉｃｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ）を通じて生体のエストロゲンを調節するのに影響を及ぼすことを確認し、これは、生体と腸内微生物の相互作用の結果で生体に不足したエストロゲンを補充するために腸内に流入した抱合型エストロゲンを代謝、可溶性エストロゲンを変換させて再使用することによって、生体のエストロゲン恒常性を維持するための結果であると解釈される。閉経期のエストロゲンホルモンの減少が腸内微生物にどんな影響を与えるか、核心微生物の変化が生体にどんな影響を与えるか等を確認して、閉経期以降に現れる骨粗しょう症、認知力低下、うつ病のような症状が、エストロゲンそのものの影響であるか、あるいは腸内微生物を媒介とした影響であるかを明確に究明する必要があり、閉経による腸内微生物の変化を確認し、核心微生物の変化がホストの健康にどんな影響を与えるかを明確に究明する必要があった。

本発明者らは、卵巣摘出を通じて更年期動物モデルを確立して、閉経による腸内微生物の変化を分析し、更年期症状の改善のための微生物素材の開発のために鋭意研究した結果、対照群に比べて更年期動物モデルで有意に分布が変化した腸内微生物のうち新規のラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）ＹＴ１（受託番号：ＫＣＣＭ１１８０８Ｐ）菌株を同定および分離し、前記新規の菌株を含むラクトバチルス・アシドフィルス菌株の更年期症状の改善効果を確認し、これに基づいて本発明を完成した。

したがって、本発明は、更年期の予防または治療効果を有するラクトバチルス・アシドフィルスＹＴ１菌株（受託番号：ＫＣＣＭ１１８０８Ｐ）を提供することを目的とする。

また、本発明は、前記新規菌株を含むラクトバチルス・アシドフィルスを有効成分として含む、更年期の予防、改善、または治療用組成物を提供することを目的とする。

しかしながら、本発明が達成しようとする技術的課題は、以上で言及した課題に制限されず、言及されてない他の課題は、下記の記載から当業者に明確に理解され得るものである。

前記のような本発明の目的を達成するために、本発明は、更年期の予防または治療効果を有する新規のラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）ＹＴ１菌株（受託番号：ＫＣＣＭ１１８０８Ｐ）を提供する。

また、本発明は、前記新規の菌株を含むラクトバチルス・アシドフィルスを有効成分として含む、更年期の予防または治療用薬学的組成物、更年期の改善用食品組成物、および／または更年期の改善用化粧料組成物を提供する。

また、本発明は、ラクトバチルス・アシドフィルスを有効成分として含む、更年期の予防または治療用薬学的組成物、更年期の改善用食品組成物、および／または更年期の改善用化粧料組成物を提供する。

本発明の一具現例において、前記食品組成物には、健康機能性食品組成物が含まれ得る。

本発明の他の具現例において、前記ラクトバチルス・アシドフィルスは、ラクトバチルス・アシドフィルスＹＴ１菌株またはラクトバチルス・アシドフィルスＫＣＴＣ３１６４菌株であってもよい。

本発明のさらに他の具現例において、前記組成物は、更年期による体脂肪増加を抑制することができる。

本発明のさらに他の具現例において、前記組成物は、更年期による骨密度減少を抑制することができる。

本発明のさらに他の具現例において、前記組成物は、更年期による痛覚感受性増加を抑制することができる。

本発明のさらに他の具現例において、前記組成物は、更年期によるうつ病を緩和させることができる。

また、本発明は、ラクトバチルス・アシドフィルスを有効成分として含む薬学的組成物を個体に投与する段階を含む、更年期の予防または治療方法を提供する。

また、本発明は、ラクトバチルス・アシドフィルスの、更年期の予防または治療の用途を提供する。

本発明者らは、卵巣摘出を通じて更年期動物モデルを確立して、これから腸内微生物の分布変化を確認し、更年期モデルで分布が有意に減少する乳酸菌のうち新規のラクトバチルス・アシドフィルス菌株を同定および分離し、前記新規の菌株および従来に報告されたラクトバチルス・アシドフィルス菌株による体脂肪増加の抑制、骨密度減少の抑制、痛覚感受性増加の抑制、およびうつ病の緩和等の更年期症状の改善効果を確認したところ、本発明による前記ラクトバチルス・アシドフィルスを含む組成物は、更年期の予防、改善、または治療の用途に有用に用いられると期待される。

雌性ラットに卵巣摘出手術を実施した後、１８週間２週間隔で対照群（Ｓｈａｍ）および卵巣摘出群（ＯＶＸ）の体重を測定して比較した結果である。雌性ラットに卵巣摘出手術を実施した後、対照群（Ｓｈａｍ）および卵巣摘出群（ＯＶＸ）の大腿部の骨密度を測定して示した結果である（Ａｒｅａ：面積、ＢＭＣ：骨無機質含量、ＢＭＤ：骨密度）。雌性ラットに卵巣摘出手術を実施した後、１８週目に対照群（Ｓｈａｍ）および卵巣摘出群（ＯＶＸ）の血液を採取して血中アルカリ性リン酸加水分解酵素（ＡＬＰ）、アスパラギン酸アミノ基転移酵素（ＡＳＴ）の含量を測定して示した結果である。雌性ラットに卵巣摘出手術を実施した後、１８週目に対照群（Ｓｈａｍ）および卵巣摘出群（ＯＶＸ）の血液を採取して血中エストラジオールの含量を測定して示した結果である。図５ａおよび図５ｂは、雌性ラットに卵巣摘出手術を実施した後、１８週目に対照群（Ｓｈａｍ）および卵巣摘出群（ＯＶＸ）の免疫器官内サイトカインの濃度を分析したものであって、図５ａは、パイエル板での多様なサイトカイン（ＩＬ−１α、１β、２、４、６、１０、１２、１３、ＩＮＦ−γ、ＴＮＦ−α、ＧＭ，ＲＡＮＴＥＳ）の濃度を測定した結果であり、図５ｂは、パイエル板および脾臓でのＩＬ−１０の濃度を測定した結果である。雌性ラットに卵巣摘出手術を実施した後、０、１、３、６、１０、１４、および１８週（ｗｅｅｋ）に対照群（Ｓｈａｍ）および卵巣摘出群（ＯＶＸ）内の全体腸内微生物の変化をＰＣＡプロッティングで示した結果である。雌性ラットに卵巣摘出手術を実施した後、０、１、３、６、１０、１４、および１８週（ｗｅｅｋ）に対照群（Ｓｈａｍ）および卵巣摘出群（ＯＶＸ）で腸内微生物の変化を種のレベルで分析して、分布が変化した主な微生物の時間による分布変化を測定して示した図である。ラクトバチルス・アシドフィルスの投与による更年期症状の改善効果を評価するために、卵巣摘出手術後に各実験群の時間による体重変化を測定して示した図である。ラクトバチルス・アシドフィルスの投与による更年期症状の改善効果を評価するために、卵巣摘出手術後に１６週目に各実験群の体脂肪量を測定して示した結果である。図１０ａおよび図１０ｂは、ラクトバチルス・アシドフィルスの投与による更年期症状の改善効果を評価するために、卵巣摘出手術後に１週から１６週まで各実験群の飼料摂取（図１０ａ）および飲水摂取量（図１０ｂ）を測定して示した結果である。図１１ａ〜図１１ｃは、ラクトバチルス・アシドフィルスの投与による更年期症状の改善効果を評価するために、卵巣摘出手術後にそれぞれ８（図１１ａ）、１２（図１１ｂ）、１６週（図１１ｃ）目に各実験群の大腿部の骨密度を測定して示した結果である。図１２ａ〜図１２ｄは、ラクトバチルス・アシドフィルスの投与による更年期症状の改善効果を評価するために、卵巣摘出手術後にそれぞれ４（図１２ａ）、８（図１２ｂ）、１２（図１２ｃ）、および１６週（図１２ｄ）目に各実験群に対してｖｏｎＦｒｅｙフィラメントテストを実施して痛覚感受性を測定して示した結果である。図１３ａおよび図１３ｂは、ラクトバチルス・アシドフィルスの投与による更年期症状の改善効果を評価するために、卵巣摘出手術後に１６週目に各実験群に対して強制水泳試験を実施して無動時間（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｔｙｔｉｍｅ）（図１３ａ）および水泳時間（Ｓｗｉｍｍｉｎｇｔｉｍｅ）（図１３ｂ）を測定して示した結果である。図１４ａおよび図１４ｂは、ラクトバチルス・アシドフィルス菌株とラクトバチルス属他の種の菌株との効能を比較するために、卵巣摘出後に、試料投与１２週のラットの大腿部の骨密度（図１４ａ）および痛覚感受性（図１４ｂ）を測定して示した結果である。

本発明は、更年期ラットモデルの糞便から分離したラクトバチルス・アシドフィルス新規の菌株および前記菌株を含むラクトバチルス・アシドフィルスを有効成分として含む更年期の予防、改善、または治療用組成物に関する。

本発明者らは、卵巣摘出を通じて更年期動物モデルを確立して、閉経による腸内微生物の変化を分析し、更年期症状の改善のための微生物素材を開発するために研究した結果、更年期動物モデルで分布が有意に減少したラクトバチルス・アシドフィルス菌株を同定および分離し、前記菌株を含むラクトバチルス・アシドフィルスによる更年期症状の改善効果を確認することによって本発明を完成した。

これより、本発明は、更年期の予防または治療効果を有するラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）ＹＴ１菌株（受託番号：ＫＣＣＭ１１８０８Ｐ）を提供する。

本発明者らは、前記新規の菌株をラクトバチルス・アシドフィルスＹＴ１と命名し、２０１６年０１月２０日付で韓国微生物保存センターに受託番号ＫＣＣＭ１１８０８Ｐで寄託した。

また、本発明は、前記新規の菌株を含むラクトバチルス・アシドフィルスを有効成分として含む更年期の予防または治療用薬学的組成物を提供する。

本発明において使用される用語「予防」とは、本発明による薬学的組成物の投与により更年期症状を抑制させたり、発病を遅延させるすべての行為を意味する。

本発明において使用される用語「治療」とは、本発明による薬学的組成物の投与により更年期に対する症状が好転したり、有利に変更されるすべての行為を意味する。

本発明において、前記更年期の予防または治療効果を有するラクトバチルス・アシドフィルスは、本発明の更年期ラットモデルの糞便から分離および同定した新規の菌株（ＹＴ１）だけでなく、従来に公知となったラクトバチルス・アシドフィルス菌株を全部含むものであり、本発明では、ラクトバチルス・アシドフィルスの更年期の予防または治療効果を最初に解明したものである。

本発明において対象とする疾患である更年期（ｃｌｉｍａｃｔｅｒｉｕｍ）とは、閉経期とも言い、女性の生殖機能が消失する兆候として現れる月経閉止の時期を意味する。更年期になると、卵巣機能の失調によって月経の量や周期が不規則になり、数ヶ月から３年にわたる卵胞ホルモン（エストロゲン）の分泌低下によって月経が閉止され、間脳の自律神経中枢に作用して自律神経系の失調を起こして、更年期障害の原因となる。また、脳下垂体前葉の機能失調によって副腎皮質機能をこう進させて男性化を示し、甲状腺ホルモンの影響により甲状腺機能に異常をもたらして肥満を招くなど更年期特有の機能失調が現れる。例えば、一過性熱感、動悸（心臓の拍動が普段よりも強く、胸がドキドキすること）、眩気、耳鳴、高血圧、消化器障害、頭痛、記憶力減退、うつ病等の症状が現れる。

本発明では、雌性ラットから卵巣を摘出して更年期モデルを製作し、正常対照群と比較して腸内微生物の変化を分析することによって、更年期モデルで分布が有意に減少するラクトバチルス・アシドフィルス新規の菌株を同定および分離し、ラクトバチルス・アシドフィルスの投与による更年期症状の改善効果を確認した。

本発明の一実施例では、卵巣を摘出した更年期モデルを製作し、正常対照群と比較して体重、骨密度、臓器の重さおよび長さ変化、血中生化学的指標、血中エストラジオール、免疫器官のサイトカインの濃度を測定することによって、更年期モデルがよく確立されたことを確認した（実施例２参照）。

本発明の他の実施例では、確立された更年期動物モデルを利用して正常対照群と比較して腸内微生物の分布変化をメタゲノム分析を通じて確認し、最終的に発掘された３２種の腸内微生物のうち更年期モデルで分布が減少した１０種の微生物を確認した（実施例３参照）。

本発明のさらに他の実施例では、実施例３の結果に基づいて卵巣摘出更年期モデルで有意に分布が減少した乳酸菌のうち最も大きい差異を示したラクトバチルス・アシドフィルスを選別し、糞便サンプルからこの菌株を分離した（実施例４参照）。

本発明のさらに他の実施例では、本発明で分離した前記新規のラクトバチルス・アシドフィルス菌株（ＹＴ１）および公知となったラクトバチルス・アシドフィルス菌株（ＫＣＴＣ３１６４）をそれぞれ更年期モデルに経口投与し、体重および体脂肪量、摂食行動の変化、大腿部の骨密度、痛覚感受性、うつ病様行動を分析することによって、前記菌株の投与により更年期症状が改善されることを確認した（実施例５参照）。

前記ラクトバチルス・アシドフィルス菌株（ＫＣＴＣ３１６４）は、ＬＰＳＮ（Ｌｉｓｔｏｆｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃｎａｍｅｓｗｉｔｈｓｔａｎｄｉｎｇｉｎｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ）およびＫＣＴＣ（ＫｏｒｅａｎＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎｆｏｒＴｙｐｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）によれば、ラクトバチルス・アシドフィルス菌株の代表菌株である。

本発明のさらに他の実施例では、本発明で分離した前記新規のラクトバチルス・アシドフィルス菌株（ＹＴ１）およびラクトバチルス属他の種の菌株（ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌ．Ｒｅｕｔｅｒｉ））をそれぞれ更年期モデルに経口投与し、大腿部の骨密度および痛覚感受性を分析することによって、前記ラクトバチルス・アシドフィルス菌株（ＹＴ１）の投与により更年期症状が改善されることを確認した（実施例６参照）。

前記結果に照らして見るとき、本発明によるラクトバチルス・アシドフィルス菌株は、更年期の予防、改善、または治療のために有用に用いられる。

本発明による薬学的組成物は、ラクトバチルス・アシドフィルスを有効成分として含み、薬学的に許容可能な担体をさらに含むことができる。前記薬学的に許容可能な担体は、製剤化のときに通常用いられるものであって、食塩水、滅菌水、リンガー液、緩衝食塩水、シクロデキストリン、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノール、リポソーム等を含むが、これらに限定されず、必要に応じて抗酸化剤、緩衝液など他の通常の添加剤をさらに含むことができる。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤、潤滑剤等を付加的に添加して、水溶液、懸濁液、乳濁液等のような注射用剤形、丸薬、カプセル、顆粒または錠剤に製剤化することができる。好適な薬学的に許容される担体および製剤化については、レミントンの文献に開示されている方法を利用して各成分によって好ましく製剤化することができる。本発明の薬学的組成物は、剤形に特別な制限はないが、注射剤、吸入剤、皮膚外用剤等に製剤化することができる。

本発明の薬学的組成物は、目的とする方法によって経口投与したり、非経口投与（例えば、静脈内、皮下、腹腔内または局所に適用）することができ、投与量は、患者の状態および体重、疾病の程度、薬物形態、投与経路および時間によって異なるが、当業者により適切に選択され得る。

本発明の薬学的組成物は、薬学的に有効な量で投与する。本発明において薬学的に有効な量は、医学的治療に適用可能な合理的な恩恵／リスクの割合で疾患を治療するのに十分な量を意味し、有効用量のレベルは、患者の疾患の種類、重症度、薬物の活性、薬物に対する感受性、投与時間、投与経路および排出の比率、治療期間、同時に用いられる薬物を含む要素およびその他医学分野によく知られている要素に応じて決定することができる。本発明による薬学的組成物は、個々の治療剤として投与したり、他の治療剤と併用して投与することができ、従来の治療剤とは順次または同時に投与することができ、単一または多重投与することができる。上記の要素をすべて考慮して副作用なしに最小限の量で最大の効果を得ることができる量を投与することが重要であり、これは、当業者により容易に決定することができる。

具体的に、本発明の薬学的組成物の有効量は、患者の年齢、性別、状態、体重、体内における活性成分の吸収度、不活性率および排泄速度、疾病の種類、併用される薬物により異なり、一般的には、体重１ｋｇ当たり０．００１〜１５０ｍｇ、好ましくは０．０１〜１００ｍｇを毎日または隔日投与したり、１日に１〜３回に分けて投与することができる。しかしながら、投与経路、肥満の重症度、性別、体重、年齢等によって増減することができるので、前記投与量がどのような方法でも本発明の範囲を限定するものではない。

本発明の他の態様として、本発明は、前記新規の菌株を含むラクトバチルス・アシドフィルスを有効成分として含む更年期の改善用食品組成物を提供する。

本発明において前記食品組成物は、健康機能性食品組成物を含むことができるが、これに限定されない。

本発明において使用される用語「改善」とは、治療される状態と関連したパラメーター、例えば症状の程度を少なくとも減少させるすべての行為を意味する。この際、前記健康機能性食品組成物は、更年期の改善のために当該疾患の発病段階の前または発病後に、治療のための薬剤と同時にまたは別々に使用することができる。

本発明において使用される用語「健康機能性食品組成物」は、担体、希釈剤、賦形剤、および添加剤のうち一つ以上を含み、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、粉末、カプセル剤、および液剤剤形よりなる群から選ばれる一つに剤形されたことを特徴とする。本発明の組成物に添加できる食品としては、各種食品類、粉末、顆粒、錠剤、カプセル、シロップ剤、飲料、ガム、お茶、ビタミン複合剤、健康機能性食品類等がある。前記本発明にさらに含まれ得る添加剤としては、天然炭水化物、香味剤、栄養剤、ビタミン、鉱物（電解質）、風味剤（合成風味剤、天然風味剤等）、着色剤、充填剤、ペクチン酸およびその塩、アルギン酸およびその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、酸化防止剤、グリセリン、アルコール、炭酸化剤および果肉よりなる群から選ばれる１種以上の成分を使用することができる。上述した天然炭水化物の例は、モノサッカライド、例えば、ブドウ糖、果糖等；ジサッカライド、例えばマルトース、スクロース等；およびポリサッカライド、例えばデキストリン、シクロデキストリン等のような通常の糖、およびキシリトール、ソルビトール、エリスリトール等の糖アルコールである。前記香味剤として天然香味剤（タウマチン、ステビア抽出物（例えばレバウジオシドＡ、グリチルリチン等）および合成香味剤（サッカリン、アスパルテーム等））を有利に使用することができる。上記以外に本発明による組成物は、様々な栄養剤、ビタミン、鉱物（電解質）、合成風味剤および天然風味剤等の風味剤、着色剤および増進剤、ペクチン酸およびその塩、アルギン酸およびその塩、有機酸、保護性のコロイド増粘剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に使用される炭酸化剤等を含有することができる。その他に、本発明による組成物は、天然果物ジュースおよび野菜飲料の製造のための果肉を含有することができる。このような成分は、独立してまたは組み合わせて使用することができる。前記担体、賦形剤、希釈剤、および添加剤の具体例としては、これらに限定されるものではないが、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、エリスリトール、デンプン、アカシアガム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、カルシウムホスフェート、カルシウムシリケート、微結晶セルロース、セルロース、ポリビニルピロリドン、メチルセルロース、水、砂糖シロップ、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアリン酸マグネシウムおよびミネラルオイルよりなる群より選ばれる１種以上を使用することが好ましい。

本発明のさらに他の様態として、本発明は、前記新規の菌株を含むラクトバチルス・アシドフィルスを有効成分として含む更年期の改善用化粧料組成物を提供する。

本発明の前記化粧料組成物は、ラクトバチルス・アシドフィルスだけでなく、化粧料組成物に通常用いられる成分を含むことができ、例えば抗酸化剤、安定化剤、溶解化剤、ビタミン、色素、および香料のような通常の補助剤、そして担体を含むことができる。

また、本発明の組成物は、ラクトバチルス・アシドフィルスの他に、ラクトバチルス・アシドフィルスと反応して皮膚保護効果を損傷させない限度で従来から使用されてきた有機紫外線遮断剤を混合して使用することもできる。前記有機紫外線遮断剤としては、グリセリルＰＡＢＡ、ドロメトリゾールトリシロキサン、ドロメトリゾール、ジガロイルトリオレエート、フェニルジベンズイミダゾールテトラスルホン酸二ナトリウム、ジエチルヘキシルブタミドトリアゾン、ジエチルアミノヒドロキシベンゾイル安息香酸ヘキシル、メトキシケイヒ酸ＤＥＡ、ローソンとジヒドロキシアセトンの混合物、メチレンビスベンゾトリアゾリルテトラメチルブチルフェノール、４−メチルベンジリデンカンファー、アントラニル酸メチル、ベンゾフェノン−３（オキシベンゾン）、ベンゾフェノン−４、ベンゾフェノン−８（ジオキシベンゾン）、ブチルメトキシジベンゾイルメタン、ビスエチルヘキシルオキシフェノールメトキシフェニルトリアジン、シノキセート、エチルジヒドロキシプロピルＰＡＢＡ、オクトクリレン、ジメチルＰＡＢＡエチルヘキシル、メトキシケイヒ酸エチルヘキシル、サリチル酸エチルヘキシル、エチルヘキシルトリアゾン、パラメトキシケイヒ酸イソアミル、ポリシリコーン−１５（ジメチコジエチルベンザルマロネート）、テレフタリリデンジカンフルスルホン酸およびその塩類、サリチル酸ＴＥＡおよびアミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）からなる群より選ばれる１種以上を使用することができる。

本発明の化粧料組成物を添加できる製品としては、例えば、収れん化粧水、柔軟化粧水、栄養化粧水、各種クリーム、エッセンス、パック、ファンデーション等のような化粧品類とクレンジング、洗顔料、石鹸、トリートメント、美容液等がある。本発明の化粧料組成物の具体的な剤形としては、スキンローション、スキンソフナー、スキントナー、アストリンゼント、ローション、ミルクローション、モイスチャーローション、栄養ローション、マッサージクリーム、栄養クリーム、モイスチャークリーム、ハンドクリーム、エッセンス、栄養エッセンス、パック、石鹸、シャンプー、クレンジングフォーム、クレジングローション、クレンジングクリーム、ボディーローション、ボディークレンザー、乳液、リップスティック、メイクアップベース、ファンデーション、プレスパウダー、ルースパウダー、アイシャドウ等の剤形を含む。

本発明の好ましい具現例によれば、本発明のラクトバチルス・アシドフィルスの含量は、組成物の総重量に対して０．００００１〜３０重量％であり、好ましくは０．５〜２０％であり、より好ましくは１．０〜１０重量％である。前記ラクトバチルス・アシドフィルスの含量が０．００００１重量％未満であれば、紫外線吸収効果が大きく減少し、３０重量％を超過する場合には、皮膚刺激を招くことがあり、剤形上の問題点が発生し得る。

以下、本発明の理解を助けるために好ましい実施例を提示する。しかしながら、下記の実施例は、本発明をより容易に理解するために提供されるものに過ぎず、下記実施例により本発明の内容が限定されるものではない。

［実施例１．実験方法および準備］
（１−１．実験動物および更年期動物モデルの作製）
更年期動物モデルを製作するために、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラット（４週齢、１００〜１２０ｇ、メス）を株式会社Ｓａｍｔａｋｏから分譲されて、実験動物用飼育箱に４週間適応させた後に実験に使用した。動物飼育は、温度２２±１℃、湿度５５±５％、明暗サイクルは昼夜周期（１２時間昼間／１２時間夜）、照度３００Ｌｕｘの条件下に行われ、飼料および飲水は、自由給餌した。また、すべての動物は、ＫＦＲＩ−ＩＡＣＵＣ（Korea Food Research Institute, Institutional Animal Care and Use Committee）の実験動物使用指針によって管理された。

更年期動物モデルの作製は、卵巣摘出モデルを利用した。このために、前記ラットの適応飼育後に正常と判断された動物に対して体重を測定し、無作為的に実験群を分離し、長期飼育のために実験動物の個体識別は、被毛色素塗布法と耳標（ｅａｒｔａｇ）を使用した。実験には、成熟期に入る時期のＳＤ雌性ラット（８週齢、２００〜２５０ｇ）を使用し、個体数は、グループ当たり最小１０匹（ｎ＝１０）以上になるように設定した。

卵巣摘出のために左右側の最後の肋骨から１ｃｍ離れた位置を剃毛して切開した後、卵巣を囲んだ脂肪組織を把持して子宮を露出し、卵巣の部分を摘出した後、子宮を元の位置に戻した。手術部位は、滑らかに圧迫して止血し、皮膚は、ナイロン４−０縫合糸で縫合した後、１０％ポビドン液で消毒した。手術後に感染防止のために抗生剤軟膏を塗布し、飼育ケージに移して回復させた。手術後に２４時間の間実験動物の状態を観察して、異常有無を確認した。

（１−２．体重の測定および糞便試料の採取）
前記実施例１−１の方法によってラットから卵巣摘出を実施した後、１０週間毎週体重変化を測定し、糞便試料を採取し、手術後に１２週以降からは、実験終了（手術後１８週）まで２週に一回ずつ体重を測定し、糞便試料を採取して、以後に分析実験を進めた。

（１−３．骨密度の測定）
卵巣摘出手術後に長期間体重変化の観察と共に、骨密度の測定のために時期別に骨密度測定装備（ｐＤＥＸＡＴＭ，Ｎｏｒｌａｎｄ）を利用して実験動物の大腿部の骨密度を測定して分析した。骨密度測定装備（ｐＤＥＸＡＴＭ，Ｎｏｒｌａｎｄ）ｘ−ｒａｙを利用して大腿部の測定Ａｒｅａ（面積）、ＢＭＣ（骨無機質量）、ＢＭＤ（骨密度）等を測定して、ＯＶＸによる骨密度の変化と、候補腸内微生物処理群の骨密度の変化に対する影響を比較分析した。

（１−４．ｖｏｎＦｒｅｙフィラメントテスト）
卵巣摘出手術後に長期間体重変化の確認と共に、糞便試料の採取後に実験動物の機械的異痛の程度を測定するために、手術後４、１２、１６、１８週にｖｏｎＦｒｅｙフィラメントテストを実施した。実験動物を金網実験台が設置されたアクリル箱に入れ、１５分以上適応させた後、実験動物の動き等が静かになってから、連続した太さのｖｏｎＦｒｅｙフィラメント（Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ，ＵＳＡ）を使用して機械逃避閾値（ｍｅｃｈａｎｉｃａｌｗｉｔｈｄｒａｗａｌｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）（ｇ）を評価した。フィラメントを左側の患部の足裏に垂直に接触させ、５〜６秒間維持させて、実験動物が迅速な回避反応を示したり、またはフィラメントを剥離すると直ちにぎくりとしたり、足裏をなめると、陽性反応を示したものと見なした。中央部のｖｏｎＦｒｅｙフィラメントから刺激して陽性反応を示した場合は弱いフィラメントで刺激し、陽性反応がない場合は強いフィラメントで刺激して進めた。陽性反応を示す最小の刺激の大きさを閾値とし、１５ｇ以上でも反応がない場合を上限線として、これ以上適用しなかった。

（１−５．強制水泳試験（Ｆｏｒｃｅｄｓｗｉｍｔｅｓｔ；ＦＳＴ））
実験動物を卵巣摘出手術１８週後に強制水泳試験（Ｆｏｒｃｅｄｓｗｉｍｔｅｓｔ：ＦＳＴ）を実施した。このために、高さ５０ｃｍ、直径２５ｃｍの透明なアクリル円筒形水槽に水（２３〜２５℃）を満たして、ラットの尻尾が底につかないほどの高さの水に強制的に落とした後、１５分間強制水泳をさせた。２４時間後に６分間同じ環境で強制水泳をさせ、録画した後、Ｓｍａｒｔ３．０プログラムを使用して登り（Ｃｌｉｍｂｉｎｇ）、水泳（Ｓｗｉｍｍｉｎｇ）、無動（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｔｙ）の時間を比較分析した。ここで、登りは、最も激烈な運動状態であって、前足を積極的に使用してアクリル円筒上に上がってこようと四肢を全部使用する状態を言い、水泳は、水面上を回って動いて、時々水底に潜水したりする状態を言う。また、不動とは、頭を含む上体の一部分だけ水面上に露出したまま動きがない状態であるが、これは、生存放棄による急激なうつ病状態を意味する。それぞれに該当する状態の時間を測定することによって、卵巣摘出手術の前後の行動変化をＦＳＴを通じて比較分析した。

（１−６．腸内微生物のメタゲノム分析）
更年期動物モデルの腸内微生物メタゲノム分析のために、まず、Ｓｈａｍ群およびＯＶＸ（卵巣摘出）群のラットの糞便試料を０．５ｇずつを回収してメタゲノムを抽出した。より具体的に、０．５ｇの試料をＬＮ２を利用して均質化し、ＳＴＥＳバッファーを添加した後、６０℃で一晩培養して、細胞を溶解させた。細胞溶解後に、フェノール抽出（ＰＣＩ：フェノール−クロロホルム−イソアミルアルコール）方法を利用してメタゲノムを抽出した。次に、クルードメタゲノム上に存在するＲＮＡを除去するために１０μｌ（１００ｍｇ／ｍｌ）のＲＮａｓｅを処理して１時間培養し、さらに、ＤＮＡ精製カラムを利用して配列分析に利用可能な純度を有する精製されたメタゲノムを獲得した。

確保したメタゲノムを対象としてＧ−ｓｐｉｎＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎを利用して精製し、ＤＮＡの定量的／定性的特性分析を進めた。抽出／精製したＤＮＡに対して細菌のリボソームＤＮＡをターゲットするユニバーサルプライマー（９Ｆ、５’−ＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＡＴＧＧＣＴＣＡＧ−３’（配列番号１）；３５６Ｒ、５’−ＴＧＣＴＧＣＣＴＣＣＣＧＴＡＧＧＡＧＴ−３’（配列番号２））を利用して当該遺伝子を増幅させ、この際、ユニバーサルプライマーの５’に各サンプル特異的な８塩基のバーコード配列を添加して、以後の分析で各サンプル由来配列を区分できるようにした。次に、１６ＳｒＤＮＡ増幅産物を１００ｎｇずつプーリングした混合物を作って、追加精製した後、末端を平滑末端にリペアし、Ｉｏｎ−ｔｏｒｒｅｎｔシーケンシングアダプタを利用してそれぞれのプールされたアンプリコンの５’および３’末端に特異的な５０塩基オリゴアダプターを連結した。アダプターをライゲーション後にシーケンシングターゲット長さである４００ｂｐのアダプターをライゲーションした断片を回収するためにｐｉｐｐｉｎｐｒｅｐの２％エチジウムフリーゲルを利用してサイズセレクションを行い、アダプターシーケンスの両端側の末端のプライマー結合部位を利用して５サイクル増幅を通じて全体生成物の量を増幅させた。最終産物の確認のために各段階ごとの産物をｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒｈｉｇｈｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙＤＮＡｃｈｉｐを利用して定量−定性分析した後、ＩｏｎｔｏｒｒｅｎｔＰＧＭを利用してアンプリコンシーケンシングを進めた。

確保された動物モデルのアンプリコンシーケンスを利用してＭｏｔｈｕｒｐｒｏｇｒａｍで各サンプル由来のシーケンスを整列し、バーコード配列あるいはプライマー配列が合わない配列を除去し、分析した配列のうち、Ｎｂａｓｅ（あいまいな）配列があるシーケンスリード等を除去する過程等を通して有効な配列のみを確保した。有効なシーケンスリードを対象としてコンピューティングして、各配列を多重整列し、最終的に比較配列長さが同じ塩基配列のみを確保した。各サンプルのシーケンスリード数が異なっていて、絶対的な比較が不可能なため、各サンプルで確保されたシーケンスリードを対象としてランダムシャッフリングを通じて無作為的なサブサンプリングを進めて、各サンプル当たり１０００シーケンスリードを対象として最終分析に利用した。その後、各サンプル由来のシーケンスを参考データベースにマッピングして最も近い微生物を同定し、このデータに基づいてＳＴＡＭＰプログラムを利用して統計分析を進めた。統計分析を通じて各期間別の微生物分布様相をＰＣＡ分析を通じて確認し、主な微生物の変化および最後の分析で有意に違いが生じる微生物種を確保した。

（１−７．統計分析）
実験結果は、平均と標準誤差（ｍｅａｎ±ＳＥＭ）で示し、二つのグループ間の有意差は、スチューデントのｔ検定を通じて評価され、ｐ＜０．０５を統計的に有意性があるものと見なし、ｐ＜０．０５（^＊）、ｐ＜０．０１（^＊＊）、ｐ＜０．００１（^＊＊＊）で表示した。各群と対照群との統計的な比較は、各実験群間に分類して一元配置分散分析方法を使用し、統計的分析は、Ｓｔａｔｖｉｅｗ（ｖｅｒ．５．０１，ＴｈｅＳＡＳＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，ＣＡ）プログラムを利用した。

［実施例２．卵巣摘出を用いた更年期動物モデルの分析］
（２−１．体重の変化および骨密度の測定）
実施例１−１の方法によって卵巣摘出手術を実施した雌性ラットに対して実施例１−２の方法によって手術後１週から１８週間体重を測定した。

その結果、図１に示されたように、対照群（ｓｈａｍ）ラットに比べて卵巣摘出手術を施行したＯＶＸ群の場合、手術１週後から持続的に体重が有意に増加した（^＊＊＊ｐ＜０．００１）。この結果は、卵巣摘出手術による更年期動物モデルが良好に確立されたことを示す一つの結果である。

これに加えて、さらに他の更年期動物モデルの指標として前記実施例１−３の方法によって対照群（Ｓｈａｍ）と卵巣摘出群（ＯＶＸ）の骨密度を測定した。

その結果、図２に示されたように、面積（Ａｒｅａ）は、ｓｈａｍとＯＶＸ群の差異がない同じレベルで現れたのに対し、骨の無機質量（ＢＭＣ）の場合には、Ｓｈａｍ群に比べてＯＶＸ群で有意的に減少し（^＊ｐ＜０．０５）、骨密度（ＢＭＤ）の分析結果でも、Ｓｈａｍ群に比べてＯＶＸ群で有意的に減少したことを確認した（^＊＊＊ｐ＜０．００１）。この結果は、卵巣摘出による更年期症状の一つである骨粗しょう症の現象と解釈され、体重増加と共に更年期動物モデル確立の指標として使用され得る結果である。

（２−２．臓器重さおよび長さ変化の確認）
卵巣摘出手術１８週後にラットを犠牲にさせて、対照群（Ｓｈａｍ）と卵巣摘出群（ＯＶＸ）の臓器の重さおよび長さ変化の差異を調べてみるために、肝臓、脾臓、大腸等を摘出して、重さと長さを確認した。

その結果、下記表１に示されたように、Ｓｈａｍ群とＯＶＸ群の臓器の重さおよび長さには差異がないことを確認した。

（２−３．血中生化学的指標の分析）
卵巣摘出手術後に変化する血中生化学的指標を測定するために、卵巣摘出手術１８週後にラットを犠牲にして、対照群（Ｓｈａｍ）と卵巣摘出群（ＯＶＸ）の腹部大動脈を通じて血液を採取した後、自動血液分析装備（ＦＵＪＩＤＲＹ−ＣＨＥＭ３５００ｓ）を通じて血中アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、ガンマグルタミルトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）、グルコース（ＧＬＵ）、総蛋白質（ＴＰ）、血液尿素窒素（ＢＵＮ）、クレアチニン（ＣＲＥ）濃度を比較測定した。

その結果、図３に示されたように、ＯＶＸ群の血中ＡＬＰおよびＡＳＴ濃度は、それぞれ３６０．１±５３．７Ｕ／Ｌ、２２６．４±１２７．０Ｕ／Ｌであって、Ｓｈａｍ群に比べて有意に２６．３％、５０．９％増加したことが分かった（^＊ｐ＜０．０５）。ＡＬＰは、骨芽細胞が骨形成をする間に生成される酵素であって、骨再形成活動に有用な指標であり、骨疾患等に増加を示す。ＡＳＴは、肝臓に多量分布し、肝細胞が損傷すると、血中濃度が上昇するようになる。したがって、これら結果を通じてＯＶＸ群の有意的なＡＬＰ，ＡＳＴ増加は、ラットの卵巣摘出手術でホルモン欠乏によって閉経期の女性に現れる類似した代謝状態になったことを判断することができる。他方で、表２に示されたように、ＯＶＸ群の血中ＧＧＴの濃度は、Ｓｈａｍ群に比べて約４３％増加したが、統計的に有意でなく、血中ＧＬＵ、ＴＰ、ＢＵＮ、ＣＲＥの濃度は、Ｓｈａｍ群に比べて変化が現れなかった。

２−４．血中エストラジオールの分析
卵巣摘出手術後に変化する血中エストラジオール数値を測定するために、前記実施例２−３と同じ方法で卵巣摘出手術１８週後にラットを犠牲にさせて、対照群（Ｓｈａｍ）と卵巣摘出群（ＯＶＸ）の血液を採取した後、ＥｓｔｒａｄｉｏｌＲＩＡｋｉｔ（ＥＳ１８０Ｓ−１００，ＳＩＥＭＥＮＳ，ＣａｌｂｉｏｔｅｃｈＩｎｃ）を利用して測定した。

その結果、図４に示されたように、ＯＶＸ群の血中エストラジオール濃度は、１５．４±４．２ｐｇ／ｍＬ濃度であって、対照群に比べて有意に４７％減少が見られた。これは、卵巣摘出手術でホルモン欠乏によって閉経期の女性に現れる類似した代謝状態になったことを判断することができる。

（２−５．免疫器官でのサイトカインの分析）
卵巣摘出手術１８週後、対照群（Ｓｈａｍ）と卵巣摘出群（ＯＶＸ）の解剖時にラットで脾臓とパイエル板を分離して単細胞化した後、７２時間培養して、その上澄み液を取ってサイトカインの分析に使用した。細胞培養時には、コンカナバリンＡ（２μｇ／ｍｌ）を処理してＴ細胞を活性化した。サイトカイン分析は、Ｍｕｌｔｉ−ＡｎａｌｙｔｅＬＩＳＡｒｒａｙｆｏｒＲａｔＫｉｔ（Ｃａｔ．３３６１６１，ＱＩＡＧＥＮ）を使用し、ＩＬ−１α、１β、２、４、６、１０、１２、１３、ＩＮＦ−γ、ＴＮＦ−α、ＧＭ、ＲＡＮＴＥＳの数値を測定した。また、サイトカイン濃度の測定後、その発色程度を比較して、対照群と差異を示すサイトカインを再分析した。

まず、パイエル板でのサイトカイン分析の結果、図５ａに示されたように、抗炎症性サイトカインであるＩＬ−１０が刺激有無に関係なく全部減少することを確認した。これに基づいて、腸管免疫の抗炎症効果に可能性を置いて、全身免疫でのＩＬ−１０の変化に注目してＩＬ−１０を分析した。

ＩＬ−１０分析には、ＲａｔＩＬ−１０ＥＬＩＳＡｓｅｔ（ｃａｔＮｏ．５５５１３４，ＢＤｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用した。測定の結果、図５ｂに示されたように、図５ａの結果と同様に、パイエル板でＩＬ−１０が有的に減少した。他方で、脾臓で測定した結果、パイエル板での結果とは異なって、ＯＶＸ群でＩＬ−１０が有意に増加する結果を示した。先行研究の調査に基づいて卵巣摘出モデルで全身免疫のＩＬ−１０の増加と調節Ｔ細胞の誘導の可能性について研究したものを確認し、現在の研究結果と比較してＩＬ−１０の増加と調節Ｔ細胞誘導の可能性を確認した。

この結果を通じて、雌性ラットで卵巣摘出手術を通じて更年期動物モデルが良好に確立されたことを確認し、前記モデルを利用して更年期による腸内微生物の変化を分析しようと考えた。

［実施例３．更年期動物モデルの腸内微生物の変化の分析］
前記実施例１−１の方法によって卵巣摘出手術後から０週、１週、３週、６週、１０週、１４週、および１８週の当該期間に収集した対照群（Ｓｈａｍ）と卵巣摘出群（ＯＶＸ）の糞便サンプルを利用して前記実施例１−６の方法によってＯＶＸ手術によるエストロゲン減少による腸内微生物の変化の分析に使用した。

ＯＶＸ群とＳｈａｍ群の時間による全体微生物の変化をＰＣＡプロッティングで確認してみた結果、図６に示されたように、３週まではＯＶＸ群とＳｈａｍ群の腸内微生物の差異を確認することができなかったが、６週からは腸内微生物の差異が確認され始めて、１０週からはＯＶＸ群とＳｈａｍ群の腸内微生物の分離が明確に現れ、１８週経過後には二つの群の腸内微生物の分布が分離様相を示すことを確認した。

さらに、種のレベルで腸内微生物の変化を分析した結果、各ＯＶＸ群およびＳｈａｍ群の腸内には、平均的に３５６種の細菌が存在することが明らかにされ、ＯＶＸ群においてＳｈａｍ群より相対的に多数の細菌種が発見された（Ｓｈａｍ群の平均：３２４種、ＯＶＸ群の平均：３８７種）。これにより、各微生物種に対する統計分析を進めて、１８週目で二つの群間に有意差がある微生物を発掘した。その結果、最終３２個の微生物種を発掘し、このうち非分離された微生物１０種を除いた２２種は、従来に分離になっている細菌種であった。１８週目の更年期モデル動物の腸内微生物の分析において有意差を示す代表的な微生物の分布差異の比率を下記表３に示した。より詳細には、前記３２個の微生物種のうち１２種は、ＯＶＸ群で減少することが明らかにされ、２０種は、ＯＶＸ群でかえって増加する様相を示した。これにより、ＯＶＸ群で減少することが明らかにされた微生物を発掘／確保し、これをＯＶＸ群での更年期緩和の腸内微生物として活用して研究を進めた。これに加えて、主な微生物の場合に、時間変化による微生物の変化様相を観察した。

その結果、図７に示されたように、プレボテラＤＪＦＢ１１６（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｓｐ．ＤＪＦＢ１１６）、ユーバクテリウム・テヌエ（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ＿ｔｅｎｕｅ）、ルミノコッカス・ブロミイ（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ＿ｂｒｏｍｉｉ）、ラクトバチルス・アシドフィルスＹＴ１（ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓＹＴ１）、ラクトバチルス属ＺＳ２−１５（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．ＺＳ２−１５）、クロストリジウム・ディスポリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ＿ｄｉｓｐｏｒｉｃｕｍ）、ラクトバチルス・ムリヌス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ＿ｍｕｒｉｎｕｓ）、およびツリシバクター・サングイニス（Ｔｕｒｉｃｉｂａｃｔｅｒ＿ｓａｎｇｕｉｎｉｓ）のように飼育期間が経過するに伴い、ドラマチックな変化を示す微生物を確認することができた。

［実施例４．更年期症状緩和用腸内微生物の発掘］
前記実施例３の結果に基づいて、対照群（ｓｈａｍ）より卵巣摘出群（ＯＶＸ）で有意に分布が減少した微生物のうち乳酸菌として最も大きい差異（腸内３％以上存在、二つの群間に２倍以上の量的差異）を示す微生物、すなわちラクトバチルス・アシドフィルスをターゲットに設定し、ＭＲＳ／Ｒｏｇｏｓａ培地、ｐＨ５／６．４、嫌気／好気性等の培養条件を異にして当該微生物の分離を試みた。Ｓｈａｍ群およびＯＶＸ群の腸内微生物の変化確認サンプルの１８週目の糞便を利用して当該微生物の分離を進め、１０１個の微生物コロニーを単一分離し、これらの１６ＳｒＤＮＡ塩基配列分析を通じて当該微生物の同定を進めた。

その結果、８種類のラクトバチルス属菌種、すなわちラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｒｅｕｔｅｒｉ）２３種、ラクトバチルスジョンソニイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）３８種、ラクトバチルスアニマリス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓａｎｉｍａｌｉｓ）、ラクトバチルスバジナリス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｖａｇｉｎａｌｉｓ）、ラクトバチルスポンティス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｏｎｔｉｓ）、ラクトバチルスタイワネンシス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｔａｉｗａｎｅｎｓｉｓ）、ラクトバチルスインテスティナーリス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）、およびターゲットに設定したラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）をそれぞれ１種ずつ分離完了した。前記で分離したラクトバチルス・アシドフィルス菌株は、新規の菌株であって、ラクトバチルス・アシドフィルスＹＴ１と命名し、韓国微生物保存センターに菌株を寄託した（受託番号ＫＣＣＭ１１８０８Ｐ）。

［実施例５．ラクトバチルス・アシドフィルス菌株の投与による更年期の改善効能の検証］
前記実施例４を通じて分離したターゲット候補腸内微生物であるラクトバチルス・アシドフィルスＹＴ１菌株および従来に公知となったさらに他のラクトバチルス・アシドフィルス（ＫＣＴＣ３１６４）を利用してラクトバチルス・アシドフィルスによる更年期症状の改善効果を調べてみるために、実施例１−１の方法によって作製した更年期動物モデルを利用して下記のような方法で実験を実施した。

４週齢の雌性ラットを４週間循環（ｒｏｔａｔｉｏｎ）させて、実験動物の腸内微生物の均質化を進め、生後８週に卵巣摘出を実施した。前述したように、ラットの糞便から分離したラクトバチルス・アシドフィルス新規の菌株および公知となった菌株をそれぞれ利用して実験を設計し、実験群は、１）対照群（Ｓｈａｍ）＋ＰＢＳ（ｎ＝１０）、２）卵巣摘出群（ＯＶＸ）＋ＰＢＳ（ｎ＝１０）、３）卵巣摘出群（ＯＶＸ）＋エストラジオール２０μｇ／ｋｇ（ｎ＝１０）、４）卵巣摘出群（ＯＶＸ）＋ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）ＫＣＴＣ３１６４（ｎ＝１１）、５）卵巣摘出群（ＯＶＸ）＋ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）ＹＴ１（ｎ＝１１）の合計５個群に分けて実験に進めた。すべての試料は、２日に１回ずつ投与し、腸内微生物試料は、１ｘ１０^９ＣＦＵ／ｍｌ／匹の用量で経口投与し、エストラジオールは、２０μｇ／ｋｇ／３ｍｌの用量で腹腔投与した。

（５−１．体重および体脂肪量変化の分析）
前記方法によって各実験群のラットに対して卵巣摘出手術１週間後から１６週間エストラジオールまたは各ラクトバチルス・アシドフィルス菌株を投与し、一週間の間隔で体重を測定した。

その結果、図８に示されたように、卵巣摘出手術後２週から持続的に対照群（Ｓｈａｍ＋ＰＢＳ）の体重に比べて卵巣摘出手術群（ＯＶＸ＋ＰＢＳ）およびＯＶＸ手術−ラクトバチルス・アシドフィルスの投与群（ＯＶＸ＋Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓＫＣＴＣ３１６４，ＯＶＸ＋Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓＹＴ１）の体重が有意に増加した（^＊＊＊ｐ＜０．００１）。エストラジオールを投与した群（ＯＶＸ＋Ｅｓｔｒａｄｉｏｌ）の体重は、ＯＶＸ手術群に比べて有意的に減少した（^＊＊＊ｐ＜０．００１））。手術後に体重の増加は、ＯＶＸ手術動物モデルが良好に確立されることを意味する。

次に、卵巣摘出手術後１６週に大腿部の体脂肪量を分析した結果、図９に示されたように、Ｓｈａｍ＋ＰＢＳ群に比べてＯＶＸ＋ＰＢＳ群の体脂肪量が有意的に増加することを確認し、エストラジオール投与群（ＯＶＸ＋Ｅｓｔｒａｄｉｏｌ）およびラクトバチルス・アシドフィルス新規の菌株投与群（ＯＶＸ＋Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓＹＴ１）の体脂肪量は、ＯＶＸ＋ＰＢＳ群に比べて有意的に減少することを確認した。

（５−２．摂食行動変化の分析）
更年期動物モデルでラクトバチルス・アシドフィルスの投与による摂食行動変化を評価するために、卵巣摘出手術後１週から１６週間飼料と飲水の摂取量を確認した。

まず、摂食行動分析の結果、図１０ａに示されたように、対照群（Ｓｈａｍ＋ＰＢＳ）に比べて卵巣摘出群（ＯＶＸ＋ＰＢＳ）の場合、飼料摂取量が減少したのに対し、エストラジオール投与群（ＯＶＸ＋Ｅｓｔｒａｄｉｏｌ）の場合、卵巣摘出群に比べて有意に増加し、ラクトバチルス・アシドフィルスの投与群の場合、多少増加した飼料摂取量を示した。

飲水摂取量の場合、図１０ｂに示されたように、対照群（Ｓｈａｍ＋ＰＢＳ）に比べて卵巣摘出群（ＯＶＸ＋ＰＢＳ）の場合では飲水摂取量が顕著に減少したのに対し、エストラジオール投与群（ＯＶＸ＋Ｅｓｔｒａｄｉｏｌ）およびすべてのラクトバチルス・アシドフィルスの投与群において飲水摂取量が有意に増加することを確認した。前記結果を通じてラクトバチルス・アシドフィルスの影響により、卵巣摘出による更年期症状および痛覚による摂食行動の減少が改善されることが分かった。

（５−３．大腿部の骨密度の分析）
前記実施例の結果に加えて、ラクトバチルス・アシドフィルスの投与により大腿部の骨密度が増加するかを調べてみようとした。このために、卵巣摘出後、各群のラットに対して手術８、１２、および１６週にラットを吸入麻酔し、骨密度測定装備（ｐＤＥＸＡＴＭ，Ｎｏｒｌａｎｄ）を利用して大腿部の骨密度（ＢＭＤ）を測定した。

その結果、図１１ａ〜図１１ｃに示されたように、卵巣摘出８週から１６週までにおいて、卵巣摘出群（ＯＶＸ＋ＰＢＳ）の場合、対照群（Ｓｈａｍ＋ＰＢＳ）に比べて持続的に骨密度が減少した。これに対し、エストラジオール投与群（ＯＶＸ＋Ｅｓｔｒａｄｉｏｌ）およびすべてのラクトバチルス・アシドフィルスの投与群では、卵巣摘出群に比べて８、１２、および１６週に骨密度が有意に増加したことを確認した。

（５−４．痛覚感受性の分析）
従来に研究された報告によれば、卵巣摘出手術後に機械逃避閾値（ｍｅｃｈａｎｉｃａｌｗｉｔｈｄｒａｗａｌｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）（ｇ）、すなわち痛覚感受性が高くなると知られている。したがって、更年期動物モデルでラクトバチルス・アシドフィルスの投与による痛覚感受性の変化を確認するために、卵巣摘出手術４、８、１２、および１６週に前記実施例１−４の方法によってｖｏｎＦｒｅｙフィラメントテストを実施して痛覚感受性を測定した。

実験の結果、図１２ａ〜図１２ｄに示されたように、対照群（Ｓｈａｍ＋ＰＢＳ）に比べて卵巣摘出群（ＯＶＸ＋ＰＢＳ）の場合、痛覚を感じる力の閾値が有意に（ｐ＜０．００１）減少したことを通じて、痛覚感受性が増加したことを確認した。これに対し、エストラジオール投与群（ＯＶＸ＋Ｅｓｔｒａｄｉｏｌ）およびすべてのラクトバチルス・アシドフィルスの投与群では、痛覚を感じる力の閾値が卵巣摘出群に比べて有意に増加した。これは、痛覚感受性が減少したことを意味する。

（５−５．うつ病様行動の分析）
更年期の症状で現れるうつ病がラクトバチルス・アシドフィルスの投与により改善され得るかを調べてみるために、卵巣摘出手術１６週後にうつ病と類似した行動が現れるかを実施例１−５の方法によって強制水泳試験を実施した。

実験の結果、図１３ａおよび図１３ｂに示されたように、対照群（Ｓｈａｍ＋ＰＢＳ）に比べて卵巣摘出群（ＯＶＸ＋ＰＢＳ）において無動時間（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｔｙｔｉｍｅ）が増加し、水泳時間（Ｓｗｉｍｍｉｎｇｔｉｍｅ）は有意に減少したことが分かった。これに対し、エストラジオール投与群（ＯＶＸ＋Ｅｓｔｒａｄｉｏｌ）および公知となったラクトバチルス・アシドフィルスの投与群（ＯＶＸ＋Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓＫＣＴＣ３１６４）において無動時間は卵巣摘出群に比べて有意的に減少し、水泳時間は増加する結果を示した。また、ラットの糞便から分離したラクトバチルス・アシドフィルス新規の菌株投与群（ＯＶＸ＋Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓＹＴ１）においても無動時間および水泳時間が多少変化したことを確認した。このような結果は、卵巣摘出によるホルモン欠乏によって示すうつ病のような類似した行動がラクトバチルス・アシドフィルスの投与により改善されることを意味する。

上記の卵巣摘出を通じた更年期動物モデルでラクトバチルス・アシドフィルスの公知の菌株および新規の菌株がいずれも更年期症状の改善効果を示すことを確認したところ、この結果からラクトバチルス・アシドフィルス菌株の更年期症状の改善効果を知ることができた。

［実施例６．ラクトバチルス・アシドフィルス菌株とラクトバチルス属他の種の菌株との効能の比較］
実施例５を通じて検証されたラクトバチルス・アシドフィルス菌株の効能とラクトバチルス属の他の種の菌株（ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌ．Ｒｅｕｔｅｒｉ））との効能比較のために、更年期動物モデルを利用して下記のような方法で実験を実施した。

９週齢の雌性ラットを３週間循環（ｒｏｔａｔｉｏｎ）させて実験動物腸内微生物の均質化を進め、生後１２週に卵巣摘出を実施した。実験群は、（１）対照群（Ｓｈａｍ）＋ＰＢＳ（ｎ＝９）、（２）卵巣摘出群（ＯＶＸ）＋ＰＢＳ（ｎ＝１０）、（３）卵巣摘出群（ＯＶＸ）＋ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌ．Ｒｅｕｔｅｒｉ）３．７×１０^６／匹／日（ｎ＝１０）、および（４）卵巣摘出群（ＯＶＸ）＋ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）ＹＴ１３．７×１０^５／匹／日（ｎ＝１０）の合計４群に分けて実験を進めた。すべての試料は、一日に１回ずつ経口投与し、実験群に表記したように、ラクトバチルス・ロイテリは、ラクトバチルス・アシドフィルスＹＴ１より１０倍高い濃度で経口投与した。

（６−１．大腿部の骨密度の分析）
更年期動物モデルでラクトバチルス・アシドフィルス菌株の効能とラクトバチルス属の他の種の菌株（ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌ．Ｒｅｕｔｅｒｉ））との効能比較のために、卵巣摘出手術後、試料投与１２週のラットを吸入麻酔し、骨密度測定装備（ｐＤＥＸＡＴＭ，Ｎｏｒｌａｎｄ）を利用して大腿部の骨密度（ＢＭＤ）を測定した。

その結果、図１４ａに示されたように、卵巣摘出群（ＯＶＸ＋ＰＢＳ）の場合、対照群（Ｓｈａｍ＋ＰＢＳ）に比べて持続的に骨密度が減少した。これに対し、ラクトバチルス・アシドフィルスＹＴ１投与群では、卵巣摘出群に比べて骨密度が有意に増加したが、ラクトバチルス・ロイテリ投与群では、ラクトバチルス・アシドフィルスＹＴ１投与群に比べて１０倍高い濃度で投与したにもかかわらず、統計的に有意な増加を示さないことを確認した。

（６−２．痛覚感受性の分析）
更年期動物モデルでラクトバチルス・アシドフィルス菌株の効能とラクトバチルス属の他の種の菌株（ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌ．Ｒｅｕｔｅｒｉ））との痛覚感受性の変化効能を比較するために、卵巣摘出手術後、試料投与１２週のラットに対して前記実施例１−４の方法によってｖｏｎＦｒｅｙフィラメントテストを実施して、痛覚感受性を測定した。

その結果、図１４ｂに示されたように、対照群（Ｓｈａｍ＋ＰＢＳ）に比べて卵巣摘出群（ＯＶＸ＋ＰＢＳ）の場合、痛覚を感じる力の閾値が有意的に減少したことを通じて痛覚感受性が増加したことを確認した。これに対し、ラクトバチルス・アシドフィルスＹＴ１投与群では、痛みを感じる力の閾値が卵巣摘出群に比べて有意的に増加し、これは、痛覚感受性が減少したことを意味する。しかしながら、ラクトバチルス・ロイテリ投与群では、ラクトバチルス・アシドフィルスＹＴ１投与群に比べて１０倍高い濃度で投与したにもかかわらず、痛覚を感じる力の閾値が卵巣摘出群に比べて統計的に有意な増加を示さないことを確認した。

上述した本発明の説明は、例示のためのものであり、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者は、本発明の技術的思想や必須的な特徴を変更することなく、他の具体的な形態な容易に変形が可能であることを理解することができる。したがって、以上で記述した実施例は、すべての面において例示的なものであり、限定的ではないものと理解しなければならない。

本発明者らは、新規のラクトバチルス・アシドフィルス菌株を同定および分離し、前記新規の菌株および従来に報告されたラクトバチルス・アシドフィルス菌株による体脂肪増加の抑制、骨密度減少の抑制、痛覚感受性増加の抑制、およびうつ病の緩和等の更年期症状の改善効果を確認したところ、本発明による前記ラクトバチルス・アシドフィルスを含む組成物は、更年期の予防、改善、または治療の用途に有用に用いられるものと期待される。

寄託機関名：ＫＣＣＭ韓国微生物保存センター
受託番号：ＫＣＣＭ１１８０８Ｐ
受託日付：２０１６０１２０

Claims

更年期症状の予防または治療効果を有するラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）ＹＴ１菌株（受託番号：ＫＣＣＭ１１８０８Ｐ）であって、前記更年期症状は、更年期による体脂肪の増加、更年期による骨密度の減少、更年期による痛覚感受性増加又は更年期によるうつ病である、ラクトバチルス・アシドフィルスＹＴ１菌株。
請求項１に記載の菌株を含むラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）を有効成分として含む、更年期症状の予防または治療用薬学的組成物であって、
更年期による体脂肪増加を抑制すること、更年期による骨密度減少を抑制すること、更年期による骨密度減少を抑制すること、更年期による痛覚感受性増加を抑制すること、又は更年期によるうつ病を緩和させることを特徴とする、薬学的組成物。
請求項１に記載の菌株を含むラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）を有効成分として含む、更年期症状の改善用食品組成物であって、
更年期による体脂肪増加を抑制すること、更年期による骨密度減少を抑制すること、更年期による骨密度減少を抑制すること、更年期による痛覚感受性増加を抑制すること、又は更年期によるうつ病を緩和させることを特徴とする、食品組成物。
健康機能性食品組成物であることを特徴とする、請求項３に記載の食品組成物。
請求項１に記載の菌株を含むラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）を有効成分として含む、更年期症状の改善用化粧料組成物であって、
更年期による体脂肪増加を抑制すること、更年期による骨密度減少を抑制すること、更年期による骨密度減少を抑制すること、更年期による痛覚感受性増加を抑制すること、又は更年期によるうつ病を緩和させることを特徴とする、化粧料組成物。