KR102587940B1 - 에스트로겐 수용체 베타 특이적 활성화를 통한 여성 갱년기 증상의 예방 또는 치료 효능을 갖는 비피도박테리움 브레브 hdb7040 균주 - Google Patents

에스트로겐 수용체 베타 특이적 활성화를 통한 여성 갱년기 증상의 예방 또는 치료 효능을 갖는 비피도박테리움 브레브 hdb7040 균주 Download PDF

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Abstract

본 발명의 신규한 비피도박테리움 브레브 HDB7040 균주는 에스트로겐 수용체 베타 재조합 효모 시스템에서 유사 리간드 활성을 통해 에스트로겐 수용체 베타를 자극하여 활성화를 유도한다. 나아가, 본 발명의 HDB7040 균주를 에스트로겐 배제 조건 하에서 인간 유방 세포에 처리한 경우 세포 증식 촉진 효과가 있으며, 또한 에스트로겐 수용체 중 베타의 유전자 발현을 특이적으로 증가시킨다.

Description

에스트로겐 수용체 베타 특이적 활성화를 통한 여성 갱년기 증상의 예방 또는 치료 효능을 갖는 비피도박테리움 브레브 HDB7040 균주 {Bifidobacterium breve HDB7040 strain for preventing or treating female menopausal syndrome via estrogen receptor-beta specific activation}
본 발명은 에스트로겐 수용체 베타를 특이적으로 활성화하여 여성 갱년기 증상의 예방 또는 치료 효능을 갖는 비피도박테리움 브레브 HDB7040(Bifidobacterium breve HDB7040, 기탁번호: KCCM13304P) 균주에 관한 것이다.
대한산부인과학회에서는 폐경을 '여성에서 난소의 기능이 쇠퇴하여 정상적인 월경이 중지되는 현상 또는 시점'이라고 정의하며, 갱년기란 이러한 폐경과 관련된 신체적 및 심리적 변화를 겪는 시기로 폐경 전기와 후기를 모두 포괄한다. 대표적인 갱년기 증상으로는 안면 홍조, 배뇨 장애, 수면 장애, 발한, 감정 변화, 우울증, 관절통, 근육통, 골다공증, 심계항진과 같은 다양한 호르몬성, 신경학적 증상과 근골격계, 비뇨생식기계, 심혈관계 질환을 포함하며, 이러한 증상들은 갱년기 여성의 삶의 질을 저하시키는 것으로 인식되고 있다. 통계청에 따르면 2020년 폐경 및 기타폐경전후장애로 내원한 환자는 669,753명이며, 대한폐경학회에서 2020년 폐경기 여성 500명을 대상으로 진행한 실태조사에서는 폐경기 여성 중 80.3%가 불면증, 수면장애, 안면 홍조, 발한, 식은땀과 같은 폐경 증상을 경험한 것으로 응답하였다.
갱년기 증상 완화를 위한 치료법으로는 여성호르몬을 투여하는 호르몬 요법이 가장 대표적으로, 안면 홍조 개선 및 골다공증의 예방에 큰 기여를 하는 것으로 알려져 있지만 여성호르몬 제제의 장기 투여시 유방암의 발병 위험이 높아질 수 있다는 연구 보고가 있다. 유방암 발병과 같은 부작용을 피하기 위해 티볼론 (Tibolone), 라록시펜염산염 (Raloxifen hydrochloride), 알렌드론산나트륨수화물 (Sodium alendronate hydrate), 리세드론산나트륨 (Risedronate sodium) 등의 약물이 처방되기도 하지만 간질환, 안면 홍조 유발과 같은 부작용이 있을 수 있으며, 이는 갱년기 여성으로 하여금 호르몬 요법과 같은 병원 치료를 주저하게 한다. 대한폐경학회의 자료에 따르면 2020년 실태조사 응답자 중 약 38.3%만이 갱년기 증상 개선을 위해 병원 치료를 시도했다고 응답했으며, 병원 치료가 증상 개선에 가장 도움이 되었다고 응답한 비율도 24.6%로 저조한 편이다. 반면, 가장 많은 수의 응답자가 갱년기 증상 개선을 위해 시도한 관리법은 건강기능식품 섭취 (78.8%)였으며, 가장 중점적으로 시행한 치료 관리법 한 가지를 묻는 질문에서도 39.9%의 응답자가 건강기능식품 섭취를 선택함으로써 생활습관 개선 (22.2%), 호르몬 치료 (20.2%)를 제치고 1위를 차지하였다.
에스트로겐 수용체 (Estrogen receptor)는 에스트로겐과 결합하여 관련 유전자 발현을 조절하는 세포 내 전사 인자로, 인간에서는 에스트로겐 수용체 알파 (Estrogen receptor α, ERα)와 에스트로겐 수용체 베타 (Estrogen receptor β, ERβ) 두 가지 형태가 발현 된다. 이 중 ERα는 여성의 유선 및 자궁 발달과 대사 및 골격 항상성 유지에 중요 역할을 하지만, 과도하게 발현될 경우 유방암이나 자궁내막암, 난소암과 같은 여성 질환을 유발할 수 있다는 연구 보고가 있으며 실제로 전체 유방암 환자 중 약 70%는 ERα-양성 유방암으로 진단된다 (Liu et al., 2020). 이렇게 촉발된 유방암의 경우 타목시펜 (Tamoxifen)과 같은 에스트로겐 수용체 저해제를 투여하게 되는데, 이때 ERβ가 발현되어 있을수록 항암 효과 및 환자 생존율이 유의적으로 증가한다는 것이 임상 연구에서 보고된 바 있다 (Honma et al., 2008; Dalal et al., 2022).
이에 본 발명자들은 관련 연구를 하던 중, 신규 비피도박테리움 브레브 HDB7040 균주가 에스트로겐 수용체 중 ERβ의 활성만을 특이적으로 유도하는 활성이 우수하여 여성 갱년기 예방, 개선 또는 치료용 조성물로 활용될 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
대한민국 등록특허 제10-1771692호 (발명의 명칭: 꽃송이버섯 및 유산균을 유효성분으로 포함하는 갱년기 또는 폐경기 증상의 예방, 치료 또는 개선용 조성물, 출원인: 호서대학교 산학협력단, 등록일: 2017년 8월 21일) 대한민국 등록특허 제10-1867768호 (발명의 명칭: 락토바실러스 아시도필루스를 포함하는 갱년기 예방 또는 치료용 조성물, 출원인: 한국식품연구원, 등록일: 2018년 6월 7일) 대한민국 등록특허 제10-1915904호 (발명의 명칭: 락토바실러스 인테스티날리스를 포함하는 갱년기 예방 또는 치료용 조성물, 출원인: 한국식품연구원, 등록일: 2018년 10월 31일) 대한민국 등록특허 제10-2107443호 (발명의 명칭: 여성 갱년기 증상 예방 또는 치료용 유산균 프로바이오틱스 제제, 출원인: (주) 바이오리듬, 등록일: 2020년 4월 28일) 대한민국 등록특허 제10-2362968호 (발명의 명칭: 유산균 및 프리바이오틱스를 포함하는 갱년기 증상의 예방, 완화 또는 치료용 조성물, 출원인: 주식회사 쎌바이오텍, 등록일: 2022년 2월 10일) 대한민국 공개특허 제10-2021-0104596호 (발명의 명칭: 락토바실러스 가세리 BNR17을 포함하는 갱년기 질환 치료용 조성물, 출원인: (주) 에이스바이옴, 공개일: 2021년 8월 25일) 대한민국 공개특허 제10-2021-0124931호 (발명의 명칭: 락토바실러스 아시도필루스를 포함하는 갱년기 여성의 근관절통, 두통, 또는 질 건조증의 예방, 개선, 또는 치료용 조성물, 출원인: 한국식품연구원 외 1인, 공개일: 2021년 10월 15일) 대한민국 등록특허 제10-2332021호 (발명의 명칭: A2 베타 카제인 단백질이 포함된 배지 조성물을 이용한 아미노바이오틱스의 제조방법 및 이를 통해 제조한 아미노바이오틱스, 출원인: 주식회사 현대바이오랜드, 등록일: 2021년 11월 24일) 대한민국 등록특허 제10-2323673호 (발명의 명칭: HtrA 샤페론 프로바이오틱스의 제조방법 및 이를 통해 제조된 장 마이크로바이옴 조절 효능이 있는 염증성 장질환 치료용 조성물, 출원인: 주식회사 현대바이오랜드, 등록일: 2021년 11월 03일) 대한민국 등록특허 제10-2084003호 (발명의 명칭: 저분자 기능성 생물소재와 포접된 유산균 뉴클레오티드의 제조방법 및 그 방법으로 제조된 큐비솜, 출원인: 주식회사 현대바이오랜드, 등록일: 2020년 2월 26일)
Jafarnejad et al., Effects of a multispecies probiotic supplement on bone health in osteopenic postmenopausal women: A randomized, double-blind, controlled trial, Journal of the American College of Nutrition, 36:497-506, 2017 Lee et al., The effect of Lactobacillus gasseri BNR17 on postmenopausal symptoms in ovariectomized rats, Journal of Microbiology and Biotechnology, 28:1281-1287, 2021 Lim et al., Lactobacillus intestinalis YT2 restores the gut microbiota and improves menopausal symptoms in ovariectomized rats, Beneficial Microbes, 12:503-516, 2021 Sapra et al., Bifidobacterium longum ameliorates ovariectomy-induced bone loss via enhancing anti-osteoclastogenic and immunomodulatory potential of regulatory B cells (Bregs), Frontiers in Immunology, 13:875788, 2022 Sawada et al., Effects of Lactobacillus gasseri CP2305 on mild menopausal symptoms in middle-aged women, Nutrients, 19:1695, 2022 Shafie et al., The effect of probiotics on mood and sleep quality in postmenopausal women: A triple-blind randomized controlled trial, Clinical Nutrition ESPEN, 50:15-23, 2022 Liu et al., ERα, a key target for cancer therapy: a review, OncoTargets and Therapy, 13:2183-2191, 2020 Honma et al., Clinical importance of estrogen receptor-beta evaluation in breast cancer patients treated with adjuvant tamoxifen therapy, Journal of Clinical Oncology, 26:3727-3734, 2008 Dalal et al., Clinical associations of ESR2 (estrogen receptor beta) expression across thousands of primary breast tumors, Scientific Reports, 12:4696, 2022
본 발명의 목적은 에스트로겐 수용체 베타를 특이적으로 활성화하여 여성 갱년기 증상의 예방 또는 치료 효능을 갖는 비피도박테리움 브레브 HDB7040 (Bifidobacterium breve HDB7040, 기탁번호: KCCM13304P) 균주를 제공하는 데에 있다.
본 발명은 신규한 비피도박테리움 브레브 HDB7040 (Bifidobacterium breve HDB7040, 기탁번호: KCCM13304P) 균주를 포함하는 여성 갱년기 증상의 예방 또는 치료용 조성물을 제공할 수 있다.
상기 여성 갱년기 증상은 여성 호르몬 감소로 인한 것일 수 있다.
상기 여성 갱년기 증상은 안면홍조, 발한, 피부건조, 질건조증, 질위축, 하부 요도 위축, 질염, 방광염, 배뇨통, 급뇨, 집중장애, 단기 기억장애, 불안, 신경과민, 기억력 감퇴, 근육통, 관절통 및 골다공증으로 이루어진 증상에서 선택된다.
상기 균주는 에스트로겐 수용체 베타-특이적 활성화를 유도할 수 있다.
상기 균주는 생균체, 사균체, 배양물, 균체를 포함하는 배양액, 균체를 제거한 배양액, 배양액의 농축물, 균체의 파쇄물, 균체의 추출물, 배양액의 추출물, 배양액 내 세포외 다당체의 농축물, 및, 균체나 배양액으로부터 분리된 대사체로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상이 포함된 것을 특징으로 한다.
본 발명은 신규한 비피도박테리움 브레브 HDB7040 균주를 포함하는 여성 갱년기 증상의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공할 수 있다.
이에 본 발명은 에스트로겐 수용체 베타-특이적 활성화 효능이 있는 신규한 비피도박테리움 브레브 HDB7040 균주에 관한 것이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명의 균주는 30~37℃에서 16~48시간 배양하는 것이 바람직하며, 배양가능한 최적 온도는 37℃, 최소 온도는 30℃, 최대온도는 40~42℃이고, 최적 pH는 6.6~6.7, 배양가능한 최소 pH는 5.0 최대 pH는 7.0 이다. 최적 배양시간은 16시간이며 최소 배양시간은 8시간 최대 배양시간 72시간이다.
상기 균주의 계대배양에 사용되는 배지는 MRS 또는 BL의 액체배지나 고체배지를 사용할 수 있으며, 통상의 유산균용 배양배지는 모두 사용가능하다.
또한 바람직하게는 포도당, 효모추출물, 소이펩톤, 제1인산칼륨, 제2인산칼륨, 황산암모늄, 황산마그네슘, 구연산나트륨 및 폴리소르베이트 80 (트윈80; pH 5.6~6.0)을 함유하는 배지에서 배양 가능하다.
가장 바람직하게는 포도당 2~6 중량%, 효모추출물 0.5~2 중량%, 소이펩톤 0.5~1.5 중량%, 제1인산칼륨 0.1~0.5 중량%, 제2인산칼륨 0.1~0.5 중량%, 황산암모늄 0.1~0.5 중량%, 황산마그네슘 0.01~0.05 중량%, 카제인펩톤 0.5~2 중량%, 황산망간 0.01~0.05 중량%, 구연산나트륨 0.1~0.5 중량% 및 폴리소르베이트 80 0.1~0.5 중량% (pH 5.6~6.0)를 함유하는 배지에서 배양 가능하다.
본 발명의 균주 배양물은 배양 이후에 살균 또는 멸균 과정을 수행할 수 있으며, 바람직하게는 90~110℃에서 20~120분간 열을 가하는 방법을 이용할 수 있다.
본 발명에서 바람직하게는 균주 유래 배양물로서, 균체를 열압추출하고 사균화하여 이를 분말화하여 사용할 수 있다. 이 때, 열압추출 조건은 120~130℃, 0.12~0.30 MPa에서 15~200분간 수행되는 것을 특징으로 한다.
상기 균주 배양물은 여과 또는 농축하여 사용할 수도 있고, 이 때, 메시크기 0.1 ~ 10 ㎛, 바람직하게는 250 mesh ~ 1.0 ㎛의 메시크기의 필터 여과기로 배양물을 여과하거나 한외여과한 후 필요에 따라 농축할 수 있다. 농축과정은 통상의 약품, 식품 또는 화장료 원료의 제조시 사용하는 농축기를 이용할 수 있으며, 바람직하게는 감압농축 방법을 이용하여 농축하는 것이 좋다.
또는 열압추출하여 얻은 배양물로부터 상등액만을 수득할 수도 있다. 열압추출된 배양물의 상등액을 얻기 위해, 열압 추출 이후 바로, 냉각정제할 수 있는데, 바람직하게는 3~5℃로 유지된 상태에서 3,000~8,000 rpm에서 10~30분간 원심분리하고 200 nm 이하의 기공크기(pore size)를 갖는 나노막을 이용한 나노막 여과공정을 이용하여 정제할 수 있다.
각 배양물은 필요에 따라 열압추출 후 덱스트린류이나 전분 등의 첨가제를 첨가하여 분말화를 보다 용이하게 할 수 있다. 이 때, 첨가제의 추가로 인해 살균 과정이 수행되는 것이 바람직하고, 살균 조건은 90~100℃에서 0.5~2시간인 것이 좋다. 상기 열압추출은 배양물 내 균체의 사균화를 유도할 수 있다. 또한, 상기 첨가제는 배양물 내 고형분 중량 대비 1~3배가 첨가될 수 있다. 상기 배양물은 건조된 분말 상태로 제공될 수 있다. 또한, 상기 배양물은 250~1000㎍/㎖에서 MCF-7세포의 증식을 140~260% 증강시킬 수 있고, 1000㎍/㎖에서 ERβ의 mRNA (ESR2) 발현 증가를 20~35배(fold) 증가시킬 수 있다.
본 발명에서 또한 상기 균주를 물, C1~C4 알코올 또는 이들의 혼합용액을 용매로 하여 추출할 수 있으며, 상기 C1~C4 알코올은 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올 및 이소부탄올로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 상기 추출물은 또한 물 또는 30~90%(v/v) 알코올 수용액 추출물, 바람직하게는 물 또는 50~80%(v/v) 알코올 수용액 추출물일 수 있다.
상기 균주 추출물의 제조시 사용되는 물, C1~C4 알코올 또는 이들의 혼합용액은 균주 사용 중량 기준 1~40배 부피(1kg 기준 1~40ℓ)를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 5~40배 부피를 사용할 수 있다. 상기 균주 추출물의 추출조건은 20~100℃에서 1분~48시간일 수 있다. 상기 과정은 1~4번까지 반복할 수 있다.
상기 균주 추출물의 추출용 기기로는 통상의 추출기기, 초음파분쇄추출기 또는 분획기를 이용할 수 있다. 이렇게 제조된 균주 추출물은 열풍건조, 감압건조 또는 동결건조하여 용매를 제거할 수 있다. 또한, 상기 균주 추출물은 컬럼크로마토그래피를 이용하여 정제하여 사용할 수 있다.
상기 균주 추출물은 상법에 따라, 유기용매(알코올, 에테르, 아세톤 등)에 의한 추출, 헥산과 물의 분배, 컬럼크로마토그래피에 의한 방법 등, 식물체 성분의 분리 추출에 이용되는 공지의 방법을 단독 또는 적합하게 조합한 방법을 이용하여 분획 또는 정제하여 사용할 수 있다.
상기 크로마토그래피는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography), 엘에이취-20 컬럼 크로마토그래피(LH-20 column chromatography), 이온교환수지 크로마토그래피(ion exchange resin chromatography), 중압 액체 크로마토그래피(medium pressure liquid chromatography), 박층 크로마토그래피(TLC; thin layer chromatography), 실리카겔 진공 액체 크로마토그래피(silica gel vacuum liquid chromatography) 및 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography) 중에서 선택될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 균주를 함유하는 여성 갱년기 증상의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 상기 균주는 본 발명의 약학 조성물에 0.001~100 중량%로 하여 첨가될 수 있다.
상기 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상기 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 약학 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 투여량은 치료받을 대상의 연령, 성별, 체중과, 치료할 특정 질환 또는 병리 상태, 질환 또는 병리 상태의 심각도, 투여경로 및 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 일반적으로 투여량은 0.01㎎/㎏/일 내지 대략 2000㎎/㎏/일의 범위이다. 더 바람직한 투여량은 1㎎/㎏/일 내지 500㎎/㎏/일이다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 약학 조성물은 쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 주사에 의해 투여될 수 있다.
또한, 본 발명은 비피도박테리움 브레브 HDB7040 균주 및 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 포함하는 여성 갱년기 증상의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다. 상기 비피도박테리움 브레브 HDB7040 균주는 본 발명의 건강기능식품에 0.001~100 중량%로 하여 첨가될 수 있다. 본 발명의 건강기능식품은 정제, 캡슐제, 환제 또는 액제 등의 형태를 포함하며, 본 발명의 균주를 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 드링크제, 육류, 소세지, 빵, 캔디류, 스넥류, 면류, 아이스크림, 유제품, 스프, 이온음료, 음료수, 알코올 음료, 껌, 차 및 비타민 복합제 등이 있다.
본 발명의 신규한 비피도박테리움 브레브 HDB7040 균주는 에스트로겐 수용체 베타 재조합 효모 시스템에서 유사 리간드 활성을 통해 에스트로겐 수용체 베타를 자극하여 활성화를 유도한다. 나아가, 본 발명의 HDB7040 균주를 에스트로겐 배제 조건 하에서 인간 유방 세포에 처리한 경우 세포 증식 촉진 효과가 있으며, 또한 에스트로겐 수용체 중 베타의 유전자 발현을 특이적으로 증가시킨다. 따라서 본 발명의 비피도박테리움 브레브 HDB7040 균주는 에스트로겐 수용체 베타의 특이적 활성화를 통해 여성 갱년기를 예방, 개선 또는 치료하는 효과가 있다.
도 1은 ERβ 재조합 효모 assay 결과 1차 유효 균주로 선별된 7040, 1012, 2023 균주를 에스트로겐 배제 조건 하에서 에스트로겐 수용체 발현 세포 (MCF-7 cells)에 처리한 후, MCF-7 세포의 증식율을 측정한 E-screen assay 결과이다.
도 2a는 1차 유효 균주로 선별된 7040, 1012, 2023 균주를 에스트로겐 배제 조건 하에서 에스트로겐 수용체 발현 세포 (MCF-7 cells)에 처리한 후, 세포 내 ERα의 mRNA (ESR1) 발현량 변화를 Real-time PCR로 확인하고 이를 정량화한 그래프이다.
도 2b는 1차 유효 균주로 선별된 7040, 1012, 2023 균주를 에스트로겐 배제 조건 하에서 에스트로겐 수용체 발현 세포 (MCF-7 cells)에 처리한 후, 세포 내 ERβ의 mRNA (ESR2) 발현량 변화를 RT-PCR로 확인하고 이를 정량화한 그래프이다.
도 3a는 비피도박테리움 브레브 HDB7040 균주의 16s rRNA 유전자 서열을 나타낸다.
도 3b는 비피도박테리움 브레브 균주 5종을 에스트로겐 배제 조건 하에서 에스트로겐 수용체 발현 세포 (MCF-7 cells)에 처리한 후, MCF-7 세포의 증식율을 측정한 E-screen assay 결과이다.
도 4a는 비피도박테리움 브레브 HDB7040 균주를 에스트로겐 배제 조건 하에서 에스트로겐 수용체 발현 세포 (MCF-7 cells)에 농도별로 처리한 후, MCF-7 세포의 증식율을 측정한 E-screen assay 결과이다.
도 4b는 비피도박테리움 브레브 HDB7040 균주를 에스트로겐 배제 조건 하에서 에스트로겐 수용체 발현 세포 (MCF-7 cells)에 에스트로겐 수용체의 저해제 (fulvestrant; ful)와 함께 병용 처리한 후, MCF-7 세포의 증식율을 측정한 E-screen assay 결과이다.
도 5는 비피도박테리움 브레브 HDB7040 균주를 에스트로겐 배제 조건 하에서 에스트로겐 수용체 발현 세포 (MCF-7 cells)에 처리한 후, MCF-7 세포의 형태 변화 여부 및 증식을 관찰한 결과이다.
도 6a는 비피도박테리움 브레브 HDB7040 균주를 에스트로겐 배제 조건 하에서 에스트로겐 수용체 발현 세포 (MCF-7 cells)에 농도별로 처리한 후, 세포 내 ERα의 mRNA (ESR1) 발현량 변화를 Real-time PCR로 확인하고 이를 정량화한 그래프이다.
도 6b는 비피도박테리움 브레브 HDB7040 균주를 에스트로겐 배제 조건 하에서 에스트로겐 수용체 발현 세포 (MCF-7 cells)에 농도별로 처리한 후, 세포 내 ERβ의 mRNA (ESR2) 발현량 변화를 RT-PCR로 확인하고 이를 정량화한 그래프이다.
이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해지도록, 당업자에게 본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다.
<실시예 1> 여성 갱년기 증상 완화 효능 균주 개발을 위한 유산균의 균주 분리
여성 갱년기 증상 완화에 효능이 있는 유산균을 찾기 위해, 천연물 및 발효식품, 신생아의 분변 샘플을 채취하여 유산균을 분리하였다. 이를 위해, 샘플 0.1 g을 멸균식염수 10 ㎖에 현탁하고, 현탁액은 10배수 연속 희석하였다. 젖산에 의한 황변 분별을 위하여 BCP (Bromocresol purple) 고체배지에 섞어 접종하여 상온에서 굳힌 후, 37℃, 48시간 동안 혐기 배양하였다. 형성된 콜로니 중, 주변에 뚜렷한 황변을 나타내는 것을 선별하여 취한 후, 유산균 영양배지 BL (MBcell, KisanBio, Korea) 액상배지에 접종한 후 형태학적 관찰을 통해 유산균을 재선별하였다. 선별 유산균들은 연속 계대 배양을 통해 순수 분리한 후, 여성 갱년기 증상 완화에 대한 효능 평가를 위한 에스트로겐 수용체 베타 활성 유도 스크리닝 실험에 사용하였다.
<실시예 2> 여성 갱년기 증상 완화 효능 평가를 위한 유산균 배양분말 제조
유산균 균주를 배양하기 위한 기본배지로서 포도당 4(w/w)%, 효모추출물 2(w/w)%, 소이펩톤 1.5(w/w)%, 제1인산칼륨 0.2(w/w)%, 제2인산칼륨 0.2(w/w)%, 황산암모늄 0.2(w/w)%, 황산마그네슘 0.01(w/w)%, 카제인펩톤 1(w/w)%, 황산망간 0.05(w/w)%, 구연산나트륨 0.2(w/w)%, 트윈80 0.1(w/w)%가 되도록 정제수에 용해하여 121℃, 0.20 MPa에서 30분간 멸균하였다. 멸균된 기본 배지에 유산균 균주를 5(w/w)% 농도로 접종하고 37℃ 조건으로 24시간 배양하되, 수산화나트륨 수용액을 일정 시간 간격으로 적하하면서 pH를 6.8~7.0으로 유지하며 배양하였다. 균체 및 배양액을 모두 수득 후 121℃, 0.20 MPa에서 1시간 열처리하여 사균화 하였으며, 총 고형분 중량 대비 2배 중량의 덱스트린을 혼합하였다. 이후 95℃에서 1시간 동안 살균 후 건조하여 수집된 유산균들의 배양분말을 제조하였다.
<실시예 3> 에스트로겐 수용체 자극 활성 평가를 위한 ERβ 재조합 효모 assay
여성 갱년기 증상 완화의 기전으로써, 에스트로겐 수용체 활성을 자극하는 유산균을 선별하기 위해 인체 유래의 ERβ 유전자를 함유하는 플라스미드로 재조합된 효모 균주를 이용하여 스크리닝을 수행하였다. 재조합 효모 assay의 원리는, ERβ가 발현된 효모에 에스트로겐 수용체를 자극하는 유사 리간드 활성을 기반으로 한다. ERβ/리간드 복합체가 LacZ 유전자 프로모터의 element 서열에 결합하면 LacZ, 즉 beta-galactosidase가 발현하게 된다. 이 효소는 기질을 분해하여 반응액의 색깔 변화를 유도하고, 색깔 변화가 클수록 ERβ 자극 활성이 높은 것으로 예상할 수 있다.
실험을 위하여 ERβ 재조합 효모를 트립토판이 제외된 최소영양배지 YNB (Sigma Aldrich, USA) 5 ㎖에 접종하여 37℃, 160 rpm, 20시간 진탕 배양하였다. 재조합 효모 배양액을 신선한 배지에 20배 희석하고 96 well plate에 well당 200 ㎕씩 분주하고, 각 well당 대조군 및 유산균 배양분말 희석액을 5 ㎕씩 분주한다. 음성 대조군으로는 50(v/v)% 에탄올 수용액 (용매대조군)과 YNB배지 (배지대조군), 양성 대조군으로는 17베타 에스트라다이올 (17β-estradiol, Sigma Aldrich, USA)을 50(v/v)% 에탄올 수용액에 0.25 ㎍/㎖ 농도로 희석하여 처리하고, 유산균 배양분말은 50(v/v)% 에탄올 수용액에 20 ㎎/㎖ 농도로 현탁하여 처리하였다. 접종된 96 well plate를 랩으로 감싸 30℃, 20시간 정치배양 하였다. 샘플이 처리된 효모 배양액을 50 ㎕ 취하여 새로운 96 well plate에 각각 분주하고, 반응 전 효모량을 측정하기 위해 마이크로플레이트 리더기로 610 nm 탁도를 기록하였다 (OD610nm). 기질반응을 위한 LacZ buffer는 일인산나트륨, 이인산나트륨, 염화마그네슘, 염화칼륨, N-lauroylsarcosine sodium salt, 그리고 2-mercaptoethanol을 함유하는 Z buffer에, 기질로써 CPRG (chlorophenol red-beta-D-galactopyranoside)를 77.7 ㎎/ℓ 농도로 첨가하여 제조하였다. 효모배양액 50 ㎕ well에 LacZ buffer를 200 ㎕씩 섞고, plate를 랩으로 감싸 30℃ 3시간 기질반응한 후, 꺼내어 반응 종료를 위해 50 mM sodium carbonate 용액을 50 ㎕씩 분주하였다. 반응이 종료된 plate를 마이크로플레이트 리더기에 넣고, 기질반응에 의한 574nm 흡광도를 측정하였다 (OD574nm).
모든 대조군과 샘플은 3반복 이상 수행하고, 실험 결과 ERβ 자극 활성은 아래 [수식 1] 및 [수식 2]와 같이 계산하였고, 유산균 별 활성을 [수식 2]의 양성 대조군으로서 ES (에스트라다이올) 0.25 ㎍/㎖에 대한 상대적 활성으로 비교하였다.
[수식 1]
LacZ value = ((샘플OD574nm-용매대조군OD574nm)Х1000) / ((샘플 OD600nm-배지대조군OD600nm)Х50㎕Х3h)
[수식 2]
LacZ value % to ES = ((샘플 LacZ value)/(양성대조군(ES)LacZ value)) Х 100
이들 수식을 통해 확인된 천연물 및 발효식품, 신생아의 분변으로부터 분리한 균주 중 13종을 선택하였고, 이렇게 확인된 ERβ에 대한 유사 리간드 활성 스크리닝 결과를 표 1에 나타내었다.
유산균 No. # LacZ value % to ES
Bifidobacterium 7040 89.1
7071 59.6
Lactobacillus 1012 73.9
1093 43.4
1104 23.9
1199 1.8
1234 26.1
1245 48.6
1259 23.9
Lactococcus 2023 67.2
2041 38.4
Streptococcus 5042 16.5
5056 6.9
실험 결과, 상기 표 1과 같이 천연물 및 발효식품, 신생아의 분변에서 유래한 유산균 13종의 배양분말을 처리했을 때, 유산균 7040, 1012, 2023 3개 균주에서 목표로 삼았던 60% 이상의 높은 LacZ value를 나타내어 1차 유효 균주로 선별하였다. 한편, 이 3종 균주 중에서도 신생아의 분변 유래 7040 균주에서 가장 우수한 ERβ 유사 리간드 활성이 확인된다.
<실시예 4> 1차 선별 균주의 MCF-7 세포 증식에 미치는 영향 평가 (E-screen assay)
여성 갱년기 증상 완화 여부를 세포 단계에서 평가하기 위한 세포주로는 에스트로겐 수용체를 발현하여 에스트로겐 활성에 반응하는 인간 유래 유방 세포주 MCF-7 세포를 이용하였으며, ERβ 재조합 효모 스크리닝 실험 결과 1차 선별된 7040, 1012, 2023 3개 균주가 에스트로겐 배제 (Estrogen-free) 조건 하에서 MCF-7 세포 증식에 미치는 영향을 평가하기 위하여 E-screen assay를 시행하였다.
MCF-7 세포는 10% 우태아혈청 (Fetal Bovine Serum, FBS, Gibco, USA), 1% 페니실린-스트렙토마이신 (+10,000 U/㎖ 페니실린, +10,000 ㎍/㎖ 스트렙토마이신, Gibco, USA)과 페놀 레드가 포함된 RPMI1640 배지 (Welgene, Korea)로 배양하였으며, E-screen assay를 위해 96-well 배양 플레이트에 5 Х 103 cells/well의 밀도로 분주한 뒤 24시간 동안 37℃, 5% CO2 조건으로 배양하였다. PBS로 세포를 세척한 다음, 10% CD-FBS (Charcoal-stripped FBS, Gibco, USA)와 1% 페니실린-스트렙토마이신을 포함하고 페놀 레드를 포함하지 않는 RPMI1640 배지로 교체하여 48시간 동안 37℃, 5% CO2 조건으로 배양하여 에스트로겐 배제 조건을 유도하였다. 1차 선별 균주를 1000 ㎍/㎖의 농도로 에스트로겐 배제 RPMI1640 배지에 제조하여 세포에 처리하였으며, 양성 대조군으로는 1 nM 농도의 17β-estradiol (E2, Sigma-Aldrich, USA)을 이용하였다. 144시간 동안 처리 후, 배양액을 제거하고 PBS로 세포를 세척한 다음 3-(4,5-dimethyl-thiazol)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide (MTT, Invitrogen, USA) 시약을 100 ㎕씩 첨가하여 반응시켰다. 이후 MTT 시약을 제거하고 100 ㎕의 dimethyl sulfoxide (DMSO)를 첨가하여 형성된 포마잔을 모두 용해 시킨 뒤, 마이크로플레이트 리더기를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하여 세포 증식율을 평가하였다.
이에 대한 결과는 도 1에 나타내었는데, 7040, 1012, 2023을 처리한 군에서 MCF-7 세포 증식율이 각각 대조군 대비 178%, 114%, 116%까지 증가한 결과를 도출할 수 있었다. 이 가운데, 1차 선별 균주 중 7040 균주가 에스트로겐 배제 조건에서의 MCF-7 세포 증식 촉진능이 가장 우수한 것을 확인하였다.
<실시예 5> 에스트로겐 수용체 mRNA 발현 평가
실시예 5-1. 에스트로겐 수용체 알파 (ERα) (Real-time PCR)
MCF-7 세포를 6-well 배양 플레이트에 5 × 105 cells/well의 밀도로 분주하여 37℃, 5% CO2 조건에서 24시간 동안 배양한 후, PBS로 세포를 세척한 다음 에스트로겐 배제 RPMI1640 배지로 교체하여 48시간 동안 추가로 배양하였다. 에스트로겐 배제 RPMI1640 배지에 7040, 1012, 2023 균주를 1000 ㎍/㎖의 농도로 제조하여 24시간 동안 처리한 다음, 배양 상등액을 제거하고 PBS로 세척 후 세포를 용해하여 RNA를 추출한 후, RNA를 정량하여 1 ㎍의 RNA로부터 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA에 하기 표 2에 나타낸 인간 ESR1에 상응하는 프라이머와 SYBR 시약을 넣고 증폭 시킨 후, 2-△△Ct 식을 이용하여 18S rRNA 대비 ESR1의 상대적 발현량을 계산하였다.
유전자 프라이머 서열 (5' → 3')
ESR1 정방향 CGA CAT GCT GCT GGC TAC ATC
역방향 AGA CTT CAG GGT GCT GGA CAG A
ESR2 정방향 AGC ACG GCT CCA TAT ACA TAC C
역방향 TGG ACC ACT AAA GGA GAA AGG T
18S rRNA 정방향 CGG CTA CCA CAT CCA AGG AA
역방향 GCT GGA ATT ACC GCG GCT GC
그 결과, 도 2a와 같이, 7040, 1012, 2023 균주 처리군에서 ESR1 발현량은 각각 대조군 대비 1배, 1.6배, 13.4배로 확인됨에 따라, 7040 균주는 MCF-7 세포의 ERα 유전자 발현에 영향을 미치지 않는 반면, 2023 균주는 MCF-7 세포에서 ERα 유전자 발현을 13.4배 강하게 촉진시키는 것을 확인하였다.
실시예 5-2. 에스트로겐 수용체 베타 (ERβ) (RT-PCR)
MCF-7 세포를 6-well 배양 플레이트에 5 × 105 cells/well의 밀도로 분주하여 37℃, 5% CO2 조건에서 24시간 동안 배양한 후, PBS로 세포를 세척한 다음 에스트로겐 배제 RPMI1640 배지로 교체하여 48시간 동안 추가로 배양하였다. 에스트로겐 배제 RPMI 배지에 7040, 1012, 2023 균주를 1000 ㎍/㎖의 농도로 제조하여 24시간 동안 처리한 다음, 배양 상등액을 제거하고 PBS로 세척한 후, RNA를 추출 및 정량 하여 1 ㎍의 RNA로부터 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA에 하기 표 2에 나타낸 인간 ESR2에 상응하는 프라이머를 넣고 PCR 방법으로 증폭시킨 후, RedSafe (iNtRON Biotechnology, Korea)를 첨가한 1.5% Agarose gel에 전기영동 하여 18S rRNA 대비 ESR2 발현량을 측정하였다.
그 결과, 도 2b와 같이, 7040, 1012, 2023 균주 처리군에서 ESR2 발현량은 각각 대조군 대비 21.2, 8.6, 13.7배로 확인됨에 따라, ESR1 발현과는 달리 7040 균주 처리시 MCF-7 세포에서의 ERβ 유전자 발현을 강하게 촉진시키는 것을 확인 하였다.
상기 실시예 4 및 실시예 5의 결과를 종합하여 볼 때, 1차 유효 균주로 선별된 7040과 1012, 2023 중 7040 균주의 유사 에스트로겐 활성이 가장 높을 뿐 아니라, ERα와 ERβ 중 ERβ의 유전자 발현만을 특이적으로 촉진 시키는 효능이 가장 우수한 것이 확인되었다.
이에 7040 균주를 최종 유효 균주로 선별하였고, 다음의 실험을 진행하였다.
<실시예 6> 여성 갱년기 증상 완화 효능을 가지는 7040 균주의 동정
ERβ 재조합 효모 스크리닝 실험 및 MCF-7 세포를 이용한 in vitro 스크리닝 평가를 통해 최종 유효 균주로 선발된 7040 균주의 동정을 위해 16S rRNA 유전자 서열비교를 통한 계통유전학적 분석 (phylogenetic analysis)을 수행하였다.
이를 위해 블라스트 유사성 조사 프로그램 (Blast Similarity Search Program: National Institute of Biotechnology Information)을 이용하여 7040 균주의 16S rRNA 유전자 염기서열과 GenBank에 등록된 유산균들의 16S rRNA 유전자 서열들과 함께 각각 다중 서열 정렬을 진행한 후 유전학적 위치를 판별하였다. 7040 균주의 16S rRNA 시퀀싱 분석 결과, 도 3a와 같이 [서열번호 1]의 유전자를 가지며, 비피도박테리움 브레브 (Bifidobacterium breve)에 가장 가까운 상동성 (homology)을 보이는 것으로 확인되었다 (99% 이상).
이와 같은 분자생물학적 방법으로 동정한 결과를 통해, 7040 균주를 비피도박테리움 브레브로 동정하였고, 에스트로겐 수용체 베타 특이적인 자극 활성을 가지는 상기 7040 균주를 '비피도박테리움 브레브 HDB7040 (Bifidobacterium breve HDB7040)'로 명명하고 이를 2022년 12월 16일에 한국미생물보존센터 (Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM)에 수탁하였다 (기탁번호: KCCM13304P).
<실시예 7> 비피도박테리움 브레브 균주 간 효능 비교 평가
HDB7040을 포함한 비피도박테리움 브레브 균주 간 효능 비교 평가를 위하여, 비피도박테리움 브레브 표준 균주 1종 (KCCM42255)과 HDB7040을 포함한 비피도박테리움 브레브 분리 균주 4종을 각각 1000 ㎍/㎖의 농도로 MCF-7 세포에 처리하여 실시예 4와 동일한 방법으로 E-screen assay를 수행하였다.
실험 결과, 도 3b와 같이, 비피도박테리움 브레브 균주 5종 중 HDB7040의 MCF-7 세포 증식 촉진능이 가장 우수한 것을 확인하였다.
<실시예 8> HDB7040의 농도별 MCF-7 세포 증식에 미치는 영향 평가
비피도박테리움 브레브 HDB7040의 MCF-7 세포 증식 촉진능의 농도의존성을 확인하기 위하여 실시예 4와 동일한 방법으로 E-screen assay를 수행하였으며 HDB7040은 250, 500, 1000 ㎍/㎖ 농도로 처리하였다.
실험 결과, 도 4a와 같이 비피도박테리움 브레브 HDB7040을 처리한 군에서 MCF-7 세포 증식율이 대조군 대비 137%, 147%, 168%까지 농도 의존적으로 증가함으로써, 비피도박테리움 브레브 HDB7040 균주가 에스트로겐 배제 조건에서 MCF-7 세포의 증식을 농도 의존적으로 촉진하는 것이 확인된다.
<실시예 9> 에스트로겐 수용체 저해제 (Fulvestrant) 병용 처리
비피도박테리움 브레브 HDB7040 균주의 MCF-7 세포 증식 촉진능이 에스트로겐 수용체와 연계된 것인지 확인하기 위해, 에스트로겐 수용체의 저해제로 알려진 fulvestrant (ICI 182,780)를 이용하였다.
이를 위해, 실시예 4와 동일한 방법으로 E-screen assay를 수행하였으며, 비피도박테리움 브레브 HDB7040과 fulvestrant의 병용 처리는 에스트로겐 배제 RPMI1640 배지에 1000 ㎍/㎖ 농도의 비피도박테리움 브레브 HDB7040과 100 nM 농도의 fulvestrant를 함께 제조하여 진행하였다.
실험 결과, 도 4b와 같이, 비피도박테리움 브레브 HDB7040 균주 단독 처리시 대조군 대비 166%까지 증가하였던 MCF-7 세포 증식율이, fulvestrant (ful) 병용 처리시 81%까지 감소하였다. 이를 통해 비피도박테리움 브레브 HDB7040 균주가 에스트로겐 수용체를 통해 MCF-7 세포의 증식을 유도하는 결과인 것으로 확인된다.
<실시예 10> 광학현미경 관찰을 통한 MCF-7 세포 증식 촉진
광학현미경 이미지를 얻기 위해, 실시예 4와 동일한 방법으로 비피도박테리움 브레브 HDB7040 균주에 대해 E-screen assay를 진행하였다. 144시간의 샘플 처리가 끝난 후 배양액을 제거하고 PBS로 세포를 세척한 다음, 광학 현미경을 이용하여 40배 배율에서 세포 형태 변화 여부 및 세포 증식을 관찰하였다.
그 결과 도 5와 같이 비피도박테리움 브레브 HDB7040 균주는 MCF-7 세포의 이상 형태 변화 유발 없이 정상 형태를 유지시키며 세포 증식을 촉진하는 것으로 확인된다.
<실시예 11> 에스트로겐 수용체 mRNA 발현 평가
비피도박테리움 브레브 HDB7040이 에스트로겐 수용체 mRNA 발현에 미치는 영향의 농도의존성을 확인하기 위해, 실시예 5와 동일한 방법으로 Real-time PCR 및 RT-PCR을 수행하였다. 표준 균주와의 비교 평가를 위해서는 비피도박테리움 브레브 표준 균주 KCCM42255를 동일한 조건에서 1000 ㎍/㎖의 농도로 처리하였다. 또한 에스트로겐 수용체의 저해제인 fulvestrant (ful) 와의 병용 처리를 위해서는 비피도박테리움 브레브 HDB7040 균주를 처리하기 전, 100 nM 농도의 fulvestrant를 30분 간 전처리 한 다음, 비피도박테리움 브레브 HDB7040 균주의 농도별 (500, 1000 ㎍/㎖) 처리를 진행하였다.
도 6a와 같이 Real-time PCR을 통해 ESR1 발현을 확인한 결과, 비피도박테리움 브레브 HDB7040의 처리는 MCF-7 세포에서 ESR1의 발현 증가에 영향을 미치지 않는 반면, 비피도박테리움 브레브 표준 균주 KCCM42255는 ESR1의 발현을 유도하는 것을 확인하였다.
또한, 도 6b와 같이 RT-PCR을 통해 ESR2 발현을 확인한 결과를 살펴보면, 비피도박테리움 브레브 HDB7040을 처리하였을 경우 MCF-7 세포에서의 ESR2 발현량이 농도 의존적으로 증가하였으며, fulvestrant (ful) 를 병용 처리한 경우 HDB7040에 의한 ESR2의 발현이 억제되었다. 반면, 비피도박테리움 브레브 표준 균주 KCCM42255를 처리한 경우에는 비피도박테리움 브레브 HDB7040을 처리한 경우에 비해 ESR2의 발현 증가량이 낮은 것을 확인하였다.
이를 종합하여 볼 때, 비피도박테리움 브레브 KCCM42255 표준 균주는 ERα의 유전자 발현을 유도하고 ERβ 유전자 발현 또한 소폭 증가시키는 것으로 보아, ERβ 특이적 활성화 유도능을 보유하고 있지 않지만, 본 발명의 비피도박테리움 브레브 HDB7040 균주는 오직 ERβ의 유전자 발현만 특이적으로 유도할 뿐 아니라 발현 증가량 또한 KCCM42255 대비 약 3배 더 높은 유사 에스트로겐 활성을 보유하고 있는 것이 확인되었다.
<제제예 1. 약학적 제제>
제제예 1-1. 정제의 제조
본 발명의 균주 200g을 락토오스 175.9g, 감자전분 180g 및 콜로이드성 규산 32g과 혼합하였다. 이 혼합물에 10% 젤라틴 용액을 첨가시킨 후, 분쇄해서 14 메쉬체를 통과시켰다. 이것을 건조시키고 여기에 감자전분 160g, 활석 50g 및 스테아린산 마그네슘 5g을 첨가해서 얻은 혼합물을 정제로 만들었다.
<제제예 2. 식품 제조>
제제예 2-1. 조리용 양념의 제조
본 발명의 균주를 조리용 양념에 1 중량%로 첨가하여 건강 증진용 조리용 양념을 제조하였다.
제제예 2-2. 밀가루 식품의 제조
본 발명의 균주를 밀가루에 0.1 중량%로 첨가하고, 이 혼합물을 이용하여 빵, 케이크, 쿠키, 크래커 및 면류를 제조하여 건강 증진용 식품을 제조하였다.
제제예 2-3. 스프 및 육즙(gravies)의 제조
본 발명의 균주를 스프 및 육즙에 0.1 중량%로 첨가하여 건강 증진용 수프 및 육즙을 제조하였다.
제제예 2-4. 유제품(dairy products)의 제조
본 발명의 균주를 우유에 0.1 중량%로 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.
제제예 2-5. 야채주스 제조
본 발명의 균주 0.5g을 토마토주스 또는 당근주스 1,000㎖에 가하여 건강 증진용 야채주스를 제조하였다.
제제예 2-6. 과일주스 제조
본 발명의 균주 0.1g을 사과주스 또는 포도주스 1,000㎖에 가하여 건강 증진용 과일주스를 제조하였다.
한국미생물보존센터 KCCM13304P 20221216

Claims (12)

  1. 신규한 비피도박테리움 브레브 HDB7040 (Bifidobacterium breve HDB7040, 기탁번호: KCCM13304P) 균주의 사균체를 포함하는 여성 갱년기 증상의 예방 또는 치료용 조성물로서,
    상기 균주의 사균체가,
    에스트로겐 수용체 알파의 발현은 그대로 유지하면서, 에스트로겐 수용체 베타의 발현만을 증강시키는 것을 특징으로 하는 여성 갱년기 증상의 예방 또는 치료용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 여성 갱년기 증상은 여성 호르몬 감소로 인한 것을 특징으로 하는 여성 갱년기 증상의 예방 또는 치료용 조성물.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 여성 갱년기 증상은 안면홍조, 발한, 피부건조, 질건조증, 질위축, 하부 요도 위축, 질염, 방광염, 배뇨통, 급뇨, 집중장애, 단기 기억장애, 불안, 신경과민, 기억력 감퇴, 근육통, 관절통 또는 골다공증인 것을 특징으로 하는 여성 갱년기 증상의 예방 또는 치료용 조성물.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 신규한 비피도박테리움 브레브 HDB7040 (Bifidobacterium breve HDB7040, 기탁번호: KCCM13304P)의 사균체를 포함하는 것을 특징으로 하는 여성 갱년기 증상의 예방 또는 개선용 건강기능식품으로서,
    상기 균주의 사균체가,
    에스트로겐 수용체 알파의 발현은 그대로 유지하면서, 에스트로겐 수용체 베타의 발현만을 증강시키는 것을 특징으로 하는 여성 갱년기 증상의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 여성 갱년기 증상은 여성 호르몬 감소로 인한 것을 특징으로 하는 여성 갱년기 증상의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 여성 갱년기 증상은 안면홍조, 발한, 피부건조, 질건조증, 질위축, 하부 요도 위축, 질염, 방광염, 배뇨통, 급뇨, 집중장애, 단기 기억장애, 불안, 신경과민, 기억력 감퇴, 근육통, 관절통 또는 골다공증인 것을 특징으로 하는 여성 갱년기 증상의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 신규한 비피도박테리움 브레브 HDB7040 (Bifidobacterium breve HDB7040, 기탁번호: KCCM13304P) 균주로서,
    상기 균주의 사균체 처리로 인해,
    에스트로겐 수용체 알파의 발현은 그대로 유지하면서, 에스트로겐 수용체 베타의 발현만을 증강시키는 것을 특징으로 하는 균주.
  12. 삭제
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