KR20130132172A

KR20130132172A - 황련해독탕의 유산균 발효물을 유효성분으로 함유하는 골질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강기능식품

Info

Publication number: KR20130132172A
Application number: KR1020120056355A
Authority: KR
Inventors: 마진열; 조원경; 송광훈; 김태수; 심기석; 하현일; 정다영; 송석영
Original assignee: 한국 한의학 연구원
Priority date: 2012-05-25
Filing date: 2012-05-25
Publication date: 2013-12-04
Also published as: KR101402926B1; WO2013176327A1

Abstract

본 발명은 골질환의 예방 또는 치료에 효과적인 천연물 추출물의 유산균 발효물로서, 더 자세하게는 황련해독탕의 유산균 발효물을 유효성분으로 함유하는 골질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 개선용 건강기능식품 조성물에 관한 것이다.

Description

황련해독탕의 유산균 발효물을 유효성분으로 함유하는 골질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강기능식품{Pharmaceutical composition and functional food for prevention or treatment of bone disease comprising the lactic acid bacteria ferment of hwangryunhaedoktang}

본 발명은 황련해독탕의 유산균 발효물을 유효성분으로 함유하는 골질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강기능식품에 관한 것이다.

정상적인 뼈의 재형성과정은 뼈 형성과 뼈 흡수의 균형으로 이루어지며, 이러한 뼈 형성과 뼈 흡수는 크게 세 가지 세포, 연골세포, 조골세포(osteoblast) 및 파골세포(osteoclast)의 상호작용에 의해 이루어진다. 특히, 조골세포의 증식과 분화는 뼈의 석회화와 밀접한 관계가 있으며 조골세포에서 중요한 전사인자인 RUNX2에 변이가 생기거나 발현량이 감소하면 뼈의 석회화가 일어나지 않는다. RANKL(receptor activator of NF-kB ligand)은 조골세포의 분화과정 동안에 발현되어 파골세포의 분화를 촉진하는 인자로 알려져 있고 OPG(Osteoprotegrin) 역시 조골세포에서 발현되어 RANKL의 역할을 억제함으로써 파골세포의 분화를 억제하는 인자로 알려져 있다.

뼈(bone)는 인체의 연조직과 체중을 지탱해주고 내부기관을 둘러싸서 내부 장기를 외부의 충격으로부터 보호한다. 또한 근육이나 장기를 구조적으로 지탱할 뿐만 아니라 체내의 칼슘이나 다른 필수 무기질, 즉 인이나 마그네슘과 같은 물질을 저장하는 인체의 중요한 부분 중 하나이다. 따라서 성장이 끝난 성인의 뼈는 멈추지 않고 죽는 날까지 오래된 뼈는 제거하고 새로운 뼈로 대체하는 생성과 흡수 과정을 매우 역동적, 지속적으로 반복재생 하면서 균형을 유지하게 된다. 이를 골재형성(bone remodeling)이라고 한다. 오래된 뼈는 제거하고 새로운 뼈로 대체하는 뼈의 순환은 성장과 스트레스에 의해서 일어나는 뼈의 미세한 손상을 회복시키고 적절히 뼈의 기능을 유지하는데 필수적이다.

골재형성에는 크게 두 종류의 세포가 관여하는 것으로 알려져 있다. 두 세포 중 하나는 뼈를 생성하는 조골세포이고, 다른 하나는 뼈를 파괴하는 파골세포이다. 조골세포는 RANKL과 이것의 유도 수용체인 OPG를 생성한다. RANKL이 파골 전구세포 표면에 있는 수용체인 RANK에 결합하면 파골 전구세포가 파골세포로 성숙화되어 골흡수가 일어난다. 그러나 OPG가 RANKL과 결합하면 RANKL과 RANK간 결합이 차단되어 파골세포의 형성이 억제되고 필요 이상의 골 흡수가 일어나지 않게 된다.

골다공증(osteoporosis)은 여러 가지 원인에 의하여 뼈의 질량이 감소하고 뼈 조직의 미세구조의 퇴화로 골절 위험이 지속적으로 증가하는 질환으로 뼈를 구성하는 미네랄(특히 칼슘)과 기질이 감소한 상태이며, 골재형성의 균형이 깨져서 파골작용이 조골작용보다 증가된 상태에서 발생한다. 정상적인 뼈 내부는 그물망처럼 치밀한 구조를 이루고 있으나, 골다공증의 경우에는 골미세구조 사이의 간격이 넓어지고 미세구조가 얇아져 약해짐으로써 조그만 충격에도 뼈가 쉽게 골절될 위험이 증가하는 질환으로 폐경기 이후 골다공증, 70세 이상의 남녀 노인에게 서서히 발생하며 골반골과 척추뼈의 점진적인 골 손실을 가져오는 노년기 골다공증 및 연령에 상관없이 질병이나 약물, 알코올, 흡연, 사고로 인해 발생하는 2차 골다공증으로 분류된다.

골다공증은 현재 가장 중요한 사회적 문제 중 하나로, 미국의 경우 매년 약 26 만명의 여성들에게 유발되고 있으며, 이중 약 12 내지 20% 정도는 사망에 이르고 있다. 사회가 노령화되고 여성들의 사회참여가 활발해지고 있는 상황에서 노인들이나 폐경 후 여성들의 골다공증 및 골다공증으로 인한 골절은 심각한 문제를 야기한다.

현재 골다공증 치료제로 사용되고 있는 물질로는 에스트로겐(estrogen), 남성화 스테로이드 호르몬(androgenic anagolic ateroid), 칼슘 제제, 인삼염, 불소 제제, 이프리플라본(Ipriflavone), 비타민 D₃ 등이 있다. 에스트로겐은 조골세포의 세포고사를 억제하여 세포의 생존기간을 증가시키고 파골세포의 세포고사를 촉진하여 세포의 생존기간을 감소시켜 폐경증상의 치료와 골밀도 유지에 어느 정도 효과적인 방법이나 유방암, 자궁내막 증식증 등을 유발하는 부작용이 있다. 이외에도 파골세포의 활성을 억제하여 골파괴를 억제시키거나 조골세포의 증식을 통해 골재생 단위의 활성을 증가시키는 약물로 칼시토닌, 부갑상선호르몬, 비스포스포네이트 제제 등이 있다. 그러나, 기존 골다공증 치료약제들은 골흡수만을 차단시키거나 골형성을 촉진시키는 효능만을 갖으며 장기간 투여시 많은 부작용을 유발하고 있다. 따라서 장기간 투여에도 지속적인 골밀도 증가 효과를 나타내고 부작용이 적은 안전한 예방 및 치료제 개발이 요구되고 있다.

이에, 본 발명자들은 이상과 같은 골다공증과 같은 골질환을 예방 또는 치료하기 위한 천연 약재를 연구하던 중, 황련, 황금, 황백 및 치자의 혼합생약재 추출물의 유산균 발효물이 난소 적출 동물의 골밀도 증가, TRAP 활성 및 다핵성 파골세포 형성 억제 등을 보임으로써 골질환의 예방 또는 치료에 효능이 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 골질환을 예방 또는 치료할 수 있는 황련해독탕의 유산균 발효물을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물 또는 건강기능식품을 제공하기 위한 것이다.

상기의 과제를 해결하기 위해, 황련해독탕의 유산균 발효물을 유효성분으로 포함하는 골질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에서 사용되는 용어 '황련해독탕(黃連解毒湯)'은, 황련(黃連), 황금(黃芩), 황백(黃柏) 및 치자(梔子)로 구성되고, 삼초(상초(上焦), 중초(中焦), 하초(下焦), 즉 사지를 제외한 몸통을 의미함)의 실열(實熱)이 있을 때 효험이 있는 한방유래의 탕약을 의미한다. 열성병(熱性病)으로 염증이 있고 열과 충혈에 의한 정신불안에 출혈이 있으며, 요(尿)가 붉고 심하부(心下部)가 걸려서 저항이 있을 때 처방하고, 또한 하혈, 객혈, 뇌일혈에도 처방하는 것으로 알려져 있다. 최근 연구를 통해 항산화 효과, 항궤양 효과, 이뇨작용, 혈압강하 효과 및 항균 효과 등이 보고된 바 있고, 피부와 관련하여 아토피성 피부염, 접촉성 피부염, 지루성 피부염 등에 효과가 있음이 보고된 바 있다. 본 발명의 황련해독탕은 황련, 황금, 황백 및 치자의 열수추출물인 것이 바람직하다.

본 발명에서 사용되는 용어 '유산균 발효물'은, 유산균이 성장할 수 있는 배지에 유산균을 접종하고 배양한 배양물로부터 수득한 배양결과물을 의미한다. 본 발명의 유산균 발효물은 상기 황련해독탕에 유산균을 접종하고, 호기성 대기하에, 35℃ 내지 40℃의 온도 및 1일 내지 3일의 시간 동안 발효시킨 것이 바람직하다.

상기 유산균은 락토바실루스(Lactobacillus) 속 또는 비피도박테리움(Bifidobacterium) 속인 것이 바람직하다.

상기 락토바실루스(Lactobacillus) 속은, 락토바실루스 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실루스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실루스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실루스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum), 락토바실루스 커바투스(Lactobacillus curvatus), 락토바실루스 콘푸수스(Lactobacillus confusus) 및 락토바실루스 가세리(Lactobacillus gasseri) 균주로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것이 바람직하다.

상기 비피도박테리움(Bifidobacterium) 속은, 비피도박테리움 브레브(Bifidobacterium breve) 또는 비피도박테리움 써모필럼(Bifidobacterium thermophilum) 균주인 것이 바람직하다.

본 발명에서 사용되는 용어 '골질환'은, 골밀도가 감소되어 일어나는 모든 질환을 의미하는 것으로, 골다공증, 골형성 부전증, 치주질환 또는 골절 등을 포함한다.

본 발명에서는 황련해독탕의 유산균 발효물을 함유하는 조성물이 골질환의 예방 또는 치료에 효과가 있음을 확인하였다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 골질환의 지표가 되는 파골세포 분화마커인 TRAP 활성 및 다핵성 파골세포 형성 억제효과를 확인함으로써, 골질환의 예방 또는 치료 효능이 있음을 확인하였다.

본 발명에서 사용되는 용어 '예방'은, 상기 황련해독탕의 유산균 발효물을 함유하는 조성물의 투여로 질환을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 또한, 본 발명에서 사용되는 용어 '치료'는, 상기 황련해독탕의 유산균 발효물을 함유하는 조성물의 투여로 질환의 증세가 호전되거나 완치되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 조성물은 투여를 위하여, 상기 기재한 유효성분 이외에 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기 담체, 보형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

본 발명의 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사 용액의 형태로 제형화하여 사용할 수 있다. 상세하게는, 제형화할 경우 통상 사용하는 충진제, 중량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제로는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 고형제제는 상기 황련해독탕의 유산균 발효물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 첨가하여 조제될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 과제를 포함한다. 비수성 용제 및 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로솔, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여 경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 상기 황련해독탕의 유산균 발효물의 일일 투여량은 바람직하게는 1 mg/kg 내지 500 mg/kg이며, 필요에 따라 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다.

또한, 본 발명은 황련해독탕의 유산균 발효물을 유효성분으로 함유하는 골질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.

상기 건강기능식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 천연 과일 주스 및 과일 주스 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 또한, 건강기능식품은 육류, 소세지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 껌류, 아이스크림류, 스프, 음료수, 차, 기능수, 드링크제, 알콜 및 비타민 복합제 중 어느 하나의 형태일 수 있다.

또한 상기 건강기능식품은 식품첨가물을 추가로 포함할 수 있으며, "식품첨가물"로서의 적합여부는 다른 규정이 없는 한 식품의약품안정청에 승인된 식품첨가물공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.

상기 "식품첨가물공전"에 수재된 품목으로 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산 칼륨, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성품, 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고랭색소, 구아검 등의 천연첨가물, L-글루타민산나트륨제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합 제제류 등을 들 수 있다.

이때, 건강기능식품을 제조하는 과정에서 음료를 포함한 식품에 첨가되는 본 발명에 따른 황련해독탕의 유산균 발효물은 필요에 따라 그 함량을 적절히 가감할 수 있으며, 바람직하게는 식품 100 중량%에 1 내지 15 중량% 포함되도록 첨가하는 것이 바람직하다.

본 발명은 골질환의 예방 또는 치료에 효과적인 황련해독탕의 유산균 발효물로서, 골질환의 예방 또는 치료 조성물로 약학적으로 이용 가능할 뿐 아니라 건강기능식품으로서도 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은, 본 발명의 일 실시예에 따른 RAW264.7 세포에서 황련해독탕(HRT) 및 황련해독탕 발효물(fHRT)의 TRAP 활성에 대한 효과를 나타낸 그래프이다.
도 2는, 본 발명의 일 실시예에 따른 황련해독탕(HRT) 및 황련해독탕 발효물(fHRT)의 (A) TRAP 활성 억제 효능, (B) TRAP 양성 다핵성파골세포 형성 억제 효능 및 (C) TRAP 양성 다핵성파골세포 형성 억제 효과를 확인한 세포 사진에 대한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은, 본 발명의 일 실시예에 따른 황련해독탕(HRT) 및 황련해독탕 발효물(fHRT)의 (A) 에틸아세테이트(EA) 분획물의 TRAP 활성 억제 효능, (B) 부탄올(BU) 분획물의 TRAP 활성 억제 효능, (C) 부탄올(BU) 분획물의 TRAP 양성 다핵성파골세포 형성 억제 효능 및 (D) TRAP 양성 다핵성파골세포 형성 억제 효과를 확인한 세포 사진에 대한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는, 본 발명의 일 실시예에 따른 공생배양 조건에서의 황련해독탕(HRT) 및 황련해독탕 발효물(fHRT)의 부탄올 분획물의 (A) TRAP 활성 억제 효능, (B) TRAP 양성 다핵성파골세포 형성 억제 효능 및 (C) TRAP 양성 다핵성파골세포 형성 억제 효과를 확인한 세포 사진에 대한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는, 본 발명의 일 실시예에 따른 (A) 황련해독탕(HRT) 및 황련해독탕 발효물(fHRT), (B) 황련해독탕(HRT) 및 황련해독탕 발효물(fHRT)의 에틸아세테이트 분획물(EA) 및 (C) 황련해독탕(HRT) 및 황련해독탕 발효물(fHRT)의 부탄올 분획물(BU)의 세포 생장에 대한 효과를 나타낸 그래프이다.
도 6은, 본 발명의 일 실시예에 따른 (A) 황련해독탕 부탄올 분획(HRT-BU) 및 황련해독탕 발효물 127 부탄올 분획(fHRT-BU127) 및 (B) 황련해독탕 부탄올 분획(HRT-BU) 및 황련해독탕 발효물 166 부탄올 분획(fHRT-BU166)의 MAPK 및 NF-kB 신호전달계에 대한 효과를 나타낸 것이다.
도 7은, 본 발명의 일 실시예에 따른 (A) 황련해독탕 부탄올 분획(HRT-BU) 및 황련해독탕 발효물 127 부탄올 분획(fHRT-BU127) 및 (B) 황련해독탕 부탄올 분획(HRT-BU) 및 황련해독탕 발효물 166 부탄올 분획(fHRT-BU166)의 NFATc1 및 Atp6v0d2 단백질 발현에 대한 효과를 나타낸 것이다.
도 8은, 본 발명의 일 실시예에 따른 황련해독탕 부탄올 분획(HRT-BU), 황련해독탕 발효물 127 부탄올 분획(fHRT-BU127) 및 황련해독탕 발효물 166 부탄올 분획(fHRT-BU166)의 NF-kB에 의해 조절되는 유전자 (A) ICAM-1, (B) NFkb2, (C) TNF-α 및 (D) I-kBα의 mRNA 발현에 대한 QPCR 결과를 나타낸 것이다.
도 9는, 본 발명의 일 실시예에 따른 황련해독탕 부탄올 분획(HRT-BU), 황련해독탕 발효물 127 부탄올 분획(fHRT-BU127) 및 황련해독탕 발효물 166 부탄올 분획(fHRT-BU166)의 NFATc1을 과발현시킨 BMM세포에 대한 (A) TRAP 활성 억제 효능, (B) TRAP 양성 다핵성파골세포 형성 억제 효능 및 (C) Western blot 결과를 나타낸 것이다.
도 10은, 본 발명의 일 실시예에 따른 난소 절제 랫트의 (A) bone mineral density(BMD), (B) bone volume/trabecular volume(BV/TV), (C) bone surface/bone volume(BS/BV), (D) Trabecular Thinckness(Tb.Th), (E) Trabecular separation(Tb.Sp) 및 (F) Trabecular number(Tb.N)에 대한 결과를 나타낸 것이다.
도 11은, 본 발명의 일 실시예에 따른 난소 절제 랫트의 대퇴골 Micro-CT 결과를 나타낸 것이다.

이하, 하기 제조예 및 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 제조예 및 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

실시예 : 황련해독탕 유산균 발효물 ( fHRT ) 제조

1) HRT(황련해독탕) 제조

황련, 황금, 황백 및 치자를 각 250 g씩 준비하여 총 1000 g을 10 ℓ 생수에 넣은 후 1시간 침적하였다. 그리고 115℃에서 180분간 열탕 추출하였다. 추출물은 test sieve(106 ㎛)를 이용하여 여과하여 황련해독탕을 얻었다.

2) 황련해독탕의 유산균 발효

fHRT(황련해독탕 유산균 발효물)을 제조하기 위해 락토바실루스(Lactobacillus) 속 및 비피도박테리움(Bifidobacterium) 속을 한국식품연구원(KFRI)으로부터 받아서 사용하였으며, 하기 표 1에 황련해독탕 유산균 발표물을 제조하기 위해 사용한 발효균주를 나타내었다. MRS 배지에서 37℃로 24시간 동안 2회 계대배양 한 후 배양액을 다시 배지에 주입하였다. 그리고 1×10⁶ 내지 5×10⁶ CFU/ml의 개체군을 얻기 위하여 적당히 희석한 후 접종원으로 사용하였다. 발효를 위하여, 상기 실시예 1)에서 제조한 HRT(황련해독탕) 5 ml를 상기 접종원 0.05 ml와 함께 캡이 있는 시험관에 주입하였다. 그리고 48시간 동안 37℃를 유지하면서 배양하였다.

KFRI Nov.	발효 균주	발표균주 제공기관	발효균주번호 및 균주정보
127	Lactobacillus casei	KCTC	2180
128	Lactobacillus acidophilus	KCTC	2182
129	Lactobacillus casei	ATCC	393
144	Lactobacillus plantarum	ATCC	8014
145	Lactobacillusfermentum	ATCC	14931, Fermented beets
150	Lactobacillus acidophilus	ATCC	4356IFO 13951, Human
161	Lactobacillus amylophilus	NRRL	B-4437
164	Lactobacillus fermentum	NRRL	B-4524
166	Lactobacillus curvatus	NRRL	B-4562
217	Lactobacillus acidophilus	KCTC	3168, Human intestine
227	Lactobacillus confusus	IH	14005
239	Lactobacillus brevis	IH	14003
344	Lactobacillus bulgaricus	-	-
402	Lactobacillus plantarum	ATCC	8014
442	Lactobacillus gelbruekiisubsp, lactis	ATCC	7830IFO 3376
658	Lactobacillus gasseri	NCFB	2233, DSM 20243, Human
692	Lactobacillus casei	Yakurt	-
693	Lactobacillus casei	Yacurt	-
744	Bifidobacterium breve	ATCC	15700, Intestine of infant
748	Bifidobacterium thermophilum	ATCC	25525, Swine feces
1092	Lactobacillus gasseri	ATCC	33323
NRRL: Norther Regional Research Laboratory, ARS Culture Collection, US Department of Agriculture, Peoria, III, USA DSM: Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, GmbH, Braunschweig, Germany NCFB: National Collection of Food Bacteria, Reading United Kingdom IFO: Instite for Fermentation, Osaka, Japan

실험예 1: in - vitro 분석

1) TRAP 활성 분석

파골세포 분화마커인 TRAP 효소 활성을 억제하는 효능을 확인하기 위하여, RANKL에 의해 파골 세포로 분화하는 RAW264.7 세포에 HRT(황련해독탕) 및 fHRT(황련해독탕 발효물)을 처리한 후 TRAP 활성을 측정하였다. 파골세포는 마우스의 골수세포로부터 얻었다. 골수세포는 M-CSF(60 ng/ml)를 함유한 10% FBS로 이뤄진 α-MEM에서 3일 동안 배양하여 골수 세포 유래 대식세포(BMMs)를 수득하였으며, 이를 파골세포 전구 세포로 사용하였다. 파골세포 생성을 위해, BMMs를 M-CSF(60 ng/ml) 및 RANKL(150 ng/ml)와 4일 동안 배양하였다. 조골전구세포 및 골수세포를 포함하는 공생배양으로부터 파골세포 생성을 위해, 조골전구세포는 신생마우스의 두개골로부터 준비하였다. 골수세포(BMCs) 및 조골전구세포는 1.25(OH)₂D₃(1×10^-8 M)의 존재하에 6일 동안 공생배양하였다. 배양된 세포는 TRAP 활성 측정을 위해 고정하고 착색하였다. TRAP 활성은 기질(q-나이트로페닐포스페이트, q-nitrophenyl phosphate)을 처리한 후 405 nm 흡광도에서 측정하였다.

① HRT(황련해독탕) 및 fHRT(황련해독탕 발효물)의 TRAP 효소 억제 활성

상기 실시예에서 제조된 황련해독탕(HRT) 및 황련해독탕 발효물(fHRT) 각각 100 ㎍/ml를 RAW264.7 세포에 처리하여 TRAP 활성 억제 효과를 분석하였으며, 도 1에 결과를 나타내었다. 도 1에 나타난 바와 같이, HRT와 비교하여 fHRT127은 13%, fHRT144는 6% 그리고 fHRT166은 8%로 TRAP 활성을 감소시키는 것을 확인하였다.

② HRT(황련해독탕) 및 fHRT(황련해독탕 발효물)의 농도별 TRAP 효소 억제 활성

농도별 효과를 알아보기 위하여, fHRT127 및 fHRT166과 HRT를 12.5 내지 200 ㎍/ml 농도로 처리하여 TRAP 활성 억제 효과 및 TRAP 양성 다핵성 파골세포 형성에 미치는 효과를 분석하였으며, 도 2에 나타내었다. 도 2에 나타난 바와 같이, 50, 100 및 200 ㎍/ml HRT는 TRAP 효소 활성을 19, 67 및 94% 억제하였으며, 100 ㎍/ml에서 HRT와 비교하여 fHRT127은 11%, fHRT166은 18%로 추가적인 TRAP 활성 억제효능을 나타내었다. 또한, 100 ㎍/ml에서 HRT 및 두 종의 fHRT가 약 90%의 TRAP 양성 다핵성 파골세포 형성 억제 효능을 보이는 것을 확인하였다.

③ HRT(황련해독탕) 및 fHRT(황련해독탕 발효물) 분획물의 TRAP 효소 억제 활성 및 TRAP 양성 다핵성 파골세포 생성 억제 활성 분석

상기 실시예에서 제조된 HRT 또는 fHRT을 에틸아세테이트(EA) 및 n-부탄올(BU)에 계대 용매 추출을 사용하여 분별하였으며, 각 분획은 건조시킨 후 -20℃ 건조기에 보관하였다. 각 분획물을 0 내지 30 ㎍/ml로 처리한 후 TRAP 효소 억제 활성을 분석하였으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타난 바와 같이, 10 ㎍/ml 농도에서 HRT-EA(황련해독탕 에틸아세테이트 분획)와 비교하여 fHRT-EA127(황련해독탕 발효물 127의 에틸아세테이트 분획)은 24%, fHRT-EA166(황련해독탕 발효물 166의 에틸아세테이트 분획)은 9%의 TRAP 활성 억제 효능을 나타내었다. 또한, 0 ㎍/ml 농도와 비교하여, 3, 10, 30 ㎍/ml 농도에서 HRT-BU(황련해독탕 부탄올 분획)은 각각 17%, 67% 및 95%의 TRAP 억제 활성을 보였으며, 3 ㎍/ml HRT-BU와 비교하여 fHRT-BU127(황련해독탕 발효물 127의 부탄올 분획)은 23%, fHRT-BU166(황련해독탕 발효물 166의 부탄올 분획)은 32%로 추가적인 TRAP 억제 효능을 보였다. 10 ㎍/ml HRT-BU와 비교해서는 fHRT-BU127은 21%, fHRT-BU166은 22%의 추가적인 억제효능을 보였으며, 30 ㎍/ml HRT-BU와 비교하여 fHRT-BU127은 3% 그리고 fHRT-BU166은 3%의 추가적인 TRAP 활성 억제 효능을 나타내었다.

또한, 0 ㎍/ml와 비교하여 3, 10, 30 ㎍/ml HRT-BU에서는 각각 55%, 97% 및 98%의 TRAP 양성 다핵성 파골세포 형성 억제 효능을 보였으며, 3 ㎍/ml HRT-BU와 비교하여 fHRT-BU127 및 fHRT-BU166은 34%의 추가적인 TRAP 양성 다핵성 파골세포 형성 억제 효능을 나타내었다.

④ 공생배양 조건에서 HRT-BU 및 fHRT-BU의 TRAP 활성 억제 및 TRAP 양성 다핵성 파골세포 형성 억제 효과

HRT-BU 및 fHRT-BU의 골수세포와 조골전구세포(pre-osteeoblast) 공생배양 조건에서 TRAP 효소 활성 및 TRAP 양성 다핵성 파골세포 형성에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 상기 HRT-BU 및 fHRT-BU를 0 내지 30 ㎍/ml 처리하여 분석하였으며, 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4에 나타난 바와 같이, 0 ㎍/ml와 비교하여 10 및 30 ㎍/ml의 HRT-BU는 53 및 95%의 TRAP 활성 억제 효능을 나타냈으며, 10 ㎍/ml HRT-BU와 비교하여 fHRT-BU127은 24%, fHRT-BU166은 33%의 추가적인 억제활성을 보였다. 또한, 30 ㎍/ml HRT-BU와 비교하여 fHRT-BU127 및 fHRT-BU166은 각각 3%의 추가적인 TRAP 활성 억제 효능을 나타내었다.

또한, 0 ㎍/ml와 비교하여 3, 10, 30 ㎍/ml HRT-BU는 34%, 96% 및 98%의 TRAP 양성 다핵성 파골세포 형성 억제 효능을 보였으며, 3 ㎍/ml HRT-BU와 비교하여 fHRT-BU127 및 fHRT-BU166은 각각 34%의 추가적인 TRAP 양성 다핵성 파골세포 형성 억제 효능을 나타내었다. 10 ㎍/ml HRT-BU와 비교한 경우에는 각각 3%의 추가적인 TRAP 양성 다핵성 파골세포 형성 억제 효능을 보였다.

2) 세포 생장 분석(cell viability assay)

BMM 세포(1×10⁴ cell/well)는 M-CSF(60 ng/ml) 존재하에 96-well plate에서 3일 동안 다양한 농도(12.5 내지 200 ㎍/ml)로 시료와 함께 배양하였다. Cell counting Kit-8(CCK-8)은 세포 생존능 측정에 사용하였으며, 데이터는 3번 반복실험의 평균과 표준오차로 나타내었다. 도 5에 나타난 바와 같이, 실험에 사용한 HRT(황련해독탕), fHRT(황련해독탕 발효물)이 생장을 억제하지 않음을 확인하였다. 또한, 10 ㎍/ml 농도에서 HRT-EA(황련해독탕 에탄올아세테이트 분획)은 세포 생장을 억제하지 않았으나, fHRT-EA127(황련해독탕 발효물 127의 에틸아세테이트 분획)은 26%, fHRT-EA166(황련해독탕 발효물 166의 에틸아세테이트 분획)은 22%의 추가적인 세포생장 억제를 하였으며, 30 ㎍/ml HRT-EA와 비교하여 fHRT-EA127은 35%, fHRT-EA166은 36%의 추가적인 세포생장을 억제하였다. 반면, fHRT-BU(황련해독탕 발효물의 부탄올 분획)은 세포생장 억제 활성이 나타나지 않았다.

따라서, 상기 실험예 1의 1) 및 2)의 결과에 따라, 세포 독성이 없으면서 추가적인 TRAP 활성 억제 효능을 갖는 HRT-BU 및 fHRT-BU 분획을 다른 in-vitro 실험에 사용하였다.

3) Western blot 분석

BMMs는 차가운 인산완충식염수(PBS)로 세척하고 50 mM tris-염산(pH 8.0), 5 mM EDTA, 150 mM 염화나트륨, 1% NP-40, 0.1% SDS, 1 nM PMSF, 분해효소 저해제 혼합 타블렛 및 인산화효소 저해제 혼합 타블렛으로 구성된 단백질 추출 완충용액(proteinn extraction buffer)에 녹였다. 세포 분해물은 4℃에서 10,000 ×g으로 15분 동안 원심분리하였다. 단백질 농도는 BCA 단백질 분석 키트를 사용하여 측정하였으며, 단백질 시료(20 ㎍)은 시료 완충액(100 nM tris-염산, 2% SDS, 1% 2-메캅토에탄올, 2% 글리세롤 및 0.01% 브로모페놀 블루, pH 7.6)과 혼합하고 5분 동안 95℃에서 배양하고 12% 폴리아크릴아민 겔에 점적하였다. 전기영동법은 mini protean 3 cell(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 사용하여 수행하였으며, 겔 위에 분리된 단백질은 PVDF 막으로 옮겼다. 막은 blocking 완충액(10 mM tris-염산(pH 7.5), 150 mM 염화나트륨, 0.1% Tween 20 및 3% non-fat dry milk) 내에서 배양한 후, 1:1000으로 희석된 1차 항체와 함께 상온에서 2시간 동안 배양하였다. 세척 완충액(10 mM tris-염산(pH 7.5), 150 mM 염화나트륨 및 0.1% Tween 20)으로 각 10분 동안 3차례 세척한 후, 1:2000으로 희석된 2 차 항체(Cell Signaling Technology Inc., Danvers, MA, USA)와 1시간 동안 배양하였다. 그 후, 막을 세척 완충액(10 nM tris-염산(pH 7.5), 150 mM 염화나트륨 및 0.1% Tween 20)으로 각 10분 동안 3차례 세척한 후 SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate를 사용하였다. 화학발광 신호는 LAS-3000 Luminescent image analyzer로 검출하였다.

① HRT-BU(황련해독탕 부탄올 분획) 및 fHRT-BU(황련해독탕 발효물 부탄올 분획)의 MAPK 및 NF-kB 신호전달계에 미치는 영향

HRT(황련해독탕) 및 fHRT(황련해독탕 발효물)의 분획물이 파골세포 분화와 관련된 MAPK 및 NF-kB 신호전달계에 미치는 영향을 확인하였으며, 도 6에 결과를 나타내었다. 도 6에 나타난 바와 같이, HRT-BU와 비교하여 fHRT-BU127은 RANKL 처리로 증가되는 p38, IKKα/β 및 p65의 활성을 추가적으로 억제하였으며, fHRT-BU166은 p-ERK 및 p-JNK를 추가적으로 억제하는 것을 확인하였다.

② HRT-BU(황련해독탕 부탄올 분획) 및 fHRT-BU(황련해독탕 발효물 부탄올 분획)의 NFATc1 및 Atp6v0d2 발현에 대한 효과

파골세포 분화관련 마스터 전사인자인 NFATc1과 다핵성 파골세포 형성에 관여하는 Atp6v0d2 발현에 대한 효과를 확인하였으며, 도 7에 결과를 나타내었다. 도 7에 나타난 바와 같이, NFATc1 및 Atp6v0d2의 단백질 발현이 RANKL 처리 2-3일 차에 각각 증가되는 것을 확인하였으며, HRT-BU(10 ㎍/ml)가 두 단백질의 발현 증가를 억제하며 HRT-BU와 비교하여 fHRT-BU127(10 ㎍/ml) 및 fHRT-BU166(10 ㎍/ml)이 추가적으로 두 단백질 발현을 억제하는 것을 확인하였다.

4) real-time quantitative PCR(QPCR) 분석

NF-kB에 의해 조절된 유전자의 mRNA 발현에 대한 효능을 평가하기 위하여, 세포(3×10⁵ cell/well in a 6 well plate)는 M-CSF(60 ng/ml) 존재하에 2시간 동안 시료와 배양하였다. total RNA는 RANKL(150 ng/ml)의 3, 6, 12 시간 처리 후 RNA easy mini kit로 분리하였다. first-strand cDNA는 1 ㎍ total RNA, 1 μM oligo-dT₁₈ 프라이머, RNase 10 units 및 Omniscript Reverse Transcriptase와 함께 합성하였다. 그 후, SYBR green-based QPCR 증폭은 1:3으로 희석한 first-strand cDNA 및 10 pmol 프라이머를 사용하여 SYBR Green PCR Master Mix 및 Applied Biosystems 7500 Real-time PCR system을 이용하여 수행하였다. PCR 반응은 3단계로 구성되는데, 첫 번째는 95℃에서 10분 동안 중합효소 활성화를 수행한다. 두 번째 단계는 94℃에서 30초, 60℃에서 40초 및 72℃에서 1분 동안 세 단계 사이클을 수행한다. PCR 생성물 Temperature melting curve의 생성을 위한 세 번째 단계는 95℃에서 1분, 60℃에서 30초 및 95℃에서 30초 수행된다. 모든 반응은 3번 반복하였으며, 데이터는 2^-△△ ^CT 방법으로 분석하였다. β-엑틴(actin)은 내부표준으로 사용하였다. 분석 결과를 도 8에 나타내었다.

도 8에 나타난 바와 같이, Vehicle과 비교하여 HRT-BU127이 ICAM, TNF-a 및 Nfkb2의 유전자 mRNA 발현을 추가적으로 억제하는 것을 확인하였다.

5) HRT(황련해독탕) 및 fHRT(황련해독탕 발효물)의 분획의 NFATc1 과발현에 대한 효과

파골세포에 전사인자인 NFATc1을 ectopic expression시키고, 이것이 HRT-BU(황련해독탕 부탄올 분획) 및 fHRT-BU(황련해독탕 발효물의 부탄올 분획)으로 인한 분화 억제효능을 극복할 수 있는지 조사하였다. HA-tagged Ca-NFATc1(the Xhol/Klenow-EcoRI 조각)을 코드화한 MSCV-CaNFATc1으로부터의 DNA 조각은 푸로마이신 선별인자(pMX-Ca-NFATc1)와 함께 pMX-puronow-EcoRI로 서브클로닝하였다. 레트로바이러스 스톡을 제조하기 위하여, pMX벡터(control) 및 pMX-Ca-NFATc1 레트로바이러스 벡터를 LiPofectamine 2000(Invitrogen)을 사용하여 PLAT-E 세포에 주입하였다. 그리고 배지는 2일 후에 수득하였으며, 이를 BMMs(1×10⁷ cell/100 mm dish)에 M-CSF(120 ng/ml) 및 폴리브렌(polybrene, 5 ㎍/ml)와 2일 동안 추가배양하였다. 푸로마이신-저항성(puromycin-resistant)인 BMMs는 60 ng/ml M-CSF 및 150 ng/ml RANKL 존재하에 4 내지 5일 동안 파골세포로 분화하였다. 조사 결과는 도 9에 나타내었다. 도 9에 나타난 바와 같이, pMX vector를 transfection 시킨 BMM에서 Vehicle과 비교하여 HRT-BU는 78%, fHRT-BU127은 88% 그리고 fHRT-BU166은 90% TRAP 활성 억제 효능을 보였으며, HRT-BU는 93%, fHRT-BU127은 98% 그리고 fHRT-BU166은 95%의 TRAP 양성 다핵성 파골세포 형성 억제 효능을 나타내었다. 또한, pMX vector와 비교하여 Ca-NFATc1을 trasfection 시킨 BMM은 약 2배의 TRAP 활성 증가를 보였으며, Ca-NFATc1을 trasnfection 시킨 BMM과 비교하여 HRT-BU는 85%, fHRT-BU127은 90% 그리고 fHRT-BU166은 95%의 TRAP 활성 억제 효능을 보였다. 또한 pMX vector와 비교하여 Ca-NFATc1을 trasfection 시킨 BMM은 약 3배의 다핵성 파골세포 형성 증가를 보였으며, Ca-NFATc1을 transfection 시킨 BMM과 비교하여 HRT-BU는 92%, fHRT-BU127은 88% 그리고 fHRT-BU166은 98%의 TRAP 양성 다핵성 파골세포 형성 억제 효능을 나타내었다.

실험예 2: in - vivo 분석

1) 실험동물

190 내지 210 g의 8주된 암컷 Sprague-Dawley 랫트(Orient Bio Inc., Seoul, Korea)를 실험에 사용하였다. 실험 전 랫트는 7일간의 순화과정을 거쳐 실험에 사용하였으며, 순화과정 동안 22±1℃ 온도 및 55±10% 습도가 조절된 사육실에서 자유식이로 사육하였으며, 명암 주기는 12시간 주기로 조절하였다. 그 후 sham-operate(Sham, n=8) 또는 난소 절제술(OVX, n=56)을 실시하였다. 동물실험은 한국한의학연구원 동물실험운영규정에 준하여 취급하였다.

2) 시료투여 및 시료에 따른 골손실 효과 분석

상기 난소 절제(OVX) 랫트는 수술 일주일 후, 각 8마리씩 7군으로 나누고, 3개월 동안 황련해독탕(HRT) 및 황련해독탕 발효물(fHRT127 및 fHRT166)을 두 농도(0.3 g/kg 및 1.0 g/kg)로 경구투여 하였으며, 하기 표 2에 자세한 실험 군을 나타내었다.

군	시료투여량
OVX	양방향 OVX
HRT-0.3	양방향 OVX 후 0.3 g/kg HRT 주입
HRT-1.0	양방향 OVX 후 1.0 g/kg HRT 주입
fHRT127-0.3	양방향 OVX 후 0.3 g/kg fHRT127 주입
fHRT127-1.0	양방향 OVX 후 1.0 g/kg fHRT127 주입
fHRT166-0.3	양방향 OVX 후 0.3 g/kg fHRT166 주입
fHRT166-1.0	양방향 OVX 후 1.0 g/kg fHRT166 주입

상기 시료투여에 따른 난소 절제(OVX) 랫트의 대퇴골에서 골손실에 대한 효과를 도 10에 나타내었다. 도 10에 나타난 바와 같이, Sham 군과 비교하여 OVX군은 골밀도(BMD)가 70% 감소, bone volume/trabecular volume(BV/TV)가 65% 감소, bone surface/bone volume raito(BS/BV)가 29% 증가, Trabecular Thinckness(Tb.Th)가 14% 감소, Trabecular separation(Tb.Sp)가 169% 증가 및 Trabecular number(Tb.N)이 60% 감소하는 효과를 나타내었다. 상기 결과를 10A 내지 도 10F를 통하여 더 자세하게 나타내었다.

도 10A에 나타난 바와 같이, Sham군을 100%로 하여, OVX군과 비교한 결과 fHRT127-1.0은 55% 그리고 fHRT166-0.3은 52%로 골밀도(BMD)를 유의적으로 증가시켰으며, HRT-0.3과 비교하여 fHRT166-0.3은 43%, HRT-1.0과 비교하여 fHRT127-1.0은 54%로 추가적으로 BMD를 증가키는 것을 확인하였다.

도 10B에 나타난 바와 같이, OVX군과 비교하여 fHRT127-1.0은 35% 그리고 fHRT166-0.3은 31%로 BV/TV를 유의적으로 증가시켰으며, HRT-0.3과 비교하여 fHRT166-0.3은 27%의 BV/TV를 증가시켰으나 유의성은 없었다. 또한, HRT-1.0과 비교하여 fHRT127-1.0은 41%로 BV/TV를 유의적이며 추가적으로 증가시켰다.

도 10C에 나타난 바와 같이, OVX군과 비교하여 fHRT127-1.0은 34%, fHRT166-0.3은 34% 그리고 fHRT166-1.0은 20%로 BS/BV를 유의적으로 감소시켰다. 또한, HRT-0.3 및 HRT-1.0과 비교하여 fHRT166-0.3 및 fHRT127-1.0은 각각 23%씩 유의적이며 추가적으로 BS/BV를 감소시켰다.

도 10D에 나타난 바와 같이, OVX군과 비교하여 fHRT127-1.0은 21%, fHRT166-0.3은 19% 그리고 fHRT166-1.0은 11%로 유의적으로 Tb.Th를 증가시켰으며, HRT-0.3 및 HRT-1.0과 비교하여 fHRT166-0.3 및 fHRT127-1.0은 각각 15% 유의적이며 추가적으로 Tb.Th를 증가시켰다.

도 10E 및 도 10F에 나타난 바와 같이, OVX군과 비교하여 유의적으로 Tb.Sp 및 Tb.N을 변화시키는 군은 발견되지 않았다.

2) Mitro-computed tomography(Micro-CT) 분석

3D 골격 구조 분석을 위해, 8 ㎛ 해상도 eXplore Locus 스캐너(GEHealthcare UK Ltd., Buckinghamshire, UK)로 조직형태학적 분석을 수행하였다. 모든 형태측정 파라미터는 eXplore Micro-View(wersion 2.2, GEHealthcare)을 사용하여 계산하였다. 대퇴골에서, 스캐너 영역은 초기의 해면상의 proximal tip으로부터 약 1.7 mm 확장한 말초 골간단에 한정하였으며, 결과를 도 11에 나타내었다.

상기 모든 실험의 통계학적분석은 SPSS 소프트웨어를 사용하여 수행하였다. TRAP 활성 및 파골세포 관련 유전자의 mRNA expression level의 유의성은 β-엑틴(actin)-normalized 2^-△△CT 수치를 사용한 studen's t-test로 계산하였으며, 동물실험의 통계분석을 위해, 분산의 파라메트릭 one-way 분석은 모든 다른 군 시험에 사용하였다. Duncan multiple comparison test는 그룹간 평균수치 유의차를 확인하기 위해 사용되었으며, 0.05 보다 낮은 p 수치는 의미가 있는 결과로 고려하였다.

Claims

황련해독탕의 유산균 발효물을 유효성분으로 포함하는 골질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 황련해독탕은 황련, 황금, 황백 및 치자의 열수추출물인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 유산균 발효물은 상기 황련해독탕에 유산균을 접종하고, 호기성 대기하에, 35℃ 내지 45℃의 온도 및 1일 내지 3일의 시간 동안 발효시킨 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제3항에 있어서, 상기 유산균은 락토바실루스(Lactobacillus) 속 또는 비피도박테리움(Bifidobacterium) 속인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제4항에 있어서, 상기 락토바실루스(Lactobacillus) 속은, 락토바실루스 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실루스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실루스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실루스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum), 락토바실루스 커바투스(Lactobacillus curvatus), 락토바실루스 콘푸수스(Lactobacillus confusus) 및 락토바실루스 가세리(Lactobacillus gasseri) 균주로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제4항에 있어서, 상기 비피도박테리움(Bifidobacterium) 속은, 비피도박테리움 브레브(Bifidobacterium breve) 또는 비피도박테리움 써모필럼(Bifidobacterium thermophilum) 균주인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
황련해독탕의 유산균 발효물을 유효성분으로 함유하는 골질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
제7항에 있어서, 상기 황련해독탕은 황련, 황금, 황백 및 치자의 열수추출물인 것을 특징으로 하는 건강기능식품 조성물.
제7항에 있어서, 상기 유산균 발효물은 상기 황련해독탕에 유산균을 접종하고, 호기성 대기하에, 35℃ 내지 45℃의 온도 및 1일 내지 3일의 시간동안 발효시킨 것을 특징으로 하는 건강기능식품 조성물.
제9항에 있어서, 상기 유산균은 락토바실루스(Lactobacillus) 속 또는 비피도박테리움(Bifidobacterium) 속인 것을 특징으로 하는 건강기능식품 조성물.
제10항에 있어서, 상기 락토바실루스(Lactobacillus) 속은, 락토바실루스 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실루스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실루스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실루스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum), 락토바실루스 커바투스(Lactobacillus curvatus), 락토바실루스 콘푸수스(Lactobacillus confusus) 및 락토바실루스 가세리(Lactobacillus gasseri) 균주로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 건강기능식품 조성물.
제10항에 있어서, 상기 비피도박테리움(Bifidobacterium) 속은, 비피도박테리움 브레브(Bifidobacterium breve) 또는 비피도박테리움 써모필럼(Bifidobacterium thermophilum) 균주인 것을 특징으로 하는 건강기능식품 조성물.