KR20160086249A - 락토바실러스 플란타룸 yd-212 균주 및 이를 이용하여 제조되는 발효물을 포함하는 조성물 - Google Patents
락토바실러스 플란타룸 yd-212 균주 및 이를 이용하여 제조되는 발효물을 포함하는 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 건강한 한국 성인의 분변에서 분리한 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) YD-212 균주 및 이에 의한 발효물을 유효성분으로 포함하는 골 대사질환 예방 및 개선용 조성물 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 락토바실러스 플란타룸 YD-212 균주에 의한 발효물은 조골세포의 증식 및 분화를 촉진하고, 골밀도 및 골강도를 증가시킴으로써 골다공증 등의 골 대사성 질환을 개선, 예방 또는 치료하는데 매우 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 락토바실러스 플란타룸 YD-212 균주 및 이를 이용하여 제조되는 발효물을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 락토바실러스 플란타룸 YD-212 균주를 사용하여 제조되는 발효물을 포함하는 골 대사 개선용 또는 골 질환의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.
오래된 뼈의 흡수 또는 파괴는 혈액세포(조혈모세포)에서 생기는 파골세포에 의해 이루어지며 이는 뼈에 구멍을 내어 적은 양의 칼슘이 혈류로 방출되어 신체기능을 유지하는데 사용된다(William J. et al., 2003). 한편, 뼈세포에서 생성된 조골세포는 교원질로 구멍을 채우고 칼슘과 인의 침척물(Hydroyapatite)을 덮어서 단단한 새로운 뼈를 만들어 골격을 재건한다(Stains J.P. et al., 2005). 유아에서는 1년 내에 뼈의 칼슘이 100% 바뀌지만 성인에서는 매년 골격의 약 10-30%가 이런 과정을 통하여 재형성되며, 파골속도와 조골속도가 동일해야만 전과 같은 골밀도를 유지할 수 있다. 골의 재형성 시스템 중 조골세포의 활성이 저하되어 골형성이 감소하거나 파골세포의 활성이 증가하여 골흡수가 상승하는 경우, 또는 두 가지 요소가 모두 작용하는 경우 골 대사 질환이 발생하는데, 골다공증 등의 질환이 대표적이다.
Yamamura 등(1999)은 조골세포의 증식을 촉진하는 유청단백질 성분은 분자량이 약 10kDa에 해당하는 HMG1(high mobility group protein)일 것으로 추정하였으며, 이 단백질은 양이온크로마토그래피의 정제 과정에서 결합하였으므로 염기성 단백질(milk basic protein fraction, MBP)이라 하였다. 우유에 존재하는 미량단백질인 MBP와는 다르게 우유단백질에 외부로부터 투입된 단백질 분해효소나 발효과정에서 스타터로부터 분비되는 단백질 분해효소는 단백질을 분해하여 생리적으로 활성을 지닌 펩타이드를 생산하기도 하며 특히 골밀도를 향상시키는데 기여하기도 한다.
본 발명은 유산균에 의한 발효물을 이용하여 골 대사를 개선하여 골 대사성 질환을 치료할 수 있는 가능성에 대한 연구로, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) YD-212 균주 및 이에 의한 발효물이 조골세포의 성장 및 분화를 촉진하여 골밀도와 골강도를 증가시키는 효능을 가짐으로써 골 대사성 질환의 개선, 치료 및 예방에 매우 유용함을 발견하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 균주에 의한 발효물을 유효 성분으로 포함하는 골 대사 개선용 또는 골 질환의 예방 및 치료용 조성물을 제공하는데 있다. 또한, 본 발명의 다른 목적은 락토바실러스 플란타룸 균주에 의한 발효물의 제조방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
이하, 본원에 기재된 다양한 구체예가 도면을 참조로 기재된다. 하기 설명에서, 본 발명의 완전한 이해를 위해서, 다양한 특이적 상세사항, 예컨대, 특이적 형태, 조성물 및 공정 등이 기재되어 있다. 그러나, 특정의 구체예는 이들 특이적 상세 사항 중 하나 이상 없이, 또는 다른 공지된 방법 및 형태와 함께 실행될 수 있다. 다른 예에서, 공지된 공정 및 제조 기술은 본 발명을 불필요하게 모호하게 하지 않게 하기 위해서, 특정의 상세사항으로 기재되지 않는다. "한 가지 구체예" 또는 "구체예"에 대한 본 명세서 전체를 통한 참조는 구체예와 결부되어 기재된 특별한 특징, 형태, 조성 또는 특성이 본 발명의 하나 이상의 구체예에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체에 걸친 다양한 위치에서 표현된 "한 가지 구체예에서" 또는 "구체예"의 상황은 반드시 본 발명의 동일한 구체예를 나타내지는 않는다. 추가로, 특별한 특징, 형태, 조성, 또는 특성은 하나 이상의 구체예에서 어떠한 적합한 방법으로 조합될 수 있다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 락토바실러스 플란타룸 YD-212(Lactobacillus plantarum YD-212)을 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 락토바실러스 플란타룸 YD-212 균주에 의한 발효물을 유효 성분으로 포함하는 골 대사 개선용 조성물을 제공한다. 본 발명에 따른 락토바실러스 플란타룸 YD-212는 한국인을 위한 발효제품에 사용되는 유산균으로서 한국인의 인체로부터 유산균을 분리함으로써, 숙주 특이성의 관계에서 유산균의 유용한 효과를 극대화할 수 있다.
본 발명의 락토바실러스 플란타룸 YD-212은 미생물의 동정 및 분류를 위한 16S rRNA 염기서열 분석 결과 락토바실러스 플란타룸 표준균주(Lactobacillus plantarum WCFS1, GenBank accession number NC_004567.2)와 가장 높은 상동성(97.6%)을 나타내어 락토바실러스 플란타룸과 가장 높은 분자계통학적 유연관계를 보였다.
본 발명의 락토바실러스 플란타룸 YD-212는 장기간 안정적으로 보존하기 위해서 물과 글리세롤이 일정량 혼합하여 만들어진 멸균 보관용액에 균체를 풀어 -80℃에 보관하거나, 멸균된 10% 탈지유에 현탁하여 동결 건조할 수 있다.
본 발명에서 발효 원료로 사용되는 "우유(milk)"는 다양한 동물 기원의 우유를 의미하며, 예를 들어 소의 우유(cow milk), 염소의 우유(goat milk), 또는 말의 우유(horse milk)를 포함하며 이에 한정되지 않는다. 또한 이들의 전우유(whole milk) 또는 탈지 우유(skim milk) 또는 이들의 분말(powder) 형태로 사용될 수 있다. 본 발명의 명세에서 용어 "우유 단백질"은 우유에 포함되어 있는 모든 단백질을 의미하며, 예컨대, 카세인(casein), 유청 단백질(whey protein) 및 그 밖의 미량의 우유 단백질을 모두 포함한다.
본 발명의 명세서에서 용어 "발효물"은 본 발명의 락토바실러스 플란타룸 균주에 의한 탈지우분유와 같은 배지상에서 발효 후에 얻어진 모든 발효물의 혼합물(mixture)을 의미한다. 본 발명의 발효물은 통상적인 유산균 발효 방법에 의해 제조될 수 있다. 유산균 발효 방법은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 공지되어 있다.
본 발명에서 "골질환"은 뼈 내의 파골세포와 조골세포의 불균형에 의한 결과로서 그 예로는 이에 한정하지는 않지만, 뼈의 손상, 골다공증, 골연화증, 구루병, 섬유성 골염, 무형성골질환 및 대사성골질환이 있다(한국등록특허 제 10-0399374 및 제 10-0720026 참조). 생물의 뼈 조직은 조골세포에 의한 조직의 형성과 파골세포에 의한 조직의 흡수가 끊임없이 반복되는 동적인 평형 상태를 유지하고 있다. 성인의 뼈는 오래된 뼈는 제거되고 새로운 뼈로 대체하는 생성과 흡수 과정을 지속적으로 반복 재생하면서 균형을 유지하게 된다. 이를 골재형성(Bone Remodeling)이라고 한다(Yamaguchi A. et al., 2005). 조골세포는 새로운 뼈를 생성하는 골 생성 과정에, 파골세포는 낡은 뼈를 파괴하는 재흡수 과정에 관여하며 뼈를 파손(흡수)하고 생성(재형성)시키는 과정이 한 단계가 다른 단계를 자극하면서 평형 상태를 유지한다(Christenson, Clinical Biochemistry, 30권, 573-593, 1997). 뼈(Bone)는 인체의 연조직과 체중을 지탱해주고 내부기관을 둘러싸서 내부 장기를 외부의 충격으로부터 보호한다. 또한, 근육이나 장기를 구조적으로 지탱할 뿐만 아니라 체내의 칼슘이나 다른 필수 무기질, 즉 인이나 마그네슘과 같은 물질을 저장하는 인체의 중요한 부분 중 하나이다. 골다공증(Osteoporosis)은 여러 가지 원인에 의하여 골 조직의 석회가 감소되어 뼈의 치밀질이 엷어지고 그로 인해 골수강이 넓어지게 되며, 증세가 진전됨에 따라 뼈가 약해지기 때문에 작은 충격에도 골절되기 쉽다. 뼈를 구성하는 미네랄(특히 칼슘)과 기질이 감소한 상태이며, 골재형성의 균형이 깨져서 파골작용이 조골작용보다 증가된 상태에서 발생한다(Iqbal M.M., 2000). 정상적인 뼈 내부는 그물망처럼 치밀한 구조를 이루고 있으나, 골다공증의 경우에는 구조 사이의 간격이 넓어지고 미세구조가 얇아져 약해짐으로써 조그만 충격에도 뼈가 쉽게 골절될 수 있는 상태로 진행된다(Stepan J.J. et al., 2003). 골다공증은 폐경기의 시작과 동시에 급속한 골 손실(년간 2-3%)이 나타나며 척추의 압박 및 손목뼈가 쉽게 골절될 위험이 증가하는 폐경기 이후의 골다공증(Postmenopausal osteoporosis), 그리고 연령에 상관없이 질병(내분비질환, 위장관질환, 악성종양)이나 약물(부신피질호르몬, 항암화학요법, 갑상성호르몬, 항경련제, 항응고제, methotexate, cyclosporine, GnRH 등), 알코올, 흡연, 사고로 인해 발생하는 2차 골다공증(Secondary osteoporosis)으로 분류된다(RoSep C.J., et al., 2005; Davidson M. et al., 2002). 현재 사용되고 있는 골다공증 치료제는 대부분 에스트로겐 계통의 물질로서, 이들은 장기 투여할 경우 암, 담석, 혈전증 등의 부작용이 나타나는 문제점이 있다. 골다공증은 약물의 단기 투여만으로는 치료할 수 없고 약물의 장기 투여가 필수적인 질환이므로, 약물을 장기 투여할 때에도 상기와 같은 부작용이 없고 에스트로겐을 대체할 수 있을 만큼 우수한 약효를 갖는 새로운 물질의 개발이 요구되고 있다. 골다공증 예방을 위한 식품소재는 대두단백질 또는 대두 추출물 등 콩 및 콩 가공품 등 식품에 함유된 피토에스트로겐(phytoestrogen)을 응용하여 장기간 복용할 수 있고 상대적으로 부작용이 적은 골다공증 예방 및 치료제를 개발하고자 많은 연구자 진행 중이다. 식물성 호르몬인 피토에스트로겐은 생체이용률은 비교적 낮으나 에스트로겐 수용체-α(ER-α) 및 에스트로겐 수용체-β(ER-β)에 대한 친화력이 좋고 유방암 등의 부작용이 적어 골다공증 치료제인 E2의 대체 의약품으로 각광받고 있다. 피토에스트로겐으로 알려진 물질로는 다이드제인(daidzein), 제니스테인(genistein), 포르모노네틴(formononetin), 비오카닌 A(biochanin A), 등의 이소플라본(isoflavone)류 화합물, 쿠메스트롤(coumestrol) 등의 쿠메스탄(coumestan)류 화합물, 엔테로락톤(enterolactone) 등의 리그난(lignan)계 화합물 및 엔테로디올(enterodiol)등의 페놀(phenol)계 화합물이 있다. 축산자원의 경우, 유청 단백질의 급여가 난소절제 된 쥐의 골강도와 골세포 대사 및 미네랄화를 조절하는데 관여하는 골기질 단백질 콜라겐(collagen)의 구성성분인 하이드록시프롤린(hydroxyroline)의 함량을 증가시킬 수 있음이 보고되었다(Takada et al., 1997). 또한 유청 단백질이 세포배양실험에서 조골세포주의 증식을 향상시키는 반면(Takada et al., 1996), 파골세포의 골흡수를 감소시킬 수 있음(Takada el al., 1997)이 확인됨에 따라 유청단백질에 존재하는 활성성분을 구명하려는 연구가 지속적으로 수행되었다.
본 발명의 명세서에서 용어 "예방"은 질환 또는 질병을 보유하고 있다고 진단된 적은 없으나, 이러한 질병 또는 질병에 걸리기 쉬운 경향이 있는 동물에서 질환 또는 질병의 발생을 억제하는 것을 의미한다. 본 명세서에서 용어 "치료"는(a) 질환 또는 질병의 발전의 억제;(b) 질환 또는 질병의 경감;(c) 질환 또는 질병의 제거를 의미한다.
본 발명의 락토바실러스 플란타룸 YD-212 균주에 의한 발효물은 조골세포의 증식과 분화를 촉진하여 골밀도와 골강도를 증진시키는 효능을 갖는다. 따라서 본 발명의 발효물은 파골세포와 조골세포의 활성 및 증식의 균형이 깨어진 불균형한 골 대사를 개선하는데 매우 유용하게 사용될 수 있다. 따라서 본 발명에 의하면 발효 시에 외부로부터 단백질 분해 효소나 단백질 분해물들을 따로 첨가하지 않고 골 대사 질환의 예방 및 개선 효과를 갖는 발효물을 제공할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 수탁번호 KCTC 12728BP의 락토바실러스 플란타룸 YD-212(Lactobacillus plantarum YD-212) 균주를 제공한다. 상기 구체예에서, 상기 균주는 pH2.5 이하의 강산의 환경에서 내산성을 갖고, 담즙산에 노출된 환경에서 내담즙성을 갖으며, 용혈 현상 검사, 젤라틴 액화 반응 검사, 유해 대사산물(암모니아) 생성 확인 검사 중 어느 하나 이상의 검사에서 안정성이 높은 균주를 제공한다.
본 발명의 일 구체예에서, 수탁번호 KCTC 12728BP의 락토바실러스 플란타룸 YD-212(Lactobacillus plantarum YD-212) 균주를 탈지분유배지에 접종하는 단계, 23~39℃의 범위에서 수일간 배양하는 단계. 상기 배양액을 원심분리하여 상등액을 분리하는 단계. 및 회수된 상등액을 pH 6.0~7 미만의 범위로 조정한 후 동결 건조하는 단계를 포함하는 골 대사 개선용, 골 질환의 예방 및 치료용 발효물을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에서, 본 발명은 수탁번호 KCTC 12728BP의 락토바실러스 플란타룸 YD-212(Lactobacillus plantarum YD-212) 균주을 제공한다. 상기 구체예에서, 상기 균주는 pH2.5 이하의 강산의 환경에서 내산성을 갖는 균주을 제공하고, 상기 균주는 담즙산에 노출된 환경에서 내담즙성을 갖는 균주를 제공한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 균주로 발효시킨 발효물을 유효성분으로 포함하는 골 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 상기 구체예에서, 골질환은 골 질환은 골다공증(osteoporosis), 골연화증(osteomalacia), 구루병, 섬유성 골염, 무형성 골질환 및 대사성 골질환으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 약학 조성물을 제공하고, 상기 발효물은 골밀도 또는 골강도를 증가시키는 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 균주로 발효시킨 발효물을 포함하는 골 질환의 개선용 식품 조성물을 제공한다. 상기 구체예에서, 골 질환은 골다공증(osteoporosis), 골연화증(osteomalacia), 구루병, 섬유성 골염, 무형성 골질환 및 대사성 골질환으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 식품 조성물을 제공하고, 상기 발효물은 골밀도 또는 골강도를 증가시키는 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 균주를 배지에 접종하는 단계, 20~40℃의 범위에서 배양하는 단계; 상기 배양액의 상등액을 분리하는 단계; 및 회수된 상등액을 동결 건조하는 단계를 포함하는 골 질환 치료용 발효물을 제조하는 방법을 제공한다. 상기 구체예에서, 배지는 탈지분유를 포함하는 골 질환 치료용 발효물을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 본 발명의 활성 발효물을 0.1 내지 50 중량%로 포함한다. 본 발명의 본 발명의 활성 발효물을 포함하는 조성물은 통상의 방법에 따른 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상세하게는, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 본 발명의 활성 발효물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose), 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는 데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으나, 일반적으로 0.01 내지 500 mg/㎏의 양, 바람직하게는 0.1 내지 100 mg/㎏의 양을 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다. 또한 그 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다. 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 랫트, 마우스, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식이 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직 본 발명은 상기 본 발명의 활성 발효물 및 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 포함하는 건강 기능 식품을 제공하는데, 각종 식품류, 예를 들어, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있으며, 환제, 분말, 과립, 침제, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다. 이때, 식품 또는 음료 중의 상기 본 발명의 활성 발효물의 양은, 일반적으로 본 발명의 건강식품 조성물의 경우 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물의 경우 100㎖를 기준으로 0.02 내지 10g, 바람직하게는 0.3 내지 1g의 비율로 가할 수 있다.
본 명세서에서 정의되는 식품보조첨가제는 당업계에 통상적인 식품첨가제, 예를 들어 향미제, 풍미제, 착색제, 충진제, 안정화제 등을 포함한다. 본 발명에 따른 건강 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서, 상기 본 발명의 활성 발효물 외에 첨가되는 성분에 특별한 제한은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 예로는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱 스트린; 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등)) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100㎖당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다.
상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.
그밖에 본 발명의 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100중량부당 0 내지 약 20중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
본 발명은 락토바실러스 플란타룸 균주 및 이에 의한 발효물을 유효성분으로 포함하는 골 대사질환 예방 및 개선용 또는 치료용 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물의 유효성분인 발효물은 조골세포의 증식과 분화를 촉진하며, 골밀도와 골강도를 증가시키는 효능을 가지므로 골다공증 등의 골 대사성 질환의 개선, 예방 또는 치료에 매우 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 신규 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) YD-212 균주의 내산성과 내담즙성을 나타내는 그래프이다.
도 2는 본 발명의 신규 락토바실러스 플란타룸 YD-212 균주에 의한 우유 발효물의 발효 시간에 따른 조골세포(MC3T3-E1) 증식에 미치는 효과를 나타내는 그래프이다.
도 3은 본 발명의 신규 락토바실러스 플란타룸 YD-212 균주에 의한 우유 발효물 및 동일 단백질 함량의 탈지유, 유청단백질의 조골세포 증식 효과를 비교하는 그래프이다.
도 4는 본 발명의 신규 락토바실러스 플란타룸 YD-212 균주에 의한 우유 발효물의 조골세포 분화 활성에 미치는 효과를 나타내는 그래프이다.
도 5는 본 발명의 신규 락토바실러스 플란타룸 YD-212 균주에 의한 우유 발효물 급여가 난소 절제 랫드의 골밀도에 미치는 효과를 나타내는 그래프이다.
도 6은 본 발명의 신규 락토바실러스 플란타룸 YD-212 균주에 의한 우유 발효물 급여가 난소 절제 랫드의 골 파괴 강도에 미치는 효과를 나타내는 그래프이다.
도 2는 본 발명의 신규 락토바실러스 플란타룸 YD-212 균주에 의한 우유 발효물의 발효 시간에 따른 조골세포(MC3T3-E1) 증식에 미치는 효과를 나타내는 그래프이다.
도 3은 본 발명의 신규 락토바실러스 플란타룸 YD-212 균주에 의한 우유 발효물 및 동일 단백질 함량의 탈지유, 유청단백질의 조골세포 증식 효과를 비교하는 그래프이다.
도 4는 본 발명의 신규 락토바실러스 플란타룸 YD-212 균주에 의한 우유 발효물의 조골세포 분화 활성에 미치는 효과를 나타내는 그래프이다.
도 5는 본 발명의 신규 락토바실러스 플란타룸 YD-212 균주에 의한 우유 발효물 급여가 난소 절제 랫드의 골밀도에 미치는 효과를 나타내는 그래프이다.
도 6은 본 발명의 신규 락토바실러스 플란타룸 YD-212 균주에 의한 우유 발효물 급여가 난소 절제 랫드의 골 파괴 강도에 미치는 효과를 나타내는 그래프이다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 상세히 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 유산균 분리 및 동정
본 발명에 따른 균주를 분리하기 위하여 건강한 한국인 성인의 분변 1g을 멸균한 생리식염수에 101 내지 107 배로 단계적으로 희석한 후, 각 희석액 0.1mL을 엠알에스 한천배지(MRS, 배지 조성은 표 1 참조)에 도말하고 37℃에서 48시간 동안 배양하여 유산균만을 분리, 선별하였다.
상기 균주를 동정하기 위해 16S rRNA 염기서열을 분석하였다. 16S rRNA 염기서열을 분석하기 위해, MRS 액체배지에 37℃로 18시간 동안 정치 배양한 후 원심 분리하여 균주를 회수하고, G-spinTM Genomic DNA Extraction Kit(for Bacteria, iNtRON Biotechnology, Inc. 17212)를 이용하여 유산균주의 genomic DNA를 분리하였다. 16S rRNA 염기서열 분석을 위해 Universal Primer인 27F(5' AGAGTTTGATCMTGGCTCAG 3')와 1492R(5' TACGGYTACCTTGTTACGACTT 3')를 이용하여 Tm(annealing temperature) 57℃, 30cycle PCR 반응 후, 염기서열 분석 회사인 Biomedic에 의뢰하여 염기서열을 분석하였다.
상기 균주는 16S rRNA 염기서열 분석 결과 락토바실러스 플란타룸 표준균주(Lactobacillus plantarum WCFS1, GenBank accession number NC_004567.2)와 가장 높은 상동성(97.6%)을 나타내어, 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 가지는 락토바실러스 플란타룸으로 동정되었으며, 본 발명자들은 상기 균주를 "락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) YD-212"로 명명하였으며, 한국생명공학연구원 미생물자원센터(Korean Collection for Type Cultures; KCTC)에 기탁하였다(수탁번호 KCTC 12728BP).
실시예 2: 락토바실러스 플란타룸 YD-212 균주의 특성 확인
실험예 1: 내산성 측정
인공 위액에서의 내산성 실험은 Kobayashi 등(1974)의 방법에 따라, 제조한 인공 위액을 사용하여 위장 환경인 유사한 강산과 소화효소에 대해 락토바실러스 플란타룸 YD-212가 생존하는 능력을 알아보았다. 구체적으로, 락토바실러스 플란타룸 YD-212를 MRS 액체 배지에 접종하여 37℃에서 18시간 동안 정치 배양하여 유산균의 농도가 109 내지 1010CFU/mL이 되도록 하였다. 배양된 유산균은 pH 2.5, 위의 소화효소인 펩신(pepsin, Sigma, P7000) 1,000Units/mL이 첨가된 MRS 액체 배지에 접종하여 37℃ 항온수조에 담아 3시간 동안 방치한 후 멸균수에 일정 비율로 희석하여 MRS 평판배지에 도말하여 나타난 집락 수(colony forming unit, CFU)를 비교하여 유산균의 생존력을 표시하였다. 유산균은 접종 직후(0 시간)와 3시간 방치한 후 비교하였으며, 생존력(%)은 "시간 경과 후 생균수/반응 초기의 생균수×100"으로 계산하였다.
그 결과, 락토바실러스 플란타룸 YD-212는 pH 2.5에서, 초기 9.1×107CFU/mL에서 3시간 처리 후 4.0×107CFU/mL로 95.19%의 생존력을 나타내었다(도 1). 본 발명의 락토바실러스 플란타룸 YD-212는 위의 소화효소 펩신과 pH 2.5 강산의 조건에서 생존력이 뛰어나 내산성이 우수한 균주임을 알 수 있었다.
실험예 2: 내담즙성 측정
인공 담즙에서의 내담즙성 실험은 Casey 등(2004)의 방법에 따라 진행하였으며, 생체 내에서 분비되는 담즙산에 대한 락토바실러스 플란타룸 YD-212의 생존능을 측정하기 위해, 황소 담즙(옥스갈, Oxgall, BD DifcoTM, 212820) 0.3%가 첨가된 MRS 액체 배지에 락토바실러스 플란타룸 YD-212를 접종하여 37℃ 항온수조에 담아 24시간 동안 방치한 후 멸균수로 일정비율로 희석하여 MRS 평판배지에 도말하여 나타난 집락 수(colony forming unit, CFU)를 비교하여 유산균의 생존력을 표시하였다. 유산균은 접종 직후(0 시간)와 3시간 방치한 후 비교하였으며, 생존력(%)은 "시간 경과 후 생균수/반응 초기의 생균수×100"으로 계산하였다.
그 결과, 락토바실러스 플란타룸 YD-212는 담즙산(옥스갈 0.3%)에서 24시간 처리 후 1.7×107CFU/mL로 초기 8.6×107CUF/mL과 비교하였을 때, 91.3%의 생존력을 나타내었다(도 1). 따라서 락토바실러스 플란타룸 YD-212는 담즙산에 노출된 환경에서 내담즙성이 우수한 균주임을 알 수 있었다.
실험예 3: 락토바실러스 플란타룸 YD-212 균주의 안전성 평가
상기 실시예 1에서 분리된 균주의 안전성을 평가하기 위하여 한국바이오벤처협회 단체표준에서 제시한 안전성 평가 시험법에 따라 용혈 현상 검사, 젤라틴 액화 반응 검사, 유해 대사산물(암모니아) 생성 확인 검사를 수행하였다.
결과는 하기 표 2와 같다.
락토바실러스 플란타룸 YD-212는 젤라틴 액화반응, 유해 대사산물(암모니아) 생성에 대해 음성이었으며, 용혈성 검사에서는 병원성과 무관한 것으로 판정되는 α-용혈로 확인되었다. 따라서 락토바실러스 플란타룸 YD-212는 인체에 투여할 수 있는 안전한 균주인 것으로 확인되었다.
실시예 3: 락토바실러스 플란타룸 YD-212 균주를 이용한 발효물의 제조
락토바실러스 플란타룸 YD-212를 탈지분유배지(배지 조성은 표 3 참조)에 접종하고 37℃에서 3일간 배양한 후 원심분리하여 상등액을 얻었다. 회수된 상등액의 pH를 6.5로 조정한 후 동결 건조하여 발효물을 제조하였다.
실시예 4: 락토바실러스 플란타룸 YD-212 발효물의 조골세포에 대한 효과 확인
4-1. 조골세포 증식 촉진 효과
실시예 3에 의해 제조된 발효물이 조골세포의 증식에 미치는 효과를 알아보기 위하여, 조골 세포주(MC3T3-E1 cell line, ECACC)를 이용하여 조골세포의 증식률을 측정하였다. 세포를 측정하는 목적에 따라 다양한 크기의 세포배양용 플라스크(flask)에, 우태아혈청(Fetal bovine serum; FBS, 1456396, Gibco® Life Technologies)을 함유한 α-minimum essential medium(MEM-α, A1049001, Gibco® Life Technologies)를 사용하여 배양기(37℃, 5% CO2)에서 배양하였다. 또한, 세포의 충분한 증식을 위해 2-3일 간격으로 배양액을 교환하였다.
96 웰 플레이트에 1×105cell/웰의 농도로 배양한 MC3T3-E1를 분주하고 24시간 배양하여 세포부착을 확인하였다. 그 후, 발효물을 무혈청 배지(serum free media)에 혼합하여 각 웰에 200㎕씩 넣고 37℃, 5% CO2 조건에서 24시간 동안 배양하였다.
조골세포주(MC3T3-E1)의 증식에 미치는 효과는 MTT(methylthiazol tetrazoliumbromide) 검정법으로 측정하였고, 그 결과는 무혈청 배지 처리군을 대조군으로 하여 증식율(%)을 계산하였다.
발효 시간에 따른 조골세포의 증식에 미치는 효과를 알아보기 위해 발효물을 18시간, 24시간(1일), 2일, 3일, 4일, 5일 배양하여 제조하고, 각각의 제조된 발효물을 1mg/mL의 농도로 무혈청 배지에 혼합하여 처리하였다.
그 결과, 락토바실러스 플란타룸 YD-212 발효물은 대조군과 비교하여 조골세포의 증식을 월등히 향상시키는 효과를 나타내었다. 또한, 발효 시간이 경과함에 따른 발효물의 조골세포의 증식에 미치는 영향은, 발효 시간 3일(대조군 대비 164%)까지 증가하는 것을 확인할 수 있었다(도 2).
4-2. 락토바실러스 플란타룸 YD-212 발효물과 대조군의 조골세포 증식 촉진 효과 비교
유산균에 의한 발효를 행하지 않은 탈지유 및 유청 단백질이 조골세포의 증식에 미치는 영향을 본 발명의 락토바실러스 플란타룸 YD-212 균주의 발효물과 비교 평가하였다.
락토바실러스 플란타룸 YD-212의 발효물과 탈지유 및 유청단백질 모두 Bradford법을 이용하여 단백질 농도를 정량한 후, 단백질 함량 0.5, 1.0mg/mL 농도로 무혈청 배지에 혼합하여 각 웰에 200㎕씩 넣고 37℃, 5% CO2 조건에서 24시간 동안 배양하였다.
Bradford 법을 이용한 단백질 함량별 탈지유, 유청단백질과 락토바실러스 플란타룸 YD-212 발효물의 조골세포의 성장에 미치는 효과를 비교한 결과, 탈지유와 유청 단백질의 경우 조골세포 증식 효과가 대조군(무혈청 배지)의 100-110%로 대조군 효과와 유사한 반면, 공지된 바와 같이, 유청단백질의 단백질 함량 1.0mg/mL 농도에서 124%의 조골세포 증식 촉진 효과를 보였다. 반면, 본 발명의 락토바실러스 플란타룸 YD-212 발효물의 조골세포 증식 촉진 효과는 0.5, 1.0mg/mL 농도에서 각각 141%, 162%로 유의적으로 높은 수치(p<0.001)를 나타났다(도 3). 이는 유청단백질의 경우보다 우수한 조골세포 증식 촉진 효과를 나타내었다.
따라서 락토바실러스 플란타룸 YD-212에 의한 발효물은 동량의 단백질 함량에서 탈지유, 유청단백질에 비해 조골세포의 활성을 촉진하는 효과가 우수함을 확인하였다. 이러한 결과는 본 발명의 발효물의 조골세포 활성 촉진 효과가 다른 우유 유래 단백질이 아닌 락토바실러스 플란타룸 YD-212의 발효물에 의한 특이적 효과임을 확인하였다. 또한 조골세포 증식 향상 효과가 첨가된 발효물 농도에 의존적으로 나타냄으로써 락토바실러스 플란타룸 YD-212의 발효물이 농도 의존적으로 조골세포의 활성을 촉진함을 확인하였다.
4-3. 락토바실러스 플란타룸 YD-212 발효물의 조골세포의 분화 활성에 미치는 효과
조골세포에 대한 분화능력을 검증하기 위해 락토바실러스 플란타룸 YD-212의 발효물과 탈지유를 비교 검증하였다. 또한, 대조군으로 MC3T3-E1 세포의 분화 유도제로 알려진 아스코르브산(L-ascorbic acid), 베타-글라이세로포스페이트(β-glycerophosphate)를 사용하였다.
조골세포의 성숙 및 골 형성 유발을 위해 처리군(Control)은 50㎍/mL 아스코르브산(Sigma, A5960)과 10mM 베타-글라이세로포스페이트(Sigma, G9422)를 우태아혈청 배지에 혼합하였고, 비처리군(Normal)은 우태아혈청 배지만을 사용하였다. 락토바실러스 플란타룸 YD-212의 발효물과 탈지유는 각 0.5, 1.0, 1.5mg/mL의 농도로 우태아혈청 배지에 혼합하여 14일 동안 배양하였으며, 3-4일 간격으로 배지를 교체하였다.
조골세포의 성숙 및 골 형성 확인을 위해, 조골세포의 분화 지표인 칼슘증착 정도를 확인하였다. 칼슘증착 정도는 조골세포의 분화 유도 14일 후 ARS(alizarin Red S) 염료를 사용하였으며, Millipore 사의 Osteogenesis Assay Kit(ECM815)를 이용하였다.
ARS(alizarin Red S)는 금속이온과 결합하는 성질을 가짐으로서 조골세포의 성숙 및 골 형성 과정에서 침착된 칼슘염 염색을 통하여 석회화된 골기질의 형성 정도를 측정할 수 있다. 도 4와 같이, 락토바실러스 플란타룸 YD-212의 발효물은 분화 유도제인 대조군(Control) 효과와 유사하거나 유의적으로 우수한 분화 촉진 효과(p<0.001)를 보였으며, 조골세포 분화 촉진 효과가 첨가된 발효물 농도에 의존적으로 나타냄으로써 락토바실러스 플란타룸 YD-212의 발효물이 농도 의존적으로 조골세포의 분화를 촉진함을 확인하였다.
실시예 5: 락토바실러스 플란타룸 YD-212 발효물의 골밀도 및 골강도에 대한 in vivo 효과
실험예 5-1: 난소적출 골다공증 랫트 모델 제작
락토바실러스 플란타룸 YD-212의 발효물의 골다공증 유발 동물모델에서 골밀도 개선 효능을 검증하기 위해 12주 동안 난소 적출 랫트 모델을 이용하여 실시하였다. 구체적으로, 8주령의 Sprague-Dawley 계통의 랫트(오리엔트 바이오, 한국)를 구입하여 실험을 수행하였으며, 동물 입수 시 외관을 육안으로 검사한 후, 7일간 동물실에서 순화시켰다. 난소 적출을 위해, 수술실에서 zoletil(Zoletil® 50, Virbac)과 rompun(Bayer)을 이용하여 전신마취 후 등 부위를 제모한 후 제모한 부위를 절개하고, 다른 장기에 손상이 가해지지 않도록 난소를 확인하고 봉합용 실로 난소를 결찰한 뒤 양측의 난소 모두를 제거하였다. 난소 제거 후 생리식염수를 주입하며 각 장기를 복강 내로 재위치가 되도록 한 후 봉합용 실로 봉합하였다. 난소 비적출군(정상군, SHAM)은 상기 난소 적출군과 같은 스트레스를 주기 위하여 개복하여 난소를 복강 외부로 노출시킨 후, 난소 적출 시 소요되는 시간을 동일하게 하여 다시 봉합하였다.
실험예 5-2: 군 배정 및 시료 경구 투여
난소 적출 7일 후, 동물의 체중을 측정하고 군 당 8마리씩 균등한 체중이 되도록 무작위적으로 분배하였다. 각 실험군은(1) 정상군(SHAM, 난소 비적출군),(2) 대조군(OVX, 난소 적출군),(3) 난소 적출군+탈지유 투여(SM),(4) 난소 적출군+락토바실러스 플라타룸 YD-212 발효물 투여(YD-212) 4군으로 분류하였다. 탈지유와 발효물은 각각 단백질 함량 기준 50mg/kg을 1일 1회 12주간 경구 투여하였고, 정상군(SHAM군) 및 대조군(OVX)은 동일 용량의 증류수를 경구 투여하였다.
실험예 5-3: 골밀도 측정
실험예 5-2의 정상군과 난소 적출군 각 개체에 대하여 골밀도 측정을 실시하였다. 골밀도 측정을 위해 Zoletil과 Rompun을 이용하여 개체를 마취시킨 후 고정하여 살아있는 상태에서 micro-CT(SkyScan 1076)를 이용하여 3D image를 측정한 후 CTAn software(SkyScan)를 이용하여 골밀도를 계산하였다.
상기 골밀도 분석 결과를 도 5에 나타내었다. 난소적출군(OVX)은 정상군(SHAM, 난소 비적출군)보다 유의적으로 낮은 골밀도(p<0.001)는 나타내어 골다공증이 유발되었음을 확인하였다. 난소 적출 후 락토바실러스 플란타룸 YD-212의 발효물을 12주간 경구 투여한 경우 골밀도가 정상군과 유사한 수준으로 유지되었으며, 난소 적출군(OVX)에 비해 유의적으로 증가(p<0.001)하여 락토바실러스 플란타룸 YD-212의 발효물의 투여가 골밀도 증가에 효과적임을 확인하였다.
실험예 5-4: 골강도 측정
실험예 5-2의 12주의 시료 경구투여를 종료 후 개체를 희생시켰고, 각 개체로부터 대퇴골을 분리하여 110℃ 건조 오븐에서 3일간 건조하였다. 대퇴골의 파괴 강도는 Universal Testing Machine(Model Instron 3366)을 이용하여 측정하였다. 골강도 측정은 3부분지지 굴곡시험(three point bending test)법을 이용하였으며, 골에 힘이 가해져 골절된 부분의 파단강도와 파단변위를 분석하였다. Jamsa 등(1998)의 방법에 따라, 대퇴골 길이의 1/2 지점에 골전면 및 골중심부로 압력이 가해지도록 하였다. 압력이 가해지는 속도는 0.1mm/sec로 하였으며 가해지는 하중은 최대 3,000N으로 하였다. 대퇴골의 강도는 대퇴골이 절단 될 때의 최대 힘(N)으로 표현하였다.
상기 골 파괴 강도는 도 6에 나타내었으며, 난소 적출군은 정상군(난소 비적출군)보다 유의적으로 낮은 골 파괴 강도를 나타내어 골의 약화 경향을 나타냈다. 이와 같은 경향은 골다공증의 유발 시 골밀도가 감소함으로써 골절이 일어나기 쉬워지는 현상을 반영하는 것이다. 난소적출 후 본 발명의 락토바실러스 플란타룸 YD-212의 발효물을 12주간 경구 투여한 경우 골 파괴 강도가 정상군과 유사한 수준으로 유지되었으며, 대조군(난소 적출군)에 비해 유의적으로 증가(p<0.001)하여 락토바실러스 플란타룸 YD-212의 발효물의 투여가 골강도의 상승효과에 효과적임을 확인하였다.
<110> YD LIFE SCIENCE CO., LTD
<120> LACTOBACILLUS PLANTARUM YD-212 STRAINS, AND COMPOSITION
CONTAINING FERMENTATION SUBSTANCE PREPARED BY USING THE SAME
<130> DPB140065
<160> 1
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 1227
<212> DNA
<213> LACTOBACILLUS PLANTARUM
<400> 1
cattttctgt caccttaggc ggctggttcc taaaaggtta ccccaccgac tttgggtgtt 60
acaaactctc atggtgtgac gggcggtgtg tacaaggccc gggaacgtat tcaccgcggc 120
atgctgatcc gcgattacta gcgattccga cttcatgtag gcgagttgca gcctacaatc 180
cgaactgaga atggctttaa gagattagct tactctcgcg agttcgcaac tcgttgtacc 240
atccattgta gcacgtgtgt agcccaggtc ataaggggca tgatgatttg acgtcatccc 300
caccttcctc cggtttgtca ccggcagtct caccagagtg cccaacttaa tgctggcaac 360
tgataataag ggttgcgctc gttgcgggac ttaacccaac atctcacgac acgagctgac 420
gacaaccatg caccacctgt atccatgtcc ccgaagggaa cgtctaatct cttagatttg 480
catagtatgt caagacctgg taaggttctt cgcgtagctt cgaattaaac cacatgctcc 540
accgcttgtg cgggcccccg tcaattcctt tgagtttcag ccttgcggcc gtactcccca 600
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tctacgcatt tcaccgctac acatggagtt ccactgtcct cttctgcact caagtttccc 840
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gcgtgctcat cagacctttc gtcattgtgg agatcctact gctgcttcgt agagtttgga 1140
cgtgtttcag ttcaatgtgc cgataaccct tcagtcgtac gtacatgcat gtgagcgtaa 1200
agtgacactc taagccttaa tacgtcg 1227
Claims (11)
- 수탁번호 KCTC 12728BP의 락토바실러스 플란타룸 YD-212 (Lactobacillus plantarum YD-212) 균주.
- 제 1 항에 있어서,
상기 균주는 pH2.5 이하의 강산의 환경에서 내산성을 갖는 균주. - 제 1 항에 있어서,
상기 균주는 담즙산에 노출된 환경에서 내담즙성을 갖는 균주. - 제 1 항의 균주로 발효시킨 발효물을 유효성분으로 포함하는 골 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제 4 항에 있어서,
골질환은 골 질환은 골다공증(osteoporosis), 골연화증(osteomalacia), 구루병, 섬유성 골염, 무형성 골질환 및 대사성 골질환으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 약학 조성물. - 제 4 항에 있어서,
상기 발효물은 골밀도 또는 골강도를 증가시키는 약학 조성물. - 제 1 항의 균주로 발효시킨 발효물을 포함하는 골 질환의 개선용 식품 조성물.
- 제 7 항에 있어서,
골질환은 골 질환은 골다공증(osteoporosis), 골연화증(osteomalacia), 구루병, 섬유성 골염, 무형성 골질환 및 대사성 골질환으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 식품 조성물. - 제 7 항에 있어서,
상기 발효물은 골밀도 또는 골강도를 증가시키는 식품 조성물. - 제 1 항의 균주를 배지에 접종하는 단계,
20~40℃의 범위에서 배양하는 단계;
상기 배양액의 상등액을 분리하는 단계; 및
회수된 상등액을 동결 건조하는 단계를 포함하는 골 질환 치료용 발효물을 제조하는 방법. - 제 10항에 있어서,
배지는 탈지분유를 포함하는 골 질환 치료용 발효물을 제조하는 방법.
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| WO2020226460A1 (ko) * | 2019-05-08 | 2020-11-12 | 김연란 | 미생물 유래 핵산 및 이의 용도 |
| CN115806898A (zh) * | 2022-08-10 | 2023-03-17 | 重庆第二师范学院 | 一种植物乳杆菌ksfy04及其应用 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A107 | Divisional application of patent | ||
| WITN | Withdrawal due to no request for examination |