KR20210064480A - 유산균 및 프리바이오틱스를 포함하는 갱년기 증상의 예방, 완화 또는 치료용 조성물 - Google Patents

유산균 및 프리바이오틱스를 포함하는 갱년기 증상의 예방, 완화 또는 치료용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 유산균 및 프리바이오틱스를 포함하는 갱년기 증상의 예방, 완화 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 유산균은 β-글루코시다아제 활성을 가지며, 이소플라본으로부터 이퀄(equol) 화합물로의 전환능력이 매우 우수하여, 장내 미생물군과 상승적 작용을 통해 에스트로겐 활성(estrogen activity)을 나타낼 수 있으므로, 여성의 갱년기 또는 폐경기 증상의 예방, 완화, 치료에 효과적으로 사용될 수 있다.

Description

유산균 및 프리바이오틱스를 포함하는 갱년기 증상의 예방, 완화 또는 치료용 조성물{Composition for Preventing, Relieving or Treating Climacteric Disorders Comprising Lactic Acid Bacteria and Prebiotics}
본 발명은 유산균 및 프리바이오틱스를 포함하는 갱년기 증상의 예방, 완화 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
여성의 폐경(menopause)은 태어난 후 약 50년에 이르는 유전적으로 이미 결정된 난소의 기능이 수명을 다함으로써 나타나는 월경의 중단 현상으로 생식능력의 소실을 의미하며 병적 현상이 아닌 생리적인 변화이다. 현재 우리나라 여성의 평균 수명은 81.2세(2011년, 통계청)로 대한산부인과학회에서 규정한 한국 여성의 평균 폐경 연령을 50세로 가정한다면 여성 일생의 약 1/3 이상을 여성호르몬이 고갈된 상태로 산다는 것을 의미한다. 여성 갱년기(climacteric periods)란 폐경을 전후하여 여성의 생식능력이 감소되고 소실되는 전환시기로 신체적 및 정신적으로 매우 불안정한 시기이다. 그 기간은 대개 폐경 3-5년 전, 후 약 10년 동안을 갱년기라고 부르는데 46-55세 정도이다. 그리고 월경이 완전히 정지된 후 1년이 지난 시기부터 폐경(menopause)이라고 정의한다. 이와 관련하여 여성은 폐경 전기 - 폐경기 이행기 - 폐경 - 폐경 후기로 나누어서 신체적, 정신적 변화가 달라진다.
최근 호르몬 치료법에 대한 부정적인 여러 연구가 발표되면서 호르몬 치료의 유효성 여부에 많은 도전을 받고 있다. 그 중 대표적인 것이 미국 국립 위생 연구소(NIH)의 후원으로 2002년에 발표된 WHI 연구이다. 1993년부터 원발성 관상동맥질환, 유방암과 직장암, 속발성 골절에 호르몬 치료법이 어떤 영향을 미치는지에 대하여 연구를 진행하였다. WHI 연구는 8.5년간 진행될 계획이었는데 5.2년 투여 후 호르몬 치료군에서 유방암의 위험이 유의하게 높아지고, 심혈관계 질환의 발생이 호르몬 투여 군에서 유의하게 증가되는 것이 발견되어 조기 중단되었다.
식물성 에스트로겐은 식물에 존재하는 물질로서 구조적, 기능적으로 17-β-에스트라디올(estradiol)과 연관되어 있거나 혹은 에스트로겐 효과를 나타내는 물질을 일컬으며, 다음과 같이 4종류로 대별된다. (i) 석류 또는 대추 야자 등의 스테로이드류, (ⅱ) 홍삼과 같은 사포닌(saponin) 함유물질, (ⅲ) 플라보노이드류와 같은 페놀류, (ⅳ) 승마 또는 감초와 같은 테르페노이드(terpenoid)류 구분되며, 이들 중에서 플라보노이드류는 대두 및 적클로버와 같은 이소플라본(isoflavone)류, 아마인 및 블루베리와 같은 리그난(lignan)류, 해바리기씨유 및 적토끼풀와 같은 쿠메스탄(coumestan)류로 분류된다.
콩(soy)에서 유래되는 이소플라본은 대부분 글리코시드 컨쥬게이트(glycoside conjugates) (daidzin, genistin, glycitin) 형태이며, 이는 생체이용능 및 에스토로겐 활성도가 낮은 형태이다. 이에 대한 흡수력 및 활성화 증가를 위해서는 글리코시드가 분해된 이소플라본 어글리콘(isoflavone aglycone) (daidzein, genistein, glycitein)이 필요하게 되며, 이는 장내 미생물군(gut microbiota)의 β-글리코시다아제에 의해 생성된다. 또한 장내 미생물군에 의해 최종적으로 이퀄(equol) 형태로 변화되어 식물성 에스트로겐(phyto-estrogen) 형태를 갖게 된다. 장내 미생물군에 의해 생성되는 이퀄은 동서양에서도 서로 다른 생성양을 나타낸다. 평소 콩 섭취가 많은 아시아의 50% 정도는 콩 섭취로 이퀄을 만들어 내지만, 상대적으로 적은 콩을 섭취하는 서양인의 20~30% 정도 만이 이퀄을 만들어 낼 수 있다.
이퀄(equol)은 이소플라본 중에서도 가장 강한 에스트로겐 반응을 나타낸다. 이퀄과 에스트로겐은 분자 구조적으로 매우 유사하다. 이퀄은 에스트로겐 수용체(estrogen receptor, ERα, ERβ)에 결합하여 에스트로겐에 의해 발현되는 활성을 나타내며, 특히 ERβ에 높은 친화도를 나타낸다. Daidzein 역시 에스트로겐 수용체(ER) 결합 친화도를 나타내지만 이퀄은 그 보다 높은 ER 결합 친화도를 나타낸다.
본 명세서에서 언급된 특허문헌 및 참고문헌은 각각의 문헌이 참조에 의해 개별적이고 명확하게 특정된 것과 동일한 정도로 본 명세서에 참조로 삽입된다.
대한민국 공개특허 제2019-0014056호 대한민국 공개특허 제2014-0131881호 대한민국 공개특허 제2015-0007851호
본 발명자들은 여성 갱년기 또는 폐경기 증상의 예방, 완화, 치료에 적용할 수 있는 프로바이오틱스 유산균 균주를 개발하기 위해 연구 노력하였다. 그 결과, β-글리코시다아제 활성이 높고, 이소플라본류를 이퀄(equol) 화합물로 높은 효율로 전환시킬 수 있는 유산균을 개발하였고, 이 유산균이 세포 실험 및 갱년기 동물 모델에서 에스트로겐 활성(estrogen activity)를 나타냄을 실험적으로 입증 및 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 유산균 및 이소플라본을 포함하는 프리바이오틱스 조성물을 포함하는 갱년기 또는 폐경기 증상의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것에 있다.
본 발명의 다른 목적은 유산균 및 이소플라본을 포함하는 프리바이오틱스 조성물을 포함하는 갱년기 또는 폐경기 증상의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것에 있다.
본 발명의 다른 목적 및 기술적 특징은 이하의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 구체적으로 제시된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 (i) 비피도박테리움(Bifidobacterium) 속 유산균, 락토바실러스(Lactobacillus) 속 유산균 및 락토코커스(Lactococcus) 속 유산균으로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 유산균; 및 (ⅱ) 이소플라본(isoflavone) 및 대두배아추출물(soybean germ extract)을 포함하는 프리바이오틱스 조성물을 포함하는 갱년기 또는 폐경기 증상의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 유산균은 체내에 투여되는 경우 장내에 정착하여 장내 미생물군(gut microbiota)과 함께 유익한 상승적 작용을 한다는 의미에서 프로바이오틱스(probiotics) 유산균일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 유산균은 비피도박테리움 속 유산균, 락토바실러스 속 유산균 및 락토코커스 속 유산균으로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 유산균이다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 비피도박테리움 속 유산균은 비피도박테리움 락티스(Bifidobacterium lactis), 비피도박테리움 브레비(Bifidobacterium breve), 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum), 및 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 유산균이다.
본 발명의 다른 구현예에서, 상기 락토바실러스 속 유산균은 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri), 및 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 유산균이다.
본 발명의 다른 구현예에서, 상기 락토코커스 속 유산균은 락토코커서 락티스(Lactococcus lactis)이다.
본 발명의 다른 구현예에서, 상기 유산균은 비피도박테리움 락티스(Bifidobacterium lactis), 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis), 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri), 및 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 유산균일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에서, 상기 유산균은 비피도박테리움 락티스(Bifidobacterium lactis), 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis), 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri), 및 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus)으로 이루어지는 군에서 선택되는 2종 이상의 복합 유산균일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에서, 상기 유산균은 비피도박테리움 락티스(Bifidobacterium lactis), 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis), 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri), 및 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus)의 4종 복합 유산균일 수 있다.
본 발명의 식품 조성물에는 이소플라본 및 대두배아추출물을 포함하는 프리바이오틱스(prebiotics) 조성물이 포함된다.
본 발명에서 용어 “프리바이오틱스”는 상기 설명된 본 발명의 유산균에 대해 기질(substrate)로 작용하여 유산균의 성장이나 유익한 활성을 촉진하는 화합물들을 의미한다.
본 발명에서 프리바이오틱스 성분은 본 발명의 유산균의 성장을 촉진하며, 본 발명의 유산균에 의해 이퀄(equol) 화합물로 전환된다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 이소플라본은 상기 프리바이오틱스 조성물에 대해 1-50 중량％, 바람직하게는 5-45 중량％, 더 바람직하게는 10-40 중량％ 포함될 수 있다.
본 발명의 유산균은 매우 높은 β-글루코시다아제(glucosidase) 활성을 나타낸다.
본 발명에서 용어 “갱년기 증상”또는 “폐경기 증상”은 여성에서 난소 기능의 점진적 소실에 의해 여성 호르몬의 생성 및 활성이 감소하는 폐경 기간에 나타나는 증상들을 의미한다. 상기 갱년기 동안 활성과 생산이 감소되는 여성 호르몬은 예컨대 에스트로겐을 들 수 있다. 상기 에스트로겐은 에스트론(estrone), 에스트라디올(estradiol), 에스트리올(estriol)의 호르몬을 총칭하며, 이 중에서 에스트라디올이 가장 강력한 여성 호르몬이다.
본 발명에서 상기 갱년기 또는 폐경기 증상은 예를 들어, 안면홍조, 야간발한, 불규칙한 생리주기, 성욕의 감퇴, 질 건조감, 피로감, 탈모, 수면장애, 집중력 장애, 기억력 감퇴, 현기증, 체중 증가, 요실금, 복부 팽만감, 알러지, 잘부러지는 손톱, 체취의 변화, 불규칙한 심장박동, 우울증, 불안감, 초조함, 공황장애 증상, 골다공증, 골밀도감소증, 고지혈증, 또는 이상지질혈증일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 식품 조성물은 기능성 식품(functional food), 영양 보조제(nutritional supplement), 건강 식품(health food) 또는 식품 첨가제(food additives)로 제조될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 식품 조성물은 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있으며, 예를 들어, 발효유와 같은 음료, 또는 분말 형태로도 제조될 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 상술한 본 발명의 유효성분 뿐만 아니라, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등]) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물이 음료 형태로 제조되는 경우에는 본 발명의 유효성분 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 두충 추출물, 대추 추출물, 감초 추출물 등을 추가로 포함시킬 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (i) 비피도박테리움(Bifidobacterium) 속 유산균, 락토바실러스(Lactobacillus) 속 유산균 및 락토코커스(Lactococcus) 속 유산균으로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 유산균; (ⅱ) 이소플라본(isoflavone) 및 대두배아추출물(soybean germ extract)을 포함하는 프리바이오틱스 조성물; 및 (ⅲ) 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 갱년기 또는 폐경기 증상의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 약학적 조성물에서 유산균 및 프리바이오틱스 조성물에 대한 내용은 상기 설명된 본 발명의 다른 일 양태인 “갱년기 또는 폐경기 증상의 예방 또는 개선용 식품 조성물”에서 설명된 내용과 동일하므로 이들을 원용하며 중복하여 설명하지 않는다.
본 발명에서 용어 “예방”은 질환, 질병, 또는 질환으로 인한 증상을 보유하고 있다고 진단된 적은 없으나, 이러한 질환, 질병, 또는 증상에 걸리기 쉬운 경향이 있는 동물에서 질환, 질병 또는 증상의 발생을 억제하는 것을 의미한다.
본 발명에서 용어 “치료”는 (i) 질환, 질병 또는 증상의 발전의 억제, (ⅱ) 질환, 질병 또는 증상의 경감, 또는 (ⅲ) 질환, 질병 또는 증상의 제거를 의미한다.
본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 탄수화물류 화합물 (예: 락토스, 아밀로스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 셀룰로스, 등), 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 염 용액, 알코올, 아라비아 고무, 식물성 기름 (예: 옥수수 기름, 목화 종자유, 두유, 올리브유, 코코넛유), 폴리에틸렌 글리콜, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 약학적 조성물의 경구 투여량은 바람직하게는 1일 당 0.001 - 1000 mg/kg (체중)이다.
본 발명의 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
이상에서 상세히 설명된 바와 같이, 본 발명의 유산균은 β-글루코시다아제 활성을 가지며, 이소플라본으로부터 이퀄(equol) 화합물로의 전환능력이 매우 우수하여, 장내 미생물군과 상승적 작용을 통해 에스트로겐 활성(estrogen activity)을 나타낼 수 있으므로, 여성의 갱년기 또는 폐경기 증상의 예방, 완화, 치료에 효과적으로 사용될 수 있다.
도 1a 및 도 1b는 대두배아추출물에서 프로바이오틱스 유산균 균주들의 이퀄(equol)의 생성능을 측정한 결과이다.
도 2a 및 도 2b는 대두배아추출물에서 프로바이오틱스 유산균 균주들의 β-글루코시다아제 활성을 측정한 결과이다.
도 3a는 MCF-7 세포에서 S30 및 S30에 프로바이오틱스 유산균 균주(B. lactis, B. infantis, L. gasseri, L. helveticus)를 배양한 배양액 처리가 에스트로겐 관련 유전자 ESR1, ESR2 및 pS2의 mRNA 발현 수준에 미치는 영향을 측정한 결과이다.
도 3b는 MG-63 세포에서 S30 및 S30에 프로바이오틱스 유산균 균주(B. lactis, B. infantis, L. gasseri, L. helveticus)를 배양한 배양액 처리가 ESR1, ESR2, Osteocalcin, Osteoprotegerin의 mRNA 발현 수준에 미치는 영향을 측정한 결과이다.
도 3c는 MG-63 세포에서 S30 및 S30에 프로바이오틱스 유산균 균주(B. lactis, B. infantis, L. gasseri, L. helveticus)를 배양한 배양액 처리가 Alkaline phosphatase, COL1A1, BMP-2, BMP-4의 mRNA 발현 수준에 미치는 영향을 측정한 결과이다.
도 4는 난소 제거(OVX, ovariectomized) 랫트에서 각 실험군(Sham, OVX, OVX+E2, OVX+PRO, OVX+S30, OVX+S30+PRO)의 17β-에스트라디올 및 이퀄의 혈액(serum) 농도 측정결과이다. 측정값들은 평균±SD으로 표시하였다. a p<0.05. b p<0.01, compared to Sham group. c p<0.05. d p<0.01, compared to OVX group. e p<0.05. f p<0.01, compared to OVX+E2 group. g p<0.05. h p<0.01, compared to OVX+PRO group. i p<0.05. j p<0.01, compared to OVX+S30 group.
도 5는 OVX 랫트에서 각 실험군(Sham, OVX, OVX+E2, OVX+PRO, OVX+S30, OVX+S30+PRO)의 체중변화를 측정한 결과이다. 측정값은 평균±SD으로 표시하였다. a p<0.05. b p<0.01, compared to Sham group. c p<0.05 . d p<0.01, compared to OVX group. e p<0.05. f p<0.01, compared to OVX+E2 group. g p<0.05. h p<0.01, compared to OVX+PRO group. i p<0.05. j p<0.01, compared to OVX+S30 group.
도 6a 및 도 6b는 OVX 랫트에서 각 실험군의 체중에 따른 복부 지방 부피를 측정한 결과이다. 측정값들은 평균±SD으로 표시하였다. a p<0.05. b p<0.01, compared to Sham group. c p<0.05. d p<0.01, compared to OVX group. e p<0.05. f p<0.01, compared to OVX+E2 group. g p<0.05. h p<0.01, compared to OVX+PRO group. i p<0.05. j p<0.01, compared to OVX+S30 group.
도 7a 및 도 7b는 OVX 랫트에서 각 실험군의 혈액학적 지표들을 측정한 결과이다. 측정값들은 평균±SD으로 표시하였다. a p<0.05. b p<0.01, compared to Sham group. c p<0.05. d p<0.01, compared to OVX group. e p<0.05. f p<0.01, compared to OVX+E2 group. g p<0.05. h p<0.01, compared to OVX+PRO group. i p<0.05. j p<0.01, compared to OVX+S30 group.
도 8a는 OVX 랫트에서 각 실험군의 질 상피조직의 두께를 측정한 결과이다.
도 8b는 OVX 랫트에서 각 실험군의 자궁조직의 무게를 측정한 결과이다. 측정값들은 평균±SD으로 표시하였다. a p<0.05. b p<0.01, compared to Sham group. c p<0.05. d p<0.01, compared to OVX group. e p<0.05. f p<0.01, compared to OVX+E2 group. g p<0.05. h p<0.01, compared to OVX+PRO group. i p<0.05. j p<0.01, compared to OVX+S30 group.
도 9a - 도 9c는 OVX 랫트에서 각 실험군의 골 지표들을 측정한 결과들이다. 도 10은 OVX 랫트에서 각 실험군의 혈중 세로토닌 및 노르에피네프린의 농도를 측정한 결과이다. 측정값들은 평균±SD으로 표시하였다. a p<0.05 . b p<0.01, compared to Sham group. c p<0.05 . d p<0.01, compared to OVX group. e p<0.05 . f p<0.01, compared to OVX+E2 group. g p<0.05 . h p<0.01, compared to OVX+PRO group. i p<0.05 . j p<0.01, compared to OVX+S30 group.
도 11a는 OVX 랫트에서 각 실험군의 혈중 골 형성 마커 Osteocalcin 및 B-ALP의 농도를 측정한 결과이다. 측정값들은 평균±SD으로 표시하였다. a p<0.05. b p<0.01, compared to Sham group. c p<0.05. d p<0.01, compared to OVX group. e p<0.05. f p<0.01, compared to OVX+E2 group. g p<0.05. h p<0.01, compared to OVX+PRO group. i p<0.05 . j p<0.01, compared to OVX+S30 group.
도 11b는 OVX 랫트에서 각 실험군의 혈중 골 흡수 마커 Deoxypyridinoline, Prydinoline, Type 1 Collagen cross-linked telopeptide (NTX, CTX)을 측정한 결과이다. 측정값들은 평균±SD으로 표시하였다. a p<0.05. b p<0.01, compared to Sham group. c p<0.05. d p<0.01, compared to OVX group. e p<0.05. f p<0.01, compared to OVX+E2 group. g p<0.05. h p<0.01, compared to OVX+PRO group. i p<0.05. j p<0.01, compared to OVX+S30 group.
도 12는 OVX 랫트에서 각 실험군의 혈관 항상성 혈액 마커, Endothelin-1, 산화질소(NO, Nitric Oxide), eNOS(endothelial Nitric Oxide Synthase)를 측정한 결과이다. 측정값들은 평균±SD으로 표시하였다. a p<0.05. b p<0.01, compared to Sham group. c p<0.05. d p<0.01, compared to OVX group. e p<0.05. f p<0.01, compared to OVX+E2 group. g p<0.05. h p<0.01, compared to OVX+PRO group. i p<0.05. j p<0.01, compared to OVX+S30 group.
도 13은 OVX 랫트에서 각 실험군에서의 혈중 난포자극호르몬(follicle stimulating hormone, FSH)과 황체형성호르몬(luteinizing hormone, LH)의 농도를 측정한 결과이다. 측정값들은 평균±SD으로 표시하였다. a p<0.05. b p<0.01, compared to Sham group. c p<0.05. d p<0.01, compared to OVX group. e p<0.05. f p<0.01, compared to OVX+E2 group. g p<0.05. h p<0.01, compared to OVX+PRO group. i p<0.05. j p<0.01, compared to OVX+S30 group.
본 명세서에서 설명된 구체적인 실시예는 본 발명의 바람직한 구현예 또는 예시를 대표하는 의미이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되지는 않는다. 본 발명의 변형과 다른 용도가 본 명세서 특허청구범위에 기재된 발명의 범위로부터 벗어나지 않는다는 것은 당업자에게 명백하다.
실시예
실험 방법
실험예 1: 이소플라본으로부터 이퀄(equol) 전환능을 가진 프로바이오틱스의 선별
이소플라본(isoflavone)을 30중량％를 포함하는 대두배아추출물(soybean germ extract)(S30)로부터 이퀄(equol)을 생성할 수 있는 능력을 가진 프로바이오틱스 균주를 선별하였다.
먼저, 이소플라본이 30중량％ 포함된 대두배아추출물(S30, Seorim Bio 제조)와 40g/L의 멸균수를 사용하여 대두배아추출물을 제조하였다. 5M의 NaOH를 사용하여 pH를 6.7로 조정하였다. 대두배아추출물 전체를 121℃에서 15분간 오토클레이브하여 멸균하였다. 미생물들을 재수화시킨 MRS(Mann Rogosa Sharpe) 브로쓰 (De Mann et al. 1960)에서 37℃, 20시간 동안 활성화시키고, 5％(v/v)의 접종 수준을 사용하여 멸균한 대두배아추출물에서 4회 활성화하였다. 40 - 400mL의 멸균 대두배아추출물에 대해 활성화 배양물(5% v/v)을 접종하고, 이소플라본 글리코시드를 가수분해시키기 위해서 37℃에서 24시간 동안 접종하였다. 대두배아추출물에서 활성화된 상태의 균주를 사용하였다.
초기 스크리닝 단계에서는 48시간 까지 대두배아추출물에서 배양하여 대두배아추출물로부터 이퀄(equol)의 생성여부를 조사하였다. 또한 시간 의존적으로 일정 시간 간격으로 샘플을 채취하여 β-글루코시다아제 활성을 확인하였다. β-글루코시다아제 활성도 측정은 qNPG (p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside) 방법을 이용하였다. 위의 스크리닝 단계의 우선 순위는 유동적으로 결정하였다. 즉, 이퀄(equol)을 생성하는 균주를 먼저 스크리닝한 후 β-글루코시다아제 활성을 측정하거나, 또는 높은 β-글루코시다아제 활성을 가지는 균주를 먼저 스크리닝한 후 이퀄(equol) 생성 여부를 확인하였다. 선별은 단일 균주 또는 복합 균주에서의 이퀄(equol) 생성능 및 β-글루코시다아제 활성을 측정하여 행하였다.
실험예 2: 인 비트로(in vitro) 세포 분석
인 비트로(in vitro) 세포 실험을 통해, 프로바이오틱스에 의해 생성된 이퀄(equol)의 에스트로겐 관련 효능 및 에스트로겐 관련 마커 발현 수준을 조사하였다. MG-63 세포(Homo sapiens bone osteosarcoma, 조골세포)와, MCF-7 세포(human breast adenocarcinoma, 유방암세포)에서 에스트로겐 관련 마커의 발현 수준을 조사하였다. 이퀄(equol) 형성 및 β-글루코시다아제 활성을 기준으로 선별된 프로바이오틱스 균주의 대두배아추출물 배양액을 상기 세포주에 처리하여 mRNA 수준에서 바이오마커들의 발현양을 실시간 PCR로 분석하였다(표 1).
Gene Organism Primer sequence
ERα Human Forward AATTCAGATAATCGACGCCAG
Reverse GTGTTTCAACATTCTCCCTCCTC
ERβ Human Forward TAG TGG TCC ATC GCC AGT TAT
Reverse GGG AGC CAA CAC TTC ACC AT
pS2 Human Forward CAT GGA GAA CAA GGT GAT CTG
Reverse CAG AAG CGT GTC TGA GGT GTC
osteocalcin Human Forward ACA CTC CTC GCC CTA TTG
Reverse GAT GTG GTC AGC CAA CTC
alkaline
phosphatase		 Human Forward AAA CCG AGA TAC AAG CAC TCC CAC
Reverse TCC GTC ACG TTG TTC CTG TTC AG
Collagen, type I,
alpha 1 (COL1A1)		 Human Forward GCG GCT CCC CAT TTT TAT ACC
Reverse GCT CTC CTC CCA TGT TAA ATA GCA
BMP2 Human Forward GCG TGA AAA GAG AGA CTG C
Reverse CCA TTG AAA GAG CGT CCA C
BMP4 Human Forward ACG GTG GGA AAC TTT TGA TGT G
Reverse CGA GTC TGA TGG AGG TGA GTC
osteoprotegerin Human Forward GGA ACC CCA GAG CGA AAT ACA
Reverse CCT GAA GAA TGC CTC CTC ACA
β-actin Human Forward CATTGCCGACAGGATGCA
Reverse CATCTGCTGGAAGGTGGACAG
2-1. 에스트로겐 수용체(ER)-α, β 활성화 및 단백질 발현 수준 측정
세포실험은 에스트로겐 수용체가 많이 분포되어 있는 조직의 확립된 세포주MCF-7 세포(유방암 세포주), Ishikawa 세포(자궁내막암세포), SaOS-2 세포(골육종세포)를 사용하였다. 이들 세포에 시험 물질을 처리하여 수용체를 활성화시키는지 확인하였고, 이를 통해 유전자 전사활성을 평가하였다. 또한, 세포실험 또는 동물모델에서 웨스턴 블로팅(Western blotting) 방법으로 ERα(ESR1), ERβ(ESR2)의 단백질 발현 수준 측정 및 RT-PCR(reverse transcription polymerase chain reaction)에 의해 mRNA 수준을 측정하였다.
2-2. ESR1 및 pS2 mRNA 발현 수준 측정
ESR1, pS2는 에스트로겐 수용체에 의해 발현이 증가되는 에스트로겐 반응 유전자(estrogen-responsive gene)로서 MCF-7 세포(유방암 세포주)에 시험물질을 처리한 후 상기 유전자들의 mRNA 수준 변화를 분석하여 시험물질이 에스트로겐 활성(estrogenic activity)을 나타내는지를 평가하였다.
2-3. 조골세포에서 골밀도 관련 발현양 측정
골 형성 지표로는 OPG(osteoprotegerin), BMP-2(Bone morphogenetic protein 2), BMP-4(Bone morphogenetic protein 4), Osteocalcin, Alkaline phosphatase 등 의 발현 수준을 측정하였다. BMP4 (Bone morphogenetic protein 4)는 골형성 단백질로 뼈 유도 능력이 높은 것으로 알려져 있고, BMP2 (Bone morphogenetic protein 2)는 골 형성을 촉진하는 유전자로 발현이 증가되면 골 형성이 촉진되는 것으로 해석하며, COL1A1(Collagen type I α1)은 결합조직, 연골 등의 주요 구성 요소로 제1형 콜라겐의 생성을 활성화한다. 또한, OPG(Osteoprotegerin)는 뼈를 형성하는 조골세포에서 만들어지는 단백질로서 파골세포의 작용을 억제한다.
실험예 3: 동물 실험 테스트
최종 선별된 프로바이오틱스 균주에 대해 갱년기 모델 실험동물에서 갱년기 증상 억제 활성을 평가하였다.
3-1. 실험 디자인
실험동물은 Female Sprague-Dawley 랫트(초기 체중 : 150 - 180g/랫트)를 6 랫트/그룹으로 사용하였다. 실험기간은 10주(1주: 적응기, 1주: 난소절제(OVX) 후 회복기간, 8주: 실험물질 투여기간) 동안 진행하였다. 에스트로겐(17β-에스트라디올, E2), 대두배아추출물(이소플라본30%, S30), 프로바이오틱스(BL+BT+LGA+LH, Pro), 사료(AIN-93G, Soybean Oil을 Corn Oil로 교체)를 투여하였다. 에스트로겐(17β-에스트라디올, E2)은 10 μg/kg의 용량으로 1주일에 3회 투여하였고, S30은 10 mg/kg으로 매일 투여하였으며, 프로바이오틱스는 1 X 107 CFU/head의 용량으로 매일 투여하였다. 아래 표 2에 동물 실험 계획을 나타내었다.
그룹 1-0주 0-1주 1주 2주 3주 4주 5주 6주 7주 8주
Sham 적응기
(Acclimation)		 AIN-93G
OVX 난소절제
(0 주)&
적응기		 AIN-93G
OVX+E2 AIN-93G + E2 8주 투여
OVX+Pro AIN-93G + Pro 8주 투여
OVX+S30 AIN-93G + S30 8주 투여
OVX+Pro+S30 AIN-93G + E2 + S30 8주 투여
3-2. 측정 실험
각 실험군의 체중을 매주 측정하였다. 8주 투여 후 각 실험군의 혈액에서 혈중 에스트로겐 및 이퀄(equol)의 함량을 측정하였다. 8주 투여 후 각 개체의 복부조직의 지방 분포 및 정량 측정을 Micro-CT 촬영을 통해 행하였다.
질 상피세포의 H&E 염색을 통해 질 상피세포의 두께를 측정하였다. 자궁 무게 측정을 통해, OVX로 인해 자궁 무게가 감소되어 갱년기 모델이 잘 유도되었음을 확인하여, 투여 물질로 인하여 자궁의 내피에도 영향을 주는지 확인하였다.
혈액학적 분석으로서, 중성지방, 총 콜레스테롤, LDL 콜레스테롤, HDL 콜레스테롤, 유리지방산 수준을 측정하여 혈중 지질 수준을 측정하였다. 또한, 혈관 이완을 측정하였다. 에스트로겐은 혈관을 이완시키고 혈중지질을 감소시키는 작용을 하며, 갱년기에 여성의 심혈관계 질환 유병률의 증가는 에스트로겐 수준의 감소와 연관이 있는 것으로 알려져 있다. 이에 따라 갱년기 여성의 심혈관 건강을 측정하는 지표로서 혈중 총 콜레스테롤(total cholesterol), HDL-콜레스테롤, VLDL-콜레스테롤, LDL-콜레스테롤, 중성지방 수준을 측정, Endothelin-1, 산화질소(nitric oxide, NO), eNOS(endothelial nitric oxide synthase) 등의 혈관 수축 및 이완 지표를 측정하였다.
BMD(Bone mineral density) 및 BMC(Bone mineral concentration)를 측정하였다. 갱년기 동물 모델(OVX)에서 골밀도를 측정함으로써 에스트로겐 결핍으로 인해 골밀도가 낮아지는 것을 투여 물질로 중재할 수 있는지를 평가하였다. 조골세포의 골밀도 관련 발현양을 측정하였다. 갱년기 여성의 경우 골 흡수 지표가 골 형성 지표 보다 크게 증가되는 것이 일반적이다. 골 흡수 지표는 파골세포가 뼈를 갉아먹을 때, 나오는 지표로 Deoxypyridinoline, Prydinoline, Type 1 collagen cross-linked telopeptide (NTX, CTX) 등이 있다. 골 형성 지표로는 Osteocalcin, Alkaline phosphatase 등을 측정하였다. 갱년기 효능 관련 측정 마커(marker)는 아래 표 3에 나타내었다.
바이오마커 생산물
신경전달물질 세로토닌(Serotonin) Rat 5-hydroxy tryptamine (5-ht) ELISA Kit
노르에피네프린
(Norepinephrine)		 Rat Norepinephrine (NE) ELISA Kit
골형성지표 Osteocalcin Rat Osteocalcin (OC) ELISA Kit
alkaline phosphatase Rat bone alkaline phosphatase, BALP ELISA Kit
골흡수지표 Deoxypyridinoline Rat deoxypyridinoline (DPD) ELISA Kit
Pyridinoline Rat Pyridinoline (PYD) ELISA Kit
NTX Rat cross linked N-telopeptide of type I collagen, NTX ELISA Kit
CTX Rat cross Linked C-telopeptide of type I collagen (CTX-I) ELISA Kit
심혈관지표 endothelin-1 Rat Endothelin 1 ELISA Kit
nitric oxide Rat nitric oxide (NO) ELISA Kit
eNOS Rat Endothelial Nitric Oxide Synthase ELISA Kit
난포자극호르몬 Follicle-Stimulating
Hormone 		Rat Follicle Stimulating Hormone (FSH) ELISA Kit
황체형성호르몬 Luteinizing hormone Rat Luteinizing hormone ELISA Kit
에스트라디올 Estradiol, E2 Rat Estradiol (E2) ELISA Kit
Equol Equol Equol ELISA Kit
실험결과
실시예 1: 프로바이오틱스에 의한 이퀄(equol) 생성 농도의 측정
주식회사 쎌바이오텍 보유 균주(CBT 19개 균주)들에 대해 이소플라본 30% 함유 대두배아추출물(S30)에 접종하여 37℃에서 48시간 동안 배양한 후, 상층액에 존재하는 이퀄(Equol)의 형성 유무 및 농도를 측정하였다. 측정한 균주 중 8개의 균주, Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium infantis, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus helveticus, Lactococcus lactis 에서 배양 상층액에서 이퀄(equol)이 형성되었고, 이의 유의적인 농도가 측정되었다. 특히, 비피도박테리움(Bifidobacterium) 계열의 균주에서 이퀄(equol)의 양이 높게 형성되었다(도 1a). 또한, 이퀄(equol) 생성능이 높았던 4개 균주의 혼합(Four strains of probiotics, B. lactis, B. infantis, L. gasseri, L. helveticus)에서는 각각의 단일 균주 보다 높은 이퀄(equol) 형성능을 나타내었다(도 1b).
실시예 2: 프로바이오틱스의 β-글루코시다아제 활성의 측정
이소플라본은 당이 결합 되어있는 배당체 형태(glycoside conjugates form)로 존재한다. 이퀄(equol)을 형성하기 위해서는 우선적으로 이소플라본에 결합된 당(glycoside)을 분해하여 비배당체 형태가 되어야 한다. 이러한 반응은 장내 미생물군(gut microbiota)의 β-글루코시다아제에 의해 진행된다. 이퀄(equol)을 형성하는 균주 8개 중, 동일 조건에서 β-글루코시다아제 활성을 측정하여, 효율성이 높은 균주를 스크리닝하였다. 초기 반응시간(1h - 2h)에서, β-글루코시다아제 활성이 상대적으로 높은 균주는 B. lactis, B. infantis, L. gasseri, L. helveticus 이었으며, 또한 총 48h 반응 동안 다른 균주에 비해 높은 β-글루코시다아제 활성을 유지하였다(도 2a). 또한, 4개 균주의 혼합(B. lactis, B. infantis, L. gasseri, L. helveticus)에서는 다른 단일 균주에 비해 높은 β-글루코시다아제 활성을 유지하였다(도 2b). 투여 후 장내에서 대두배아추출물(S30)와 반응하여 이퀄(equol)을 높은 농도로 형성하며 높은 β-글루코시다아제 활성을 나타내는, 4가지 종류의 프로바이오틱스, B. lactis, B. infantis, L. gasseri, L. helveticus을 선정하고, 이들을 인 비보(in vivo) 테스트에 사용하였다.
실시예 3: 유방암세포 및 조골세포에서 에스트로겐 관련 유전자 발현의 측정
MCF-7 세포(human breast adenocarcinoma, 유방암세포) 및 MG-63 세포(Homo sapiens bone osteosarcoma, 조골세포)에 S30, 또는 S30에 프로바이오틱스 균주 B. lactis, B. infantis, L. gasseri, L. helveticus을 배양한 여액을 처리하여 에스트로겐 관련 유전자의 발현양을 측정하였다. 측정 결과, S30 단독 처리한 세포에서는 대조군과 유의적인 차이를 나타내지 않았으나, S30에 각 프로바이오틱스 균주를 배양하여 얻은 여액을 처리한 세포에서는 유전자의 발현양에 유의적 차이가 나타났고, 전체적으로 대조군 및 S30 처리군 보다 에스트로겐 관련 유전자의 발현양이 유의적으로 증가하였다(도 3a - 도 3c).
실시예 4: OVX 랫트에서 17β-에스트라디올 및 이퀄의 혈중 농도 측정
17β-에스트라디올(E2)은 각 실험군의 혈액(serum)에서 측정한 결과 OVX에서는 유의적으로 감소하였지만, 17β-에스트라디올을 투여함으로써 Sham 수치만큼 유지되는 것을 확인하였다. OVX 개체에 Probiotics, S30, S30+Probiotics 투여로 17β-에스트라디올의 수치는 유의적으로 증가하지 않았다. 이퀄(equol)의 경우, 각 실험군의 혈액에서 측정한 결과, Sham, OVX, OVX+E2, OVX+Probiotics는 유의적 차이를 나타내지 않았으나, S30 또는 S30+Probiotics를 투여함으로써 이퀄(equol)이 유의적으로 증가함을 확인하였다. OVX+S30 실험군에서 이퀄(equol)의 증가는 개체의 장내 미생물군(gut microbiota)에 의해 생성된 것으로 판단되었다. S30+Proiotics 투여로 인해 혈액 내 이퀄(equol)의 농도는 유의적 증가를 나타냈으며, 이는 개체의 장내 미생물군에 프로바이오틱스(Probiotics)를 투여함으로써 S30으로부터 이퀄(equol)을 형성하는데 시너지 효과(synergy effect)를 나타내는 것으로 판단되었다(도 4).
실시예 5: OVX 랫트에서의 체중 변화 측정
폐경 이후에도 에스트로겐이 어느 정도 필요하기 때문에, 폐경 후에는 주로 복부 지방조직의 지방세포와 근육세포에서 에스트로겐 전구체를 에스트로겐으로 전환하며, 폐경에 의한 에스트로겐 급감을 보완하는 과정에서 지방세포가 활성화되어 비만의 원인이 된다. 난소제거(OVX, ovariectomized) 후, 8주 동안 체중을 측정하였다. 투여 전(0 week) 각 실험군의 체중은 유의적 차이 없이 비슷한 값을 나타내었다. 투여 1주차부터 실험군간 유의적 차이가 나타나기 시작하였다. Sham 그룹 대비 OVX로 인한 체중 증가가 나타나기 시작하였으며, 특히 S30+Probioics 실험군에서는 유의적으로 체중 증가량이 감소하였다. 또한 Probiotic 투여로 인한 효과도 나타났다. 투여 3주차 부터 S30+Probioics 실험군은 Sham 그룹 대비 유의적 체중 차이가 나타나지 않기 시작하였으며, 투여 4주차에는 E2(17β-에스트라디올, 에스트로겐) 투여군보다 체중 증가량이 감소하였다. 투여 8주차(투여 종료) 시점에서 S30+Probiotics 실험군은 Sham 그룹 및 Probiotics 투여 그룹과 유의적 차이를 나타내지 않았으나, OVX, E2 및 S30 실험군보다 체중 증가량이 유의적으로 감소하였다. OVX 후 8주간 개체의 체중이 증가함을 확인하였으며, 또한 E2 투여로 인해 체중 증가량이 유의적으로 감소함을 확인하였다. 이와 같은 효과는 Probiotics, S30 + Probiotics 투여에서도 나타났으나, S30 투여만으로는 나타나지 않았다(도 5).
실시예 6 : OVX 랫트에서 복부 지방 부피 측정
OVX 랫트에서 각 실험군의 체중에 따른 복부 지방 부피를 측정하여 비교하였다(도 6a 및 도 6b).
전체 복부 부피(Total abdominal volume) 측정결과, OVX 및 S30 단독 투여에 의한 복부 부피는 Sham 보다 유의적으로 증가하였다. E2, Probiotics 투여는 OVX와 유의적 차이가 나지 않았으나, S30+Probiotics 투여는 OVX보다 유의적 감소 효과를 나타내었다.
또한, 전체 복부지방 부피, 복부 내장지방 부피+복부 피하지방 부피(Total Abdominal Fat volume)를 측정한 결과, 전제 복부 부피 측정에서와 같은 양상의 결과를 나타내었다. 또한, 복부 내장지방 부피(Abdominal Visceral Fat volume)를 측정한 결과, OVX 및 S30 단독 투여는 Sham 보다 유의적으로 증가하였다. E2, Probiotics 투여로 OVX 보다 유의적으로 감소가 나타났다. S30+Probiotics 투여는 OVX 및 S30 투여군보다 유의적으로 감소 효과가 나타났다.
복부 피하지방 부피(Abdominal Subcutaneous Fat volume) 측정한 결과, OVX에 의해 Sham 보다 유의적으로 증가하였다. 다른 실험군에서는 OVX와 유의적 차이가 없었으나, S30+Probiotics 투여군은 OVX 보다 유의적 감소 효과를 나타냈다.
전체 복부지방 비율(Total Abdominal Fat ratio, Total Abdominal Fat volume /Total abdominal volume, %): OVX 및 S30 단독 투여는 Sham 보다 유의적으로 증가하였다. S30+Probiotics 투여는 Sham과 유의적 차이가 없었으며, E2, Probiotics 및 S30 투여군보다 유의적 감소 효과를 나타내었다.
복부 내장지방 비율(Abdominal Visceral Fat ratio, Abdominal Visceral Fat volume/Total Abdominal Fat volume, %)을 측정한 결과, 실험군간 유의적 차이 없었다.
복부 피하지방 비율(Abdominal Subcutaneous Fat ratio, Abdominal Subcutaneous Fat volume/Total Abdominal Fat volume, %)을 측정한 결과, 실험군간 유의적 차이가 없었다.
실시예 7 : OVX 랫트에서 혈액학적 지표 측정
OVX 랫트에서 각 실험군의 혈액학적 지표들을 측정하고 이들을 분석하였다(도 7a 및 도 7b).
알부민(Albumin)은 여러 호르몬들의 운반체로서 Ca, P, sulfur(S) 등의 전해질 및 갑상선호르몬과 결합하여 운반 역할을 한다. 알부민의 농도가 낮아지면 제반기능이 떨어진다. OVX로 인해 알부민의 수치는 감소되었으나, Probiotics 또는 S30 + Probiotics 투여로 인해 유의적으로 증가하였다.
혈중 칼슘(calcium) 농도의 변화는 뼈에 존재하는 칼슘의 영향을 받게 되고, 난소제거로 인한 골교착율의 증가가 골질의 감소를 초래하여 혈중 칼슘 농도의 상승을 가져오게 되므로 칼슘 농도의 변화는 골흡수와 관련이 있다. OVX로 인해 혈중 칼슘의 농도는 증가되었으나, E2 투여로 인해 감소하였다. 또한 S30, Probiotics, S30+Probiotics 투여에 의해, Sham 및 E2 투여 보다 칼슘 농도가 유의적으로 감소하였다.
에스트로겐의 분비가 감소하면 리포단백질 리파아제(Lipoprotein lipase)의 활성화를 억제하는 기능이 낮아져 지방이 과다하게 축적되며, 고지혈증이 나타난다. OVX로 인해 콜레스테롤(cholestrol), 중성지방(triglyceride), LDL은 Sham 보다 유의적으로 증가하였고, HDL은 유의적으로 감소하였다. S30, Probiotics, S30+Probiotics의 투여는 전반적으로 유의적인 고지혈증 개선 효과를 나타내었고, 특히 S30+Probiotics 투여는 혈중 LDL의 감소 및 HDL의 증가의 효과가 다른 투여군보다 높게 나타났다.
OVX로 인해 간수치 AST(Aspartate ransaminase), ALT (Alanine transaminase)는 Sham 그룹 보다 유의적으로 증가하였다. Probiotics 투여만으로도 유의적 감소 효능이 나타났지만, S30+Probiotics 투여는 S30 단독 투여보다 더 나은 효능을 나타내었다.
실시예 8: OVX 랫트에서 자궁질 내막의 두께 측정
8-1. 각 실험군에서 질 상피조직 두께(vaginal epithelial height) 측정
갱년기 및 폐경 후 감소하는 혈중 에스트로겐 농도는 비뇨생식기에도 영향을 주어, 질 점막의 발적, 탄력성 소실, 주름의 소실, 세포구성의 변화, 질 내 산도의 증가를 가져오는 비뇨생식기 위축증을 유발한다. 질 상피의 두께와 혈류가 감소하여 건조해지고, 얇아지며, 창백해지고, 질 상피의 성숙도가 떨어져 미성숙한 세포가 더 많아지게 된다. OVX로 인해 질 상피조직의 두께는 Sham보다 유의적으로 줄어들었으며, E2 투여로 인해 OVX 보다 유의적으로 증가하였다. Probiotics 또는 S30의 단독 투여는 Sham 및 E2 투여보다 질 상피 조직의 두께는 유의적으로 감소하였으며, OVX와는 유의적 차이를 나타내지 않았다. 그러나, S30 + Probiotics 투여는 질 상피 조직의 두께에서 Sham 및 E2 실험군과 유의적 차이를 나타내지 않았고, OVX, Probiotics 또는 S30 실험군보다 유의적으로 증가하였다. 이는 에스트로겐 감소로 나타나는 질 조직의 변화에 S30 + Probiotics 투여에 의해 유의적인 개선 효과를 나타낸 결과로 해석된다(도 8a).
8-2. 각 실험군에서 자궁조직 무게 측정
난소를 절제(OVX)하면 자궁 내막을 자라게 하는 에스트로겐이 감소하여 자궁무게가 감소한다. OVX로 인해 자궁조직 무게는 Sham보다 유의적으로 감소하였으며, E2 투여로 인해 OVX보다 유의적으로 증가하였다. Probiotics 또는 S30의 단독 투여에 의해 자궁조직 무게는 Sham 및 E2 투여보다 유의적으로 감소하였으며, OVX와는 유의적 차이를 나타내지 않았다. 그러나, S30 + Probiotics 투여에 의해 자궁조직 무게는 Sham 및 E2 실험군 보다는 유의적으로 감소하였으나, OVX, Probiotics 또는 S30 실험군보다 유의적으로 증가하였다. 이는 에스트로겐 감소로 나타나는 자궁조직의 변화에 S30 + Probiotics 투여가 유의적인 개선 효과를 나타낸 결과이다(개체 무게 100g 당 자궁조직 무게도 같은 유의성을 나타내었다)(도 8b).
실시예 9 : OVX 랫트에서 골 지표 측정
OVX 랫트에서 각 실험군의 골 지표들을 측정하고 이들을 분석하였다(도 9a - 도 9c). BMD(Bone material density)는 OVX에 의해 유의적으로 감소하였다. Probiotics, S30 투여는 OVX와 유의적 차이가 없었으나, E2 또는 S30 + Probiotics 투여에 의해 BMD가 유의적으로 증가하였다. 특히, S30 + Probiotics 투여는 Probiotics, S30 투여보다 BMD가 유의적으로 증가하였다. TV(Total volum)은 모든 실험군에서 유사하였고, OVX에 의한 전체 부피에는 변화가 없었다. OVX에 의해 BV(Bone volume), BV/TV, 및 BS(Bone surface)는 유의적으로 감소하였다. Probiotics, S30 투여는 OVX와 유의적 차이가 없었으나, E2 또는 S30 + Probiotics 투여는 BV, BV/TV, BS가 유의적으로 증가하였다. OVX에 의해 BS/BV, Tb. Th(Trabecular Thickness)는 유의적으로 감소하였고, E2 및 S30 + Probiotics 투여로 인해 유의적으로 증가하였다. Tb. N(Trabecular Number), Tb. Sp(Trabecular Separation)은 OVX를 수행한 모든 실험군에서는 유의적으로 증가하였으나, 실험군 간의 유의적 차이는 없었다.
실시예 10 : OVX 랫트에서 혈중 세로토닌 및 노르에피네프린 농도 측정
세로토닌(serotonin)은 뇌, 내장조직, 혈소판, 비만세포 등에 들어있는 신경전달물질로서, 그 중 마이크로바이옴(microbiome)의 영향으로 장조직에서 생성되는 세로토닌(Peripheral serotonin)는 조골세포(osteoblast)의 분화를 억제한다. 에스트로겐은 노르에피네프린(norepinephrine)의 농도와 신경전달 물질의 수용체를 증가시키는 것으로 알려져 있으며, 에스트로겐이 감소되는 갱년기에는 노르에피네프린 감소가 유발될 수 있다. 혈중(serum) 세로토닌(serotonin)의 농도를 측정한 결과, OVX에 의해 Sham 보다 유의적으로 증가하였으나, E2, probiotics 또는 S30 + Probiotics 투여로 인해 유의적으로 감소하였다. S30, S30 + Probiotics 실험군 간의 유의적 차이는 나타나지 않았다. 혈중(serum) 노르에피네프린(Norepinephrine)의 농도를 측정한 결과, OVX에 의해 Sham 보다 유의적으로 감소하였으나, E2, probiotics, S30, S30 + Probiotics 투여로 인해 유의적으로 증가하였다. 특히 S30 + Probiotics 투여에서 유의적으로 가장 높은 농도 증가를 나타냈다(도 10).
실시예 11 : OVX 랫트에서 혈중 골 형성 마커 및 골 흡수 마커 농도 측정
에스트로겐은 골 흡수를 억제하는 작용을 하는데 갱년기에 에스트로겐 분비가 감소하면서 골 손실이 증가한다. 갱년기 여성의 경우 골 흡수 지표가 골 형성 지표 보다 크게 증가되는 것이 일반적이다. 골 흡수 지표는 파골 세포가 뼈를 분해할 때 생성되는 지표로 Deoxypyridinoline, Prydinoline, Type 1 Collagen cross-linked telopeptide (NTX, CTX)을 측정하였으며, 골 형성 지표로는 Osteocalcin, Bone Alkaline phosphatase (B-ALP) 등을 측정하였다. 골 형성(Bone formation) 마커를 측정한 결과, Osteocalcin 및 B-ALP는 OVX에 의해 유의적으로 감소하였으나, E2, probiotics, S30 투여에 의해 OVX 보다 유의적으로 증가하였고, 특히 S30+Probiotics 투여에 의해 E2, probiotics, S30 투여 보다 유의적으로 증가하였다(도 11a). 골 흡수(Bone resorption) 마커를 측정한 결과, Deoxypyridinoline, Prydinoline, NTX, CTX의 경우 전체적으로 OVX에 의한 증가가 나타났고, E2, probiotics, S30 투여에 의해 OVX 보다 유의적으로 감소하였으며, 특히 S30 + Probiotics 투여에 의해 E2와 견줄 만큼으로 유의적인 감소를 나타내었다(도 11b).
실시예 12 : 혈관 항상성 혈액 마커 측정
에스트로겐은 혈관을 이완시키며, 갱년기에 여성의 심혈관계 질환 유병률의 증가는 에스트로겐 수준의 감소와 연관이 있는 것으로 알려져 있다. 이에 따라 갱년기 여성의 심혈관 건강을 측정하는 지표로서 혈관수축 지표인 Endothelin-1, 혈관 이완 지표인 산화 질소(Nitric Oxide, NO), eNOS(endothelial Nitric Oxide Synthase)를 측정하였다. Endothelin-1 측정 결과, OVX에 의해 유의적으로 증가하였으나, E2, probiotics, S30 + probiotics 투여에 의해 OVX 보다 유의적인 감소를 나타내었다. 특히, S30 + Probiotics 투여는 Sham과 유사하며, S30 투여보다 유의적인 감소를 나타내었다. NO(nitric oxide)는 OVX에 의해 유의적으로 감소하였으나. E2, S30 + probiotics 투여에 의해 OVX 보다 유의적 증가를 나타내었고, probiotics, S30 투여는 OVX와 유의적 차이가 없었다. eNOS(endothelial nitric oxide synthase)는 Sham과 OVX간의 유의적 차이는 없었으나, E2 투여로 인해 유의적으로 증가하였고, S30 + Probiotics 투여에 의해 OVX 보다 유의적으로 증가하였다. Probiotics, S30 투여는 Sham, OVX와 유의적 차이가 없었다(도 12).
실시예 13 : FSH, LH의 혈중 수준 측정
갱년기에는 난소에서 난포의 고갈로 에스트로겐의 분비가 감소하게 되며, 이로 인해 시상하부-뇌하수체 축의 음성 피드백(negative feedback) 기전에 의해 난포자극호르몬(follicle stimulating hormone, FSH)과 황체형성호르몬(luteinizing hormone, LH)의 분비가 증가하는 것이 특징이다. FSH(follicle stimulating hormone)은 OVX에 의해 유의적으로 증가하였다. E2, S30 + probiotics 투여에 의해 OVX 보다 유의적으로 감소하였다. 특히 S30 + Probiotics 투여는 Sham 및 E2 투여와 유사하였으며, Probiotics, S30 투여와 비교하여 유의적 감소를 나타내었다. LH(luteinizing hormone)은 FSH과 유사한 경향을 나타내었으며, S30 + Probiotics 투여에 의해 E2 투여와 유사한 효능을 나타내었다(도 13).
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (10)

  1. (i) 비피도박테리움 속 유산균, 락토바실러스 속 유산균 및 락토코커스 속 유산균으로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 유산균; 및
    (ii) 이소플라본(isoflavone) 및 대두배아추출물(soybean germ extract)을 포함하는 프리바이오틱스 조성물을 포함하는 갱년기 또는 폐경기 증상의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 비피도박테리움 속 유산균은 비피도박테리움 락티스(Bifidobacterium lactis), 비피도박테리움 브레비(Bifidobacterium breve), 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum), 및 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 유산균이고;
    상기 락토바실러스 속 유산균은 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri), 및 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 유산균이고;
    상기 락토코커스 속 유산균은 락토코커서 락티스(Lactococcus lactis)인 것을 특징으로 하는 갱년기 또는 폐경기 증상의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 유산균은 비피도박테리움 락티스(Bifidobacterium lactis), 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis), 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri), 및 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 유산균인 것을 특징으로 하는 갱년기 또는 폐경기 증상의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 이소플라본은 상기 프리바이오틱스 조성물에 대해 1-50 중량% 포함되는 것을 특징으로 하는 갱년기 또는 폐경기 증상의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 갱년기 또는 폐경기 증상은 안면홍조, 야간발한, 불규칙한 생리주기, 성욕의 감퇴, 질 건조감, 피로감, 탈모, 수면장애, 집중력 장애, 기억력 감퇴, 현기증, 체중 증가, 요실금, 복부 팽만감, 알러지, 잘부러지는 손톱, 체취의 변화, 불규칙한 심장박동, 우울증, 불안감, 초조함, 공황장애 증상, 골다공증, 골밀도감소증, 고지혈증, 또는 이상지질혈증인 것을 특징으로 하는, 갱년기 또는 폐경기 증상의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  6. (i) 비피도박테리움 속 유산균, 락토바실러스 속 유산균 및 락토코커스 속 유산균으로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 유산균;
    (ii) 이소플라본(isoflavone) 및 대두배아추출물(soybean germ extract)을 포함하는 프리바이오틱스 조성물; 및
    (iii) 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 갱년기 또는 폐경기 증상의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  7. 제 6 항에 있어서,
    상기 비피도박테리움 속 유산균은 비피도박테리움 락티스(Bifidobacterium lactis), 비피도박테리움 브레비(Bifidobacterium breve), 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum), 및 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 유산균이고;
    상기 락토바실러스 속 유산균은 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri), 및 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 유산균이고;
    상기 락토코커스 속 유산균은 락토코커서 락티스(Lactococcus lactis)인 것을 특징으로 하는, 갱년기 또는 폐경기 증상의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  8. 제 6 항에 있어서,
    상기 유산균은 비피도박테리움 락티스(Bifidobacterium lactis), 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis), 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri), 및 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 유산균인 것을 특징으로 하는, 갱년기 또는 폐경기 증상의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  9. 제 6 항에 있어서,
    상기 이소플라본은 상기 프리바이오틱스 조성물에 대해 1-50 중량% 포함되는 것을 특징으로 하는, 갱년기 또는 폐경기 증상의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  10. 제 6 항에 있어서,
    상기 갱년기 또는 폐경기 증상은 안면홍조, 야간발한, 불규칙한 생리주기, 성욕의 감퇴, 질 건조감, 피로감, 탈모, 수면장애, 집중력 장애, 기억력 감퇴, 현기증, 체중 증가, 요실금, 복부 팽만감, 알러지, 잘부러지는 손톱, 체취의 변화, 불규칙한 심장박동, 우울증, 불안감, 초조함, 공황장애 증상, 골다공증, 골밀도감소증, 고지혈증, 또는 이상지질혈증인 것을 특징으로 하는, 갱년기 또는 폐경기 증상의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
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