KR101798882B1 - 홍국균 발효산물을 포함하는 여성 갱년기 질환의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

홍국균 발효산물을 포함하는 여성 갱년기 질환의 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 여성 갱년기 질환의 예방 또는 치료용 조성물, 또는 여성 갱년기 질환 개선용 건강기능식품 조성물, 또는 홍국균 발효산물의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 상기 제조방법으로 홍국균 발효산물을 제조할 경우, 발효산물인 monacolin K를 생산하도록 함으로써, 이를 여성 갱년기 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물로서 포함할 경우, 여성 갱년기 질환의 예방, 개선 또는 치료 효과가 우수하다.

Description

홍국균 발효산물을 포함하는 여성 갱년기 질환의 예방 또는 치료용 조성물{Composition comprising an extract of fermentation products from Monascus sp. for preventing or treating of climacteric disorder}
본 발명은 여성 갱년기 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 홍국균 발효산물을 포함하는 여성 갱년기 질환의 예방 또는 치료용 조성물, 여성 갱년기 질환 개선용 건강기능식품 조성물 및 홍국균 발효산물의 제조방법에 관한 것이다.
에스트로겐은 난소 내의 난포에서 분비되는 호르몬으로서, 생식기를 발육시키고 그 기능을 나타내도록 하여 제2차 성징을 발달시키며 자궁 발육, 내막 증식, 젖샘 발육, 규칙적 월경 등을 촉진한다. 에스트로겐의 분비 감소는 여성의 비뇨, 생식계통뿐 아니라 신체의 다른 부위에서 영향을 미치므로 에스트로겐의 분비 감소는 신체전반에 걸쳐 큰 영향을 미치게 된다. 폐경기 이후 여성에게는 에스트로겐의 급격한 감소로 인하여, 안면홍조현상(Hot Flush)이나 급작스런 심장박동 변화 및 수면장애 등의 증상이 생기는데, 이것이 가장 빈번한 폐경기 증상이다. 이러한 에스트로겐의 부족은 신경증, 과민성, 집중력 저하, 우울한 기분, 불안증세, 자신감과 성적 욕구의 상실로 이어지기도 한다. 또한, 에스트로겐의 감소로 피의 공급이 원활하게 이루어 지지 않아 피부와 질 점막의 탄력과 수분을 잃게 된다. 이는 만성 질환을 초래하기 때문에 폐경기 여성에 대한 치료의 필요성이 점차 부각되고 있으며, 이러한 폐경기 여성의 증상치료를 위한 방법으로 인위적으로 에스트로겐을 투여하는 호르몬 대체 요법(Hormone Replacement Therapy: HRT)이 널리 이용되고 있다. 호르몬 대체요법에 사용되는 합성 에스트로겐의 대체물로서 합성에스트로겐과 비슷한 활성은 가지면서 부작용이 적은 천연물 유래, 특히 식물 유래의 천연 에스트로겐을 찾고자 하는 연구가 활발히 진행되고 있는 추세이다. 특히, 식물 유래의 천연에스트로겐을 흔히 식물성 에스트로겐(phytoestrogen)이라고 칭하는데 상기 식물성에스트로겐이란 일반적으로 여성호르몬 에스트로겐과 기능 및 구조가 유사한 식물로부터 유래한 비스테로이드성 화합물을 지칭하며, 식물의 줄기, 뿌리, 꽃이나 종자에서 발견된다. 상기 식물성 에스트로겐의 예로는 크게 콩과 칡에서 유래한 이소플라본(isoflavone), 클로버에서 유래한 쿠메스탄(coumestan), 아마종자에서 유래한 리그난(lignan) 등이 있다. 이소플라본은 식물 내에서는 바이오카닌 A(biochanin A)와 포르모노네틴(formononetin)의 비활성형태로 존재하나, 체내로 흡수되어 장내 박테리아의 글루코시다제(glucosidase)에 의해 각각 에스트로겐과 유사한 구조를 갖는 제니스테인(genistein)과 다이드제인(daidzein)으로 변환되어 에스트로겐과 같은 활성을 나타내게 되는데 제니스테인은 세포의 단백질 타이로신 인산화효소(protein tyrosine kinase)를 억제하여 암세포의 성장을 억제하는 항암효과도 가지는 것으로 보고된바 있다.(Botanical antioxidants in the prevention of photocarcinogenesis and photoaging. Exp . Dermatol. 2006. 15: 678-684.) 그러나, 효과가 없거나 자궁암 및 유방암의 유전적 소인을 가지고 있는 사람들에게 있어서는 오히려 암을 유발할 수 있다는 것도 보고된 바 있다. 따라서 제니스테인의 부작용과 같은 부작용이 일어나지 않으면서도, 우수한 에스트로겐 활성을 갖는 새로운 식물성 에스트로겐을 개발하는 하는 것이 요구된다.
이에 본 발명자들은, 오랫동안 식품으로 사용되어 그 안전성이 입증된 천연자원들을 객관적으로 검증하여 여성 폐경기 증후군에 대한 치료, 개선 또는 예방효과를 갖는 천연물질을 개발하기 하고자 인간 유방조직 유래 세포주인 MCF-7 세포에서 에스트로겐 반응 부위(Estrogen Responsive Element; ERE), 구체적으로 에스트로겐 수용체(Estrogen Receptor; ER)의 발현을 촉진하여 에스트로겐 활성을 가지는 원료를 탐색한 결과, 홍국균 발효산물을 함유하는 조성물의 경우 여성 갱년기 질환의 예방, 개선 및 치료 효과가 우수한 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 주된 목적은 여성 갱년기 질환의 예방, 개선 또는 치료 효과가 우수한 홍국균 발효산물을 포함하는 여성 갱년기 질환의 예방 또는 치료용 조성물, 또는 여성 갱년기 질환 개선용 건강기능식품 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 여성 갱년기 질환의 예방, 개선 또는 치료 효과가 우수한 홍국균 발효산물을 제조하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 복분자 홍국균 발효산물을 유효성분으로 포함하는 여성 갱년기 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
여성이 나이가 들면서 난소가 노화되어 기능이 떨어지면 배란 및 여성호르몬의 생산이 더이상 이루어지지 않는데, 이로 인해 나타나는 현상이 바로 폐경이라고 한다. 대개 1년간 생리가 없을 때 폐경으로 진단한다. 이러한 변화는 대개 40대 중후반에서 시작되어 점진적으로 진행되는데, 이때부터 생리가 완전히 없어지는 폐경이 나타난 이후의 약 1년까지를 폐경이행기, 더 흔히는 ‘갱년기’라고 하며 그 기간은 평균 4~7년 정도이다. 갱년기에는 여성에게는 에스트로겐의 급격한 감소로 인하여, 안면홍조현상(Hot Flush)이나 급작스런 심장박동 변화 및 수면장애 등의 증상이 발생한다. 폐경기여성의 증상치료를 위한 방법으로 인위적으로 에스트로겐을 투여하는 호르몬 대체 요법이 널리 이용되고 있으나, 여러 가지 부작용도 보고되고 있다. 이에, 본 발명자들은 부작용을 최소화 하면서도 여성 갱년기 질환의 예방, 개선 또는 치료 효과를 갖는 천연물질을 연구개발한 결과, 홍국균 발효산물을 포함하는 조성물의 경우, 그 효과가 우수한 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명에 있어서, 상기 복분자 홍국균 발효산물은 프로토카테츄산(protocatechuic acid), 엘라그산(ellagic acid) 및 모나콜린케이(monacolin K)를 포함하는 것을 특징으로 한다.
Monascus는 붉은 색을 띄는 곰팡이로 발효액에서 매우 강한 콜레스테롤 합성 억제 활성을 가진 화합물을 2차 대사산물로 생성한다. 홍국의 라틴어인 Monascus의 어근을 따서 monacolin K라고 명명하였으며, Merk사의 Aspergillus로부터 분리한 동일 화합물은 meviolin이라 명하여 산업적으로 활용하고 있다. 콜레스테롤 개선에 관한 효능의 입증은 이미 다수의 논문으로 확인된 현황이나, 발효기질의 단순적용 및 발효기술력의 부재로 인한 소재의 대중화는 미비한 현황이다. 따라서, 본 발명에서는 홍국균의 천연물 발효기술을 기반으로 하며, 이를 산업적으로 이용할 수 있는 액상배양기술의 확립과 Monascus가 증식 및 대사과정에서 분비하는 다양한 효소를 이용하여 천연물 생물전환기술을 응용한 것이다.
본 발명의 실험예에 따르면, 복분자 홍국균 발효액과 복분자 농축액의 성분 함량을 분석한 결과, 복분자 홍국균 발효액과 복분자 농축액 모두 프로토카테츄산(protocatechuic acid) 및 엘라그산(ellagic acid)의 성분 함량이 거의 변화가 없는 것을 확인하였으며, 더욱이 복분자 홍국균 발효액의 경우에는 발효하지 않은 복분자 농축액에는 없던 모나콜린케이(monacolin K)가 생성되는 것을 확인할 수 있었다. 복분자의 ellagic acid는 에스트로겐 리셉터 활성에 효능이 있는 것으로 확인되었으며, 에스트로겐 리셉터는 에스트로겐을 수용하는 단백질 군으로 에스트로겐에 의해 활성화되어 다른 유전자의 활동을 조절하며 에스트로겐 리셉터 α에서 높은 활성을 나타내는 연구결과가 보고되었다(J. Agric. Food Chem. 2005, 53, 77157720). 또한, 여성갱년기의 대표적인 연관 질병으로 알려진 골다공증 및 골연화증에 ellagic acid가 도움을 줄 수 있다고 확인이 되었는데 뼈세포의 골형성을 촉진하는 alkaline phosphatase 활성이 ellagic acid 처리에서 증가하였으며, 골아세포의 결절을 줄여주는 역할을 하는 것으로 알려져 있다(J. Agric. Food Chem. 2005, 53, 77157720). 또한, protocatechuic acid(PA)의 에스트로겐활성 및 항에스트로겐 활성을 평가한 연구보고에 따르면, yeast two-hybrid 실험을 통해 PA가 에스트로겐 수용체에 강하게 결합한다는 것을 밝혀냈고, 컴퓨터 시뮬레이션을 통해 결합위치 또한 추정할 수 있었다. MCF-7 유방암세포의 증식 실험을 통해 에스트로겐 활성을 측정하였는데, 저농도에서 세포증식을 유발하였으며, 에스트로겐 수용체가 발현되지 않는 MDA-MB-231 세포에서는 증식을 유발하지 않았다. 위 결과로 에스트로겐 수용체를 통해서 활성을 보인다는 결론을 내릴 수 있다. Estradiol(E2)을 처리하여 세포증식을 유도하였을 시, PA를 고농도로 처리하면 항에스트로겐 활성을 보였는데, 이는 E2와 PA가 에스트로겐 수용체 결합부위에 대해 경쟁적으로 결합하려는 것으로 해석된다. 갱년기 여성의 E2 수치는 현저히 떨어진 상태이므로 PA 소량 투입시 갱년기 증상 개선이 이루어질 것으로 기대된다.(Frontier and Future Development of Information Technology in Medicine and Education. 2013.269; 3319-3327) 이러한 결과는, 복분자 추출물을 홍국균으로 발효한다고 하더라도 종래에 에스트로겐 활성에 영향을 주는 성분인 프로토카테츄산(Protocatechuic acid) 및 엘라그산(ellagic acid)의 성분 함량이 변화없이 에스트로겐 활성에 유효한 영향을 줌으로서, 여성 갱년기 질환의 예방, 개선 또는 치료에 우수한 효과에 영향을 미칠 수 있음을 보여준다(실험예 2 참조).
본 발명에 있어서, 상기 복분자 홍국균 발효산물은 여성 갱년기 질환의 예방 또는 치료 효과가 있는 것을 특징으로 한다.
여성 갱년기 증상 완화와 밀접한 에스트로겐 활성을 보는 일반적인 방법 중에 하나는 에스트로겐 투여 시 에스트로겐 수용체를 통해서 발현되는 유전자를 측정하는 것이다. 세포내에서 에스트로겐 투여로 인하여 활성화된 에스트로겐 수용체는 세포핵으로 이동하여 유전자 전사(transcription)를 수행하게 되는데, 이때 발현되는 유전자에는 프로게스테론 수용체(progesterone receptor)가 있다. 이에, 본 발명자들은 qPCR실험을 통하여 프로게스테론 수용체(PR)의 mRNA 증가를 확인하였다.
본 발명의 실험예에 따르면, 복분자 추출물을 홍국균으로 발효한 발효액 처리 시 발효하지 않은 복분자 추출물보다 프로게스테론 수용체의 mRNA의 발현량이 증가하는 것을 확인하였다. 이러한 PR mRNA의 증가는 발효하지 않은 복분자 추출물에서는 생성되지 않고 발효한 복분자 추출물에서만 생성되는 monacolin K 또는 이차대사산물로 인한 것으로 보이며, 더 나아가 본 발명의 복분자 홍국균 발효산물이 에스트로겐의 양을 증가시키고, 증가된 만큼의 에스트로겐이 에스트로겐 수용체에 결합하게 되면서 전사되는 유전자 중 PR mRNA의 양이 증가하는 것으로 보이며, 이는 에스트로겐의 양이 감소하면서 발생되는 여성 갱년기 질환을 에스트로겐 양을 증가시킴으로써 갱년기 질환을 예방, 개선 또는 치료 등의 유효한 효과를 줄 수 있을 것으로 보인다.
본 발명에 있어서, 상기 복분자 홍국균 발효산물은 약학 조성물 총 중량 대비 10 내지 90 중량% 함유하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서, 상기 약학적 조성물은 정제, 환제, 과립제 또는 캡슐제로 이루어진 군에서 선택된 하나의 제형을 갖는 것이 바람직하다.
또한, 상기 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은, 임상 투여 시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 즉, 본 발명의 홍국균 부산물을 함유하는 약학적 조성물은 실제 임상 투여 시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제 및 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제 및 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스, 락토오스 및 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제 및 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제와 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 여성 갱년기 질환은 상기 안면홍조, 발한, 피부건조, 질건조증, 질위축, 하부 요도 위축, 질염, 방광염, 배뇨통, 급뇨, 집중장애, 단기 기억장애, 불안, 신경과민, 기억력 감퇴, 근육통, 관절통 또는 골다공증인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 복분자 홍국균 발효산물을 유효성분으로 포함하는 여성 갱년기 질환 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명에서, 홍국균 발효산물을 유효성분으로 포함하는 건강기능식품 조성물은 일반 식품류에 홍국균 발효산물을 첨가하여 일반 식품류에 여성 갱년기 질환을 부여한 건강기능성 식품을 말하는 것으로, 홍국균 발효산물을 일반 식품류에 첨가하여 캡슐화, 분말화, 현탁액 등으로 제조할 수 있다. 이러한 식품 조성물을 섭취할 경우 여성 갱년기 질환의 예방, 개선 또는 치료 효과를 나타낼 수 있으며, 이를 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있다.
또한, 상기 건강기능식품 조성물의 종류에는 특별한 제한은 없다. 구체적으로, 홍국균 발효산물을 함유하는 건강기능식품으로는 홍국균 발효산물을 주성분으로 만든 차, 젤리, 쥬스 등의 건강식품 및 기호품을 들 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계들을 포함하는 복분자 홍국균 발효산물의 제조방법을 제공한다.
a) 홍국균을 배양하는 단계;
b) 상기 배양한 홍국균을 yeast extract, soy peptone 및 glucose가 포함된 배지에서 전배양 하는 단계;
c) 상기 b) 단계의 홍국균을 복분자 추출물 및 glucose에서 본배양하는 단계; 및
d) 상기 c) 단계의 배양액을 여과, 농축 및 건조를 하여 발효물을 회수하는 단계.
본 발명에 있어서, 상기 b) 단계의 전배양 및 c) 단계의 본배양은 1일 내지 7일동안, 바람직하게는 24 내지 72시간 동안 배양하는 것을 특징으로 한다. 상기 배양 시간을 벗어날 경우 균 오염 및 활성이 떨어질 수 있다.
이하, 본 발명의 복분자 홍국균 발효산물 제조방법을 단계별로 보다 구체적으로 설명한다.
1) 복분자를 이용한 홍국균 균주를 스크리닝하는 단계;
2) 선정된 균주를 이용해 plate배양, 전배양, 본배양의 발효 조건을 확립하는 단계;
본 발명에 있어서, 균주 스크리닝은 홍국균 17종을 flask 조건에서 복분자 추출물의 monacolin K와 citrinin의 생성능을 비교하여 선정하였다. 또한, 추출물의 발효 이후 고형분을 측정하여 고형분이 감소하면 홍국균에 의한 대사가 일어났음을 간접적으로 확인하였다.
본 발명에 있어서, 전배양에서 사용하는 배지는 yeast extract, soy peptone, glucose를 이용해 조성한 것을 특징으로 한다.
더욱 구체적으로는, yeast extract를 1~10%, 보다 바람직하게는 1~5%, soy peptone 1~10%, 보다 바람직하게는 1~5%, glucose 1~10%, 보다 바람직하게는 1~5%를 이용해 배지를 만들었으며 배양시간은 24~72시간 동안 배양을 하였다.
본 발명에 있어서, 본배양에서는 복분자 추출 농축액과 glucose를 이용해 배양한 것을 특징으로 한다.
더욱 구체적으로는, 복분자추출농축액 1~10%, glucose 1~10%를 이용해 배양을 하였고 배양시간은 24~72시간 동안 배양을 하였다.
또한, 배양액을 여과, 농축, 동결건조 및 분무건조를 통해 최종 배양물을 얻었다.
이상 설명한 바와 같이, 본 발명의 제조방법으로 복분자 홍국균 발효산물을 제조할 경우, 복분자의 페놀산 및 ellagic acid의 함량은 유지하면서 발효산물인 monacolin K를 함유하는 조성물을 제조할 수 있으며, 상기 방법으로 제조된 홍국균 발효산물을 함유하는 조성물의 경우, 여성 갱년기 질환의 예방, 개선 또는 치료에 효과적이다.
도 1은 홍국균 발효시 monacolin K의 생성을 통한 균주 스크리닝에 대한 도표이다.
도 2는 홍국균 발효시 고형분의 변화에 대한 도표이다.
도 3은 홍국균 발효시 pH및 glucose 변화에 대한 도표이다.
도 4는 4종의 샘플의 갱년기 여성 건강 기능성 효능평가에 대한 도표이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
비교예 1: 복분자 추출물
시중에서 구입한 복분자 3kg과 상수 30kg을 가하고 온도 90 ~ 110℃, 교반속도 100 ~ 200rpm, 4~8 시간 추출하였다. 추출액을 여과, 농축하여 균주 스크리닝 및 갱년기 여성 건강 개선 관련 기능성 효능평가를 하는데 이용하였다.
실시예 1: 홍국균 균주 스크리닝
홍국균 균주 17종을 복분자 추출물에 1% 접종하여 monacolin K의 생성능을 확인하였다(도 1 참조). 복분자 추출물에서는 monacolin K 가 Monascus sp. K에서 최대 155.8 mg/kg 생성된 것을 확인하였고, citrinin의 경우 모두 검출되지 않았다. 또한 복분자 추출물의 고형분을 측정하여 배양이 잘 되는지를 확인하였다(도 2 참조).
실시예 2: 복분자 추출물을 이용한 홍국균 발효
실시예 1을 통해 스크리닝된 Monascus sp. K를 PDA배지에 72시간 배양 후 yeast extract 2%, soy peptone 1%, glucose 2%가 포함된 배지에 1차 전배양 후 동일 조성의 배지에 2차 전배양을 한 후 복분자 추출 농축액(고형분: 2%)에 2% glucose를 첨가한 액에 배양액 1%를 접종하여 70시간 동안 배양하였다. 배양 후 여과, 농축, 분무건조를 하여 복분자 홍국균 발효물을 얻었다.
실험예 1: 홍국균의 발효에서 pH 및 glucose 변화 분석
상기 실시예 2를 통해 복분자 추출 농축액에 홍국균을 접종하여 70시간 배양하는 동안 pH 및 glucose 변화를 분석하였으며, 그 결과 발효가 잘 진행되는 것을 확인하였다(도 3 참조).
실험예 2: 액체크로마토그래피를 이용한 추출물의 함량 분석
상기 비교예 1과 실시예 2에서 제조한 복분자 추출물 및 복분자 홍국균 발효물에 함유된 페놀산 및 ellagic acid, monacolin K의 함량을 측정하기 위해, 고성능액체크로마토그래피(High Performance Liquid Chromatography, HPLC, Waters)를 이용하였다.
구체적으로는, 상기 비교예 1과 실시예 2를 고형분 약 1%가 되게 메탄올에 용해하여 0.45 ㎛ filter로 여과한 것을 분석 시 사용하였다. 표준액으로는 protocatecuic acid를 메탄올에 1000 ppm 농도로 용해한 표준원액들을 동량 섞어 2, 10, 30배 희석한 검액을 제조하여 검량선용 표준용액으로 사용하여 검량선을 작성하였다. 그 외에 분석조건은 다음 표 1에 나타내었으며 그 결과는 하기 표 4에 나타내었다.
기기 HPLC-PDA
이동상 Solvent A 0.1% formic acid(in water)
Solvent B acetonitrile
유속 0.5 ml/min
Gradient 조건 시간(min) Solvent A Solvent B
0 90% 10%
5 90% 10%
35 90% 50%
40 90% 10%
45 90% 10%
컬럼 CapCell Pak C18 (250 mm x 4.6 mm, 5 ㎛)
파장 306 nm
시료주입량 5 ㎕
분석시간 45 min
온도 30℃
또한, 상기 비교예 1과 실시예 2를 2 g을 추출플라스크에 넣고 전처리 용매(EtOH : D.W.: HCl = 60 : 20 : 20) 25 ml에 녹인 후 90℃에서 2시간 환류냉각 추출하여 가수분해 시킨 다음 추출액을 모두 회수하여 액량을 100 ml로 맞춘 후(메탄올 사용) 0.45 ㎛ syringe filter 여과한 것을 분석시 사용하였다. 표준액으로는 ellagic acid 표준품(sigma)을 100 ppm 농도로 메탄올에 용해한 것을 표준원액으로 하며 이 표준원액을 메탄올로 50, 25, 5 ppm이 되게 희석한 검액을 제조하여 검량선용 표준용액으로 사용하여 검량선을 작성하였다. 그 외에 분석조건은 다음 표 2에 나타내었으며 그 결과는 하기 표 4에 나타내었다.
기기 HPLC-PDA
이동상 Solvent A 0.05% 인산
Solvent B 100% 메탄올
유속 1.0 ml/min
온도 32℃
파장 230 nm
컬럼 Phenomenex Luna C18(2)(250 mm x 4.6 mm, 5 ㎛)
시료주입량 20 ㎕
분석시간 25분



Gradient 조건


시간(min) Solvent A Solvent B
0 80% 20%
5 60% 40%
10 0% 100%
15 60% 40%
20 60% 20%
25 80% 20%
또한, 상기 비교예 1과 실시예 2를 75% 에탄올에 용해한 것을 0.45 ㎛ filter로 여과한 분석 시 사용하였다. 비활성형 monacolin K 표준품(Sigma, mevinolin from Aspergillus sp., 순도 99.85%)을 100 ㎍/ml 농도로 75% 에탄올에 용해한 것을 표준용액으로 사용하였고, 활성형 monacolin K는 표준품을 100 ㎍/ml 농도로 75% 에탄올에 용해 후 2 ml를 conical tube에 넣고 0.05 N NaOH 0.5 ml를 넣어 혼합 후 실온에서 최소 30분 방치하여 표준용액으로 사용하였다. 그 외에 분석조건은 다음 표 3에 나타내었으며 그 결과는 하기 표 4에 나타내었다.
분석기기 HPLC-UV(또는 PDA)
파장 238 nm
컬럼 YMC-Pack ODS-A(4.6*150 mm, 5 ㎛)
이동상 A - 0.1% 인산, B ACN
A : B = 35 : 65
유속 0.5 ml/min
주입량 10 ㎕
컬럼온도 30℃
분석시간 20 분
샘플 Protocatecuic acid (%) Ellagic acid (%) Monacolin K (mg/kg)
복분자농축액 0.16 0.40 -
복분자 홍국균 발효액 0.13 0.35 555.06
그 결과, 상기 표 4에서 나타나는 바와 같이, protocatecuic acid 및 ellagic acid의 함량이 홍국균을 발효한 것과 발효하지 않은 것의 차이가 거의 없음을 확인하였으며, 또한, 홍국균을 발효한 발효액에서 발효하지 않은 복분자 농축애서는 없었던 monacolin K가 생성되는 것을 확인하였다.
실험예 3: 갱년기 여성 건강 기능성 in vitro 효능 평가
상기 비교예 1 및 실시예 2에서 제조한 복분자 추출물 및 복분자 홍국균 발효물에 대해 갱년기 여성 건강 기능성 in vitro 효능 평가 중 하나인 인간 유방조직 유래 세포주인 MCF-7 세포에서 에스트로겐 수용체(Estrogen Receptor; ER) 및 프로게스테론 수용체 (Progesterone Receptor; PR)의 발현을 조사하여 여성호르몬의 활성을 가지는 원료를 탐색하였으며 양성대조군으로 에스트로겐 중 폐경기 이전의 여성에게 가장 많으면서 강력한 에스트로겐인 17 β-estradiol(E2)을 사용하여 이 실험법을 구축하였다. 사용기기 및 시약은 아래와 같다.
RNA 정량: Qubitⓡ fluoremeter with RNA BR Assay kit (Invitrogen, USA)
cDNA 합성: High Capacity RNA-to-cDNA kit (Applied Biosystems, USA)
-Real-Time PCR: 7500 Fast with Power SYBR Green PCR master mix (Applied Biosystems, USA)
실험 방법은 6-well plate에 human MCF-7 cell을 접종하여 24시간 배양한 뒤, 배양된 세포의 배지를 phenol red free (10% Charcoal Stripped FBS) DMEM 배지로 교체하고 시료를 농도별로 처리하여 24시간 배양하였다. 배양 후 세포를 TRIzol로 모아 제조사의 방법에 따라 RNA를 분리한 후, 분리된 RNA를 정량한 뒤 1 ㎍의 RNA로 cDNA를 합성하여 Real-Time PCR을 실시한 결과, 홍국균 복분자 발효 후, PR mRNA의 발현을 증가시키는 것으로 확인되었다. 결과는 도 4에 나타내었다.

Claims (8)

  1. 복분자의 홍국균 발효산물을 유효성분으로 포함하는 여성 갱년기 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 홍국균 발효산물은 프로토카테츄산(protocatechuic acid), 엘라그산(ellagic acid) 및 모나콜린케이(monacolin K)를 포함하는 것을 특징으로 하는 여성 갱년기 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 홍국균 발효산물은 여성 갱년기 질환의 예방 또는 치료 효과가 있는 것을 특징으로 하는 여성 갱년기 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 홍국균 발효산물은 약학 조성물 총 중량 대비 10 내지 90 중량% 함유하는 것을 특징으로 하는 여성 갱년기 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 여성 갱년기 질환은 안면홍조, 발한, 피부건조, 질건조증, 질위축, 하부 요도 위축, 질염, 방광염, 배뇨통, 급뇨, 집중장애, 단기 기억장애, 불안, 신경과민, 기억력 감퇴, 근육통, 관절통 또는 골다공증인 것을 특징으로 하는 여성 갱년기 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  6. 복분자 홍국균 발효산물을 유효성분으로 포함하는 여성 갱년기 질환 개선용 건강기능식품.
  7. 삭제
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