KR102519591B1 - 락토바실러스 및 비타민 배양물을 유효성분으로 함유하는 피부장벽 강화용 화장료 조성물 - Google Patents

락토바실러스 및 비타민 배양물을 유효성분으로 함유하는 피부장벽 강화용 화장료 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 락토바실러스 및 비타민 배양물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로서, 구체적으로는 양배추에서 분리된 균주인 락토바실러스 플란타룸 Wikim 126(기탁번호:KFCC11872P)을 비타민 C, 비오틴(Biotin), 판토텐산(Pantothenic Acid)을 함유한 배지에서 배양하여 제조되는 배양물을 유효성분으로 함유하여 피부 보습, 피부 장벽강화 및 피부 진정활성이 우수한 화장료 조성물에 관한 것이다.

Description

락토바실러스 및 비타민 배양물을 유효성분으로 함유하는 피부장벽 강화용 화장료 조성물{Cosmetic composition for enhancing skin barrier containing culture of the Lactobacillus}
본 발명은 락토바실러스 및 비타민 배양물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로서, 구체적으로는 양배추에서 분리된 균주인 락토바실러스 플란타룸 Wikim 126(기탁번호:KFCC11872P)을 비타민 C, 비오틴(Biotin), 판토텐산(Pantothenic Acid)을 함유한 배지에서 배양하여 피부 보습, 피부 장벽강화 및 피부 진정활성이 우수한 배양물을 제조하고 이를 화장료로 이용하는 기술에 관한 것이다.
각종 외부 오염물질로부터 일차적으로 인체를 보호하는 기관인 피부는 여러 층으로 구성되어 있다. 피부 표피 최외층을 덮고 있는 각질층은 각질층세포와 그 틈새를 채우는 세포간지질로 장벽구조를 이루고 있으며 피부장벽층은 세균, 미세먼지, 자외선 등 외부물질에 의해 쉽게 약화되며 피부장벽의 약화는 피부의 수분손실 및 탄력저하로 인한 노화를 야기한다.
보호기능의 핵심역할을 하는 장벽층을 강화하기 위해 최근 유산균을 활용한 다양한 소재들이 개발되고 있으며, 유산균을 활용한 화장품 관련 연구결과로는 아토피 피부염 완화, 보습증가, 미백 및 주름개선 효과에 관한 연구결과가 보고되고 있다.
유산균은 프로바이오틱스로서 인체에 유용한 건강 증진 효능을 주는 대표 미생물이며, 유산균은 Lactobacillus, Streptococcus, Enterococcus, Pediococcus 속 등의 혐기성 균이 해당되고, 주로 동물의 장이나 여성의 질에 서식하여 동물유래 유산균에 관한 연구결과들이 대부분이다.
또한, 유산균 중 일부는 γ-아미노부티르산(γ-aminobutyric acid, GABA)를 생성하며 GABA는 피부세포의 증식을 도모하여 상처치유 및 항염증에 효과가 있으나, 유산균으로부터의 생산량이 낮아 산업용도로서의 활용은 제한적인 실정이다.
본 발명자들은 발효 양배추에서 분리된 균주로서 피부 보습 증진, 염증완화 등 피부 상태 개선에 우수한 효과를 나타내는 락토바실러스 플란타룸 Wikim 126을 활용한 화장료를 개발하기 위하여 다양한 연구를 수행하였다. 그 결과, 배양배지에 비타민 C, 비오틴(Biotin), 판토텐산(Pantothenic Acid)을 첨가하여 배양하는 경우에 GABA의 함량이 증진되고, 우수한 피부 보습, 피부 장벽강화, 피부 진정효과를 나타내는 배양물을 얻을 수 있다는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
(0001)대한민국 공개특허 제10-2016-0035454호(2016.03.31) (0002)대한민국 공개특허 제10-2022-0148723호(2022.11.07) (0003)대한민국 등록특허 제10-2313769호(2021.10.12)
본 발명은 락토바실러스 및 비타민 배양물을 유효성분으로 함유하여 우수한 피부보습, 피부장벽강화, 피부진정효과를 나타내는 화장료 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 락토바실러스 플란타룸 Wikim 126(기탁번호:KFCC11872P)의 배양물을 제조하는 방법을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명에 따르면, 비타민 C, 비오틴(Biotin), 판토텐산(Pantothenic Acid)을 함유한 배지에서 배양한 락토바실러스 플란타룸 Wikim 126(기탁번호 : KFCC11872P)의 배양물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물이 제공된다.
바람직하게는 상기 배지는 펩톤 1~2중량%, 효모 추출물 1~2중량%, 글루코스(glucose) 1~2중량%, L-글루타믹산 5~10 중량%와 비타민 C, 비오틴(Biotin) 및 판토텐산(Pantothenic Acid) 혼합물 0.01~0.05중량%를 포함하여 이루어지는 것임을 특징으로 한다.
더욱 바람직하게는, 상기 배지는 나트륨 아세테이트 트리하이드레이트(Sodium acetate trihydrate), 제2인산칼륨(dipotassium hydrogen phosphate), 트리암모늄 시트레이트(triammonium citrate), 황산마그네슘(magnesium sulfate) 및 황산 망간(manganese sulfate)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 미네랄을 더욱 포함하여 이루어지는 것임을 특징으로 한다. 이때, 상기 미네랄은 각각 0.02~0.2중량% 함유될 수 있다.
상기 배양배지에 함유되는 상기 비타민 C, 비오틴(Biotin) 및 판토텐산(Pantothenic Acid) 혼합물은 상기 비타민 C, 비오틴(Biotin) 및 판토텐산(Pantothenic Acid)이 각각 1~2:1~2:1~2의 중량비율로 혼합되어 이루어진다.
유효성분으로서의 상기 락토바실러스 플란타룸 Wikim 126(기탁번호:KFCC11872P)의 배양물은 조성물 전체 중량에 대하여 0.02~20 중량% 함유된다.
상기 화장료 조성물은 피부 보습용, 피부 장벽강화용 또는 피부 진정용임을 특징으로 한다.
상기 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명에 따르면,
(A)펩톤 1~2중량%, 효모 추출물 1~2중량%, 글루코스(glucose) 1~2중량%, L-글루타믹산 5~10중량%에 정제수를 가하여 배지를 제조하는 단계;
(B)상기 배지에 비타민 C, 비오틴(Biotin) 및 판토텐산(Pantothenic Acid)을 각각 1~2:1~2:1~2의 중량비로 혼합하여 0.01~0.05중량%를 추가하는 단계;
(C)상기 배지에 락토바실러스 플란타룸 Wikim 126(기탁번호:KFCC11872P)을 접종하고, 25~38℃의 온도에서 5~7일 동안 배양하는 단계; 및
(D)실활 시킨 후 여과하고 농축하는 단계를 포함하는 락토바실러스 플란타룸 Wikim 126(기탁번호:KFCC11872P) 배양물의 제조방법이 제공된다.
더욱 바람직하게는, 상기 (A)단계에서 배지에 나트륨 아세테이트 트리하이드레이트(Sodium acetate trihydrate), 제2인산칼륨(dipotassium hydrogen phosphate), 트리암모늄 시트레이트(triammonium citrate), 황산마그네슘(magnesium sulfate) 및 황산 망간(manganese sulfate)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 추가하여 배양한다.
본 발명의 제조방법에 의하여 제조되는 락토바실러스 플란타룸 Wikim 126(기탁번호:KFCC11872P)의 배양물은 높은 GABA함량을 나타내며, 우수한 피부보습, 피부장벽강화, 피부진정효과를 나타내므로 피부 개선용 화장료로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 실시예에 따른 배양물의 Hyaluronic acid 생성촉진효과를 나타내는 그래프이다.
도 2는 본 발명의 실시예에 따른 배양물의 iNOS 발현 억제효과를 나타내는 그래프이다.
도 3은 본 발명의 실시예에 따른 배양물의 TEER 저항값변화를 나타내는 그래프이다.
이하 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명에 따르면, 비타민 C, 비오틴(Biotin), 판토텐산(Pantothenic Acid)을 함유한 배지에서 배양한 락토바실러스 플란타룸 Wikim 126(기탁번호 : KFCC11872P)의 배양물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물이 제공된다.
락토바실러스 플란타룸(Lactobacilus plantarum)은 화장품에 자주 이용되는 대표 유산균으로 발효하는 동안 젖산을 비롯한 다수의 유기산들을 생성하고, 박테리오신(bacteriocin)과 같은 항균물질, 항산화 물질 등을 생성하여 피부 내 보습 증진, 염증완화 기능을 나타낸다.
대부분의 락토바실러스 플란타룸(Lactobacilus plantarum)은 동물의 장내에 서식하는 것으로 알려져 있으나, 최근 김치에서도 분리되어 식물성 유산균으로 이용되기도 한다. 또한 락토바실러스 플란타룸(Lactobacilus plantarum)은 γ-amino butyric acid(GABA)를 생성하는 것으로 알려져 있다. 이에 따라 식품, 화장품에 적용되나, 그 수율이 낮아 산업적으로의 활용은 어려운 것으로 알려져 있다.
γ-amino butyric acid(GABA)는 아미노산의 일종이나 알파 아미노산은 아니며, 세계적인 식품 소재로 다양하게 이용되며 보통 동물과 식물 등 자연계에 존재하고, 미생물 생육 시 glutamic acid가 glutamate decarboxylase에 탈탄산 반응을 통해 GABA가 생성된다. GABA는 신경 억제, 정신 안정 등의 기능을 하며 항염, 항산화 기능도 우수한 것으로 알려져 있다.
본 발명에서는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacilus plantarum) 중에서, 발효 양배추인 사우어크라우트에서 분리된 락토바실러스 플란타룸 Wikim 126(기탁번호 : KFCC11872P)을 이용하여, GABA 함량이 증진된 배양물을 제조하였다.
한편, 일부 비타민들은 지방산 합성, 신진대사 증진, 세포 수송체 경로 조절 및 탄수화물, 아미노산 등의 영양물질 수송 증가 등의 기능을 하며, 박테리아 증식에도 효과를 나타낼 수 있다.
Vitamin C는 뛰어난 항산화 활성으로 자외선으로부터 피부보호 및 염증반응 완화, 미백활성 등의 효능을 가지고 있으며 지방산을 합성하고 Biotin 대사에 관여한다. Biotin은 지방산 합성에 관여하는 아세틸-CoA 카복실화효소의 보조효소로서 피부 진정 및 보호활성을 가지며, 부족 시 피부 건조 및 발진, 피부염을 유발하기도 한다. 판토텐산(Pantothenic acid)은 비오틴 합성, 지방산 합성 및 피부 점막 기능에 관여하므로, 피부 보습 및 진정을 목적으로 하는 의약품, 화장품에 자주 사용되는 소재이며, 체내 비오틴 양 증가 시 판토텐산의 합성량은 감소하는 것으로 알려져 있다.
본 발명의 유효성분으로서의 락토바실러스 플란타룸 Wikim 126(기탁번호 : KFCC11872P) 배양물의 제조시, 그 배양배지에 상기 비타민 C, 비오틴(Biotin), 판토텐산(Pantothenic Acid)을 일정비율로 첨가하여 배양하는 경우에 배양물 내의 GABA 함량이 증진되며, 피부보습, 피부장벽강화 및 피부 염증완화 및 진정활성이 우수한 배양물을 얻을 수 있다.
바람직하게는 상기 배지는 펩톤 1~2중량%, 효모 추출물 1~2중량%, 글루코스(glucose) 1~2중량%, L-글루타믹산 5~10 중량%와 비타민 C, 비오틴(Biotin) 및 판토텐산(Pantothenic Acid) 혼합물 0.01~0.05중량%를 포함하여 이루어진다.
더욱 바람직하게는, 상기 배지는 나트륨 아세테이트 트리하이드레이트(Sodium acetate trihydrate), 제2인산칼륨(dipotassium hydrogen phosphate), 트리암모늄 시트레이트(triammonium citrate), 황산마그네슘(magnesium sulfate) 및 황산 망간(manganese sulfate)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 미네랄을 더욱 포함하여 이루어진다. 이때, 상기 미네랄은 각각 0.02~0.2 중량% 함유될 수 있다.
상기 배지에 함유되는 비타민 C, 비오틴(Biotin) 및 판토텐산(Pantothenic Acid) 혼합물은 상기 비타민 C, 비오틴(Biotin) 및 판토텐산(Pantothenic Acid)이 각각 1~2:1~2:1~2의 중량비율로 혼합되어 이루어지며, 더욱 바람직하게는 각각 2:1:1의 중량비율로 함유된다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 락토바실러스 플란타룸 Wikim 126(기탁번호 : KFCC11872P) 배양물은 다음과 같은 방법으로 제조된다.
(A)펩톤 1~2중량%, 효모 추출물 1~2중량%, 글루코스(glucose) 1~2중량%, L-글루타믹산 5 ~10중량%에 정제수를 가하여 배지를 제조하는 단계;
(B)상기 배지에 비타민 C, 비오틴(Biotin) 및 판토텐산(Pantothenic Acid)을 각각 1~2:1~2:1~2의 중량비로 혼합하여 0.01~0.05중량%를 추가하는 단계;
(C)상기 배지에 락토바실러스 플란타룸 Wikim 126(기탁번호:KFCC11872P)을 접종하고 25~38℃의 온도에서 5~7일 동안 배양하는 단계; 및
(D)실활 시킨 후 여과하고 농축하는 단계를 포함하여 제조된다.
이때, 더욱 바람직하게는, (A)단계에서 상기 배지에 나트륨 아세테이트 트리하이드레이트(Sodium acetate trihydrate), 제2인산칼륨(dipotassium hydrogen phosphate), 트리암모늄 시트레이트(triammonium citrate), 황산마그네슘(magnesium sulfate) 및 황산 망간(manganese sulfate)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 미네랄을 추가하여 배양한다.
이와 같이 제조되는 유효성분으로서의 상기 배양물은 우수한 피부보습, 피부장벽강화, 피부진정효과를 나타내었다. 상기 배양물은 화장료 조성물 전체 중량에 대하여 0.02~20 중량% 함유된다. 상기 배양물은 물, 부틸알코올, 글리세린, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 등을 단독으로 사용하거나 2종 이상 혼합하여 희석된 형태로 사용될 수 있다.
상기 화장료 조성물은 피부 보습용, 피부 장벽강화용 또는 피부 진정용으로 사용될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 상기 배양물에 추가로 지방 물질, 계면활성제, 보존제, 비타민, 습윤화제, 물, 유화제, 필수 오일 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품학 또는 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 그리고 상기의 성분들은 피부 과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형은 제한되지는 않으나 일반적인 유화 제형 및 가용화 제형의 형태로 제조할 수 있다. 유화 제형의 화장품으로는 로션, 크림, 에센스, 세럼 등이 있으며, 가용화 제형의 화장품으로는 토닉, 팩, 스킨, 저점도 겔 등이 있다.
[실시예]
이하, 본 발명을 하기 실시예 및 시험예에 의거하여 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명은 하기 실시예에 의해 한정되는 것이 아니다.
실시예 1: 락토바실러스 플란타룸 Wikim 126 배양물의 제조
펩톤 1.5 중량%, 효모 추출물 1 중량%, glucose 2 중량%, L-글루타믹산 5 중량%, Sodium acetate trihydrate 0.2 중량%, dipotassium hydrogen phosphate 0.2 중량%, triammonium citrate 0.2 중량%, magnesium sulfate 0.02 중량%, manganese sulfate 0.02 중량% 및 정제수를 혼합하여 배지를 제조하였다. Vitamin C, Biotin 및 Pantothenic Acid를 동일중량비율로 혼합한 혼합물 0.04중량%를 상기 배지에 추가하여 총 500g의 배지를 제조하였다.
상기 배지에 락토바실러스 플란타룸 Wikim 126(기탁번호:KFCC11872P)을 접종하고, 37℃의 온도에서 5일 동안 배양하였다. 이후 121℃에서 20분간 실활시킨 다음, 여과하고 농축하여 배양물을 제조하였다.
실시예 2~8: 락토바실러스 플란타룸 Wikim 126 배양물의 제조
상기 실시예 1에서 Vitamin C, Biotin 및 Pantothenic Acid 혼합물의 혼합비와, 락토바실러스 플란타룸 Wikim 126(기탁번호:KFCC11872P)의 배양온도 조건을 하기 표 1과 같이 달리하여 배양물을 각각 제조하였다.
구분 혼합비 배양온도
실시예 2 1:1:1 25℃
실시예 3 2:1:1 37℃
실시예 4 2:1:1 25℃
실시예 5 1:2:1 37℃
실시예 6 1:2:1 25℃
실시예 7 1:1:2 37℃
실시예 8 1:1:2 25℃
비교예 1: 락토바실러스 플란타룸 Wikim 126 배양물 제조
펩톤 1.5 중량%, 효모 추출물 1 중량%, glucose 2 중량%, L-글루타믹산 5 중량%, Sodium acetate trihydrate 0.2 중량%, dipotassium hydrogen phosphate 0.2 중량%, triammonium citrate 0.2 중량%, magnesium sulfate 0.02 중량%, manganese sulfate 0.02 중량% 및 정제수를 혼합하여 배지 500g을 제조하였다.
상기 배지에 락토바실러스 플란타룸 Wikim 126(기탁번호:KFCC11872P)을 접종하고, 37℃의 온도에서 5일 동안 배양하였다. 이후 121℃에서 20분간 실활시킨 다음, 여과하고 농축하여 배양물을 제조하였다.
비교예 2: 락토바실러스 플란타룸 Wikim 126 배양물 제조
펩톤 1.5 중량%, 효모 추출물 1 중량%, glucose 2 중량%, L-글루타믹산 5 중량%, Sodium acetate trihydrate 0.2 중량%, dipotassium hydrogen phosphate 0.2 중량%, triammonium citrate 0.2 중량%, magnesium sulfate 0.02 중량%, manganese sulfate 0.02 중량% 및 정제수를 혼합하여 배지 500g을 제조하였다.
상기 배지에 락토바실러스 플란타룸 Wikim 126(기탁번호:KFCC11872P)을 접종하고, 25℃의 온도에서 5일 동안 배양하였다. 이후 121℃에서 20분간 실활시킨 다음, 여과하고 농축하여 배양물을 제조하였다.
시험예 1: 유산균 수 확인 시험
상기 실시예 및 비교예의 배양액 1g을 최종 104 CFU/g 이 되도록 0.85% NaCl에 희석하고 이를 고체 MRS 배지에 도말하여 균 수를 측정하였다. 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.
구분 CFU/g
실시예 1 1.8Х106
실시예 2 2.7Х106
실시예 3 8.1Х108
실시예 4 4.5Х108
실시예 5 4.6Х107
실시예 6 2.2Х106
실시예 7 8.5Х107
실시예 8 6.2Х107
비교예 1 2.2Х105
비교예 2 1.6Х105
상기 표 2에서 확인되는 바와 같이 상기 실시예의 배양물에서 비교예의 배양물에 비하여 높은 유산균 수가 측정되었다. 또한, 평균적으로 37℃에서 발효되었을 때 더 높은 균 수를 나타내었으며 그 중 실시예 3의 비율에서 가장 높은 균 수를 나타내었다.
시험예 2: GABA 함량 분석
상기 상기 실시예 및 비교예의 시료에 대하여 GABA 함량을 분석하였다.
상기 시료를 원심분리 및 0.45㎛ 필터로 여과한 샘플 각 50 ㎕, 100 mM 붕산나트륨 150 ㎕, 메탄올 100 ㎕, 증류수 50 ㎕을 혼합하여 측정샘플을 제조하였다.
GABA(Sigma-aldrich, St. Louis, MO, USA)를 표준물질로 하여 HPLC를 수행하였다. 칼럼으로는 Agilent HC-C18(2)를 사용하였고, 358nm UV 검출기로 측정하였으며 이동상으로는 40mM sodium phosphate와 0.1% phosphoric acid를 사용하였다. 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
구분 GABA(%)
실시예 1 12.7
실시예 2 12.2
실시예 3 18.7
실시예 4 17.2
실시예 5 17.2
실시예 6 16.5
실시예 7 16.7
실시예 8 16.4
비교예 1 2.2
비교예 2 2.0
상기 표 3에서 확인되는 바와 같이 Vitamin C, Biotin 및 Pantothenic Acid 혼합물을 함유하는 배지에서 배양된 상기 실시예의 배양물에서 비교예의 배양물에 비하여 월등히 높은 GABA 함량을 나타내었으며, 그 중에서도 37℃에서 배양된 실시예 3의 경우 가장 높은 GABA 함량을 나타내었다.
시험예 3: Hyaluronic acid 생성 촉진 시험
상기 실시예 및 비교예의 배양물의 Hyaluronic acid 생성촉진효과를 평가하였다.
HaCaT 세포를 6 well plate에 1×104cells/well의 농도로 분주하여 배양한 후, FBS가 첨가되지 않은 배지로 교체하여 18시간 starvation 시키고, 24시간 동안 배양하였다. HaCaT 세포에 각 시료를 처리하고, 24시간 배양한 후 세포의 상층액을 걷어내어 HA-ELISA Kit(Echelon, USA)를 이용하여 hyaluronic acid 생성량을 측정하였으며, 양성대조군으로는 20 uM Zerumbone을 사용하였다. 그 결과를 도 1에 나타내었다.
hyaluronic acid 생성량을 측정한 결과, 비타민 혼합물이 포함되지 않은 배지에서 배양한 비교예에 비해 실시예의 배양물에서 더 높은 hyaluronic acid 생성량을 나타내었으며, 그 중에서도 Vitamin C, Biotin, Pantothenic Acid가 각각 2:1:1로 함유된 배지에서 배양되는 실시예 3과 실시예 4에서 보다 높은 생성량을 나타내었다.
시험예 4: NO 생성 억제 시험
Nitric oxide(NO)는 피부 내 단백질 속 아민과 결합하여 니트로사민을 생성하고 발암 및 염증을 일으킨다. 상기 실시예 1~8 및 비교예 1~2의 배양물의 NO 생성억제효과를 평가하였다.
HaCaT 세포를 96 well plate의 각 well에 1×105의 세포를 접종한 후, 18시간 동안 배양하였다. 그 후 LPS를 0.2 μg/ml 농도로 한 시간 처리하고, 이후 샘플 시료를 처리하여 16시간 동안 배양하였다. 생성된 NO의 양은 Griess 시약(1% sulfanilamide, 0.1% naphylethylenendiamine in 2.5% phosphoric acid)을 이용해 측정하였다.
세포 배양 상등액 100 μl와 Griess 시약 100 μl를 1:1로 혼합하여 96 well plate에서 15분간 반응시키고 Nano-Quant Plate™를 사용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하여 계산한 결과를 하기 표 4에 나타내었다.
Sample Concentration NO 생성율(%)
실시예 1 1 % 63.1
실시예 2 1 % 65.8
실시예 3 1 % 54.4
실시예 4 1 % 59.5
실시예 5 1 % 67.2
실시예 6 1 % 67.4
실시예 7 1 % 64.2
실시예 8 1 % 65.2
비교예 1 1 % 86.1
비교예 2 1 % 87.2
상기 표 4의 결과에서 보는 바와 같이 손상된 세포로부터 생성되는 nitrite를 측정한 결과, Vitamin C, Biotin, Pantothenic Acid가 각각 2:1:1로 함유된 배지에서 37℃에서 배양한 실시예 3의 배양물 시료에서 가장 낮은 NO 생성율을 나타내었다.
시험예 5: iNOS 발현 억제 효과
상기 실시예 1~8 및 비교예 1~2의 배양물을 통해 NO 생성을 유도하는 iNOS의 억제 효과를 확인하기 위하여 96 well plate의 각 well에 1×105의 HaCaT 세포를 접종한 후, 18시간 동안 배양하였다. 이후 각 well에 샘플 시료를 처리하고 14시간 배양한 다음, 배양된 세포의 mRNA를 추출 및 cDNA 합성, 전기영동을 통해 샘플의 iNOS 발현 억제 효과를 확인하였으며 그 결과를 도 2에 나타내었다.
세포의 손상과 염증반응에 관여하는 iNOS의 발현량을 확인한 결과, 비타민 혼합물이 포함되어 있지 않은 배지에서 배양한 비교예의 배양물에 비해 실시예의 배양물 시료에서 iNOS의 발현량이 억제됨을 확인하였고, 그 중에서도 실시예 3, 4에서 가장 높은 억제율을 나타내었다.
시험예 6 : 세포 장벽 강화효과
상기 실시예 1~8 및 비교예 1~2의 배양물이 피부 장벽에 미치는 영향을 확인하기 위하여 transepithelial electric resistance(TEER)를 측정하였다.
12-well plate 0.4 μm pore transparent PET membrane(Corning, USA)에, 5.0×104 으로 배양된 HaCaT을 접종하고 TNF-α(Tumor necrosis factor)를 사용하여 TEER 측정값이 100 ~ 120 ohmㆍcm2까지 도달하도록 배양한 뒤, 1ug/mL 의 상기 실시예 1~8 및 비교예 1~2의 배양물을 처리한 후, 0, 3, 6, 12, 24h 간격으로 TEER 값을 측정하였다. 이때 TEER 값은 ohm(Ω) × cm2로 표시하였다.
그 결과를 도 3에 나타내었다.
TEER은 막에 의한 전기저항을 나타태어 세포의 tight junction에 의해 형성된 저항 값을 통해 피부 장벽 개선 효과를 나타낸다.
상기 비교예의 배양물 시료에 비해 실시예의 시료에서 더 높은 저항 값을 나타내며, 그 중에서 실시예 3의 시료에서 가장 높은 저항 값을 나타내는 것을 알 수 있다.
제형 실시예 1 및 대조예 1: 세럼의 제조
상기 실시예 3과 비교예 1의 배양물을 포함하는 세럼을 하기 표 5의 조성 및 함량으로 통상의 방법에 따라 제조하였다.
성 분 함량(중량%)
제형 실시예 1 대조예 1
실시예 3 5.0 -
비교예 1 - 5.0
다이프로필렌글라이콜 5.0 5.0
세틸에칠헥사노에이트 10.0 10.0
글리세레스-26 12.0 12.0
솔비톨 4.0 4.0
부틸렌글라이콜 5.0 5.0
카보머 1.0 1.0
아보카도오일 2.0 2.0
콩오일 2.0 2.0
방부제, 향 미량 미량
정제수 잔량 잔량
시험예 7: 피부자극완화 평가
상기 제형 실시예 1 및 대조예 1의 세럼으로부터 자극완화 효과를 확인하기 위하여 자극성 홍반 피부를 가진 30세에서 50세의 여성 30명을 대상으로 시험하였다. 측정 방법은 인체피부시험대상자 팔의 전박부를 Mexameter® MX 18(Courage+Khazaka Electronic, Germany)을 이용하여 해당 부위에 Mexameter® MX 18을 접촉한 후 1초 이내에 센서를 통하여 홍반지수(eryhma Index, EI)를 측정하였다. 이후 제형 실시예 1 및 대조예 1의 세럼을 매일 2회 4주간 사용한 다음, 앞서 측정한 홍반지수와 비교하였다. 그 평균 값은 표 6에 나타내었다.
시료명 사용 전 홍반지수(EI) 사용 후 홍반지수(EI)
제형 실시예 1 14.7±2.5 1.3±8.6
대조예 1 15.6±7.2 13.6±2.5
상기 표 6의 결과에서 확인되는 바와 같이, 실시예 3의 배양물을 함유하는 세럼에서 높은 피부 자극완화 효과를 나타내었다.
시험예 8: 피부장벽개선 평가
피부 장벽개선 효과를 확인하기 위해, 각 10명씩 나누어 상기 제형 실시예 1 또는 대조예 1의 세럼을 하루 2회씩(아침 및 저녁) 4주간 도포하였다. 4주 후 장벽개선 정도를 경표피의 수분손실량을 측정하는 Delfin Vapo Meter SWL4255를 통해 평가하였으며, 그 결과를 표 7에 나타내었다.
구분 초기 평균(g/hm2) 4주 후 평균(g/hm2) 장벽 개선(%)
제형 실시예 1 12.4 7.25 41.5
대조예 1 13.5 13.3 1.4
상기 표 7에서 확인되는 바와 같이, 실시예 3의 배양물을 함유하는 제형 실시예 1 에서 높은 피부장벽개선 효과를 나타내었다.

Claims (10)

  1. 펩톤 1~2중량%, 효모 추출물 1~2중량%, 글루코스(glucose) 1~2중량%, L-글루타믹산 5~10 중량%와 비타민 C, 비오틴(Biotin) 및 판토텐산(Pantothenic Acid) 혼합물 0.01~0.05중량%를 포함하여 이루어지는 비타민 C, 비오틴(Biotin), 판토텐산(Pantothenic Acid) 함유 배지에서 배양한 락토바실러스 플란타룸 Wikim 126(기탁번호 : KFCC11872P)의 배양물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 배지는 나트륨 아세테이트 트리하이드레이트(Sodium acetate trihydrate), 제2인산칼륨(dipotassium hydrogen phosphate), 트리암모늄 시트레이트(triammonium citrate), 황산마그네슘(magnesium sulfate) 및 황산 망간(manganese sulfate)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 미네랄을 더욱 포함하여 이루어지는 것임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 배양배지에 함유되는 상기 비타민 C, 비오틴(Biotin) 및 판토텐산(Pantothenic Acid) 혼합물은 상기 비타민 C, 비오틴(Biotin) 및 판토텐산(Pantothenic Acid)이 각각 1~2:1~2:1~2의 중량비율로 혼합되어 이루어지는 것임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 유효성분으로서의 상기 락토바실러스 플란타룸 Wikim 126(기탁번호:KFCC11872P)의 배양물은 조성물 전체 중량에 대하여 0.02~20 중량% 함유되는 것임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 피부 보습용임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 피부 장벽강화용임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 피부 진정용임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
  9. (A)펩톤 1~2중량%, 효모 추출물 1~2중량%, 글루코스(glucose) 1~2중량%, L-글루타믹산 5 ~10중량%에 정제수를 가하여 배지를 제조하는 단계;
    (B)상기 배지에 비타민 C, 비오틴(Biotin) 및 판토텐산(Pantothenic Acid)을 각각 1~2:1~2:1~2의 중량비로 혼합하여 0.01~0.05중량%를 추가하는 단계;
    (C)상기 배지에 락토바실러스 플란타룸 Wikim 126(기탁번호:KFCC11872P)을 접종하고, 25~38℃의 온도에서 5~7일 동안 배양하는 단계; 및
    (D)실활 시킨 후 여과하고 농축하는 단계를 포함하는 락토바실러스 플란타룸 Wikim 126(기탁번호:KFCC11872P) 배양물의 제조방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 (A)단계에서 배지에 나트륨 아세테이트 트리하이드레이트(Sodium acetate trihydrate), 제2인산칼륨(dipotassium hydrogen phosphate), 트리암모늄 시트레이트(triammonium citrate), 황산마그네슘(magnesium sulfate) 및 황산 망간(manganese sulfate)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 추가하여 배양하는 것임을 특징으로 하는 락토바실러스 플란타룸 Wikim 126(기탁번호:KFCC11872P) 배양물의 제조방법.
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