KR102620811B1 - 홍국균으로 발효시킨 적색 병풀 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 홍국균으로 발효시킨 병풀에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 홍국균으로 발효시킨 적색 병풀이 갖는 항산화, 피부 미백, 피부 주름 개선, 세포 재생, 세포 독성 완화 또는 항염증 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따른 조성물은 화장품, 피부외용제, 식품 등 다양한 분야에서 활용이 가능하다.
Description
본 발명은 홍국균으로 발효시킨 병풀에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 홍국균으로 발효시킨 적색 병풀이 갖는 항산화, 피부 미백, 피부 주름 개선, 세포 재생, 세포 독성 완화 또는 항염증 용도에 관한 것이다.
사람의 피부는 노화되는 과정에서 다양한 물리ㆍ화학적인 변화가 발생하는데, 상기 노화로 인한 변화는 크게 내적인 노화(intrinsic aging)와 광노화(photo-aging)로 구분할 수 있다. 피부 노화를 야기시키는 원인으로는 자외선, 스트레스, 환경인자, 질병, 상처 등이 있으며, 나이 또한 피부 노화의 주요 원인으로 작용한다. 이런 상태가 지속될 경우, 체내에서는 자유라디칼(free radical)이 활성화되어 생체 내에 존재하는 항산화 방어막을 파괴하게 되고, 결국 세포 및 조직의 손상을 야기하게 된다.
특히, 주요 구성물질인 단백질의 산화는 피부의 결합 조직인 콜라겐(collagen), 히알루론산(hyaluronic acid), 엘라스틴(elastin), 프로테오글리칸(proteoglycan), 피브로넥틴(fibronectin) 등의 손상을 야기하여 피부 조직에 영향을 끼칠 뿐만 아니라 면역기능의 저하로 인한 건강의 악화 또는 질병의 유발, DNA 변이로 인한 돌연변이 등을 일으켜 신체 전반의 건강에 영향을 끼칠 수 있다.
따라서, 신체의 대사 과정 등의 내부 요인으로 인하여 발생하는 자유라디칼, 또는 자외선, 염증반응 등의 외부 요인으로 인하여 발생하는 자유라디칼을 소거하고, 손상된 세포는 빠르게 재생하여 증식시키는 과정은 매우 중요하다.
피부 노화로 인한 가장 대표적인 증상은 주름 및 색소 침착이다. 먼저, 주름은 피부 진피층 내 탄력을 유지시키는 콜라겐 및 엘라스틴의 합성이 감소하면서 발생하는 것으로, 피부 노화가 진행될수록 피부의 두께가 얇아지고 탄력이 감소하는 구조적인 변화를 야기한다. 피부의 탄력을 유지하는 과정에는 피부 진피 기질을 탄력적으로 유지시켜주는 콜라겐뿐만 아니라 상기 콜라겐을 엮어 단단하게 지지하는 역할을 하는 엘라스틴 또한 관여하고 있어, 이러한 단백질의 산화는 피부 노화로 인한 주름 생성의 주요 원인이 된다.
색소 침착은 피부 노화로 인해 발생하는 또다른 주요 증상으로, 피부색 및 색소 침착에 영향을 주는 다양한 색소들이 이 과정에 관여한다. 다양한 색소 중에서도 멜라닌(melanin)은 자외선을 흡수 또는 산란시켜 자외선으로부터 피부가 손상되는 것을 방지하는 역할을 한다고 알려져 있으나, 최근에 연령대별 노화 피부 세포 비율을 분석한 임상 연구 결과(J Invest Dermatol. 2022 Sep;142(9):2521-2523.e1.)를 통해 40대 후반부터 멜라닌세포의 노화가 진행되고, 노화된 멜라닌세포 수가 증가하면서 다른 피부 노화 관련 세포의 수도 함께 증가한다는 연구결과가 보고되면서, 멜라닌이 피부 노화로 인한 색소 침착의 중요한 요인임이 알려지게 되었다.
종래 통상적으로 사용되던 화학 물질 기반의 화장료 성분 중 피부 미백, 주름 개선 및 예방 등을 목적으로 사용되는 기능성 원료의 경우, 효과는 있으나 피부에 자극이 되거나 세포 독성을 유발하는 등 부작용이 발생한다는 단점이 있다. 따라서 세포 독성이 없는 천연 추출물을 기반으로 하여 피부 노화로 인해 나타나는 주름, 색소 침착 등의 증상을 완화하고, 피부 세포의 재생을 촉진하여 건강한 피부 상태를 지킬 수 있는, 피부 노화 방지 제품에 대한 요구가 증가하고 있다.
이러한 배경 하에, 본 발명자들은 인체에 안전한 천연 유래 물질을 주요 성분으로 한 다양한 식물 추출물의 제조 방법 및 조성물에 대하여 다각적인 연구를 수행하였으며, 기존에 효능ㆍ효과가 잘 알려진 병풀(Centella asiatica)의 항산화, 피부 미백, 피부 주름 개선, 세포 재생, 세포 독성 완화 또는 항염증 효과를 증진시키기 위한 방법을 찾아내기 위하여 노력하였다.
본 발명의 목적은, 홍국균으로 발효한 병풀을 포함하는 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 홍국균으로 발효한 병풀의 항산화, 피부 미백, 피부 주름 개선, 세포 재생, 세포 독성 완화 또는 항염증 용도를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 홍국균으로 발효한 병풀을 제공한다. 홍국균으로 발효한 병풀은 발효물이며, 적색을 띈다. 본 발명에 사용되는 용어 “적색 병풀”은 병풀(Centella Asiatica) 원물을 홍국균(Monascus)으로 발효시킨 것을 의미한다.
본 발명에 사용되는 용어 “원물”은 원료가 되는 물질로서, 발효 또는 추출과 같은 가공을 하기 이전의 원재료를 의미한다.
본 발명에 사용되는 용어 “발효”는 원물 또는 유기물을 세균, 효모 등과 같은 미생물 또는 미생물이 갖는 효소를 이용하여 분해 또는 변화시키는 과정을 의미한다. 예를 들어 액상발효 또는 고상발효일 수 있다.
상기 “병풀(Centella asiatica)”은 쌍떡잎식물 이판화군 산형화목 미나리과의 여러해살이풀로, 시카(CICA)라는 관용명으로 자주 쓰이는 식물이다. 인도, 동남아에서는 상처난 호랑이가 치유하기 위해 몸을 비비던 풀이라고 하여 호랑이풀이라고도 불렸으며, 한국을 포함한 일본, 중국, 인도, 마다가스카르 등에 다양하게 분포한다.
상기 “홍국균”은 반자낭균과(Hemiascomycetaceae)의 홍국균속(Monascaceae)에 속하는 균으로, 균사가 붉은색을 띠고 있기 때문에 홍국이라고 부른다. 오래 전부터 한국을 비롯한 중국, 홍콩, 일본, 대만 등에서 전통 식품에 이용해왔으며, 대표적으로 술, 야채, 육가공품 등에서의 착색 및 방부 목적으로 사용하였다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 발효에 사용되는 균은 모나스쿠스 속에 속하는 홍국균이라면 종류에 관계없이 사용할 수 있다. 본 발명에서 “홍국균”은 모나스쿠스 속으로서, 모나스쿠스 퍼퍼레우스(Monascus purpureus), 모나스쿠스 루버(Monascus ruber), 모나스쿠스 루버반 틱헴(Monascus rubervan Tieghem), 모나스쿠스 풀리기노서스 사토(Monascus fuliginosus Sato), 모나스쿠스 필로수스(Monascus pilosus), 모나스쿠스 퍼퓨렌스(Monascus purpurens), 모나스쿠스 필로수스 사토(Monascus pilosus Sato), 모나스쿠스 안카(Monascus anka), 모나스쿠스 바리케리(Monascus barykery) 및 모나스쿠스 알비두스 사토(Monascus albidus Sato) 중에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
본 발명에서, 상기 조성물의 원물인 병풀은 재배한 것, 채취한 것 또는 시판되는 것 등이 제한 없이 사용될 수 있다. 또한, 본 발명에서, 홍국균은 시판 중인 제품을 구매한 것 또는 배양한 것 등이 제한 없이 사용될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 병풀 발효물은 추가로 추출 과정을 거칠 수 있다.
본 발명에 사용되는 용어 “추출물”은 생약을 적절한 추출 용매로 추출하여 수득한 결과물을 의미하며, 여기에는 추출 처리 과정에 의해 수득되는 추출액, 추출액의 희석액 또는 농축액, 추출액을 건조하여 수득되는 건조물, 또는 이들을 정제하거나 분획하여 수득할 수 있는 정제물, 또는 분획물이 포함되는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 추출물은 당업계에 공지된 일반적인 추출 방법을 이용하여 제조할 수 있으며, 예를 들어 열탕 추출, 열수 추출, 냉침 추출, 환류 냉각 추출, 초음파 추출, 고온가압 추출 등의 방법을 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 추출물을 제조하기 위해 사용되는 추출 용매로는 물, 에탄올, 메탄올, 부탄올, 메틸프로판디올, 프로판디올, 부틸렌글리콜, 헥산다이올, 프로필렌글리콜, 클로로포름, 에틸아세테이트, 디클로로메탄, 헥산, 페트로레움에테르 및 디에틸에테르로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있고, 바람직하게는, 물, 예컨대 정제수가 추출 용매로 사용될 수 있다. 상기 추출 용매는 전체 추출물의 중량에 대해 0.01 내지 100배의 양으로 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 추출물에는 상술한 추출 용매에 의한 추출물뿐만 아니라, 통상적인 정제, 효소 처리 및 발효 과정을 거친 추출물도 포함될 수 있다. 예컨대, 이산화탄소에 의한 감압, 고온 또는 초음파를 이용한 추출, 자연 상태나 각종 미생물을 이용한 발효 산물에 의한 추출물 등, 추가적으로 실시할 수 있는 다양한 정제 및 추출 방법을 통해 얻어진 추출물 또한 본 발명의 추출물에 포함될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물의 제조 방법은 병풀을 홍국균으로 발효시키는 단계를 포함한다.
여기서, 상기 발효시키는 단계는 용매와 혼합하여 10℃ 내지 50℃의 온도에서 24시간 이상 동안 발효시키는 것일 수 있고, 예를 들어 20℃ 내지 30℃의 온도에서 24 내지 96 시간 동안 발효시키는 것일 수 있고, 예를 들어 24℃의 온도에서 72 시간 동안 발효시키는 것일 수 있다.
또한, 상기 제조 방법은 수득된 발효물을 여과한 후 건조시켜 조성물을 수득하는 단계를 더 포함할 수 있다.
또한, 상기 제조 방법은 수득된 발효물을 용매에 혼합하여 추출하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 병풀 및 홍국균은 0.1 내지 10 : 0.1 내지 10의 중량비로 혼합되는 것일 수 있으며, 바람직하게는 1:1의 중량비로 혼합되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 홍국균으로 발효된 적색 병풀을 포함하는 화장료 조성물이 제공된다.
또한, 본 발명의 또다른 구현예에 따르면, 홍국균으로 발효된 적색 병풀을 포함하는 피부외용제 조성물이 제공된다.
본 발명에 따른 화장료 조성물 또는 피부외용제의 유효성분으로서 포함되는 유효성분의 함량은 사용 목적, 사용 기간, 제형의 종류, 투여 경로, 대상체의 피부 상태 등 다양한 요인을 고려하여 적합하게 결정될 수 있다. 예를 들어, 상기 적색 병풀의 함량은 화장료 조성물 전체 중량을 기준으로 0.0001 내지 100 중량%, 예컨대 0.01 내지 5 중량%일 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 통상적으로 알려진 제조 방법을 이용하여, 일반적인 유화 제형 및 가용화 제형 등의 형태로 제조될 수 있다. 이때, 본 발명의 화장료 조성물은 패치류, 연고류, 피부접착용 겔류, 크림류, 팩류, 화장수류, 에센스류, 스프레이류, 마스크류, 파운데이션류, 메이크업베이스류, 세정제류, 수(W)형, 유(O)형, 실리콘(S)형, 수중유(O/W)형, 유중수(W/O)형, 실리콘중수(W/S)형, 수중실리콘(S/W)형, 고체상, 액상 등의 다양한 제형으로 제조될 수 있으며, 통상적으로 사용되는 화장료 제조 방법이 적용될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 효능 증진을 위해 상기 추출물 이외에 추가 성분을 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 추가 성분은 추출물의 효능을 상쇄시키거나 감소시키지 않는다면 제한이 없다. 선택적으로, 화장품 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제, 담체 등을 추가로 포함할 수 있다. 선택적으로, 화장품 기능을 부가하거나 증대시키기 위하여 전형적으로 사용되는 성분들이 또한 추가될 수 있다. 예를 들면, 안정화제, 유화제, 점증제, 보습제, 액정 막강화제, pH 조절제, 항균제, 수용성 고분자, 피막제, 금속 이온 봉쇄제, 아미노산, 유기 아민, 고분자 에멀션, pH 조정제, 피부 영양제, 산화 방지제, 산화 방지조제, 방부제, 향료 등에서 선택되는 하나 이상의 수성 첨가제; 및 유지류, 왁스류, 탄화 수소유, 고급 지방산유, 고급 알콜, 합성 에스테르유 및 실리콘유 등에서 선택되는 하나 이상의 유성 첨가제 등일 수 있다.
전술한 바와 같이, 본 발명에 따른 홍국균으로 발효한 적색 병풀은 항산화, 피부 미백, 피부 주름 개선, 세포 재생, 세포 독성 완화 또는 항염증 효과를 나타낼 수 있다. 따라서, 상기 적색 병풀을 포함하는 본 발명의 조성물은 항산화 또는 항노화용 피부외용제 조성물로 적용 가능하다.
본 발명에 따른 조성물은 자유라디칼 또는 활성산소를 감소시킴으로써 항산화 효능을 제공하며, 엘라스테이즈(elastase)의 활성을 감소시키거나 콜라겐의 생성을 촉진시킴으로써 주름의 개선 및 세포 재생 효과를 제공하고, 자외선에 의한 세포 독성을 완화하거나 염증성 사이토카인의 발현을 억제시킴으로써 세포 독성을 완화하거나 항염증 효능을 제공할 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 화장품학 또는 피부과학적으로 허용 가능한 매질 또는 기제를 함유하여 제형화될 수 있다. 이는 국소적용에 적합한 모든 제형으로서, 예를 들면, 용액, 겔, 고체, 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는 이온형(리포좀) 및 비이온형의 소낭 분산제의 형태로, 또는 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실 스틱의 형태로 제공될 수 있다. 또한 포말(foam)의 형태로 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태로도 사용될 수 있다.
바람직하게는, 상기 화장료는 유연 화장수, 수렴 화장수, 영양 화장수, 에센스, 팩, 패치, 크림, 피부접착용 겔, 파운데이션 또는 메이크업베이스로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나의 제형을 가지는 것일 수 있다.
또한 본 발명에 따른 조성물은 지방 물질, 유기용매, 용해제, 농축제, 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제, 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품학 또는 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 상기 보조제는 화장품학 또는 피부과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입된다.
본 발명의 또다른 구현예에 따르면, 홍국균으로 발효된 적색 병풀을 포함하는 식품 조성물이 제공된다.
상기 식품은 건강기능성 식품일 수 있다. 상기 "건강기능성 식품"이란, 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환제 등의 형태로 제조 및 가공한 식품을 의미한다. 여기서 "기능성" 이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻는 것으로 해석할 수 있다.
본 발명에 따른 식품 조성물은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조 가능하며, 상기 제조 시에는 당업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 식품 조성물은 천연 식물 추출물을 유효성분으로서 포함하므로, 장기 복용 시 일반적으로 발생할 수 있는 부작용 또는 내성이 없다. 따라서, 본 발명에 따른 식품 조성물은 단독으로 사용하는 것도 가능할 뿐만 아니라, 피부 상태 개선 효과를 극대화하기 위한 목적으로 본 발명에 따른 화장료 조성물, 약학 조성물, 의약외품 조성물, 및/또는 다른 조성물 또는 다른 요법과 동시에 또는 순차적으로 사용하는 것도 가능하다.
본 발명에 따른 식품 조성물에 유효성분으로서 포함되는 추출물의 함량은 사용 목적, 사용 기간, 대상체의 피부 상태 등에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
본 발명에 따른 식품 조성물은 효능 증진을 위해 유효성분 외에 추가 성분을 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 추가 성분은 본 발명에 따른 추출물의 효능을 상쇄시키거나 감소시키지 않는 한, 피부 상태 개선 효과를 나타내는 성분 또는 제제 등일 수 있다.
상기 식품 조성물은 환제, 정제, 과립, 분말, 캡슐, 액상 등의 제형일 수 있다. 또한, 상기 식품의 종류는 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 상기 추출물이 포함될 수 있는 식품은 육류, 소세지, 빵, 초콜렛, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림 류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료, 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함한다.
본 발명의 식품 조성물은 통상의 식품에 사용되는 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 수크로스와 같은 디사카라이드, 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜일 수 있다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제, 또는 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다.
본 발명에 대해서는 하기의 실시예와 본 명세서에 첨부된 도면에 기초하여 보다 상세하게 설명될 것이나, 이는 본 발명의 권리범위를 제한하려는 것이 아니다. 또한, 당업계에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 취지를 해하지 않는 범위 내에서 본 발명에 대해 다양한 변형 및 수정을 가할 수 있을 것이다.
본 발명에 따른 홍국균으로 발효한 적색 병풀은 항산화, 피부 미백, 피부 주름 개선, 세포 재생, 세포 독성 완화 또는 항염증 효과를 제공한다. 또한 다양한 원인으로부터 발생할 수 있는 피부 노화를 효과적으로 완화할 수 있다. 이와 같은 본 발명의 조성물은 피부 노화의 예방 또는 완화가 필요한 다양한 분야에 적용될 수 있으며, 화장품, 피부외용제, 식품 등에 다양하게 사용될 수 있다.
도 1은 홍국균으로 발효한 적색 병풀을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에 따른, 홍국균으로 발효한 병풀의 제조 공정을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에 따른, 홍국균으로 발효한 병풀의 제조 공정을 나타낸 것이다.
이하에서 본 발명의 이해를 돕기 위해 구체적인 예를 들어 설명하기로 한다. 다만, 하기의 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 이들 실시예가 본 발명을 한정하는 것으로 해석되어서는 안 되며, 본 발명의 범위 내에서 당업자의 통상적인 변화가 가능하다. 또한, 본 명세서에 기재된 용어, 기술 등은 특별한 한정이 없는 한, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 의미로 이해되어야 할 것이다.
실시예 1
세척하여 건조시킨 병풀 1 중량% 및 홍국균 1 중량%를 혼합하여 정제수 98 중량%에 넣고 24℃에서 72시간 동안 발효시켰다. 이후 발효된 적색 병풀을 채반으로 건져내고 드라이오븐(Dry oven, 한백과학, KR)을 이용하여 수분을 완전하게 제거한 후 ‘시료 1’이라 지칭하고 하기 시험에서 사용하였다.
실시예 2
세척하여 건조시킨 병풀 3 중량% 및 홍국균 1 중량%를 혼합하여 정제수 96 중량%에 넣고 24℃에서 72시간 동안 발효시켰다. 이후 발효된 적색 병풀을 채반으로 건져내고 드라이오븐(Dry oven, 한백과학, KR)을 이용하여 수분을 완전하게 제거한 후 ‘시료 2’라 지칭하고 하기 시험에서 사용하였다.
실시예 3
세척하여 건조시킨 병풀 5 중량% 및 홍국균 1 중량%를 혼합하여 정제수 94 중량%에 넣고 24℃에서 72시간 동안 발효시켰다. 이후 발효된 적색 병풀을 채반으로 건져내고 드라이오븐(Dry oven, 한백과학, KR)을 이용하여 수분을 완전하게 제거한 후 ‘시료 3’이라 지칭하고 하기 시험에서 사용하였다.
실시예 4
세척하여 건조시킨 병풀 10 중량% 및 홍국균 1 중량%를 혼합하여 정제수 89 중량%에 넣고 24℃에서 72시간 동안 발효시켰다. 이후 발효된 적색 병풀을 채반으로 건져내고 드라이오븐(Dry oven, 한백과학, KR)을 이용하여 수분을 완전하게 제거한 후 ‘시료 4’라 지칭하고 하기 시험에서 사용하였다.
실시예 5
세척하여 건조시킨 병풀 20 중량% 및 홍국균 1 중량%를 혼합하여 정제수 79 중량%에 넣고 24℃에서 72시간 동안 발효시켰다. 이후 발효된 적색 병풀을 채반으로 건져내고 드라이오븐(Dry oven, 한백과학, KR)을 이용하여 수분을 완전하게 제거한 후 ‘시료 5’라 지칭하고 하기 시험에서 사용하였다.
실시예 6
세척하여 건조시킨 병풀 50 중량% 및 홍국균 1 중량%를 혼합하여 정제수 49 중량%에 넣고 24℃에서 72시간 동안 발효시켰다. 이후 발효된 적색 병풀을 채반으로 건져내고 드라이오븐(Dry oven, 한백과학, KR)을 이용하여 수분을 완전하게 제거한 후 ‘시료 6’이라 지칭하고 하기 시험에서 사용하였다.
실시예 7
세척하여 건조시킨 병풀 80 중량% 및 홍국균 1 중량%를 혼합하여 정제수 19 중량%에 넣고 24℃에서 72시간 동안 발효시켰다. 이후 발효된 적색 병풀을 채반으로 건져내고 드라이오븐(Dry oven, 한백과학, KR)을 이용하여 수분을 완전하게 제거한 후 ‘시료 7’이라 지칭하고 하기 시험에서 사용하였다.
실시예 8
세척하여 건조시킨 병풀 100 중량%에, 홍국균을 담지한 정제수를 스프레이 건으로 골고루 분사한 후 24℃에서 72시간 동안 고상발효시켰다. 이후 발효된 병풀을 드라이오븐(Dry oven, 한백과학, KR)을 이용하여 수분을 완전하게 제거한 후 ‘시료 8’이라 지칭하고 하기 시험에서 사용하였다.
비교예 1
세척하여 건조시킨 병풀 1 중량% 및 락토바실러스(Lactobacillus)균 건조 1 중량%를 혼합하여 정제수 98 중량%에 넣고 발효시켰다. 이후 발효된 병풀을 채반으로 건져내고 드라이오븐(Dry oven, 한백과학, KR)을 이용하여 수분을 완전하게 제거한 후 ‘시료 9’라 지칭하고 하기 시험에서 사용하였다.
비교예 2
세척하여 건조시킨 병풀 3 중량% 및 락토바실러스(Lactobacillus)균 건조 1 중량%를 혼합하여 정제수 96 중량%에 넣고 발효시켰다. 이후 발효된 병풀을 채반으로 건져내고 드라이오븐(Dry oven, 한백과학, KR)을 이용하여 수분을 완전하게 제거한 후 ‘시료 10’이라 지칭하고 하기 시험에서 사용하였다.
비교예 3
세척하여 건조시킨 병풀 5 중량% 및 락토바실러스(Lactobacillus)균 건조 1 중량%를 혼합하여 정제수 94 중량%에 넣고 발효시켰다. 이후 발효된 병풀을 채반으로 건져내고 드라이오븐(Dry oven, 한백과학, KR)을 이용하여 수분을 완전하게 제거한 후 ‘시료 11’이라 지칭하고 하기 시험에서 사용하였다.
비교예 4
세척하여 건조시킨 병풀 10 중량% 및 락토바실러스(Lactobacillus)균 건조 1 중량%를 혼합하여 정제수 89 중량%에 넣고 발효시켰다. 이후 발효된 병풀을 채반으로 건져내고 드라이오븐(Dry oven, 한백과학, KR)을 이용하여 수분을 완전하게 제거한 후 ‘시료 12’라 지칭하고 하기 시험에서 사용하였다.
비교예 5
세척하여 건조시킨 병풀 1 중량% 및 사카로마이세스(Saccharomyces)균 건조 1 중량%를 혼합하여 정제수 98 중량%에 넣고 발효시켰다. 이후 발효된 병풀을 채반으로 건져내고 드라이오븐(Dry oven, 한백과학, KR)을 이용하여 수분을 완전하게 제거한 후 ‘시료 13’이라 지칭하고 하기 시험에서 사용하였다.
비교예 6
세척하여 건조시킨 병풀 3 중량% 및 사카로마이세스(Saccharomyces)균 건조 1 중량%를 혼합하여 정제수 96 중량%에 넣고 발효시켰다. 이후 발효된 적색 병풀을 채반으로 건져내고 드라이오븐(Dry oven, 한백과학, KR)을 이용하여 수분을 완전하게 제거한 후 ‘시료 14’라 지칭하고 하기 시험에서 사용하였다.
비교예 7
세척하여 건조시킨 병풀 5 중량% 및 사카로마이세스(Saccharomyces)균 건조 1 중량%를 혼합하여 정제수 94 중량%에 넣고 발효시켰다. 이후 발효된 병풀을 채반으로 건져내고 드라이오븐(Dry oven, 한백과학, KR)을 이용하여 수분을 완전하게 제거한 후 ‘시료 15’라 지칭하고 하기 시험에서 사용하였다.
비교예 8
세척하여 건조시킨 병풀 10 중량% 및 사카로마이세스(Saccharomyces)균 건조 1 중량%를 혼합하여 정제수 89 중량%에 넣고 발효시켰다. 이후 발효된 병풀을 채반으로 건져내고 드라이오븐(Dry oven, 한백과학, KR)을 이용하여 수분을 완전하게 제거한 후 ‘시료 16’이라 지칭하고 하기 시험에서 사용하였다.
비교예 9
세척하여 건조시킨 병풀 1 중량% 및 비피도(Bifidobacterium)균 건조 1 중량%를 혼합하여 정제수 98 중량%에 넣고 발효시켰다. 이후 발효된 병풀을 채반으로 건져내고 드라이오븐(Dry oven, 한백과학, KR)을 이용하여 수분을 완전하게 제거한 후 ‘시료 17’이라 지칭하고 하기 시험에서 사용하였다.
비교예 10
세척하여 건조시킨 병풀 3 중량% 및 비피도(Bifidobacterium)균 건조 1 중량%를 혼합하여 정제수 96 중량%에 넣고 발효시켰다. 이후 발효된 병풀을 채반으로 건져내고 드라이오븐(Dry oven, 한백과학, KR)을 이용하여 수분을 완전하게 제거한 후 ‘시료 18’이라 지칭하고 하기 시험에서 사용하였다.
비교예 11
세척하여 건조시킨 병풀 5 중량% 및 비피도(Bifidobacterium)균 건조 1 중량%를 혼합하여 정제수 94 중량%에 넣고 발효시켰다. 이후 발효된 병풀을 채반으로 건져내고 드라이오븐(Dry oven, 한백과학, KR)을 이용하여 수분을 완전하게 제거한 후 ‘시료 19’라 지칭하고 하기 시험에서 사용하였다.
비교예 12
세척하여 건조시킨 병풀 10 중량% 및 비피도(Bifidobacterium)균 건조 1 중량%를 혼합하여 정제수 89 중량%에 넣고 발효시켰다. 이후 발효된 병풀을 채반으로 건져내고 드라이오븐(Dry oven, 한백과학, KR)을 이용하여 수분을 완전하게 제거한 후 ‘시료 20’이라 지칭하고 하기 시험에서 사용하였다.
비교예 13
세척하여 건조시킨 병풀 1 중량% 및 흑국(Aspergillus)균 건조 1 중량%를 혼합하여 정제수 98 중량%에 넣고 발효시켰다. 이후 발효된 병풀을 채반으로 건져내고 드라이오븐(Dry oven, 한백과학, KR)을 이용하여 수분을 완전하게 제거한 후 ‘시료 21’이라 지칭하고 하기 시험에서 사용하였다.
비교예 14
세척하여 건조시킨 병풀 3 중량% 및 흑국(Aspergillus)균 건조 1 중량%를 혼합하여 정제수 96 중량%에 넣고 발효시켰다. 이후 발효된 병풀을 채반으로 건져내고 드라이오븐(Dry oven, 한백과학, KR)을 이용하여 수분을 완전하게 제거한 후 ‘시료 22’라 지칭하고 하기 시험에서 사용하였다.
비교예 15
세척하여 건조시킨 병풀 5 중량% 및 흑국(Aspergillus)균 건조 1 중량%를 혼합하여 정제수 94 중량%에 넣고 발효시켰다. 이후 발효된 병풀을 채반으로 건져내고 드라이오븐(Dry oven, 한백과학, KR)을 이용하여 수분을 완전하게 제거한 후 ‘시료 23’이라 지칭하고 하기 시험에서 사용하였다.
비교예 16
세척하여 건조시킨 병풀 10 중량% 및 흑국(Aspergillus)균 건조 1 중량%를 혼합하여 정제수 89 중량%에 넣고 발효시켰다. 이후 발효된 병풀을 채반으로 건져내고 드라이오븐(Dry oven, 한백과학, KR)을 이용하여 수분을 완전하게 제거한 후 ‘시료 24’라 지칭하고 하기 시험에서 사용하였다.
시험예 1: 항산화 효과
본 발명의 시험예 1에서는 상기 실시예의 적색 병풀을 포함한 조성물의 항산화 효과를 확인하기 위하여, 자유라디칼 소거 시험 및 활성산소 소거 시험을 실시하였다.
시험 전 실시예 및 비교예에서 제조된 각 병풀 시료를 5.0 중량%로 정제수와 혼합한 후 1시간 동안 추출하고, 상기 추출물을 0.45μm 필터로 여과한 후, 1/10로 희석하여 효능평가 시험에 사용하였다.
시험예 1-1. 자유라디칼 소거 시험
자유라디칼 소거 시험은 안정한 DPPH의 흡광도가 540nm에서 최대 흡광도를 나타내는 것을 이용한 시험으로, 보라색인 DPPH가 시료에 의해 소거되어 자유라디칼 소거율이 증가할수록 투명해지며, 그 결과 540nm 파장에서 흡광도가 줄어드는 것이 특징이다.
먼저 0.1 mM 2,2-diphenyl-1-picryl-hydrazyl radical (DPPH, Sigma) 용액 1mL에 상기 실시예 1의 시료를 메탄올에 적당한 농도로 희석시킨 1mL를 혼합하고, 37℃에서 15분간 방치 후 microplate reader (UVT-06685, Thermo max, USA)를 이용하여 흡광도(540nm)를 측정하였다. 병풀의 비율을 달리한 실시예 2 내지 8 또한 같은 방법을 이용하여 흡광도를 측정하였으며, 홍국균 대신 다른 균주를 이용한 비교예 1 내지 16 또한 같은 방법으로 측정하였다.
상기 자유라디칼 소거 시험에서 대조군은 DPPH 1mL와 메탄올 1mL를 넣어 같은 방법으로 측정하였으며, 메탄올 1mL와 시료 1mL를 넣어 시료와 대조군에 대한 각각의 색 보정값을 얻는 것으로 설정하였다.
자유라디칼 소거율의 계산은 하기 수학식 1을 이용하였으며, 결과는 하기 표 1에 나타내었다.
[수학식 1]
자유라디칼 소거율(%) = 100 - ((시료의 흡광도 / 대조군의 흡광도) * 100)
| 자유라디칼 소거율(%) | ||||||||||
| 실험군 | 대조군 | |||||||||
| 홍국 (Monascus)균 발효 |
락토바실러스 (Lactobacillus) 균 발효 |
사카로마이세스 (Saccharomyces) 균 발효 |
비피도 (Bifidobacterium) 균 발효 |
흑국 (Aspergillus) 균 발효 |
발효하지 않은 병풀 |
|||||
| 시료 1 | 95.8 | 시료 9 | 25.4 | 시료 13 | 32.4 | 시료 17 | 25.1 | 시료 21 | 36.6 | 29.6 |
| 시료 2 | 94.3 | 시료 10 | 33.2 | 시료 14 | 35.6 | 시료 18 | 26.9 | 시료 22 | 31.7 | |
| 시료 3 | 96.9 | 시료 11 | 19.4 | 시료 15 | 29.1 | 시료 19 | 22.7 | 시료 23 | 34.9 | |
| 시료 4 | 92.7 | 시료 12 | 24.8 | 시료 16 | 31.0 | 시료 20 | 29.3 | 시료 24 | 42.3 | |
| 시료 5 | 94.5 | |||||||||
| 시료 6 | 96.4 | |||||||||
| 시료 7 | 93.2 | |||||||||
| 시료 8 | 93.8 | |||||||||
시험예 1-2. 활성산소 소거 시험
활성산소 소거 시험은 잔틴/잔틴옥시데이즈(xanthine/xanthine oxidase, Sigma)의 효소 반응에 의한 활성산소 발생을 이용하여, 활성산소에 의하여 니트로블루 테트라졸리움(Nitroblue tetrazolium, NBT)이 산화되었을 때의 흡광도 변화를 측정하는 시험으로, 활성산소 소거능을 알 수 있는 것이 특징이다.
먼저 Na2CO3 2.4 mL, xanthine(Sigma) 0.1 mL, ethylenediamine tetraacetic acid(EDTA) 0.1 mL, bovine serum albumin(BSA, Sigma) 0.1 mL, NBT 0.1 mL 및 실시예 1의 시료 0.1 mL를 혼합한 후 voltex mixer (Type 37600 Mixer, Mini mix, USA)를 이용하여 voltexing하였다. 이후 25℃에서 10분간 방치하고 xanthine oxidase 0.1 mL를 넣고 25℃에서 20분간 반응시켰다. 이어서, 6 mM CuCl2를 넣어 반응을 정지시킨 후 microplate reader (UVT-06685, Thermo max, USA)를 이용하여 흡광도(540nm)를 측정하였다. 병풀의 비율을 달리한 실시예 2 내지 8 또한 같은 방법을 이용하여 흡광도를 측정하였으며, 홍국균 대신 다른 균주를 이용한 비교예 1 내지 16 또한 같은 방법으로 흡광도를 측정하였다.
상기 활성산소 소거 시험에서의 대조군은 시료 용액 대신 3차 증류수를 넣어 같은 방법으로 측정하였으며, xanthien oxidase 용액 대신 3차 증류수를 넣어 시료와 대조군에 대한 각각의 색 보정값을 얻는 것으로 설정하였다.
활성산소 소거율의 계산은 하기 수학식 2를 이용하였으며, 결과는 하기 표 2에 나타내었다.
[수학식 2]
활성산소 소거율(%) = 100 - ((시료의 흡광도 / 대조군의 흡광도) * 100)
| 활성산소 소거율(%) | ||||||||||
| 실험군 | 대조군 | |||||||||
| 홍국 (Monascus)균 발효 |
락토바실러스 (Lactobacillus) 균 발효 |
사카로마이세스 (Saccharomyces) 균 발효 |
비피도 (Bifidobacterium) 균 발효 |
흑국 (Aspergillus) 균 발효 |
발효하지 않은 병풀 |
|||||
| 시료 1 | 92.6 | 시료 9 | 20.1 | 시료 13 | 15.8 | 시료 17 | 25.1 | 시료 21 | 33.3 | 37.4 |
| 시료 2 | 91.8 | 시료 10 | 18.2 | 시료 14 | 21.7 | 시료 18 | 26.9 | 시료 22 | 35.9 | |
| 시료 3 | 94.2 | 시료 11 | 22.9 | 시료 15 | 18.0 | 시료 19 | 22.7 | 시료 23 | 37.8 | |
| 시료 4 | 91.8 | 시료 12 | 24.3 | 시료 16 | 19.4 | 시료 20 | 29.3 | 시료 24 | 39.1 | |
| 시료 5 | 92.5 | |||||||||
| 시료 6 | 94.3 | |||||||||
| 시료 7 | 90.7 | |||||||||
| 시료 8 | 94.2 | |||||||||
상기 표 1 및 표 2에 나타난 바와 같이, 홍국균으로 발효시킨 적색 병풀을 포함하는 조성물은 발효를 하지 않은 병풀 대비 현저하게 우수한 항산화능을 나타내었으며, 병풀의 함량에 상관없이 모든 비율에서 현저한 효과를 나타내었다. 또한, 타 균종으로 발효한 병풀과 비교하여도 현저한 자유라디칼 및 활성산소 소거율을 보임으로써, 우수한 항산화능을 입증하였다.
시험예 2: 피부 미백 효과
본 발명의 시험예 2에서는 상기 실시예의 적색 병풀을 포함한 조성물의 피부 미백 효과를 확인하기 위하여, 타이로시네이즈의 작용을 억제하는 정도를 측정하는 시험을 실시하였다.
타이로시네이즈(tyrosinase)는 생체 내에서 타이로신(tyrosine)의 산화 과정을 촉진하여 멜라닌이 생성되도록 도와주는 효소로, 멜라닌이 형성되어 피부 상층부로 이동하게 되면 피부가 검게 변하거나 기미, 주근깨 등이 생성된다.
시험 전 실시예 및 비교예에서 제조된 각 병풀 시료를 5.0 중량%로 에탄올(>95%, Daejung, KOR)과 혼합한 후 1시간 동안 추출하고, 상기 추출물을 0.45μm 필터로 여과한 후, Rotary evaporator를 이용하여 용매를 제거하고 시험에 영향이 없는 DMSO 1,000ppm으로 희석하여 효능평가 시험에 사용하였다.
먼저 실시예 1의 시료 0.9mL, 0.1 M 인산완충액(pH 6.8) 1.0 mL 및 1.5 mM L-타이로신 용액 1.0 mL를 혼합한 후 37℃에서 15분간 반응시켰다. 이후 머쉬룸타이로시네이즈(1,500 units/mL) 0.1mL를 첨가하여 37℃에서 10분간 반응시킨 후 UV-vis spectrophotometer (Smartspec Plus, Biorad, USA)를 사용하여 흡광도(475nm)를 측정하였다. 병풀의 비율을 달리한 실시예 2 내지 8 또한 같은 방법을 이용하여 흡광도를 측정하였으며, 홍국균 대신 다른 균주를 이용한 비교예 1 내지 16 또한 같은 방법으로 흡광도를 측정하였다.
상기 타이로시네이즈 활성 저해 시험에서의 대조군은 시료 용액 대신 완충 용액을 넣어 같은 방법으로 측정하였으며, 미백효과가 뛰어나다고 알려진 arbutin (Arbutin synthetic, Sigma)을 양성대조군으로 사용하였다. 그리고 타이로시네이즈 대신 완충 용액을 넣어 시료와 대조군에 대한 각각의 색 보정값을 얻는 것으로 설정하였다.
타이로시네이즈 활성 저해율의 계산은 하기 수학식 3을 이용하였으며, 결과는 하기 표 3에 나타내었다.
[수학식 3]
타이로시네이즈 저해율(%) = 100 - ((시료의 흡광도 / 대조군의 흡광도) * 100)
| 타이로시네이즈 저해율(%) | |||||||||||
| 실험군 | 대조군 | ||||||||||
| 홍국 (Monascus)균 발효 |
락토바실러스 (Lactobacillus) 균 발효 |
사카로마이세스 (Saccharomyces) 균 발효 |
비피도 (Bifidobacterium) 균 발효 |
흑국 (Aspergillus) 균 발효 |
발효하지 않은 병풀 |
Arbutin (1,000 ug/ml, PPM) | |||||
| 시료 1 | 79.3 | 시료 9 | 11.5 | 시료 13 | 13.4 | 시료 17 | 12.7 | 시료 21 | 23.4 | 12.1 | 78.4 |
| 시료 2 | 81.4 | 시료 10 | 12.3 | 시료 14 | 9.6 | 시료 18 | 10.3 | 시료 22 | 18.4 | ||
| 시료 3 | 79.9 | 시료 11 | 8.7 | 시료 15 | 12.7 | 시료 19 | 16.4 | 시료 23 | 21.6 | ||
| 시료 4 | 82.6 | 시료 12 | 13.2 | 시료 16 | 10.8 | 시료 20 | 15.6 | 시료 24 | 22.4 | ||
| 시료 5 | 80.3 | ||||||||||
| 시료 6 | 82.6 | ||||||||||
| 시료 7 | 81.7 | ||||||||||
| 시료 8 | 80.0 | ||||||||||
상기 표 3에 나타난 바와 같이, 홍국균으로 발효시킨 적색 병풀은 발효를 하지 않은 병풀 대비 현저하게 우수한 미백 효과를 나타내었으며, 병풀의 함량에 상관없이 모든 비율에서 현저한 효과를 나타내었다. 또한, 타 균종으로 발효한 병풀과 비교하여도 현저한 타이로시네이즈 활성 저해율을 보였으며, 양성대조군으로 사용한 Arbutin에 비해서도 더 높은 타이로시네이즈 활성 저해율을 보임으로써, 우수한 미백 효과를 입증하였다.
시험예 3: 피부 주름 개선 효과
본 발명의 시험예 3에서는 상기 실시예의 적색 병풀을 포함한 조성물의 피부 주름 개선 효과를 확인하기 위하여, 엘라스테이즈의 작용을 억제하는 정도를 측정하는 시험을 실시하였다.
엘라스틴(elastin)은 생체 내에서 피부 진피의 기질 층을 구성하는 성분으로, 피부의 노화가 진행되면 엘라스틴의 분해가 진행되고, 진피 기질 층이 무너지면서 주름이 생기게 된다. 엘라스테이즈(elastase)는 상기 엘라스틴의 분해를 지연시키는 효소로, 본 발명의 시험예 3에서는 상기 엘라스테이즈의 기질인 N-succinyl-(Ala)3 p-nitroaniline (Sigma)을 이용하여 p-니트로아닐린이 분해되면서 생기는 색의 변화를 측정하였다.
시험 전 실시예 및 비교예에서 제조된 각 병풀 시료를 5.0 중량%로 메탄올(>99.9%, Daejung, KOR)과 혼합한 후 1시간 동안 추출하고, 상기 추출물을 0.45μm 필터로 여과한 후, Rotary evaporator를 이용하여 용매를 제거하고 시험에 영향이 없는 DMSO 1,000ppm으로 희석하여 효능평가 시험에 사용하였다.
먼저 완충 용액 60 μl, 기질액 20 μl 및 3차 증류수로 희석한 상기 각 시료 100 μl을 혼합한 후, 효소액 20 μl를 첨가하고 25℃ 항온수조에서 15분간 반응시켰다. 이후 microplate reader (UVT-06685, Thermo max, USA)를 이용하여 흡광도(405nm)를 측정하였다. 완충 용액으로는 0.267 M Trizma-HCl (Sigma, pH 8.0)을 사용하였으며, 기질액으로는 8.8 mM의 N-succinyl-(Ala)3 p-nitroaniline을 사용하였고, 효소액으로는 돼지췌장 엘라스테이즈를 10 μg/mL (Sigma)의 농도로 사용하였다.
상기 엘라스테이즈 활성 저해 시험에서의 대조군은 시료 용액 대신 3차 증류수를 넣어 같은 방법으로 측정하였으며, 주름 개선 효과가 뛰어나다고 알려진 Retinol(>99%, Sigma, USA)을 양성대조군으로 사용하였다. 그리고 엘라스테이즈 대신 3차 증류수를 넣어 시료와 대조군에 대한 각각의 색 보정값을 얻는 것으로 설정하였다.
엘라스테이즈 활성 저해율의 계산은 하기 수학식 4를 이용하였으며, 결과는 하기 표 4에 나타내었다.
[수학식 4]
엘라스테이즈 활성 저해율(%) = 100 - ((시료의 흡광도 / 대조군의 흡광도) * 100)
| 엘라스테이즈 활성 저해율(%) | |||||||||||
| 실험군 | 대조군 | ||||||||||
| 홍국 (Monascus)균 발효 |
락토바실러스 (Lactobacillus) 균 발효 |
사카로마이세스 (Saccharomyces) 균 발효 |
비피도 (Bifidobacterium) 균 발효 |
흑국 (Aspergillus) 균 발효 |
발효하지 않은 병풀 |
Retinol (200 ug/ml, PPM) | |||||
| 시료 1 | 94.3 | 시료 9 | 10.0 | 시료 13 | 8.6 | 시료 17 | 11.4 | 시료 21 | 15.4 | 8.3 | 82.9 |
| 시료 2 | 96.2 | 시료 10 | 11.9 | 시료 14 | 10.2 | 시료 18 | 12.6 | 시료 22 | 18.9 | ||
| 시료 3 | 101.7 | 시료 11 | 9.2 | 시료 15 | 5.7 | 시료 19 | 15.4 | 시료 23 | 15.6 | ||
| 시료 4 | 93.4 | 시료 12 | 8.7 | 시료 16 | 6.4 | 시료 20 | 13.2 | 시료 24 | 17.7 | ||
| 시료 5 | 96.3 | ||||||||||
| 시료 6 | 99.0 | ||||||||||
| 시료 7 | 97.2 | ||||||||||
| 시료 8 | 94.9 | ||||||||||
상기 표 4에 나타난 바와 같이, 홍국균으로 발효시킨 적색 병풀을 포함하는 조성물은 발효를 하지 않은 병풀 대비 현저하게 우수한 피부 주름 개선 효과를 나타내었으며, 병풀의 함량에 상관없이 모든 비율에서 현저한 효과를 나타내었다. 또한, 타 균종으로 발효한 병풀과 비교하여도 현저한 엘라스테이즈 활성 저해율을 보였으며, 양성대조군으로 사용한 Retinol에 비해서도 더 높은 엘라스테이즈 활성 저해율을 보임으로써, 우수한 주름 개선 효과를 입증하였다.
시험예 4: 세포 재생 효과
본 발명의 시험예 4에서는 상기 실시예의 적색 병풀을 포함한 조성물의 세포 재생 효과를 확인하기 위하여, 콜라겐의 합성능을 측정하는 시험을 실시하였다.
콜라겐(collagen)은 생체 내 피부 진피층의 80~90%를 차지하는 성분으로, 피부 노화로 인해 콜라겐이 분해되면, 진피층의 두께가 얇아지고 주름, 탄력 저하 등이 발생하게 된다. 따라서 새로운 콜라겐의 생성이 증가한다면 피부 세포의 재생을 촉진하여 진피층의 치밀도 및 두께를 증가시키고, 피부 탄력도를 개선하는 효과를 얻을 수 있다.
시험 전 실시예 및 비교예로 제조된 각 병풀 시료를 5.0 중량%로 에틸아세테이트(>99%, Daejung, KOR)와 혼합한 후 1시간 동안 추출하고, 상기 추출물을 0.45μm 필터로 여과한 후, Rotary evaporator를 이용하여 용매를 제거하고 시험에 영향이 없는 DMSO 1,000ppm으로 희석하여 효능평가 시험에 사용하였다.
먼저 사람의 섬유아세포(human dermal fibroblast)를 24-well 마이크로플레이트에 접종시킨 후(1x105 세포/well), 37℃, 5% 농도의 CO2 배양기에서 24시간 배양하였다. 또한, 실시예 내지 비교예의 시료들은 무혈청 DMEM 배지에서 24시간 동안 배양하였다. 이후 96-well 플레이트로 옮겨 4℃에서 24시간 동안 코팅한 후, 세척 버퍼(PBS-T; 0.05 % Tween 20 in phosphate buffered saline)로 세척하고 블로킹 용액(5 % skim milk, Fluka)을 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 블로킹하였다. 블로킹 후 세척 버퍼로 세척한 플레이트에 PBS-T에 희석한 일차 항체(anti-collagen type 1, Sigma) 100 μl를 가하여 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 다시 세척 버퍼로 플레이트를 세척한 다음 PBS-T에 희석한 이차 항체(anti-IgG alkaline phosphate conjugate, Sigma) 100 μl를 가하여 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 마지막으로, 세척 버퍼를 이용하여 세척 후 기질용액(alkaline phosphatase substrate solution, Sigma)을 100 μl씩 넣고 항온 25℃에서 발색시킨 후, microplate reader (UVT-06685, Thermo max, USA)를 이용하여 흡광도(405nm)를 측정하였다.
상기 콜라겐 합성 효과를 측정하기 위한 시험에서의 대조군은 시료를 처리하지 않은 세포 배양액의 반응 흡광도이며, 콜라겐 합성에 필수적이라고 알려진 아스코르빈산을 양성대조군으로 설정하여 3회 반복실험한 후, 평균값을 구하여 비교하였다.
콜라겐 합성 활성의 계산은 하기 수학식 5를 이용하였으며, 결과는 하기 표 5에 나타내었다.
[수학식 5]
콜라겐 합성 활성율(%) = 100 + ((대조군의 흡광도 - 시료의 세포배양액 흡광도) / 대조군의 흡광도) * 100
| 콜라겐 합성 활성율(%) | |||||||||||
| 실험군 | 대조군 | ||||||||||
| 홍국 (Monascus)균 발효 |
락토바실러스 (Lactobacillus) 균 발효 |
사카로마이세스 (Saccharomyces) 균 발효 |
비피도 (Bifidobacterium) 균 발효 |
흑국 (Aspergillus) 균 발효 |
발효하지 않은 병풀 |
Ascorbic acid (100 ug/ml, PPM) | |||||
| 시료 1 | 132.6 | 시료 9 | 100.9 | 시료 13 | 103.6 | 시료 17 | 96.4 | 시료 21 | 106.8 | 101.3 | 124.8 |
| 시료 2 | 128.4 | 시료 10 | 103.2 | 시료 14 | 102.7 | 시료 18 | 104.7 | 시료 22 | 108.4 | ||
| 시료 3 | 140.2 | 시료 11 | 95.6 | 시료 15 | 106.4 | 시료 19 | 98.4 | 시료 23 | 103.6 | ||
| 시료 4 | 145.6 | 시료 12 | 102.8 | 시료 16 | 99.7 | 시료 20 | 101.2 | 시료 24 | 107.9 | ||
| 시료 5 | 136.1 | ||||||||||
| 시료 6 | 142.0 | ||||||||||
| 시료 7 | 135.4 | ||||||||||
| 시료 8 | 130.0 | ||||||||||
상기 표 5에 나타난 바와 같이, 홍국균으로 발효시킨 적색 병풀을 포함하는 조성물은 발효를 하지 않은 일반 병풀 대비 현저하게 우수한 콜라겐 합성 효과를 나타내었으며, 병풀의 함량에 상관없이 모든 비율에서 현저한 효과를 나타내었다. 또한, 타 균종으로 발효한 병풀과 비교하여도 현저한 콜라겐 합성 효과를 보였으며, 양성대조군으로 사용한 Ascorbic acid에 비해서도 더 높은 콜라겐 합성율을 보임으로써, 우수한 세포 재생 효과를 입증하였다.
시험예 5: 세포 독성 완화 효과
본 발명의 시험예 5에서는 상기 실시예의 적색 병풀에 대해 자외선 조사에 의한 세포 독성 완화 효과를 확인하기 위하여, 세포생존율을 측정하는 시험을 실시하였다.
시험 전 실시예 내지 비교예로 제조된 각 병풀 시료를 5.0 중량%로 n-부탄올(>99.5%, Daejung, KOR)과 혼합한 후 1시간 동안 추출하고, 상기 추출물을 0.45μm 필터로 여과한 후, Rotary evaporator를 이용하여 용매를 제거하고 시험에 영향이 없는 DMSO 1,000ppm으로 희석하여 효능평가 시험에 사용하였다.
먼저 사람의 섬유아세포(human dermal fibroblast)를 24-well 마이크로플레이트에 접종시킨 후(1x105 세포/well), 37℃, 5% 농도의 CO2 배양기에서 24시간 배양하였다. 각 웰을 PBS로 세척한 후, 각 well당 500μl의 PBS를 넣고, 자외선 B(UVB) 램프(Model : F15T8, UV B 15W, Sankyo Dennki사, Japan)를 이용하여 10 mJ/㎠의 자외선을 조사하였다. 이후 PBS를 제거하고 10% FBS가 첨가된 DMEM 1ml를 첨가하였다. 여기에 평가하고자 하는 실시예 내지 비교예의 시료를 각각 처리한 후, 24시간 동안 배양하였다. 24시간이 지난 후 배지를 제거하고, 각 well당 10% FBS가 첨가된 DMEM 500㎕ 및 MTT 용액(2.5 ㎎/㎖) 60 ㎕를 넣어 37℃ CO2 배양기에서 2시간 동안 배양하였다. 이후 배지를 제거하고 0.04 N 이소프로판올-HCl을 500㎕ 첨가하여 세포를 용해시켰다. 마지막으로, 용해된 세포의 상등액 100㎕를 96-well 플레이트로 옮긴 후, microplate reader (UVT-06685, Thermo max, USA)를 이용하여 흡광도(565nm)를 측정하였다.
세포생존율의 계산은 하기 수학식 6을 이용하였으며, 자외선에 의한 세포 독성 완화율은 하기 수학식 7을 이용하였다. 결과는 하기 표 6에 나타내었다.
[수학식 6]
세포생존율(%) ={(St - Bo) / (Bt - Bo)} * 100
Bo: 세포 배양 배지만을 발색 반응한 웰의 565nm 흡광도
Bt: 시료를 처리하지 않은 웰을 발색 반응한 웰의 565nm 흡광도
St: 시료를 처리한 웰을 발색 반응한 웰의 565nm 흡광도
[수학식 7]
자외선에 의한 세포 독성 완화율(%) = {1 - (St - Bo) / (Bt - Bo)} * 100
Bo: 자외선 조사하지 않고 시료를 처리하지 않은 웰의 세포생존율
Bt: 자외선 조사하고 시료를 처리하지 않은 웰의 세포생존율
St: 자외선 조사하고 시료를 처리한 웰의 세포생존율
| 세포 독성 완화율(%) | ||||||||||
| 실험군 | 대조군 | |||||||||
| 홍국 (Monascus)균 발효 |
락토바실러스 (Lactobacillus) 균 발효 |
사카로마이세스 (Saccharomyces) 균 발효 |
비피도 (Bifidobacterium) 균 발효 |
흑국 (Aspergillus) 균 발효 |
발효하지 않은 병풀 |
|||||
| 시료 1 | 36.4 | 시료 9 | 5.1 | 시료 13 | 7.4 | 시료 17 | 1.2 | 시료 21 | 2.4 | 2.3 |
| 시료 2 | 32.7 | 시료 10 | 3.6 | 시료 14 | 2.9 | 시료 18 | 2.0 | 시료 22 | 8.3 | |
| 시료 3 | 44.8 | 시료 11 | 2.0 | 시료 15 | 2.6 | 시료 19 | -2.8 | 시료 23 | 6.4 | |
| 시료 4 | 46.9 | 시료 12 | 3.3 | 시료 16 | 5.8 | 시료 20 | 1.8 | 시료 24 | 3.7 | |
| 시료 5 | 40.1 | |||||||||
| 시료 6 | 35.5 | |||||||||
| 시료 7 | 36.5 | |||||||||
| 시료 8 | 39.1 | |||||||||
상기 표 6에 나타난 바와 같이, 홍국균으로 발효시킨 적색 병풀을 포함하는 조성물은 발효를 하지 않은 일반 병풀 대비 현저하게 우수한 세포 독성 완화 효과를 나타내었으며, 병풀의 함량에 상관없이 모든 비율에서 현저한 효과를 나타내었다. 또한, 타 균종으로 발효한 병풀과 비교하여도 현저한 세포 독성 완화 효과를 보임으로써, 자외선으로 인해 발생한 세포 독성에 대하여 우수한 완화 효과를 입증하였다.
시험예 6: 항염증 효과
본 발명의 시험예 6에서는 상기 실시예의 적색 병풀을 포함한 조성물의 항염증 효과를 확인하기 위하여, 자외선 조사로 인하여 발현되는 염증성 사이토카인의 발현 억제율을 측정하는 시험을 실시하였다.
시험 전 실시예 및 비교예에서 제조된 각 병풀 시료를 5.0 중량%로 헥산다이올(DJC, KOR) 수용액과 혼합한 후 1시간 동안 추출하고, 상기 추출물을 0.45μm 필터로 여과한 후, 효능평가 시험에 사용하였다.
먼저 사람의 섬유아세포를 24-well 마이크로플레이트에 접종시킨 후(5x104 세포/well), 24시간 동안 부착시켰다. 각 웰을 PBS로 세척한 후, 각 well당 500μl의 PBS를 넣고, 자외선 B(UVB) 램프(Model : F15T8, UV B 15W, Sankyo Dennki사, Japan)를 이용하여 10 mJ/㎠의 자외선을 조사하였다. 이후 PBS를 제거하고 무혈청 DMEM 350μl를 첨가하였다. 여기에 평가하고자 하는 실시예 내지 비교예의 시료를 각각 처리한 후, 5시간 동안 배양하였다. 5시간 후 배지를 제거하고, 배양 상층액 150μl에서의 IL-1α를 정량하였다.
염증성 사이토카인 IL-1α의 양은 효소면역분석법(Enzyme-linked Immunosorbent Assay)를 이용하여 정량화하였다. IL-1α 생성율의 계산은 하기 수학식 8을 이용하였으며, 결과는 하기 표 7에 나타내었다.
[수학식 8]
염증성 사이토카인 발현 억제율(%) = {1 - (St - Bo) / (Bt - Bo)} * 100
Bo: 자외선 조사하지 않고 시료를 처리하지 않은 웰의 IL-1α 생성량
Bt: 자외선 조사하고 시료를 처리하지 않은 웰의 IL-1α 생성량
St: 자외선 조사하고 시료를 처리한 웰의 IL-1α 생성량
| 염증성 사이토카인 발현 억제율(%) | ||||||||||
| 실험군 | 대조군 | |||||||||
| 홍국 (Monascus)균 발효 |
락토바실러스 (Lactobacillus) 균 발효 |
사카로마이세스 (Saccharomyces) 균 발효 |
비피도 (Bifidobacterium) 균 발효 |
흑국 (Aspergillus) 균 발효 |
발효하지 않은 병풀 |
|||||
| 시료 1 | 73.8 | 시료 9 | 20.7 | 시료 13 | 15.4 | 시료 17 | 19.3 | 시료 21 | 22.2 | 23.1 |
| 시료 2 | 69.7 | 시료 10 | 18.4 | 시료 14 | 13.9 | 시료 18 | 18.7 | 시료 22 | 15.6 | |
| 시료 3 | 71.4 | 시료 11 | 19.2 | 시료 15 | 15.2 | 시료 19 | 24.3 | 시료 23 | 19.7 | |
| 시료 4 | 75.6 | 시료 12 | 18.0 | 시료 16 | 14.8 | 시료 20 | 20.6 | 시료 24 | 22.4 | |
| 시료 5 | 70.3 | |||||||||
| 시료 6 | 72.9 | |||||||||
| 시료 7 | 70.0 | |||||||||
| 시료 8 | 73.2 | |||||||||
상기 표 7에 나타난 바와 같이, 홍국균으로 발효시킨 적색 병풀은 발효를 하지 않은 일반 병풀 대비 현저하게 우수한 염증성 사이토카인 감소 효과를 나타내었으며, 병풀의 함량에 상관없이 모든 비율에서 현저한 효과를 나타내었다. 또한, 타 균종으로 발효한 병풀과 비교하여도 현저한 염증성 사이토카인 감소 효과를 보임으로써, 우수한 항염증 효과를 입증하였다.
이하, 본 발명의 제형예로서 유연 화장수, 수렴화장수, 영양 화장수, 마사지 크림, 에센스 및 팩 등을 예시하나 본 발명의 조성물의 제형은 이에 제한되는 것으로 해석해서는 안 되며, 본 발명의 범위 내에서 당업자의 통상적인 변화가 가능하다.
[제형예 1] 유연화장수
[제형예 2] 수렴화장수
[제형예 3] 영양화장수
[제형예 4] 에센스
[제형예 5] 팩
Claims (8)
- 홍국균(Monascus)으로 발효된 병풀을 유효성분으로 포함하는, 항산화 및 항염증 화장료 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 홍국균은 모나스쿠스 퍼퍼레우스(Monascus purpureus), 모나스쿠스 루버(Monascus ruber), 모나스쿠스 루버반 틱헴(Monascus rubervan Tieghem), 모나스쿠스 풀리기노서스 사토(Monascus fuliginosus Sato), 모나스쿠스 필로수스(Monascus pilosus), 모나스쿠스 퍼퓨렌스(Monascus purpurens), 모나스쿠스 필로수스 사토(Monascus pilosus Sato), 모나스쿠스 안카(Monascus anka), 모나스쿠스 바리케리(Monascus barykery) 및 모나스쿠스 알비두스 사토(Monascus albidus Sato)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 항산화 및 항염증 화장료 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 조성물은 피부 미백, 피부 주름 개선, 세포 재생 또는 세포 독성 완화 효과를 더 가지는 것인, 항산화 및 항염증 화장료 조성물. - 홍국균(Monascus)으로 발효된 병풀을 유효성분으로 포함하는, 항산화 및 항염증 피부외용제 조성물.
- 홍국균(Monascus)으로 발효된 병풀을 유효성분으로 포함하는, 항산화 및 항염증 식품 조성물.
- 병풀을 홍국균(Monascus)으로 발효시키는 단계를 포함하는, 항산화 및 항염증 화장료 조성물의 제조 방법.
- 제6항에 있어서,
상기 제조 방법은 상기 병풀 발효물을 용매 추출하는 단계를 더 포함하는 것인, 제조 방법. - 제7항에 있어서,
상기 용매는 물, 에탄올, 메탄올, 부탄올, 메틸프로판디올, 프로판디올, 부틸렌글리콜, 헥산다이올, 프로필렌글리콜, 클로로포름, 에틸아세테이트, 디클로로메탄, 헥산, 페트로레움에테르 및 디에틸에테르로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것인, 제조 방법.
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| KR1020230026345A KR102620811B1 (ko) | 2023-02-27 | 2023-02-27 | 홍국균으로 발효시킨 적색 병풀 및 이의 용도 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020230026345A KR102620811B1 (ko) | 2023-02-27 | 2023-02-27 | 홍국균으로 발효시킨 적색 병풀 및 이의 용도 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR102620811B1 true KR102620811B1 (ko) | 2024-01-03 |
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| KR1020230026345A KR102620811B1 (ko) | 2023-02-27 | 2023-02-27 | 홍국균으로 발효시킨 적색 병풀 및 이의 용도 |
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| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR102620811B1 (ko) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20210021209A (ko) * | 2019-08-16 | 2021-02-25 | (주) 나우코스 | 노화방지와 주름개선효과를 갖는 보습화장료용 병풀 발효추출물의 제조방법 |
-
2023
- 2023-02-27 KR KR1020230026345A patent/KR102620811B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20210021209A (ko) * | 2019-08-16 | 2021-02-25 | (주) 나우코스 | 노화방지와 주름개선효과를 갖는 보습화장료용 병풀 발효추출물의 제조방법 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 김재원 외 4인, Korean J. Food. Preserv. 2010, 17, 741-751.* * |
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