KR20210021209A

KR20210021209A - 노화방지와 주름개선효과를 갖는 보습화장료용 병풀 발효추출물의 제조방법

Info

Publication number: KR20210021209A
Application number: KR1020190100110A
Authority: KR
Inventors: 노향선; 김병만
Original assignee: (주) 나우코스; 노향선
Priority date: 2019-08-16
Filing date: 2019-08-16
Publication date: 2021-02-25
Also published as: KR102258859B1

Abstract

본 발명은 병풀 발효 추출물을 함유하는 노화방지와 주름개선 화장료 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 화장료 조성물 중 병풀 발효추출물 유효성분을 0.0001 내지10.0 중량%, 바람직하게는 0.0005 내지 8.0 중량%, 더욱 바람직하게는 0.005 내지 5.0 중량%로 함유하는 것을 특징으로 한다.
본원 기술이 적용되어 병풀 발효추출물 유효성분을 0.0001 내지10.0 중량% 범위로 화장료 조성물에 함유시켜 제공되는 경우, 병풀 발효 추출물을 이용한 피부개선용 보습화장료 조성물은 피부에 보습 작용을 해주고, 손상된 피부의 재생효과와 더불어 병풀 발효 추출물의 우수한 세포증식효과, 콜라겐 합성효과 및 히아루론산 합성효과를 통하여 피부 노화의 방지, 주름 생성 억제 또는 주름을 개선시키는데 효과가 우수한 병풀 발효 추출물을 함유하는 노화방지와 주름개선 화장료 조성물을 제공하고자 하는 기술이다.

Description

노화방지와 주름개선효과를 갖는 보습화장료용 병풀 발효추출물의 제조방법{Method of producing a ferment extract using the Centella asiatica and cosmetic composition using the same}

본 발명은 병풀 발효 추출물을 함유하는 노화방지와 주름개선 화장료 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 화장료 조성물 중 병풀 발효추출물 유효성분을 0.0001 내지10.0 중량%, 바람직하게는 0.0005 내지 8.0 중량%, 더욱 바람직하게는 0.005 내지 5.0 중량%로 함유하는 것을 특징으로 한다.

병풀 발효추출물 함유량이 0.0001중량% 미만인 경우는 뚜렷한 효과를 기대할 수 없었으며, 10.0 중량% 이상인 경우는 함유량의 증가에 따른 뚜렷한 효과의 증가가 나타나지 않는 결과를 확인하였다.

본원 기술이 적용되어 병풀 발효추출물 유효성분을 0.0001 내지10.0 중량% 범위로 화장료 조성물에 함유시켜 제공되는 경우, 병풀 발효 추출물을 이용한 피부개선용 보습화장료 조성물은 피부에 보습 작용을 해주고, 손상된 피부의 재생효과와 더불어 병풀 발효 추출물의 우수한 세포증식효과, 콜라겐 합성효과 및 히아루론산 합성효과를 통하여 피부 노화의 방지, 주름 생성 억제 또는 주름을 개선시키는데 효과가 우수한 병풀 발효 추출물을 함유하는 노화방지와 주름개선 화장료 조성물을 제공하는 것을 확인하여 완성된 발명이다.

화장품 관련 분야에서 피부 노화의 방지, 주름 생성 억제 또는 주름 개선은 항상 최상의 관심분야이다.

이러한 피부노화의 주원인은 에스트로겐(estrogen)의 결핍에 있는바 여성호르몬인 에스트로겐의 피부에 대한 주 기능은, 피부 활동을 강화시키며 피부를 부드럽고 탄력적이며 유연하게 하는 것으로 알려져 있다.

구체적으로 살펴보면 에스트로겐은 진피에 있는 섬유아세포를 자극하여 콜라겐 합성을 촉진시키며, 콜라겐의 대사에 관여하여 콜라겐의 오버글리케이션(over-glycation)을 억제하고, 해독 후 변형(post-translational modification)을 유도하며, 콜라겐 분해효소인 콜라게나제의 발현을 조절하여 콜라겐의 분해를 억제한다.

또한, 표피에 있는 기저세포의 증식효과를 증가시켜 표피를 좀더 두텁게 함으로써 피부 세포조직을 강화시키고, 피지선을 조절하여 피지선의 성장을 억제하고 피지의 생성을 감소시키며, 특히 피부수분유지에 매우 중요한 히아루론산의 합성을 촉진시킨다.

상기와 같은 효과를 가지는 에스트로겐이 결핍되게 되면 이로 인한 피부의 변화가 일어나게 되는데, 그 대표적인 현상이 피부건조이며 섬유아세포에서는 콜라겐, 탄력섬유 등의 생성이 억제되어, 피부가 얇아지고 피부의 탄력이 감소하며 히아루론산의 합성이 저해되므로 피부의 수분유지 기능이 약화되며 또한 콜라겐 글리케이션이 증가함으로써 콜라겐의 교차결합이 증가하여 피부가 경화되어 탄력이 감소하게 된다.

불행히도 에스트로겐의 분비장소인 생식기관은 나이가 들어감에 따라 점차 기능이 퇴화되어가다가 생산기능이 사라지는 시점인 폐경기를 전후하여 에스트로겐의 생성이 중지되어 호르몬의 균형이 파괴되면서 남성호르몬인 테스토스테론의 비경쟁적인 영향을 받게 되어 에스트로겐 결핍에 따른 내분비성 노화가 촉진되게 된다.

내분비성 노화는 피부노화의 일종으로 폐경기시 나타나는 생리적인 피부노화로서 최근 에스트로겐 결핍으로 인한 피부노화를 억제하기 위한 해결 방법에 대한 여러 연구 결과들이 보고되고 있는데, 그중 대표적인 예로 에스트로겐을 직접 공급하는 호르몬 대체요법 등이 시행되고 있다.

화장품분야에서 에스트로겐 결핍문제를 해결하기 위한 수단으로 제시된 선행기술로 등록특허 10-0828494호(인용1)에서는 콜라겐, 히알루론산 나트륨(sodium hyaluronate), 아데노신, 라이신, 정제수로 조성되는 피부주름 개선용 화장품 에센스 조성물과 초산용액에 아테로 콜라겐 침사를 첨가하여 용해시킨 용액에 숙신산무수물을 첨가하고 가성소다로 pH 10으로 유지시킨 상태에서 완전히 용해되었을때 염산으로 pH 4.03으로 조정한 후 원심분리하여 침사를 얻고 냉동진공건조시킨 숙신산무산물로 처리한 아테로 콜라겐을 얻는 단계를 거치고 상기 숙신산무산물로 처리한 아테로 콜라겐과 아데노신, 정제수를 0.5%의 히알루론산에 용액에 첨가 5℃ 이하로 유지시킨 상태에서 1차 용해시키고 가성소다(0.5N)를 첨가 pH 6.1로 유지시킨 상태에서 미용해된 콜라겐을 완전히 용해시킨 다음 미량의 리신을 첨가 용해시킨 다음 증발된 정제수를 보충함과 동시에 다시 가성소다로 pH6.1로 조절한 피부주름 개선용 화장품 에센스 조성물 제조방법이 제시되어 있다.

또한 등록특허 10-1796677호(인용2)에서는 에스트로겐과 유사한 작용 효과를 갖는 청미래덩굴 뿌리 추출물을 유효성분으로 함유하는 에스트로겐 결핍으로 인한 질환의 예방, 치료 또는 개선용 조성물, 유방 확대용 조성물 및 탈모의 예방, 치료 또는 개선용, 또는 발모 또는 육모 촉진용 조성물이 제시되어 있는바, 상기 특허 조성물에서는 본래 에스트로겐과 같이 에스트로겐 수용체 α 및 β와 결합하여 에스트로겐과 에스트로겐 수용체의 결합으로부터 유도되는 신호전달기작을 활성화시켜 에스트로겐 수용체가 발현되는 유방세포의 증식을 촉진할 수 있으며 이에 따라 에스트로겐 결핍으로 인한 질환을 효과적으로 예방, 치료 또는 개선할 수 있으며, 효과적인 유방 확대가 가능하고, 또한 탈모의 예방, 치료 또는 개선, 또는 발모 또는 육모의 촉진을 효과적으로 달성하고자 하는 기술이 제시되어 있다

그러나 상기와 같은 인용참증 1기술은 염산과 가성소다를 이용하여 pH를 조절하는 공정이 포함되어 적용되는 기술은 현대인의 민감한 피부에 적용이 어려운 기술이고, 인용참증 2기술은 에스트로겐과 유사한 작용 효과를 제공하는 청미래덩굴 뿌리 추출물을 탈모 예방 또는 육모 촉진용 조성물로 이용하고자 하는 기술이다.

상기 기술이외 기타 방법으로 에스트로겐을 직접 공급하는 경우, 콜라겐 합성의 증가, 히아루론산 합성의 증가 및 표피세포의 증식효과로 인한 표피의 두께 증가 등 뚜렷한 효과가 입증되고 있으나, 화장품에서는 에스트로겐의 직접적인 사용이 불가능하기 때문에 다른 방법들이 강구되고 있고 화장품에서의 대안은 에스트로겐 결핍에 따른 직접적인 대처방안이 아니라, 보습제, 노화 억제물질, 자유라디칼 소거물질, 자외선 차단제 등 피부노화의 일반적 억제물질을 이용하는 간접적인 대처방안들이 일반적으로 적용되고 있으나 이러한 간접적 대처방안으로는 피부노화의 근본적인 문제점을 해결하는데 한계가 있다.

따라서, 화장품업계의 시각에서 폐경기를 전후하여 노화가 진행되는 여성피부를 개선하기 위하여, 콜라겐 합성 및 히아루론산 합성증진 효과를 갖는 에스트로겐 유사물질의 개발이 요구되어 왔다.

본 발명자들은 에스트로겐 결핍에 따른 직접적인 대처방안으로써, 식물로부터 에스트로겐 유사물질을 개발하기 위하여 자생하는 생약에 대한 연구를 수행하던 중, 병풀 발효 추출물이 우수한 세포증식효과, 콜라겐 합성효과 및 히아루론산 합성효과를 나타냄을 발견하고 본원기술을 개발하기에 이르렀다.

본원은 손상 피부의 재생, 피부 노화의 방지, 주름 생성 억제 또는 주름을 개선시키는데 효과가 우수한 병풀 발효 추출물을 함유하는 노화방지와 주름개선효과를 갖는 화장료 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 병풀 발효추출물을 유효성분으로 함유하는 노화방지와 주름개선 화장료 조성물에 관한 것이다.

본원 화장료조성물은 병풀 발효추출물을 화장료 조성물 총 건조중량에 대하여 0.0001 내지10.0 중량%, 바람직하게는 0.0005 내지 10.0 중량%, 및 보다 바람직하게는 0.005 내지 5.0 중량%로 함유하는 것을 특징으로 하는바 함유량이 0.0001중량% 미만인 경우는 뚜렷한 효과를 기대할 수 없으며, 10.0 중량% 이상인 경우는 함유량의 증가에 따른 뚜렷한 효과의 증가가 나타나지 않는 결과를 확인하였다.

병풀은 학명이 'Centella asiatica'이며, 말굽풀, 조개풀이라고도 불리는 미나리과에 속하는 다년생 식물로서 원산지는 아프리카 동부의 Madagascar섬이며 해열제, 피부궤양, 외상치료, 결핵, 원형탈모증 등에 효과가 있는 것으로 보고되어 있다.

본원 기술은 상기와 같은 병풀 발효 추출물을 안정화시켜 인체피부에 안전하게 활용하기 위한 수단으로 노화방지와 주름개선 화장료 조성물 중 본원 기술로 제공되는 병풀 발효추출물 0.005~5.0중량%, 글리세린 10.0~20.0중량%, 세틸에틸헥사노에이트 5.0~10.0중량%, 나이아신아마이드 2.0~5.0중량%, 세테아릴알코올 1.0~4.0중량%, 폴리글리세릴-3메틸글루코오스다이스테아레이트 1.0~4.0중량%, 1,2-헥산다이올 0.5~2.0중량%, 스테아릭애씨드 1.0~2.0중량%, 글리세릴스테아레이트에스이 0.5~1.5중량%, 다이메티콘1.000, 시어버터 0.5~1.5중량%, 트로메타민 0.1~0.5중량%, 카보머 0.1~0.5중량%, 잔탄검 0.01~0.1중량%, 아데노신 0.02~0.04중량%, 팔미틱애씨드 0.01~0.05중량%, 다이소듐이디티에이 0.01~0.05중량%와 나머지 정제수를 채워 100중량%로 이루어진 병풀 발효 추출물을 포함하여 노화방지와 주름개선 화장료 조성물을 제공되어 적용될 수 있음을 확인하여 완성된 기술이다.

본원 기술에 적용되는 병풀 발효 추출물은 제1발효단계로 병풀 30~40 중량부와 정제수 60~70 중량부를 혼합하여 80±10℃ 범위에서 1~2시간 동안 습식 열처리한 후 구연산 0.5~5중량부와 포도당 3~7중량부, 흑설탕 3~7중량부를 순차로 넣고 교반/용해하고, 용해된 슬러리 100중량부를 기준으로 누룩균을 1~5중량부를 접종하고, 32~40℃에서 5~7일간 발효시켜 pH 2.5~4.0의 1차 유기산 발효물을 얻은 후, 복합유산균종균을 3~5 중량부를 추가 접종하고, 28~35℃에서 4~6일간 발효시켜 2차 유산균 발효물을 얻는 제1공정과, 제2추출단계로 상기 제1공정이 수행된 발효물 100중량부에 200~400중량부의 에칠알콜(Ethyl Alcohol)을 가하고 40~45℃ 조건에서 20~30시간 추출하는 제2공정과, 제3여과 및 멸균단계로 상기 제2공정이 수행된 추출액을 여과한 후 50℃이하의 조건에서 진공감압 증류하여 황금 발효 유효성분 30~50% 용액으로 농축하고 농축 용액을 밀폐상태의 105±5℃를 유지하는 고압멸균기에서 1~3분 멸균 처리하는 제3공정을 거쳐 얻은 병풀 발효 추출물이 사용되도록 적용된다.

또한 상기 제1공정에 사용되는 복합유산균종균은 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.)으로 락토바실러스 아시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus Brebis CD2), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 힐가르디(Lactobacillus hilgardii), 락토바실러스 말리(Lactobacillus mali), 락토바실러스 나겔리(Lactobacillus nagelii), 락토바실러스 플란타륨(Lactobacillus plantarium), 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri), 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus Rhamnosus), 락토바실러스 삿수멘시스(Lactobacillus satsumensis), 락토바실러스 서머필러스(Lactobacillus Thermophilus), 바실러스 속(Bacillus sp.)으로 바실러스 아밀로리티커스(Bacillus amylolyticus), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis), 바실러스 폴리미샤(Bacillus polymyxa), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 스테아로서머필러스(Bacillus sterothemophilus), 비피도박테리움 속(Bifidobacterium sp.)으로 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium Bifidum), 비피도박테리움 브레브(Bifidobacterium Breve), 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium Infantis), 비피도박테리움 로검(Bifidobacterium Logum), 그 외에 지오바실러스 스테아로서머필러스(Zeobacillus sterothemophilus), 지고사카라마이세스 비스포러스(Zygosaccharomyces bisporus) 중에서 하나 이상이 선택되는 종균이 사용되도록 적용될 수 있으며, 상기 제1공정에 사용되는 누룩균은 아스퍼질루스 나이가(Aspergillus nicer) NRRL 2322(ATCC 10577)이 사용되도록 적용되는 것을 특징으로 한다.

또한 본원은 노화방지와 주름개선 화장료에 사용되는 원료를 얻기 위한 병풀 발효 추출물의 제조방법에 있어서, 제1발효단계로 병풀 30~40 중량부와 정제수 60~70 중량부를 혼합하여 80±10℃ 범위에서 1~2시간 동안 습식 열처리한 후 구연산 0.5~5중량부와 포도당 3~7중량부, 흑설탕 3~7중량부를 순차로 넣고 교반/용해하고, 용해된 슬러리 100중량부를 기준으로 누룩균을 1~5중량부를 접종하고, 32~40℃에서 5~7일간 발효시켜 pH 2.5~4.0의 1차 유기산 발효물을 얻고, 복합유산균종균을 3~5 중량부를 접종하고, 28~35℃에서 4~6일간 발효시켜 2차 유산균 발효물을 얻는 제1공정과, 제2추출단계로 상기 제1공정이 수행된 발효물 100중량부에 200~400중량부의 에칠알콜(Ethyl Alcohol)을 가하고 40~45℃ 조건에서 24시간 추출하는 제2공정이 포함되어 적용되므로 피부개선용 보습화장료용 병풀 발효 추출물을 얻어 화장료 조성물에 이용하고자 하는 기술사상을 특징으로 한다.

본원 기술이 적용되어 병풀 발효추출물 유효성분을 0.0001 내지10.0 중량% 범위로 화장료 조성물에 함유시켜 제공되는 경우, 병풀 발효 추출물을 이용한 피부개선용 보습화장료 조성물은 피부에 보습 작용을 해주고, 손상된 피부의 재생효과와 더불어 병풀 발효 추출물의 우수한 세포증식효과, 콜라겐 합성효과 및 히아루론산 합성효과를 통하여 피부 노화의 방지, 주름 생성 억제 또는 주름을 개선시키는데 효과가 우수한 병풀 발효 추출물을 함유하는 노화방지와 주름개선 화장료 조성물을 제공하는데 우수한 효과를 제공하다.

본 발명의 병풀 발효 추출물은 통상의 방법에 따라 유연화장수, 영양화장수, 맛사지크림, 엣센스, 팩 등의 기초 화장료에 첨가되어 손상 피부 재생, 피부노화 방지 및 피부 개선용 화장료로 제조될 수 있는바, 본원기술의 대표적인 일 실시양태는 피부개선용 보습화장료 조성물에서, 병풀 발효추출물 0.005~5.0중량%, 글리세린 10.0~20.0중량%, 세틸에틸헥사노에이트 5.0~10.0중량%, 나이아신아마이드 2.0~5.0중량%, 세테아릴알코올 1.0~4.0중량%, 폴리글리세릴-3메틸글루코오스다이스테아레이트 1.0~4.0중량%, 1,2-헥산다이올 0.5~2.0중량%, 스테아릭애씨드 1.0~2.0중량%, 글리세릴스테아레이트에스이 0.5~1.5중량%, 다이메티콘1.000, 시어버터 0.5~1.5중량%, 트로메타민 0.1~0.5중량%, 카보머 0.1~0.5중량%, 잔탄검 0.01~0.1중량%, 아데노신 0.02~0.04중량%, 팔미틱애씨드 0.01~0.05중량%, 다이소듐이디티에이 0.01~0.05중량%와 나머지 정제수를 채워 100중량%로 이루어진 병풀 발효추출물을 포함하여 노화방지와 주름개선 효과를 갖도록 적용될 수 있다.

상기의 본원 기술이 적용되어 화장료 원료로 사용되기 까지 구체적인 실시양태를 이하 발명의 실시예 및 실험예들을 제시하여 설명하고자 하는바, 이들은 본원 기술사상의 일 적용예를 제시하여 설명하기 위한 것으로, 하기에 제시된 실시예, 실험예 등은 본원 기술사상을 설명하기 위한 하나의 적용예를 기재한 것으로 본원 기술의 보호범위가 하기에 제시된 실시예 또는 실험예에 의해 축소되거나 한정되어서는 아니될 것이다.

병풀 원료추출물의 제조(비교예)

병풀을 정제수로 세척하고 건조시킨 다음, 분말화한 병풀 가루 200g을 70% 에탄올용액 2.5 L에 넣고, 냉각콘덴서가 달린 환류 추출기에서 4시간동안 끓여 추출한 다음 300메쉬 여과포로 여과하고, 잔사를 같은 방법으로 1회 더 추출하였으며 각각의 추출액을 합하여 와트만 5번 여과지로 여과후 감압 농축기를 이용하여 용매를 제거하고, 동결 건조하여 건조중량 51.4g을 얻어서 본원 기술기술에서 적용되는 1차 발효단계, 2차 추출단계, 3차 여과 및 멸균단계를 거지지 않은 병풀 원료추출물을 활용하여 본원 기술이 적용되는 하기 실시예의 결과와 대비하는 비교예로 사용하고자 하였다.

실시예 1 : 병풀 발효추출물의 제조 실시예

[실시예 1(a) 병풀 발효추출물의 발효단계]

1. 병풀 2kg과 정제수 3Kg을 혼합, 저속 교반하면서 80℃에서 60분 동안 습식 열처리를 하였다.

2. 위액에 구연산 50g과 포도당 250g과 흑설탕 250g을 차례로 넣고 교반하여 용해하고, 용해된 슬러리 100중량부에 누룩균 아스퍼질루스 나이가(Aspergillus nicer) NRRL 2322(ATCC 10577)을 1~5중량부를 접종하고, 32~40℃에서 5일간 발효시켜 pH 약 2.5-4.0의 1차 유기산 발효물을 제조하였다.

3. 상기 유기산 발효물에 시중 제품 프로바이오-25(*KBM정밀화학 생산 복합유산종균), 3~5 중량부를 접종하고, 28~35℃에서 5일간 발효시켜 2차 유산균 발효물을 제조하였다.

4. 위액 100중량부에 300중량부의 에칠알콜(Ethyl Alcohol)을 가하여 밀폐형 교반기 또는 냉각 콘덴서가 장착된 추출기에서 저속 교반으로 40-45℃에서 24시간 추출하는 제1공정이 수행되었다.

[실시예 1(b) 병풀 발효추출물의 추출단계]

상기 제1공정이 수행된 발효물 100중량부에 200~400중량부의 에칠알콜(Ethyl Alcohol)을 가하고 40~45℃ 조건에서 20~30시간 추출하는 수단에 의해 제2공정이 수행되었다.

[실시예 1(c) 병풀 발효추출물의 여과 및 멸균단계]

5. 발효와 추출이 종료된 액을 정교한 여과를 위해서 10마이크로미터 구경의 크로스 플로우 필터레이션(Cross Flow Filteration)으로 여과를 하여 용액을 맑게 하였다.

6. 위 용액을 50℃이하에서 진공 감압 증류하여 유효성분 또는 고형분을 30-50% 용액으로 농축하였다.

7. 농축된 용액을 밀폐 고압(105℃ 1기압)멸균기에서 1-2분간 멸균 처리하고, 병풀발효 추출물로 제조하였으며 이를 본원 기술에 적용하였다.

실험예 1 : 병풀 발효 추출물의 세포증식 효과

(1) 실험방법

인체 정상 섬유아세포를 96웰 마이크로 플레이트(96-well microplate)의 각 웰에 1x10⁴세포가 되도록 접종하여, 디엠이엠(DMEM) 배지에서 24시간 배양하였으며 배양 후 비교예의 병풀추출물과 실시예에서 제조한 병풀 발효추출물을 최종 농도 250 ㎍/㎖이 되도록 조정한 혈청이 없는 디엠이엠 배지로 교체한 후, 24시간 더 배양 하였다.

표 1에서 대조군은 병풀 추출물을 첨가하지 않고 배양한 것으로 MTT 용액 [3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드: 5㎎/㎖]을 10 ㎕씩 첨가하고 4시간 방치 후, 배지 부분을 버렸으며, 각 웰당 100 ㎕의 디메틸설폭사이드 용액을 가하여 20분간 교반 후, 마이크로 플레이트 판독기(microplate reader)로 500㎚에서 흡광도를 측정하였다.

수학식 1

세포증식효과(%) = (추출물처리시의 흡광도-대조군의 흡광도 / 대조군의 흡광도) × 100

(2) 실험결과

세포증식 효과는 다음 공식에 의해 산출되었고 이의 결과는 하기 표 1에 나타내었다.

추출물	흡광도(500nm)	세포증식효과(%)
대조군	0.357	-
비교예	0.413	9.8
실시예 1	0.615	65.4

위의 실험결과로부터 병풀 발효 추출물이 대조군과 비교예 보다 우수한 세포증식 효과를 나타내고 있음을 알 수 있다.

실험예 2. 병풀 발효 추출물의 농도에 따른 세포증식 효과를 확인하기 위해 실시예 1의 방법으로 얻은 병풀 발효 추출물의 농도를 50㎍, 150㎍, 250㎍ 로 바꿔 세포증식효과를 확인하고자 하였으며 그 결과는 표 2에 기재된 바와 같다.

농도	흡광도(570 nm)	세포증식효과(%)
대조군	0.357	-
50㎍	0.503	36.1
150㎍	0.557	51.2
250㎍	0.615	65.4

위의 결과로부터 병풀 발효 추출물의 농도가 증가함에 따라 세포 증식 효과가 증가함을 알 수 있다.

실험예 3. 병풀 발효 추출물의 콜라겐 합성 증진 효과

(1) 실험방법

인체 정상 섬유아세포를 96-웰 마이크로 플레이트에 접종시키고(2x10⁴세포/웰), 24시간 배양하였다. 배양 후, 배지를 혈청이 함유되지 않은 디엠이엠 배지로 교체하였다. 이때 하기 표 2에 기재된 농도의 병풀 발효 추출물을 배지와 함께 넣고 48시간 배양하였다. 표 2에서 대조군은 병풀 발효 추출물을 첨가하지 않고 배양한 것이다. 병풀 발효 추출물은 실시예 1에서 제조한 것을 사용하였다. 배양 마지막 24시간 전에 아스코르브산 (Ascorbic acid : 50mg/ml)을 첨가하여 콜라겐 합성을 촉진시켰다. 배양 후 각 웰을 세척하고, 혈청이 함유되지 않은 디엠이엠 배지로 교체한 후 24시간 더 배양하였다.

배양 후, 각 웰의 상층액을 모아 프로콜라겐(procollagen) 타입 I C-핍타이드(PICT)양을 키트 (일본 교토 소재의 Takara)를 이용하여 새로 합성된 콜라겐 양으로 측정하였으며, PICP 양은 ng/2x10⁴세포로 환산하였다.

(2) 실험결과

병풀 발효 추출물의 인체 정상 섬유아세포에서 콜라겐 I의 합성 효과에 대한 실험결과를 표 3에 나타내었다.

농도	콜라겐 합성량(ng/2x10⁴)
대조군	148
50㎍	198
150㎍	295
250㎍	346

위의 결과로부터 병풀 발효 추출물을 포함하지 않는 대조군에 비하여 병풀 발효 추출물을 포함하는 것이 보다 우수한 콜라겐 합성증진효과를 나타냄을 알 수 있으며, 또한 병풀 발효 추출물의 농도가 증가함에 따라 콜라겐의 합성이 증가함을 알 수 있다.

실험예 4. 병풀 발효 추출물의 마우스에 대한 주름개선 효과

6주령의 헤어리스 마우스 5마리를 이용하여, 광에 의해 유발된 주름에 대한 병풀 발효 추출물의 주름개선 효과를 측정하였다.

병풀 발효 추출물은 실시예 1에서 제조된 병풀 발효 추출물을 0.5%로 증류수에 용해하여 적용하였으며, 시험법은 다음과 같다.

헤어리스 마우스에 태양관 자극기(solar simulator)를 이용하여 2MED로 1주일에 3일씩 10주간 조사하여 주름을 형성시키고, 시료를 첨가하지 않은 증류수를 처리한 대조군과, 0.5% 추출물을 1일 2회 0.5 m/㎠씩 6주간을 처리한 군을대상으로 개선정도를 정성판단 하였다.

주름개선 정도의 판단은 먼저 시료 처리부위를 육안과 사진 찰영을 통해 육안 판정하였고, 판정기준은 각각의 추출물처리군 및 대조군을 시료처리 전과 비교하여 개선효과를 개선 없음을 1로 개선이 매우 있음을 10으로하여 10단계로 판정하여 표 4에 나타내었다.

구 분	개선효과
대조군	1
비교예의 병풀 추출물 0.5%처리	5-6
실시예 1의 병풀 발효 추출물 0.5%처리	8-9

상기 결과로 부터 병풀추출물은 헤어리스 마우스의 광에 의해 생성된 주름에 탁월한 개선효과가 있음을 알 수 있다.

실험예 6. 병풀 발효 추출물의 히아루론산 합성증진 효과

인체 정상 섬유아세포를 6-웰 배양 플레이트에 접종시키고(3×104세포/웰), 48시간동안 배양하였다. 이때 배지는 10% 우태아혈청(fetal calf serum), 페니실린, 스트렙토마이신(100 ㎍/㎖) 등이 함유된 디엠이엠 배지를 사용하였다.

배양 후, 여러 농도의 병풀 발효 추출물이 함유된 배지로 교체하고 24시간 배양하였다. 병풀 발효 추출물은 실시예 1에서 제조한 것을 사용하였다. 표 5에서 대조군은 병풀 발효 추출물을 첨가하지 않고 배양한 것이다. 배양 후 배지 부분만 모으고 단백질을 제거하기 위하여, 트리클로로아세트산을 최종농도 10%가 되게 넣고, 24시간 4℃에서 보관하였다. 이 용액을 원심분리하여 상층액을 투석하고, NaCl을 처리하여 최종농도 0.04M이 되도록 한 후, 세틸피리디움 클로라이드를 첨가하여히아루론산을 침전시켰다. 원심분리하여 침전물을 4M NaCl에 용해시키고, 에탄올에 재침전시킨 후, 이 침전물을 정제수에 용해시켰다. 히아루론산을 정량하기 위하여 셀룰로오스 아세테이트 스트립을 이용하여 전기영동하였다[Hata, R.& Nagai, Y.(1972) Anal. Biochem. 45, 462~468]. 밴드 인텐시티(bend intensity)를 측정하고, 이로부터 히아루론산 합성증진 효과를 측정하였다.

히아루론산 합성증진 효과는 다음 공식에 의해 산출되었고, 이 결과는 하기 표 5에 나타내었다.

수학식 2

히아루론산 합성증진 효과(%) = (추출물처리시의 벤드인텐시티-대조군의 밴드인텐시티 / 대조군의 밴드인텐시티) × 100

농도	밴드인텐시티	히아루론산 합성증진 효과(%)
대조군	6524	-
병풀추출물 100 ㎍/㎖처리	10496	42.9
병풀추출물 500 ㎍/㎖처리	13089	69.68

상기 결과로부터, 병풀추출물이 히아루론산 합성증진 효과를 나타내며, 또한 병풀추출물의 농도가 증가함에 따라 정상섬유아세포에서의 히아루론산의 합성이 증가됨을 확인할 수 있다.

실험예 : 피부 탄력 향상 효능 확인

피부 탄력 향상 효능 확인을 위하여 상기 비교예 및 실시예 1에서 얻은 병풀 발효 추출물을 활용하여 하기 표 6의 조성으로 화장료를 제조하되, 다른 원료조성물을 고정시킨 상태에서 병풀 발효 추출물을 함유하지 않는 화장료(비교예 2)를 대조군으로 하고, 병풀 발효 추출물을 0.005 wt%로 함유한 A 샘플, 병풀 발효 추출물을 1.0 wt%로 함유한 B 샘플, 병풀 발효 추출물을 5.0 wt%로 함유한 C 샘플을 각각 제조한 후 화장수의 피부 탄력 향상 효과를 비교측정 하고자 하였다

성 분	함 량(wt %)
정제수	63.790
글리세린	15.000
세틸에틸헥사노에이트	8.000
병풀발효추출물	0/0.005/1.0/5.0
나이아신아마이드	2.000
세테아릴알코올	2.000
폴리글리세릴-3메틸글루코오스다이스테아레이트	2.000
1,2-헥산다이올	2.000
스테아릭애씨드	1.470
글리세릴스테아레이트에스이	1.000
다이메티콘	1.000
시어버터	1.000
트로메타민	0.300
카보머	0.300
잔탄검	0.050
아데노신	0.040
팔미틱애씨드	0.030
다이소듐이디티에이	0.020
	100.000

상기의 표 6으로 제공된 화장수의 피부 탄력 향상 효과를 비교하기 위하여, 30~40대 여성 80명을 대상으로 20명을 1개군으로 하여 4개군으로 나누어 측정하고자 하였으며, 실험 방법은 다음과 같다.

각 조에 표 6의 비교예 2 및 A샘플, B샘플, C 샘플 화장수를 각각 4개군으로구분하여 나누어 주고 매일 1회 12주간 눈가에 일정량을 도포하게 하였으며 이때 1군 피검자의 눈가의 양쪽에는 상기 비교예 2의 화장수를, 2군 피검자에게는 왼쪽에는 상기 비교예 2의 화장수를 오른쪽에는 A 샘플을 도포하게 하였고, 3군 피검자에게는 왼쪽에는 비교예 2의 화장수를 오른쪽에는 B 샘플을 도포하게 하였으며, 4군 피검자에게는 왼쪽에는 비교예 2의 화장수를 오른쪽에는 C 샘플을 각각 구분하여 도포하게 하였으며 12주 뒤 피부탄력을 측정할 수 있는 큐토미터(cutometer; SEM474, Courage+Khazaka electronic GmbH. Germany)를 이용하여 각 그룹의 피부 탄력을 측정하고 그 평균을 구하였으며, 그 결과는 하기 표 7에 나타내었다.

	비교예 2	샘플 A	샘플 B	샘플 C
피부탄력 향상도(%)	39	48	62	69
비교 향상율(%)	0	23	59	77

상기 표 7의 결과를 보면, 본 발명에 의한 병풀 발효추출물을 함유하고 있지 않은 비교예 2와 비교하여 병풀 발효 추출물을 0.005 wt%로 함유한 A 샘플은 피부 탄력 향상도가 23% , 병풀 발효 추출물을 1.0 wt%로 함유한 B 샘플은 피부 탄력 향상도가 59% , 병풀 발효 추출물을 5.0 wt%로 함유한 C 샘플은 피부 탄력 향상도가 77% 정도 높게 나타남을 확인할 수 있으므로부터 병풀 발효 추출물의 첨가량에 따라 향상도가 증가함을 알 수 있었다.

따라서, 본 발명의 병풀 발효 추출물을 함유하는 화장료 조성물은 피부 탄력 향상에 매우 효과적임을 확인할 수 있었으며 이에 특허 출원에 이르게 되었다.

Claims

병풀 발효추출물을 포함하여 제공되는 피부개선용 보습화장료 조성물에 있어서,
병풀 발효추출물 0.005~5.0중량%, 글리세린 10.0~20.0중량%, 세틸에틸헥사노에이트 5.0~10.0중량%, 나이아신아마이드 2.0~5.0중량%, 세테아릴알코올 1.0~4.0중량%, 폴리글리세릴-3메틸글루코오스다이스테아레이트 1.0~4.0중량%, 1,2-헥산다이올 0.5~2.0중량%, 스테아릭애씨드 1.0~2.0중량%, 글리세릴스테아레이트에스이 0.5~1.5중량%, 다이메티콘1.000, 시어버터 0.5~1.5중량%, 트로메타민 0.1~0.5중량%, 카보머 0.1~0.5중량%, 잔탄검 0.01~0.1중량%, 아데노신 0.02~0.04중량%, 팔미틱애씨드 0.01~0.05중량%, 다이소듐이디티에이 0.01~0.05중량%와 나머지 정제수를 채워 100중량%로 이루어진 병풀 발효추출물을 포함하여 노화방지와 주름개선 효과를 갖도록 제공되는 것을 특징으로 하는 피부개선용 보습화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 병풀 발효추출물은 제1차 발효단계로 병풀 30~40 중량부와 정제수 60~70 중량부를 혼합하여 80±10℃ 범위에서 1~2시간 동안 습식 열처리한 후 구연산 0.5~5중량부와 포도당 3~7중량부, 흑설탕 3~7중량부를 순차로 넣고 교반/용해하고, 용해된 슬러리 100중량부를 기준으로 누룩균을 1~5중량부를 접종하고, 32~40℃에서 5~7일간 발효시켜 pH 2.5~4.0의 1차 유기산 발효물을 얻은 후 복합유산균종균을 3~5 중량부를 접종하고, 28~35℃에서 4~6일간 발효시켜 2차 유산균 발효물을 얻는 제1공정과,
제2차 추출단계로 상기 제1공정이 수행된 발효물 100중량부에 200~400중량부의 에칠알콜(Ethyl Alcohol)을 가하고 40~45℃ 조건에서 20~30시간 추출하는 제2공정과,
제3차 여과 및 멸균단계로 상기 제2공정이 수행된 추출액을 여과한 후 50℃이하의 조건에서 진공감압 증류하여 병풀 발효 유효성분 30~50% 용액으로 농축하고 농축 용액을 밀폐상태로 105±5℃를 유지하는 고압멸균기에서 1~3분 멸균 처리하는 제3공정을 거쳐 얻어진 병풀 발효 추출물이 사용되도록 적용되는 것을 특징으로 하는 피부개선용 보습화장료 조성물.
제2항에 있어서,
상기 제1공정에 사용되는 복합유산균종균은 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.)으로 락토바실러스 아시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus Brebis CD2), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 힐가르디(Lactobacillus hilgardii), 락토바실러스 말리(Lactobacillus mali), 락토바실러스 나겔리(Lactobacillus nagelii), 락토바실러스 플란타륨(Lactobacillus plantarium), 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri), 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus Rhamnosus), 락토바실러스 삿수멘시스(Lactobacillus satsumensis), 락토바실러스 서머필러스(Lactobacillus Thermophilus), 바실러스 속(Bacillus sp.)으로 바실러스 아밀로리티커스(Bacillus amylolyticus), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis), 바실러스 폴리미샤(Bacillus polymyxa), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 스테아로서머필러스(Bacillus sterothemophilus), 비피도박테리움 속(Bifidobacterium sp.)으로 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium Bifidum), 비피도박테리움 브레브(Bifidobacterium Breve), 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium Infantis), 비피도박테리움 로검(Bifidobacterium Logum), 그 외에 지오바실러스 스테아로서머필러스(Zeobacillus sterothemophilus), 지고사카라마이세스 비스포러스(Zygosaccharomyces bisporus) 중에서 선택되는 종균이 사용되도록 적용되는 것을 것을 특징으로 하는 피부개선용 보습화장료 조성물.
제2항에 있어서,
상기 제1공정에 사용되는 누룩균은 아스퍼질루스 나이가(Aspergillus nicer) NRRL 2322(ATCC 10577)이 사용되도록 적용되는 것을 것을 특징으로 하는 피부개선용 보습화장료 조성물.
노화방지와 주름개선 효과를 제공하는 화장료의 원료를 얻기 위한 병풀 발효 추출물의 제조방법에 있어서,
제1발효단계로 병풀 30~40 중량부와 정제수 60~70 중량부를 혼합하여 80±10℃ 범위에서 1~2시간 동안 습식 열처리한 후 구연산 0.5~5중량부와 포도당 3~7중량부, 흑설탕 3~7중량부를 순차로 넣고 교반/용해하고, 용해된 슬러리 100중량부를 기준으로 누룩균을 1~5중량부를 접종하고, 32~40℃에서 5~7일간 발효시켜 pH 2.5~4.0의 1차 유기산 발효물을 얻은 후, 복합유산균종균을 3~5 중량부를 추가 접종하고, 28~35℃에서 4~6일간 발효시켜 2차 유산균 발효물을 얻는 제1공정과,
제2추출단계로 상기 제1공정이 수행된 발효물 100중량부에 200~400중량부의 에칠알콜(Ethyl Alcohol)을 가하고 40~45℃ 조건에서 20~30시간 추출하는 제2공정이 포함되어 적용되는 것을 특징으로 하는 노화방지와 주름개선효과를 제공하는 보습화장료용 병풀 발효추출물의 제조방법.