KR102652401B1 - 화이트티트리 추출물의 이중 발효물을 포함하는 화장료 조성물 - Google Patents
화이트티트리 추출물의 이중 발효물을 포함하는 화장료 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
화이트티트리 추출물을 락토바실러스 속 미생물에 의해 1차 발효 및 바실러스 속 미생물에 의해 2차 발효시켜 수득한 화이트티트리 이중 발효물을 포함하는 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 화이트티트리 이중 발효물을 포함함으로써, 항산화, 항염증, 피부 보습, 각질제거, 피부 미생물 조절 등의 효과가 우수하므로 화장품 등의 원료로써 유용하게 사용될 수 있다.
Description
화이트티트리 추출물의 이중 발효물을 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다.
최근, 피부에 무해하고 안전하면서도 피부 개선 기능성을 갖는 화장품 원료에 대한 관심이 높아짐에 따라, 천연물 추출물을 화장품 원료로서 개발하기 위한 연구가 지속되고 있다.
화이트티트리(Kunzea ericoides)는 카누카(kanuka)라고도 불리며, 뉴질랜드에서 처음으로 발견된 것으로 알려져 있다. 화이트티트리잎 추출물은 화장품에서 산화방지제, 착향제 등의 목적으로 사용되고 있으며, 화이트티트리잎 오일은 화장품에서 착향제로써 사용되고 있다. 이와 같이, 화이트티트리 추출물을 화장품 원료로써 사용하기 위한 연구가 일부 이루어지고 있다.
그러나, 현재까지 화이트티트리 발효물의 피부 개선 효과에 대해서는 보고된 바 없다.
일 양상은 화이트티트리 추출물의 발효물을 포함하는 조성물을 제공하는 것이다.
구체적으로, 상기 양상은 화이트티트리 추출물을 락토바실러스 속 미생물에 의해 1차 발효시킨 후, 바실러스 속 미생물에 의해 2차 발효시켜 수득한 화이트티트리 이중 발효물을 포함하는 화장료 조성물, 피부외용제 조성물, 또는 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
다른 양상은 화이트티트리 추출물의 발효물을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
일 양상은 화이트티트리 추출물의 발효물을 포함하는 조성물을 제공한다.
구체적으로, 상기 조성물은 화이트티트리(Kunzea ericoides) 추출물을 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.) 미생물에 의해 1차 발효시킨 후, 바실러스 속(Bacillus sp.) 미생물에 의해 2차 발효시켜 수득한 화이트티트리 이중 발효물을 포함한다.
상기 화이트티트리(Kunzea ericoides)는 전초, 잎, 줄기, 뿌리, 씨앗 등을 사용할 수 있으며, 특정 부위에 제한되지 않는다. 일 구체예에서, 상기 화이트티트리는 화이트티트리의 잎일 수 있다.
용어 "추출물"은 추출 방법, 추출 용매, 추출 조건, 추출된 성분 또는 추출물의 형태를 불문하고, 천연물의 성분을 추출함으로써 얻어진 물질을 모두 포함하며, 천연물의 성분을 추출한 후 다른 방법으로 가공 또는 처리하여 얻어질 수 있는 물질도 포함한다. 예를 들어, 상기 가공 또는 처리는 희석, 농축, 건조, 정제, 분획, 여과 등을 포함할 수 있다. 따라서, 상기 추출물은 추출액, 추출액의 희석액 또는 농축액, 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 또는 이들 조정제물 또는 정제물, 이를 분획한 분획물을 포함할 수 있다.
상기 추출 방법은 열수 추출, 에탄올 추출, 가열 추출, 냉침 추출, 환류 추출, 환류냉각 추출, 초음파 추출, 아임계 추출 등 공지된 천연물 추출 방법을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 추출 용매는 물, 유기 용매, 또는 이들의 혼합물로부터 선택될 수 있다. 상기 물은 증류수 또는 정제수일 수 있다. 상기 유기 용매는 C1 내지 C6의 알코올, 아세톤, 에테르, 에틸아세테이트, 디에틸에테르, 에틸메틸케톤 및 클로로포름 중 1종 이상을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 구체예에서, 상기 추출물의 추출 용매는 물, C1 내지 C6의 알코올, 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 추출물의 추출 용매는 물, C1 내지 C4의 알코올, 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 추출물의 추출 용매는 물 및 C1 내지 C4의 알코올의 혼합물일 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 추출물의 추출 용매는 부틸렌글라이콜일 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 추출물의 추출 용매는 10%(v/v) 내지 90%(v/v), 30%(v/v) 내지 90%(v/v), 50%(v/v) 내지 90%(v/v), 60%(v/v) 내지 80%(v/v) 또는 70%(v/v) 부틸렌글라이콜일 수 있다.
상기 추출 조건은 추출 시간, 추출 온도 등 천연물의 성분을 추출하기 위한 조건을 의미한다. 상기 추출 시간은 30분 내지 164시간, 30분 내지 120시간, 30분 내지 100시간, 30분 내지 80시간, 30분 내지 60시간, 30분 내지 40시간, 1시간 내지 164시간, 1시간 내지 120시간, 1시간 내지 100시간, 1시간 내지 80시간, 1시간 내지 60시간, 1시간 내지 40시간, 10시간 내지 164시간, 10시간 내지 120시간, 10시간 내지 100시간, 10시간 내지 80시간, 10시간 내지 60시간, 10시간 내지 40시간, 10시간 내지 30시간, 24시간 내지 164시간, 24시간 내지 120시간, 24시간 내지 100시간, 또는 24시간 내지 80시간일 수 있으나, 추출 용매, 추출 온도 등 다른 조건에 따라 적절히 선택할 수 있다. 상기 추출 온도는 1 내지 100℃, 10 내지 100℃, 50 내지 100℃, 70 내지 100℃, 80 내지 100℃, 1 내지 60℃, 2 내지 60℃, 2 내지 50℃, 또는 2 내지 40℃일 수 있으나, 추출 용매, 추출 시간 등 다른 조건에 따라 적절히 선택할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 추출 온도는 약 90℃일 수 있다.
상기 화이트티트리 이중 발효물은, 화이트티트리 추출물을 제조하는 단계; 상기 화이트티트리 추출물을 락토바실러스 속 미생물에 의해 1차 발효시켜 화이트티트리 1차 발효물을 제조하는 단계; 및 상기 화이트티트리 1차 발효물을 바실러스 속 미생물에 의해 2차 발효시켜 화이트티트리 이중 발효물을 제조하는 단계에 의해 수득될 수 있다.
상기 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.) 미생물은 당업계에 공지된 것이라면 어떤 것이든 사용할 수 있다. 상기 락토바실러스 속 미생물은 특정 종류에 제한되지 않으나, 예를 들어, 락토바실러스 애시도필러스(L. acidophilus), 락토바실러스 카제이(L. casei), 락토바실러스 가세리(L. gasseri), 락토바실러스 델부르키 불가리쿠스(L. delbrueckii ssp. bulgaricus), 락토바실러스 헬베티쿠스(L. helveticus), 락토바실러스 퍼멘텀(L. fermentum), 락토바실러스 파라카제이(L. paracasei), 락토바실러스 플란타럼(L. plantarum), 락토바실러스 류테리(L. reuteri), 락토바실러스 람노서스(L. rhamnosus), 및 락토바실러스 살리바리우스(L. salivarius)로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 락토바실러스 속 미생물은 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum)일 수 있다.
상기 바실러스 속(Bacillus sp.) 미생물은 자연계에 널리 분포하는 호기성 또는 통성 혐기성 간균을 모두 포함한다. 상기 바실러스 속 미생물은 특정 종류에 제한되지 않으나, 예를 들어, 바실러스 서브틸리스(B. subtilis), 바실러스 코아귤란스(B. coagulans), 바실러스 벨레젠시스(B. velezensis), 바실러스 리케니포르미스(B. licheniformis), 바실러스 폴리퍼멘티쿠스(B. polyfermenticus), 바실러스 메틸로트로피쿠스(B. methylotrophicus), 및 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(B. amyloliquefaciens)로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 바실러스 속 미생물은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)일 수 있다. 상기 바실러스 속 미생물은 케라티네이즈(keratinase)를 생성하는 균주일 수 있다.
상기 락토바실러스 속 미생물 또는 바실러스 속 미생물은 미생물 배양액 형태로 사용될 수 있다. 상기 락토바실러스 속 미생물 또는 바실러스 속 미생물을 배양하기 위한 배양용 배지 및 배양 조건은 통상의 지식을 가진 자가 적절하게 선택하거나 변형하여 이용할 수 있다.
상기 발효 조건은 미생물의 종류에 따라 적절한 온도 및 시간을 선택할 수 있다. 예를 들어, 상기 발효는 20 내지 40℃에서 수행될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 발효는 1 내지 164시간, 1 내지 120시간, 1 내지 72시간, 1 내지 48시간, 12 내지 164시간, 12 내지 120시간, 12 내지 72시간, 12 내지 48시간, 24 내지 164시간, 24 내지 120시간, 24 내지 72시간, 24 내지 48시간, 48 내지 164시간, 48 내지 120시간, 또는 48 내지 72시간 동안 수행될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지 않는다.
상기 발효 배지는 미생물의 종류에 따라 적절히 선택할 수 있다. 상기 배지는 미생물의 종류에 따라 그 미생물을 배양할 수 있는 공지된 배지 또는 통상적인 배지를 사용할 수 있다.
상기 발효물은 화이트티트리를 미생물에 의해 발효시켜 수득한 발효액, 상기 발효액의 희석액 또는 농축액, 상기 발효액을 건조하여 얻어지는 건조물, 또는 이들 조정제물 또는 정제물, 이를 분획한 분획물 등을 포함할 수 있다.
상기 발효물은 조성물 총 중량에 대해 0.0001 내지 99.9999 중량%, 0.0001 내지 90 중량%, 0.0001 내지 50 중량%, 0.0001 내지 10 중량%, 0.001 내지 99.9999 중량%, 0.001 내지 90 중량%, 0.001 내지 50 중량%, 0.001 내지 10 중량%, 0.01 내지 99.9999 중량%, 0.01 내지 90 중량%, 0.01 내지 50 중량%, 0.01 내지 20 중량%, 또는 0.01 내지 10 중량%로 포함될 수 있으나, 목적하는 효과 및 제형 등을 고려하여 통상의 기술자가 적절한 함량을 선택할 수 있다.
상기 조성물은 화이트티트리 이중 발효물을 유효성분으로 포함할 수 있다.
상기 "유효성분으로 포함"은 본 명세서에서 언급한 효과를 나타낼 수 있는 정도로 상기 성분이 첨가되는 것을 의미하고, 약물전달 및 안정화를 위하여 다양한 성분을 부성분으로 첨가하여 다양한 형태로 제형화(formulation)되는 것을 포함하는 의미이다.
상기 조성물은 피부 상태 개선용, 피부 미용 개선용, 피부 건강 개선용, 또는 피부 질환 예방 또는 치료용 조성물일 수 있다.
상기 화이트티트리 이중 발효물은 ABTS 라디칼 소거능을 갖는 것일 수 있다. 따라서, 상기 화이트티트리 이중 발효물을 포함하는 조성물은 항산화 효과를 갖는 것일 수 있다.
상기 화이트티트리 이중 발효물은 NO (Nitric Oxide) 억제능을 갖는 것일 수 있다. 따라서, 상기 화이트티트리 이중 발효물을 포함하는 조성물은 항염증, 피부 진정, 피부 자극 완화 효과를 갖는 것일 수 있다.
상기 화이트티트리 이중 발효물은 AQP-3 (Aquaporin-3) 발현 증가능을 갖는 것일 수 있다. 따라서, 상기 화이트티트리 이중 발효물을 포함하는 조성물은 피부 보습, 피부 장벽 강화 효과를 갖는 것일 수 있다.
상기 화이트티트리 이중 발효물은 단백질 분해효소 활성을 갖는 것일 수 있다. 따라서, 상기 화이트티트리 이중 발효물을 포함하는 조성물은 각질제거 효과를 갖는 것일 수 있다.
상기 화이트티트리 이중 발효물은 피부 미생물 조절 효과를 갖는 것일 수 있다. 상기 피부 미생물 조절이란 피부 유익균에 영향을 미치지 않으면서 피부 유해균을 감소시키는 것을 의미할 수 있다. 상기 피부 유익균은 예를 들어, 스타필로코커스 에피데르미디스(Staphylococcus epidermidis)일 수 있다. 상기 피부 유해균은 예를 들어, 슈도모나스 에어루지노사(Pseudomonas aeruginosa), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 등일 수 있다.
상기 화이트티트리 이중 발효물의 ABTS 라디칼 소거능, NO 억제능, AQP-3 발현 증가능, 단백질 분해효소 활성, 피부 미생물 조절 효과는, 발효시키지 않은 화이트티트리 추출물 또는 락토바실러스 발효 여과물에 비해 현저히 우수할 수 있다.
따라서, 상기 화이트티트리 이중 발효물을 포함하는 조성물은 항산화용, 항염증용, 피부 진정용, 피부 자극 완화용, 피부 보습용, 피부 장벽 강화용, 각질제거용, 또는 피부 미생물 조절용일 수 있다.
용어 "피부 보습"은 피부 수분을 유지하거나 수분 손실을 방지하는 모든 작용을 의미할 수 있다. 피부 보습 효과는 피부의 주름 개선, 탄력도 증가에 도움을 줄 수 있다.
용어 "피부 장벽 강화"는 피부 가장 바깥쪽에 위치하여 수분과 영양 손실을 막아주는 피부 장벽의 기능이 증진되는 모든 작용을 의미할 수 있다.
상기 "항염증"이란 "염증 개선", "염증 억제"과 혼용될 수 있으며, 예를 들어 산화질소(NO)의 생성이 억제되는 모든 작용을 포함할 수 있다.
상기 "피부 진정"이란 손상되거나 자극받은 피부의 증상(예: 열감, 통증, 붉어짐, 가려움 등)을 가라앉히고 안정되게 하거나, 피부를 회복시키는 모든 작용을 포함할 수 있다.
상기 "피부 질환"은 피부 장벽 기능 손상에 의한 질환, 또는 피부 염증 질환일 수 있다.
상기 피부 장벽 기능 손상은 피부 장벽의 기능이 저하되거나 손상되어 피부에 나타나는 모든 변화를 의미할 수 있다. 예를 들어, 피부 주름 증가, 건조, 피부염, 아토피 피부염, 알레르기성 피부염, 여드름 등을 포함할 수 있다.
상기 피부 염증 질환은 피부 상처, 피부염, 아토피 피부염, 소양증, 습진성 피부질환, 건성 습진, 홍반, 두드러기, 건선, 약발진, 및 여드름으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것일 수 있다.
용어, "피부 건강"이란 피부의 기능을 유지하고, 외부 자극으로부터 피부를 보호하는 모든 작용을 의미할 수 있으며, 예를 들어, 피부 장벽 기능 유지; 피부 보습; 자외선 등 외부 요인으로부터의 보호; 탄력 유지; 피부 손상의 진정 및 회복 등을 포함할 수 있다.
용어, "예방"은 질병의 발생을 억제하는 것을 포함한다. 용어, "치료"는 질병의 발전의 억제, 경감, 또는 제거를 포함한다. 용어 "개선"은 상태의 완화 또는 치료와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 조성물은 화장료 조성물일 수 있다.
상기 화장료 조성물은 본 명세서에 개시된 유효성분 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들, 기능성 첨가물 등을 추가로 포함할 수 있으며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 계면활성제, 분산제, 점증제, 방부제, 비타민, 안료, 향료 등과 같은 통상적인 보조제, 그리고 화장품학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다.
상기 화장료 조성물은 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있다. 예를 들면, 상기 화장료 조성물은 화장수, 크림, 에센스, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 앰플, 바디 로션, 바디 오일, 바디 젤, 샴푸, 린스, 헤어 컨디셔너, 헤어 젤, 파운데이션, 립스틱, 마스카라, 또는 메이크업 베이스의 화장료 제형을 갖는 것일 수 있다.
대안적으로, 상기 조성물은 피부외용제 조성물일 수 있다.
상기 피부외용제는 크림, 겔, 연고, 피부 유화제, 피부 현탁액, 경피전달성 패치, 약물 함유 붕대, 로션, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 피부외용제는 통상 화장품이나 의약품 등의 피부외용제에 사용되는 성분, 예를 들면 수성성분, 유성성분, 분말성분, 알코올류, 보습제, 증점제, 자외선흡수제, 미백제, 방부제, 산화방지제, 계면활성제, 향료, 색제, 각종 피부 영양제, 또는 이들의 조합과 필요에 따라서 적절하게 배합될 수 있다.
대안적으로, 상기 조성물은 약학적 조성물일 수 있다.
상기 약학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 희석제 또는 담체를 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 희석제는 유당, 옥수수 전분, 대두유, 미정질 셀룰로오스, 만니톨, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 담체는 부형제, 붕해제, 결합제, 활택제, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 부형제는 미결정 셀룰로오즈, 유당, 저치환도 히드록시셀룰로오즈, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 붕해제는 카르복시메틸셀룰로오스 칼슘, 전분글리콜산 나트륨, 무수인산일수소 칼슘, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 결합제는 폴리비닐피롤리돈, 저치환도 히드록시프로필셀룰로오즈, 히드록시프로필셀룰로오즈, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 활택제는 스테아린산 마그네슘, 이산화규소, 탈크, 또는 그 조합일 수 있다.
상기 약학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여 제형으로 제형화될 수 있다. 경구 투여 제형은 과립제, 산제, 액제, 정제, 캅셀제, 건조시럽제 등일 수 있다. 비경구 투여 제형은 주사제, 점적제, 연고제, 로션, 겔, 크림, 스프레이, 현탁제, 유제, 좌제, 패치 등일 수 있다.
다른 양상은 화이트티트리 추출물의 발효물을 제조하는 방법을 제공한다.
상기 방법은 화이트티트리 추출물을 제조하는 단계; 상기 화이트티트리 추출물을 락토바실러스 속 미생물에 의해 1차 발효시켜 화이트티트리 1차 발효물을 제조하는 단계; 및 상기 화이트티트리 1차 발효물을 바실러스 속 미생물에 의해 2차 발효시켜 화이트티트리 이중 발효물을 제조하는 단계를 포함한다.
중복되는 내용은 본 명세서의 복잡성을 고려하여 생략하며, 본 명세서에서 달리 정의되지 않은 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것이다.
일 양상에 따른 조성물은 화이트티트리 추출물을 락토바실러스 속 미생물 및 바실러스 속 미생물에 의해 이중발효시킨 화이트티트리 이중 발효물을 포함함으로써, 항산화, 항염증, 피부 보습, 각질제거, 피부 미생물 조절 등의 효과가 우수하므로, 화장품 등의 원료로써 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 ABTS 라디칼 소거능 (%)을 나타낸 그래프이다. L-Ascorbic acid: 양성대조군, 화이트티트리추출물: 제조예 1의 화이트티트리 추출물, Lactobacillus plantarum: 제조예 3의 락토바실러스 발효 여과물, White-Keratinase: 실시예 1의 화이트티트리 이중 발효물.
도 2는 NO 억제능을 확인한 그래프이다. L-NMMA: 양성대조군, 화이트티트리추출물: 제조예 1의 화이트티트리 추출물, Lactobacillus plantarum: 제조예 3의 락토바실러스 발효 여과물, White-Keratinase: 실시예 1의 화이트티트리 이중 발효물.
도 3는 AQP-3 유전자 발현 정도를 나타낸 그래프이다. 화이트티트리추출물: 제조예 1의 화이트티트리 추출물, Lactobacillus plantarum: 제조예 3의 락토바실러스 발효 여과물, White-Keratinase: 실시예 1의 화이트티트리 이중 발효물, CaCl2: 양성대조군.
도 4는 단백질 분해 효능을 확인한 페이퍼 디스크 실험 결과이다. 발효 후: 실시예 1의 화이트티트리 이중 발효물, 발효 전: 제조예 1의 화이트티트리 추출물.
도 5는 실시예 1의 화이트티트리 이중 발효물에서 공배양 전후에 따른 피부 미생물의 균수 변화를 나타낸 그래프이다.
도 2는 NO 억제능을 확인한 그래프이다. L-NMMA: 양성대조군, 화이트티트리추출물: 제조예 1의 화이트티트리 추출물, Lactobacillus plantarum: 제조예 3의 락토바실러스 발효 여과물, White-Keratinase: 실시예 1의 화이트티트리 이중 발효물.
도 3는 AQP-3 유전자 발현 정도를 나타낸 그래프이다. 화이트티트리추출물: 제조예 1의 화이트티트리 추출물, Lactobacillus plantarum: 제조예 3의 락토바실러스 발효 여과물, White-Keratinase: 실시예 1의 화이트티트리 이중 발효물, CaCl2: 양성대조군.
도 4는 단백질 분해 효능을 확인한 페이퍼 디스크 실험 결과이다. 발효 후: 실시예 1의 화이트티트리 이중 발효물, 발효 전: 제조예 1의 화이트티트리 추출물.
도 5는 실시예 1의 화이트티트리 이중 발효물에서 공배양 전후에 따른 피부 미생물의 균수 변화를 나타낸 그래프이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[제조예]
제조예 1. 화이트티트리 추출물의 제조
화이트티트리(Kunzea ericoides) 잎 100 g에 70%(v/v) 부틸렌글라이콜(butylene glycol) 500 mL를 가하여 90℃에서 24시간 동안 추출하였다. 이후, 8 ㎛ 필터를 이용하여 원물을 제거하고, 0.45 ㎛ 멤브레인 필터로 여과하여 화이트티트리 추출물을 제조하였다.
제조예 2. 락토바실러스 배양액의 제조
MRS 배지 55 g에 정제수 1,000 mL을 첨가하여 121℃에서 15분 동안 고압멸균 한 뒤, 상온까지 식혀주었다. 이후, 병풀에서 분리한 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) 균주(수탁번호: KCTC14687BP)를 배양액 부피의 2%가 되도록 접종한 뒤 180 rpm, 37℃의 조건에서 48시간 동안 배양하였다.
제조예 3. 락토바실러스 발효 여과물의 제조
상기 제조예 2의 락토바실러스 배양액을 4,500 rpm에서 20분 동안 원심분리하여 균체를 제거하고, 상등액을 수득한 뒤 0.45 ㎛의 멤브레인 필터로 여과하여 락토바실러스 발효 여과물을 제조하였다.
제조예 4. 바실러스 배양액의 제조
Nutrient 배지 55 g에 정제수 1,000 mL을 넣고 121℃에서 15분 동안 고압멸균 한 뒤, 상온까지 식혀주었다. 이후, 낫또에서 분리한 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)를 배지 부피의 2%가 되도록 접종한 뒤, 180 rpm, 37℃의 조건에서 48시간 동안 배양하였다.
[실시예]
실시예 1. 화이트티트리 발효물의 제조
실시예 1-1. 화이트티트리 1차 발효물의 제조
제조예 1의 화이트티트리 추출물을 제조예 2의 락토바실러스 배양액으로 발효시켜 화이트티트리 발효물을 제조하였다.
구체적으로, 제조예 1의 화이트티트리 추출물에 제조예 2의 락토바실러스 배양액을 추출물 부피의 2%(v/v)의 농도로 접종하고, 37℃, 150 rpm으로 72시간 동안 배양하여 화이트티트리 1차 발효물을 제조하였다. 발효물을 4,500 rpm에서 20분 동안 원심분리하여 균체를 제거하고, 상등액을 수득한 뒤 0.45 ㎛의 멤브레인 필터로 여과하여 여과액을 수득하였다. 상기 여과액을 하기 실험에서 화이트티트리 1차 발효물로 사용하였다.
실시예 1-2. 화이트티트리 2차 발효물의 제조
실시예 1-1의 화이트티트리 1차 발효물을 제조예 4의 바실러스 배양액으로 발효시켜 화이트티트리 2차 발효물을 제조하였다.
구체적으로, 실시예 1-1의 화이트티트리 1차 발효물에 제조예 4의 바실러스 배양액을 추출물 부피의 2%(v/v)의 농도로 접종하고, 37℃, 150 rpm으로 72시간 동안 배양하여 화이트티트리 2차 발효물을 제조하였다. 발효물을 4,500 rpm에서 20분 동안 원심분리하여 균체를 제거하고, 상등액을 수득한 뒤 0.45 ㎛의 멤브레인 필터로 여과하여 여과액을 수득하였다. 상기 여과액을 하기 실험에서 화이트티트리 이중 발효물로 사용하였다. 상기 화이트티트리 이중 발효물은 "White-Keratinase"로 명명하였다.
[실험예]
실험예 1. 항산화 활성 측정
일 실시예에 따른 화이트티트리 이중 발효물의 항산화 활성을 확인하기 위한 실험을 하였다.
구체적으로, 안정한 자유라디칼인 ABTS (2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid))를 이용하여, 시료와의 반응에 의해 ABTS 라디칼이 감소하는 정도를 측정하였다. 제조예 1의 화이트티트리 추출물, 제조예 3의 락토바실러스 발효 여과물, 또는 실시예 1의 화이트티트리 이중 발효물을 시료로 사용하였으며, 각 시료는 1%(v/v) 농도로 사용하였다. L-아스코르브산 (L-Ascorbic acid) 100 ㎍/㎖ 처리 군을 양성대조군으로 하였다.
도 1은 ABTS 라디칼 소거능 (%)을 나타낸 그래프이다.
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 제조예 1의 화이트티트리 추출물, 제조예 3의 락토바실러스 발효 여과물, 실시예 1의 화이트티트리 이중 발효물은 모두 항산화 활성을 갖는 것을 확인하였다. 특히, 실시예 1의 화이트티트리 이중 발효물은 화이트티트리 추출물 또는 락토바실러스 발효 여과물에 비해 현저히 우수한 항산화 활성을 갖는 것을 확인할 수 있었다.
따라서, 실시예 1의 화이트티트리 이중 발효물은 항산화 효과가 우수함을 알 수 있었다.
실험예 2. 항염증 및 피부 진정 효능 확인
일 실시예에 따른 화이트티트리 이중 발효물의 항염증 및 피부 진정 효능을 확인하기 위한 실험을 하였다.
구체적으로, 마우스 대식세포 Raw 264.7에 LPS (liposaccharides)를 처리한 후, 각 시료를 1%(v/v) 농도로 처리하여 NO (Nitric Oxide) 유전자 발현 정도를 측정하였다. 아무것도 처리하지 않은 군(MO: Media Only)을 음성대조군으로 하였다. L-NMMA 30 ㎍/㎖을 처리한 군을 양성대조군으로 하였다.
도 2는 NO 억제능을 확인한 그래프이다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 제조예 1의 화이트티트리 추출물과 실시예 1의 화이트티트리 이중 발효물은 피부 자극을 유발하는 NO 유전자 발현을 유의적으로 억제함을 확인할 수 있었다. 특히, 실시예 1의 화이트티트리 이중 발효물은 가장 우수한 NO 억제능을 나타내었다.
따라서, 실시예 1의 화이트티트리 이중 발효물은 항염증, 피부 진정, 피부 자극 완화 효과가 우수함을 알 수 있었다.
실험예 3. 피부 보습 및 피부 장벽 강화 효능 확인
일 실시예에 따른 화이트티트리 이중 발효물의 피부 보습 및 피부 장벽 강화 효능을 확인하기 위한 실험을 하였다.
구체적으로, 인간각질형성세포(keratinocyte)를 배양한 후, 각 시료를 1%(v/v) 농도로 처리하여 AQP-3 (Aquaporin-3) 유전자 발현 정도를 확인하였다. CaCl2 2 mM 처리 군을 양성대조군으로 하였다.
도 3는 AQP-3 유전자 발현 정도를 나타낸 그래프이다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 실시예 1의 화이트티트리 이중 발효물은 제조예 1의 화이트티트리 추출물 또는 제조예 3의 락토바실러스 발효 여과물에 비해 유의적으로 우수한 AQP-3 발현 증가 효능을 갖는 것을 확인하였다.
따라서, 실시예 1의 화이트티트리 이중 발효물은 피부 보습 및 피부 장벽 강화 효과가 우수함을 알 수 있었다.
실험예 4. 각질 제거 효과 확인
일 실시예에 따른 화이트티트리 이중 발효물의 단백질 분해효소 활성에 따른 각질 제거 효과를 확인하였다.
구체적으로, 1% 스킴 밀크 아가 플레이트(skim milk agar plate)에 원형의 페이퍼 디스크(paper disc)를 올려 배양시킨 후, 클리어 존(clear zone)의 직경을 통해 단백질 분해 효능을 확인하였다.
도 4는 단백질 분해 효능을 확인한 페이퍼 디스크 실험 결과이다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 실시예 1의 화이트티트리 이중 발효물은 제조예 1의 화이트티트리 추출물에 비해 클리어 존이 선명하고 지름이 크게 형성되었으므로, 콜로니에 따른 단백질 분해 효능이 더 우수함을 확인하였다.
따라서, 실시예 1의 화이트티트리 이중 발효물은 단백질 분해 효능이 우수하므로, 각질제거 효과가 우수함을 알 수 있었다.
실험예 5. 피부 미생물 조절 효과 확인
일 실시예에 따른 화이트티트리 이중 발효물의 피부 미생물 조절 효과를 확인하기 위한 실험을 하였다.
구체적으로, 미생물 배지는 TSB (Tryptic Soy Broth, BD Difco, USA)를 사용하였다. 균의 생장은 적정 배지에 해당 균주를 1Х106 CFU/mL 농도로 접종하고 37℃에서 24 h 배양한 뒤 600 nm에서 흡광도를 측정하여 생장률을 비교하거나, 연속 희석법을 통해 실제 생균수를 확인하여 생장률을 비교하였다. 시험시료와 동일한 양의 인산완충식염수(PBS)를 첨가한 실험군을 기준으로 백분율로 비교하였다. 피부 유해균과 유익균의 공배양 12웰 플레이트에 10% TSB 1 mL을 넣고, 유해균(Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus)을 1Х106 CFU/mL 농도로 접종하였다. 그 위로 0.4 ㎛ 세포 배양 인서트(cell culture insert)를 올리고, 10% TSB 1 mL에 유익균(Staphylococcus epidermidis)을 1Х106 CFU/mL 농도로 접종하였다. 대조군으로는 동일한 양의 인산완충식염수(PBS)를 처리하였다. 그 후 32℃에서 12 h 배양 한 뒤 각각의 균수를 확인하여 생장 정도를 비교하였다.
도 5는 실시예 1의 화이트티트리 이중 발효물에서 공배양 전후에 따른 피부 미생물의 균수 변화를 나타낸 그래프이다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 공배양 전에는 피부 유익균인 S. epidermidis와 피부 유해균인 S. aureus, P. aeruginosa의 균수의 변화가 없음을 확인할 수 있었다. 그러나, 실시예 1의 화이트티트리 이중 발효물에서 공배양 후, 피부 유익균인 S. epidermidis에는 아무런 영향을 미치지 않았지만, 피부 유해균인 S. aureus와 P. aeruginosa는 균수가 감소함을 확인하였다.
따라서, 실시예 1의 화이트티트리 이중 발효물은 피부 유익균에 영향을 미치지 않으면서 피부 유해균을 감소시킴으로써 피부 미생물 조절 효과를 가짐을 알 수 있었다.
종합하면, 화이트티트리 추출물을 락토바실러스로 1차 발효 후, 바실러스로 2차 발효하여 수득한 화이트티트리 이중 발효물은 아래와 같은 효과를 가짐을 확인하였다:
(i) ABTS 라디칼 소거능을 가지므로, 항산화 효과가 우수함;
(ii) NO 억제능을 가지므로, 항염증, 피부 진정, 피부 자극 완화 효과가 우수함;
(iii) AQP-3 발현 증가능을 가지므로, 피부 보습, 피부 장벽 강화 효과가 우수함;
(iv) 단백질 분해효소 활성을 가지므로, 각질제거 효과가 우수함; 및
(v) 피부 유익균(예: S. epidermidis)에 영향을 미치지 않으면서 피부 유해균(예: S. aureus, P. aeruginosa)을 감소시키므로, 피부 미생물 조절 효과가 우수함.
Claims (9)
- 화이트티트리(Kunzea ericoides) 추출물을 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum)에 의해 1차 발효시킨 후, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)에 의해 2차 발효시켜 수득한 화이트티트리 이중 발효물을 포함하는, 항산화용 화장료 조성물.
- 화이트티트리(Kunzea ericoides) 추출물을 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum)에 의해 1차 발효시킨 후, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)에 의해 2차 발효시켜 수득한 화이트티트리 이중 발효물을 포함하는, 항염증용, 피부 진정용, 또는 피부 자극 완화용 화장료 조성물.
- 화이트티트리(Kunzea ericoides) 추출물을 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum)에 의해 1차 발효시킨 후, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)에 의해 2차 발효시켜 수득한 화이트티트리 이중 발효물을 포함하는, 피부 보습용 또는 피부 장벽 강화용 화장료 조성물.
- 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, ABTS 라디칼 소거능, NO (Nitric Oxide) 억제능, 또는 AQP-3 (Aquaporin-3) 발현 증가능을 갖는 것인 화장료 조성물.
- 화이트티트리(Kunzea ericoides) 추출물을 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum)에 의해 1차 발효시킨 후, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)에 의해 2차 발효시켜 수득한 화이트티트리 이중 발효물을 포함하는, 각질제거용 화장료 조성물.
- 청구항 5에 있어서, 단백질 분해효소 활성을 갖는 것인 화장료 조성물.
- 화이트티트리(Kunzea ericoides) 추출물을 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum)에 의해 1차 발효시킨 후, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)에 의해 2차 발효시켜 수득한 화이트티트리 이중 발효물을 포함하는, 피부 미생물 조절용 화장료 조성물.
- 청구항 7에 있어서, 피부 유익균에 영향을 미치지 않으면서 피부 유해균을 감소시키는 피부 미생물 조절 효과를 갖는 것이며,
상기 피부 유익균은 스타필로코커스 에피데르미디스(Staphylococcus epidermidis)이고,
상기 피부 유해균은 슈도모나스 에어루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 또는 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)인 것인 화장료 조성물. - 청구항 1 내지 3, 5 및 7 중 어느 한 항에 있어서, 상기 락토바실러스 플란타럼은 수탁번호 KCTC14687BP로 기탁된 것인 화장료 조성물.
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