JP6596135B2

JP6596135B2 - 腸内環境改善、高脂肪食摂取による体重増加抑制またはピロリ菌抑制のための組成物

Info

Publication number: JP6596135B2
Application number: JP2018150680A
Authority: JP
Inventors: 和主男前原; 義輝前原; 敏浩栗栖; 泰三渡辺; 秀夫松▲崎▼; 史郎栃谷; 隆介佐久間
Original assignee: 株式会社マックスプロバイオ
Priority date: 2017-09-29
Filing date: 2018-08-09
Publication date: 2019-10-23
Anticipated expiration: 2038-08-09
Also published as: JP2019064997A

Description

本発明は、人体の腸内環境の改善、高脂肪食摂取による体重増加の抑制、ピロリ菌の抑制を実現するサプリメントや、動物の腸内環境の改善、高脂肪食摂取による体重増加の抑制、ピロリ菌の抑制を実現する飼料配合物として有用な発酵型の組成物に関する。

近年、滋養強壮、健康増進、ダイエット、美容、各種既往症の改善等の様々な目的で摂取する、極めて多種多様なサプリメントが登場している。これらのうち、健康増進を主目的としたサプリメントとして、種々の基材に乳酸菌、酵母菌、麹菌等を加えて発酵させたものが多々提案され、また商品化されている。例えば、特許発明としての提案では、カルシウム含有基材に特定の１３種の土壌菌を吸着発酵させたもの（特許文献１）、米糠に乳酸菌及び酵母菌を加えて発酵させたもの（特許文献２）、植物性材料に糖源と共に乳酸菌及び酵母菌を加えて発酵させたもの（特許文献３）、米糠に乳酸菌及び酵母菌を加えて発酵させ、水を加えて発酵米糠液として分離したもの（特許文献４）、複数種の植物片を混合した原材料に麹菌発酵、乳酸菌発酵、酵母菌発酵を順次施したもの（特許文献５）等がある。

特開平８−２９８９８２号公報特開２００１−２３８６６４号公報特開２００３−２５９８３５号公報特開２００４−１４７５５１号公報特開２０１１−２１７６７８号公報

しかしながら、従来の発酵型のサプリメントでは、発揮し得る効能は健康増進に寄与するごく狭い範囲の作用に限定されており、その上、生活の質を改善する効果を併せ持つものがなく、且つ効能の程度や安定性、持続性、継続摂取による効能亢進作用等で充分とは言えず、総合的な健康増進サプリメントとして物足りないものであった。

本発明は、上述の事情に鑑み、腸内環境の改善による整腸、代謝、吸収促進、便尿の臭いや体臭の低減、ピロリ菌抑制等の多岐にわたる効能を発揮でき、更に動物に対しても人と同様の効果を期待できる健康増進組成物を提供することを目的としている。

上記目的を達成するために、本発明の請求項１に係る組成物は、腸内環境改善、高脂肪食摂取による体重増加抑制またはピロリ菌抑制のための組成物であり、セルロース分解性菌として、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）Ｍ−４菌株（受託番号：ＮＩＴＥＰ−０２５３８)と、バチルス・ズブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）Ｍ−５菌株（受託番号：ＮＩＴＥＰ−０２５３９)と、バチルス・ズブチルスの近縁種であるバチルス・スピーシーズ（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ.）Ｍ−６菌株（受託番号：ＮＩＴＥＰ−０２５４０)との少なくとも３種のバチルス属菌を含む非病原性菌類による米糠粉末の発酵処理物からなることを特徴としている。

請求項２の発明は、上記請求項１の組成物において、非病原性菌類が、セルロース分解性菌と共に、乳酸菌及びビフィズス菌と麹菌より選ばれる少なくとも１種を含むことを特徴としている。

請求項３の発明は、上記請求項２の組成物において、乳酸菌がラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｃａｓｅｉ）ＮＢＲＣ１５８８３菌株であることを特徴としている。

請求項４の発明は、上記請求項２又は３の組成物において、ビフィズス菌がビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｂｉｆｉｄｕｍ）ＮＢＲＣ１０００１５菌株であることを特徴としている。

請求項５の発明は、上記請求項２〜４のいずれかの組成物において、麹菌がアスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ）ＮＢＲＣ６２１５菌株であることを特徴としている。

請求項６の発明は、上記請求項１〜５のいずれかの組成物において、非病原性菌類における総菌数の２０％以上がバチルス属菌からなることを特徴としている。

本発明の組成物は、セルロース分解性菌として新規な３種のバチルス属菌を少なくとも含む非病原性菌類の生菌が米糠に包含された形で、バランスよく共存して安定した発酵状態を維持しており、その発酵に伴って産生した酵素による米糠の分解物として、蛋白質分解物のペプチド、各種アミノ酸、オリゴ糖、ビタミンＢ１，Ｂ２，ナイアシンの如きビタミンＢ群、ビタミンＥ、亜鉛の如きミネラル等の有用成分を豊富に含んでいる。そして、この組成物を経口摂取することにより、これら有用菌の複合体が胃液で死滅することなく腸内へ届いて増殖し、悪玉菌を減らして善玉菌を増やすために腸内環境が著しく改善するため、優れた整腸作用が発現する。その結果、便秘や下痢が抑えられる。加えて、高脂肪食を摂取しても体重増加を抑制することも期待できる。更に、有用菌の働きにより、胃内のピロリ菌の増殖が抑制されることも認められており、胃癌や胃潰瘍の防止効果も期待できる。

そして、本発明の組成物において、上記の種々の効果をより高める上で、非病原性菌類が、前記の新規な３種のセルロース分解性菌と共に、乳酸菌及びビフィズス菌と麹菌より選ばれるを少なくとも１種を含むことが好ましい。その乳酸菌としては既知のラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｃａｓｅｉ）ＮＢＲＣ１５８８３菌株が、ビフィズス菌としては既知のビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｂｉｆｉｄｕｍ）ＮＢＲＣ１０００１５菌株が、麹菌としては既知のアスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ）ＮＢＲＣ６２１５菌株が、それぞれ好適なものとして挙げられる。また、非病原性菌類における総菌数の２０％以上がバチルス属菌であることが好ましい。

本発明の健康増進組成物における非病原性菌類に含まれるバチルス・アミロリケファシエンスＭ−４菌株を解析した16S rDNA部分塩基配列に基づく簡易分子系統樹を示す模式図である。同非病原性菌類に含まれるバチルス・ズブチルスＭ−５菌株を解析した同簡易分子系統樹を示す模式図である。同非病原性菌類に含まれるバチルス・スピーシーズＭ−６菌株を解析した同簡易分子系統樹を示す模式図である。同健康増進組成物の摂取及び非摂取のマウス群における体重増加量推移を示す体重−経過日数の相関図である。同マウス群における摂餌量推移を示す摂餌量−経過日数の相関図である。同マウス群における明期・暗期運動量を示す移動距離測定図である。同マウス群における２４時間周期運動量を示す移動距離−経過日数の相関図である。牛糞中の善玉菌及び悪玉菌の割合を示し、（ａ）は健康増進組成物を非投与の牛糞の分析データ図、（ｂ）は投与した牛糞の分析データ図である。ピロリ菌感染試験における同健康増進組成物の投与及び非投与のマウス群の胃壁に残留するピロリ菌数を示すデータ図である。

本発明の健康増進組成物は、種々の微生物が持つ生物学的な特徴を充分に考慮し、米糠発酵物中で異種の菌類が最大限に各々の生物活性を発揮し、且つ微生物間で良好な相互作用を及ぼし合うことで、人や動物の健康を害する障害を取り除けるように、米糠粉末に加える微生物の種類と組合せを厳選したものである。すなわち、この健康増進組成物は、米糠粉末が、セルロース分解性菌としてバチルス・アミロリクエフアシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)Ｍ−４菌株と、バチルス・ズブチルス(Bacillus subtilis)Ｍ−５菌株と、バチルス・ズブチルスの近縁種であるバチルス・スピーシーズ(Bacillus sp.)Ｍ−６菌株との新規な３種を少なくとも含む非病原性菌類によって発酵処理された発酵物からなる。

セルロース分解性菌である上記３種のバチルス属菌は、腸内で協動して糖質や蛋白質を分解して消化を助け、腐敗便をなくする役割を果たすと共に、米糠や食物中のセルロースを分解して糖類を産生するため、乳酸菌及びビフィズス菌を増やす作用があり、また多くの有機酸を産生することで有害菌の増殖を抑え、且つ腸の蠕動も促進させるため、腸内フローラを改善して優れた腸内環境を形成すると共に、その優れた腸内環境を安定的に維持するのに貢献する。加えて、バチルス属菌は、一般に高い高温耐性を備えており、１００℃前後の高温でも芽胞を形成して生き延びることから、後述する本健康増進組成物の製造時の発酵過程で発生する５０℃前後の温度条件下でも活性が低下せず、米糠に含まれるセルロース等の成分を分解することができる。一方、一般的な菌や糸状菌では５０℃前後の温度にも耐えられないものが多いため、結果として本発明の健康増進組成物が特定の微生物種を優先して含有する状態を安定に維持することに繋がっている。

上記３種のセルロース分解性菌であるバチルス・アミロリクエフアシエンスＭ−４菌株（以下、Ｍ−４菌株と略称する）、バチルス・ズブチルスＭ−５菌株（以下、Ｍ−５菌株と略称する）、バチルス・スピーシーズＭ−６菌株（以下、Ｍ−６菌株と略称する）は、いずれも本発明者らによって見出された新規なバチルス属菌であり、独立行政法人製品評価技術基板機構（ＮＩＴＥ）・特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に寄託し、Ｍ−４菌株は受託番号ＮＩＴＥＰ−０２５３８、Ｍ−５菌株は受託番号ＮＩＴＥＰ−０２５３９、Ｍ−６菌株は受託番号ＮＩＴＥＰ−０２５４０としてそれぞれ受託されている。

上記のＭ−４菌株、Ｍ−５菌株、及びＭ−６菌株が新規なバチルス属菌であることは、いずれもＤＮＡ解析による同定方法によって確認されている。その同定方法は、次のとおりである。
ＤＮＡ抽出：アクロモペプチダーゼ(Wako Pure Chemical Indutrises,Japan)
ＰＣＲ増幅：PrimeSTAR HS DNA Polymerase(Takara Bio,Japan)
サイクルシーエンス：BigDye Terminater v3.1 Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems,USA)
塩基配列決定：ChromasPro 1.7(Technelysium,AUS)
ソフトウェア：テクノスルガ・ラボ微生物同定システム(TechnoSuruga Laboratory,Japan)
データベース：DB-BA11.0(TechnoSuruga Laboratory)
国際塩基配列データベース(DDBJ/ENA(EMBL)/GenBank)
同定判断：16S rDNA部分塩基配列に基づく解析

上記同定方法により、上記３種のバチルス属菌について16S rDNA部分塩基配列に基づく解析を行ったところ、次の結果が得られた。
〔Ｍ−４菌株〕
〇同定種：Bacillus amyloliquefaciens、バイオセーフティレベル１。
〇BLAST検索による最も高い相同性の種（基準株）：Bacillus amyloliquefaciens subsp.amyloliquefaciens NBRC 15535^T株・・・相同率99.8％。
〔Ｍ−５菌株〕
〇同定種：Bacillus subtilisに近縁なBacillus sp.、バイオセーフティレベル１
〇BLAST検索による最も高い相同性の種（基準株）：Bacillus subtilis subsp.subtilis DSM 10^T株・・・相同率99.6％
〔Ｍ−６菌株〕
〇同定種：Bacillus subtilisに近縁なBacillus sp.、バイオセーフティレベル１
〇BLAST検索による最も高い相同性の種（基準株）：Bacillus subtilis subsp.subtilis DSM 10^T株・・・相同率99.6％

上記３種のバチルス属菌について、各々の16S rDNA部分塩基配列に基づく簡易分子系統樹を図１〜図３に示す。図１中のSIID19238-04がＭ−４菌株、図２中のSIID19238-05がＭ−５菌株、図３中のSIID19238-06がＭ−６菌株である。なお、図１〜図３において、左上の線はスケールバー、系統枝の分岐に位置する数字はブートストラップ値、株名の末尾のＴはその種の基準株(Type strain)、をそれぞれ示す。

なお、これら３種のバチルス属菌は、いずれも標準寒天培地（日水社製）上で褐色を帯びた黄白色のコロニーを生成する。そのコロニー形状はやや不定形に近い円形であり、芽胞を形成する。また、Ｍ−６菌株の菌体は粘性を帯びるという特徴がある。

本発明の健康増進組成物は、セルロース分解菌として上記３種の新規なバチルス属菌を必須として含む非病原性菌類を用いて米糠を発酵させたものであるが、その非病原性菌類には上記３種の新規なバチルス属菌と共に他のセルロース分解菌、乳酸菌、ビフィズス菌、麹菌、酵母菌等を含んでもよく、特に乳酸菌及びビフィズス菌と麹菌より選ばれる少なくとも１種を含むことが好ましい。すなわち、この健康増進組成物では、多岐にわたる効能を発揮させる上で、菌種によるセルロース分解能や発酵機構の違いに基づく産生物の多様性を拡大することが好ましい。ただし、セルロースを高率で含む米糠が発酵基材であるから、非病原性菌類における総菌数の２０％以上がセルロース分解菌のバチルス属菌であることが望ましく、これによってより高い健康増進効果及び生活の質の改善効果が得られる。

乳酸菌は、一般的に、ブドウ糖等の糖類を分解して乳酸を産生することで、腸内環境を酸性にして悪玉菌の増殖を抑制し、腸内の菌叢を健全に保つ作用を発揮することが知られている。本発明では、前記の非病原性菌類に種々の乳酸菌を含ませることができるが、好ましい乳酸菌としてラクトバチルス・カゼイ(Lactobacillus casei)が挙げられる。すなわち、ラクトバチルス・カゼイは、バイオセーフティレベル１であってプロバイオテックな効能に優れた菌種であり、上記作用に優れており、便秘の改善やコレステロールの低下、免疫力の向上等に大きく貢献する。そして、本発明においては、ラクトバチルス・カゼイの中でも、特に既知のラクトバチルス・カゼイＮＢＲＣ15883菌株が、より高い健康増進効果及び生活の質の改善効果を発揮するものとして推奨される。

ビフィズス菌は、一般的に、高酸素環境を嫌うために腸の中でも主に酸素の少ない大腸に棲息し、糖を分解して乳酸と共に酢酸を産生するため、強い殺菌力を発揮して腸粘膜の保護に貢献する作用を有することが知られている。そして、本発明では、前記の非病原性菌類に種々のビフィズス菌を含ませることができるが、特に既知のビフィズス菌であるビフィドバクテリウム・ビフィダム(Bifidobacterium bifidum)ＮＢＲＣ100015菌株が好適なものとして挙げられる。すなわち、このビフィドバクテリウム・ビフィダムＮＢＲＣ100015菌株は、バイオセーフティレベル１であってプロバイオテックな効能に優れた菌種であり、上記作用に優れており、糖の燃焼を促進してダイエット効果を高めることにも大きく寄与する。

麹菌は、菌体内で造った蛋白質を放出する能力に優れ、その蛋白質分解能や糖化作用を通して、食品の消化吸収を助けると共に、栄養補給や生理活性物質の付与にも貢献する。そして、本発明では、前記の非病原性菌類に種々の麹菌を含ませることができるが、特に上記作用に優れる好適なものとして、既知の麹菌であるバイオセーフティレベル１のアスペルギルス・オリゼー(Aspergillus oryzae)ＮＢＲＣ6215菌株が挙げられる。

その他、上記３種の新規なバチルス属菌と併用可能なセルロース分解菌としては、特に制約されず、例えば上記３種以外のバチルス属菌、ブレビバチルス属菌、パニエバチルス属菌等が挙げられる。また、酵母菌は、一般的に、脂質及び糖質を分解してアミノ酸やクエン酸、炭酸ガスを生成する作用を有するが、好ましいものとして、いずれもバイオセーフティレベル１である、メエロジーマ・カリビカ(Meyerozyma caribbica)やサッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)等が挙げられる。

これら菌類を加えて発酵させる米糠粉末としては、特に制約されないが、確実に均質な発酵状態とする上で、原料米糠を粉砕して篩で粗粒分を除いて得られる平均粒径１ｍｍ以下のものが好適である。また、原料の米糠は有機栽培米から得られるものが望ましい。

本発明の健康増進組成物を製造するには、各々純粋培養で保管されている少なくとも前記４種の菌類を含む所要の生菌の培養液を用い、これら培養液を個別に又は混合した状態で常温下の米糠粉末にスプレー等で添加し、手操作又は機械的操作で該米糠粉末を充分に攪拌混合することで、全ての生菌を米糠全体に均一に行き渡らせ、次いで菌の栄養源としてグルコース溶液の如き糖液を適量加えて均一に攪拌混合した上で、発酵槽内で所定期間（通常１〜４カ月程度）保管して発酵させる。この保管中には、外部からの雑菌の侵入を防ぐために、発酵槽の開放部をビニールシート等のカバーで覆うと共に、発酵槽を設置した部屋についても不用意に汚染外気が入り込まぬように所要の遮蔽対策を講じることは言うまでもない。しかして、発酵の進行に伴って米糠の温度が次第に上がってゆくため、有用成分の変質や高温に弱い有用菌の死滅を防止するために、継続的に温度を計測して適温（例えば、５０℃以下）を保つように温度管理する。なお、降温の操作は、通常、カバーを外して室内空気に一定時間晒すことによる空冷方式で行える。

かくして充分な発酵状態に達した米糠粉末は、降温後、粉砕機を通してから数週間自然乾燥し、所定の容器に充填して製品化する。この発酵米糠製品は、直接に口から摂取することも可能であるが、粉末形態であるため、ジュース等の飲料に加えたり、食物にふりかけたり、調理の際に料理に混ぜ込んだりすることで摂取が容易になる。また、人用の健康食品とする以外に、競走馬、家畜やペット動物等の健康を維持するための飼料用配合剤としても好適に利用できる。

この健康増進組成物を経口摂取すれば、上述した有用菌の複合体が胃液で死滅することなく腸内へ届き、その一部が腸管内で増殖して善玉菌として腸内環境を理想的に整えるために働き、また別の菌は米糠や食物中のセルロースを分解して糖類を産生することで、乳酸菌及びビフィズス菌を増やす作用があるため、総合的に優れた整腸作用が得られ、便秘や下痢を抑制すると共に美容効果も発揮する。また、腸内の悪玉菌を低減して免疫機能及び新陳代謝を改善するから、継続的に摂取することで生体の免疫活性が益々高まってゆき、感染症やアレルギーに対する抵抗力が増す上、脂肪の蓄積を抑制して肥満防止にも貢献し、更には胃内のピロリ菌の増殖抑制作用が認められており、胃ガンや胃潰瘍の抑止効果も期待できる。加えて、この健康増進組成物では、上記有用菌群の増殖過程で産生する様々な酵素によって米糠が分解されることで、既述した様々な有用成分を豊富に含むから、優れた滋養強壮剤としても機能する。一方、動物用飼料に配合することにより、動物の腸内環境が改善される結果、健康な体調が維持されて病気に掛かりにくくなると共に、糞便の臭気軽減や腸内ガスの低減作用も得られる。

接種菌として、いずれも株式会社環境総合テクスにおいて純粋培養して長期保存されている次の菌株を含むＭＡＸ元菌の混合物を用いた。これら接種菌の内、セルロース分解菌の３種の菌株は、既述した新規なバチルス属菌である。
〇セルロース分解性細菌・・・バチルス・アミロリクエフアシエンスＭ−４菌株（受託番号：ＮＩＴＥＰ−０２５３８)、バチルス・ズブチルスＭ−５菌株（受託番号：ＮＩＴＥＰ−０２５３９)、バチルス・スピーシーズ（受託番号：ＮＩＴＥＰ−０２５４０）の３種
〇乳酸菌・・・ラクトバチルス・カゼイＮＢＲＣ15883菌株
〇ビフィズス菌・・・ビフィドバクテリウム・ビフィダムＮＢＲＣ100015菌株
〇麹菌・・・アスペルギルス・オリゼーＮＢＲＣ6215菌株

平均粒径１ｍｍ以下の米糠粉末３００ｋｇに、上記ＭＡＸ元菌混合物３０Ｋｇ（菌数：１ｇ当り１０の１０乗個程度、総菌数の約７０％が前記Ｍ−４菌株及びＭ−５菌株とＭ−６菌株よりなるバチルス属菌）を添加しつつ、手操作で繰り返し混合し、米糠粉末全体に均一に菌を行き渡らせた。次いで、この菌を含む米糠粉末に、０．０６％濃度のグルコース溶液１１５Ｌを少量ずつに分けて加えつつ手操作で均一に攪拌混合し、発酵原料を調製した。そして、この発酵原料を上方に開放した容量１０００Ｌの発酵槽に充填し、上からビニールシートで覆った状態で原料温度が５０℃以下を維持するように継続的に温度管理しつつ約１カ月間保管して充分に発酵させたのち、得られた発酵米糠粉末を粉砕機を通してから２週間自然乾燥し、本発明の健康増進組成物であるＭＡＸ組成物を製造した。

［安全性試験］
得られたＭＡＸ組成物について、一般財団法人日本食品分析センターに依頼し、食品の衛生検査指針に沿って有害菌である大腸菌、黄色ブドウ球菌、サルモネラ、腸炎ビブリオ、セレクス菌、ウェルシュ菌の各分析試験（分析試験成績書第15107227001-0201号
2015年10月26日）を行ったところ、次の表１に示すように全て陰性の結果が得られ、食品としての安全性が確認された。

［人の摂取効果Ａ］
ホリスティック統合医療研究所の協力により、男性２４名及び女性３９名の計６３名（１１歳〜８６歳）をモニターとして、ＭＡＸ組成物を継続的に毎日１回約１ｇずつ経口摂取してもらい、１カ月後及び３カ月後に身体症状の変化についてアンケート調査したところ、次の結果が得られた。

＜摂取１カ月後＞
摂取者の７２％が何らかの身体症状の変化を感じており、表２に示すように、特に排便状態の改善が顕著である他、便尿の臭いが減った、疲れにくくなった、元気になった、胃痛が解消した、食欲が出てきた、痩せた等の多くの体調改善の回答が各々複数人にあった。

＜摂取３カ月後＞
表３に示すように、１カ月後と同様の回答に加え、風邪にかかりにくくなった、アトピー性皮膚炎が改善した、生理不順が治った、更年期の障害が出ない、二日酔いがなくなった、喘息が治った等の更なる体調改善の回答が各々複数人にあった。

［人の摂取効果Ｂ］
大阪成蹊女子大学の協力により、１８歳〜２４歳の女性２０人をモニターとして、ＭＡＸ組成物を冬季（２月）に毎日１回約１ｇずつ七日間経口摂取してもらい、便通効果、皮膚効果（化粧のり、むくみ等）、手足の保温効果についてアンケート調査したところ、次の結果が得られた。
便通効果・・・有効１５名、やや有効４名
皮膚効果・・・有効６名、やや有効９名
手足の保温効果・・・有効１１名、やや有効６名

［体重増の抑制効果］
マウスを対象として、ＭＡＸ組成物の摂取による体重増の抑制効果を調べた。その方法は、ヒト成人女性３０〜３９歳の平均体重５３．７ｋｇ（平成２５年厚労省保険局国民健康・衛生調査）が本健康増進組成物を一日１．３ｇずつ摂取するのを、マウス１２週齢メス（平均体重２１．７ｇ）の体重割合の摂取量に換算し、一匹あたり粉末状のマウス高脂肪食（日本クレア社製の商品名ＨＦＤ３２）の一日平均食餌量２．２ｇにＭＡＸ組成物０．２５３ｍｇを加える形で８週間投与したマウス群と、マウス高脂肪食のみを８週間投与したマウス群について、体重増加量推移、摂餌量推移、明期・暗期運動量、２４時間周期運動量を調べるものである。

その結果、図４〜図７に示すように、本健康増進組成物の投与は、摂餌量及び運動量に影響は与えないが、高脂肪食摂取による体重増加を抑制することが判明した。なお、高脂肪食摂取による体重増加には、摂取初期（７〜１４日後）と更にしばらく経ってからとの二つのフェーズがあるが、ＭＡＸ組成物はこれら二つのいずれをも抑制すると想定される。また、ＭＡＸ組成物の投与による体重増加抑制のメカニズムは、代謝レベル向上等の腸内環境改善以外のメカニズムが考えられる。一方、ＭＡＸ組成物投与群と非投与群とで腸内細菌叢のプロファイルが異なり、ＭＡＸ組成物投与群では投与１４日目において腸内細菌叢の多様性が高く、且つBacteroidales目に含まれるいくつかの属の占有率が高いことが判明している。

［ピロリ菌の抑制効果Ａ］
ｐＨ３に調整したブルセラ培地１０ｍｌを収容した試験管を用意し、その中にＭＡＸ組成物０．３ｍｇを秤量して添加し、３７℃で１２０時間の振盪培養を行ったのち、遠心分離により上清を採取して検体液（以下、ＭＡＸ培養液という）とした。次に、ピロリ菌培養液を添加して各々ｐＨ３に調整したブルセラ培地１０ｍｌを収容した試験管１０本をサンプルとして用い、ＭＡＸ培養液１ｍｌを添加した５本の試験管と、不添加の５本の試験管とについて、３７℃の条件下で、各経過時間後にピロリ菌数（１０⁴ＣＦＵ／ｍｌ）を調べた。その結果を表４に示す。表中の各数値はサンプル５本の平均値であり、±は該平均値に対する測定値のばらつき最大値を示す。

上表のＭＡＸ培養液不添加の左欄で示すように、この培養液では調整後２４時間で殆どのピロリ菌（９７％強）が死滅するが、１０時間後ではまだかなりの菌が生存している。しかるに、上表右欄で示すように、ＭＡＸ培養液を添加したサンプルでは、１０時間及び２４時間経過した段階で生存しているピロリ菌の数は、ＭＡＸ培養液不添加の場合に比較して有意に減少している。これは、ＭＡＸ組成物にピロリ菌の死滅を促進する作用があることを示している。この結果から、本発明の健康増進組成物の摂取により胃内のピロリ菌を減少させる効果が期待できる。

［ピロリ菌の抑制効果Ｂ］
株式会社バイオリサーチセンターにおいて、マウスを用いるピロリ菌感染実験を行い、ＭＡＸ組成物投与群と非投与群について、一定期間飼育後の胃壁に存在するピロリ菌数を調べた。その結果を図９に示す。なお、試験方法は以下のとおりである。
（１）ピロリ菌液の調製・・・冷凍保存したHelicobacter SS-1 株（岡山大学大学院
保健学研究科検査専攻横田憲治准教授より分与）を解凍し、綿棒でコロンビアヘリコバクター寒天培地に塗抹し、３７℃の恒温器内で７日間微好気培養したのち、コロニーを綿棒で釣菌し、生理食塩液５ｍＬに浮遊させ、目視によりMcFarland １〜２(3〜6×10⁸CFU/mL) の濁度になるように調製した。
（２）マウス・・・日本エルエスシー株式会社より2018年2月21日に入手した８週齢の雌２０匹（系統：C57BL/6JJms Slc、入手日の体重：10.0〜25.0ｇ）を対象とし、５週間の予備飼育期間中、ピロリ菌液の接種を週に１回、体重測定を６回、一般状態の観察を一日一回行い、最終菌液接種日にELISA キットを使用して抗体価を測定し、抗体価が感染成立の０．２以上で体重推移及び一般状態に異常が認められなかったマウスを用い、無作為抽出法によって各群の抗体価がほぼ等しくなるようにＭＡＸ組成物投与群（８匹）と非投与群（８匹）とに群分けした。
（３）飼育管理・・・温度18〜28℃、湿度30〜80％、明暗各12時間に維持された飼育室において、固形飼料（オリエンタル酵母工業株式会社製：CRF-1)及び水道水を自由に摂取させる。週に１回のピロリ菌液の接種は、１個体あたり１ｍＬの割合で経口投与した。また、ＭＡＸ組成物投与群については、予備飼育期間終了後の４週間の間、毎日１回ずつＭＡＸ組成物を１個体あたり200μＬ（ＭＡＸ組成物として20mg)の割合で経口投与した。
（４）胃内のピロリ菌測定・・・最終投与日の夕刻から絶食させ、翌日にイソフルランの過麻酔で安楽死させて胃を摘出し、剥離した胃の粘膜を生理食塩液１．５ｍＬ中に浮遊させ、100μＬをコロンビアヘリコバクター寒天培地に塗抹し、３７℃の恒温器内で７日間微好気培養したのち、培養後のコロニー数をハンディコロニーカウンターで計測し、生菌数を算出した。

図９で示すマウスを用いた感染実験の結果から、４週間のＭＡＸ組成物の投与により、胃壁に存在するピロリ菌を有意（９０％以上）に減少させることが明らかである。

［家畜への投与効果］
帯広畜産大学環境保全科及び日本大学農芸科学科栄養生理学研究所の協力により、牛の飼料に対する本健康増進組成物の非投与と投与との場合について、排出された牛糞中の善玉菌及び悪玉菌の割合を調べたところ、非投与では図８（ａ）、投与では図８（ｂ）で示す結果が得られた。なお、図中の記号は次の菌種を表している。
ＬＢＳ：Latobacollus（有機物の好気性分解に役立つ乳酸桿菌）
ＶＮ：Veillonella（グラム染色陰性の嫌気性球菌）
ＳＴ：Streplococoua（グラム染色陰性の嫌気菌の連鎖状球菌）
ＥＧ：Enterobacleriaceal（グラム染色陰性の嫌気菌の腸内菌科・・・大腸菌のEsherichia Coli，腐敗菌のOroteus Vulgaris，霊菌のSerratia Marcescents）
ＮＮ：Nannocystis（他の細菌を溶かして栄養吸収することが多い粘液細菌目の中の球状菌）

図８（ａ）（ｂ）の対比から明らかなように、本健康増進組成物の摂取と非摂取とで、病原性や腐敗性の強い細菌（ＥＧ，ＮＮ）と有用性の高い細菌（ＬＢＳ）の数値が逆になっている。この結果は、本健康増進組成物の摂取により、牛の体内で悪玉菌が善玉菌によって駆逐されていることを表している。

以上に加え、実施例で用いたものと同じＭＡＸ組成物について、海外を含む多くの大学や研究所に試験依頼した結果、多彩な生物活性が明らかになっている。以下に、各試験依頼先からの報告の要約・結論を記載する。

＜関西医科大学竹林直紀医師＞
ＭＡＸ組成物の服用１〜３カ月後のアンケート調査で、大半の人が、排便状態の改善、風邪にかかりにくい、皮膚状態の改善などを自覚する。また、ＭＡＸ組成物を３〜６カ月服用すると、腸管免疫系が改善され、唾液中の分泌型ＩｇＡが上昇する。従って、腸管内でもＩｇＡが上昇していることが推察され、有害菌の感染に対する防御機構として働いている可能性があり、感染やアレルギーに対する抵抗力がつくと推察される。
＜福井大学医学部，鈴鹿医療科学大学＞
高脂肪食を与える肥満動物モデルを用い、ＭＡＸ組成物の投与による体重増加抑制効果を確認した。また、人では、ＭＡＸ組成物の服用で食欲が出るが、普通以上に食べないことで体重がやや減少することが判った。
＜酪農学園大学畜産飼料科学研究室＞
家畜（肉用豚）に対するＭＡＸ組成物の投与により、コレステロール値、中性脂肪値、血中グルコースの低下する傾向が見られ、肥育過程における代謝性疾患の予防に繋がると考えられる。
＜帯広畜産大学＞
豚を用いる実験で、悪臭が軽減した。
＜競走馬理化学研究所＞
糞中の微生物を調べると、ＭＡＸ組成物の投与群では病原性微生物（悪玉菌）が減少して善玉菌の比率が増えた。
＜蘇州大学動物実験センター＞
ネズミとウサギを用いる実験で、ＭＡＸ組成物を投与すると、飼育室における室内アンモニア濃度がユウイに低下した。
＜中国江蘇省研究所＞
豚による投与実験で、ＭＡＸ組成物の成長促進効果が顕著に認められた。また、下痢の発生率が著しく低下した。
＜中国江蘇省畜牧獣医所＞
鶏を用いる６カ月の実験で、飼育環境が改善し、悪臭が生じなかった。
＜塩城市畜牧獣医所＞
子豚を対象としてＭＡＸ組成物の投与組と非投与組を比較したところ、投与組では食欲増加及び消化機能の改善があることに加え、下痢率は投与組が非投与組より９０．４％低下し、養豚リスクを減少させることが判った。また、投与組では、投与１０日後から体表に著しい変化が起こり、皮膚がつるつるになり、毛も艶々しくなって健康な様子が見られた。

以上のように、ＭＡＸ組成物によれば、腸内環境改善効果に加え、腸内環境改善に伴う副次的な効果として、（１）代謝・吸収の改善、（２）便、尿、体臭の脱臭効果、（３）ダイエット効果、（４）抗ピロリ菌作用が認められるが、更に（５）生理痛の緩和作用、（６）口内炎の抑制作用、（７）免疫系の改善作用も確認されている。

（５）生理痛の緩和作用については、血液凝固剤として生理の出血を抑えるビタミンＫ２がＭＡＸ組成物中に産生されているか、もしくは元から腸内にあるビタミンＫ２産生菌がＭＡＸ組成物によって活性化されることで、生理の出血が抑えられるものと考えられる。また、（６）口内炎の抑制作用も同様に、口内炎を抑制するビタミンＢ２がＭＡＸ組成物中に産生されているか、もしくは元から腸内にあるビタミンＢ２産生菌がＭＡＸ組成物によって活性化されることによると想定される。

（７）免疫系の改善作用としては、感染防御効果、過敏性大腸炎改善効果、免疫（アレルギー）調節作用、発がん抑制効果、抗菌効果等が挙げられるが、その各々の作用機構に関しては次のように推測される。

〔感染防御効果〕
身体の感染防御システムでは、パイエル板のＭ細胞より管腔の抗原が取り込まれると、パイエル板内の樹状細胞を始めとする抗原提示細胞によりＴ細胞に提示されると同時に、パイエル板Ｂ細胞もその抗原を認識し、表面に膜型ＩｇＡを発現するｓＩｇＡ⁺に分化する。そして、ｓＩｇＡ⁺Ｂ細胞はパイエル板を出て粘膜固有層へ移動し、ＩｇＡ分泌細胞となる。分泌されたＩｇＡは、上皮層を介して管腔側に排出され、腸管内で感染防御にあたる。そこで、ＭＡＸ組成物が経口投与された場合、血中ＩｇＡが増加すると共に、パイエル板のＮＫ細胞が活性化し、これらの細胞が脾臓、肺、鼻咽頭に移動することで、局所でインフルエンザ等の感染が防御される。

〔過敏性大腸炎改善効果〕
炎症や潰瘍等の器質的疾患がないにも関わらず、下痢や便秘、腹痛等が起こる過敏性大腸炎は、ストレス等により起こるが、ＭＡＸ組成物を服用することにより著しく症状が改善することがモニターの報告から判る。これは、腸内フローラの改善の結果であると推察される。過敏性大腸炎についてもプロバイオテクスが効果を示すという報告がなされているので、ＭＡＸ組成物でも改善効果が期待できる。

〔免疫（アレルギー）調節作用〕
アトピー性皮膚炎や花粉症等のアレルギー疾患に対し、ＭＡＸ組成物を服用すると、著しい改善効果が現れることが多々報告されている。その作用ついてアレルギー疾患の発症メカニズムから考察すると、ａ）IL-12依存的に未分化のＴ細胞をＴ１細胞へ分化誘導、ｂ）活性化Ｔ２細胞のアポトーシスの増加によるＴ２細胞の減少、ｃ）制御性Ｔ細胞の誘導及び活性化、によってＴ１−Ｔ２バランスが改善されるものと推察される。

〔発がん抑制効果〕
ＭＡＸ組成物によるＮＫ活性の増強が報告されている。

〔抗菌効果〕
既述のようにＭＡＸ組成物の服用後に唾液中の分泌型ＩｇＡが上昇することが認められており、このことからＭＡＸ組成物が腸内免疫機構を活性化し、腸内はもちろん、体内各所のＩｇＡの生産が高められると推察される。従って、ＭＡＸ組成物の服用により、腸管内の悪玉菌に対するＩｇＡ抗体ができ、悪玉菌の増殖が抑えられる結果、腸内フローラが改善して便秘や下痢を抑えると想定される。また、ＭＡＸ組成物の服用により、生体各所の粘膜組織でＩｇＡの生産量が増し、感染症に対する防御能が高まると考えられる。

Claims

セルロース分解性菌として、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）Ｍ−４菌株（受託番号：ＮＩＴＥＰ−０２５３８)と、バチルス・ズブチルス(Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ)Ｍ−５菌株（受託番号：ＮＩＴＥＰ−０２５３９)と、バチルス・ズブチルスの近縁種であるバチルス・スピーシーズ（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ.）Ｍ−６菌株（受託番号：ＮＩＴＥＰ−０２９４０)との少なくとも３種のバチルス属菌を含む非病原性菌類による米糠粉末の発酵物からなる腸内環境改善、高脂肪食摂取による体重増加抑制またはピロリ菌抑制のための組成物。
前記非病原性菌類が、前記セルロース分解性菌と共に、乳酸菌及びビフィズス菌と麹菌より選ばれる少なくとも１種を含む請求項１に記載の腸内環境改善、高脂肪食摂取による体重増加抑制またはピロリ菌抑制のための組成物。
前記乳酸菌がラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｃａｓｅｉ）ＮＢＲＣ１５８８３菌株である請求項２に記載の腸内環境改善、高脂肪食摂取による体重増加抑制またはピロリ菌抑制のための組成物。
前記ビフィズス菌がビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｂｉｆｉｄｕｍ）ＮＢＲＣ１０００１５菌株である請求項２又は３に記載の腸内環境改善、高脂肪食摂取による体重増加抑制またはピロリ菌抑制のための組成物。
前記麹菌がアスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ）ＮＢＲＣ６２１５菌株である請求項２〜４のいずれかに記載の腸内環境改善、高脂肪食摂取による体重増加抑制またはピロリ菌抑制のための組成物。
前記非病原性菌類における総菌数の２０％以上がバチルス属菌からなる請求項１〜５のいずれかに記載の腸内環境改善、高脂肪食摂取による体重増加抑制またはピロリ菌抑制のための組成物。