EA006428B1

EA006428B1 - Штаммы молочно-кислых бактерий и их применение

Info

Publication number: EA006428B1
Application number: EA200201284A
Authority: EA
Inventors: Ральф Цинк; Роберто Реньеро; Флоранс Роша; Кристоф Кавадини; Тьерри Вон Дер Вейд; Эдуардо Шиффрин; Жалиль Беньяку; Виржини Руссо; Пабло Перес
Original assignee: Сосьете Де Продюи Нестле С.А.
Priority date: 2000-05-25
Filing date: 2001-05-22
Publication date: 2005-12-29
Also published as: EP1290136A1; NZ523010A; JP2009096811A; HU230800B1; DE60119515T2; IL152695A; KR100796963B1; AU7843201A; MY138070A; US20100266549A1; CA2409286C; AR029100A1; JP4456649B2; JP2003534003A; US8771675B2; JP4343477B2; MXPA02011595A; WO2001090311A1; PL359182A1; ATE325864T1

Abstract

Настоящее изобретение относится к новым молочно-кислым бактериям, выделенным и отобранным за их пробиотический потенциал, к их применению для получения композиций кормов для домашних животных, предназначенных для улучшения здоровья домашних животных, и к композициям, содержащим такие микроорганизмы.

Description

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии и, в частности, к новым молочно-кислым бактериям и, в частности, к микроорганизмам родов ЬайоЬасШик, В1йбоЬас1епиш и 8йер1ососсик (Ейегососсик), выделенных и отобранных за их пробиотический потенциал. Настоящее изобретение также относится к их применению при получении композиций корма для домашних животных, предназначенных для улучшения здоровья домашних животных, и к композициям, содержащим такие микроорганизмы. Также описываются способы поддержания или улучшения здоровья домашних животных путем кормления их кормом, содержащим такие микроорганизмы.

Уровень техники

Хорошее состояние домашних животных тесно связано с их питанием. Правильное кормление должно привести к соответствующим и здоровым домашним животным. Кроме питательной ценности, состав корма влияет на равновесие кишечной микрофлоры и может привести к желудочно-кишечным расстройствам или предотвратить их. Поэтому знания о желудочно-кишечном тракте и процессе переваривания пищи у здоровых животных существенно для понимания практики кормления. Например, плотоядные животные, такие как кошки и собаки, отличаются коротким пищеварительным трактом и высокой скоростью прохождения комков корма.

Из составных частей желудочно-кишечной микрофлоры кошек и собак можно выделить вид Вас1егснбе5. вид С1ок1пбшш, Еп1егоЬас1епасеае. вид ВШбоЬайепит, вид ЬайоЬасШик, вид 81гер1ососсн5. вид 81арйу1ососсик и дрожжи.

Количество и состав такой эндогенной флоры имеет склонность скорее к стабильности, хотя возраст и, в меньшей степени, питание могут изменить ее. Кислотность желудочного сока, жёлчь, перистальтика кишечника и местный иммунитет являются факторами, считающимися важными при регуляции бактериальной флоры в тонкой кишке человека и других млекопитающих.

Часто желудочно-кишечные расстройства у кошек и собак связывают с избыточным ростом бактерий и образованием эндотоксинов, продуцируемых патогенными бактериями.

На протяжении последних нескольких лет исследования сосредоточены на некоторых важных штаммах молочнокислых бактерий и их возможном применении в качестве пробиотических средств. Пробиотики считаются жизнеспособными микробными препаратами, улучшающими здоровье млекопитающих путем поддержания в кишечнике естественной микрофлоры. Предполагается, что пробиотики закрепляются на слизистой оболочке кишечника, колонизируют кишечный тракт и посредством этого предотвращают закрепление в нем вредных микроорганизмов. Предпосылкой такого действия является то, что они достигают слизистой оболочки кишок в надлежащей и жизнеспособной форме и, в особенности, не разрушаются под влиянием низкого рН, превалирующего в желудке. В частности, физиология пищеварительного тракта кошек и собак отличается от физиологии пищеварительного тракта человека. Например, средний рН в желудке составляет примерно 3,4 у собак и 4,2 у кошек.

Хотя в υδ 5968569 описывается включение пробиотического микроорганизма в корм домашних животных на основе злаков, ни в данной работе, ни в других доступных работах нет сведений, касающихся конкретных штаммов, позитивно влияющих на здоровье животных.

Следовательно, существует потребность в новых бактериальных штаммах, в частности, адаптированных для домашних животных, и выбираемых за их высокие пробиотические свойства, благоприятные для здоровья домашних животных, и во включении указанных штаммов в состав корма.

Сущность изобретения

Согласно своему первому аспекту изобретение относится к новому пробиотическому микроорганизму из молочнокислых бактерий, выбранному за его способность выживать и колонизировать желудочно-кишечный тракт домашних животных и проявлять благоприятную пробиотическую активность в отношении здоровья домашних животных.

Пробиотический штамм можно выбрать из числа лактобацилл, бифидобактерий и энтерококков.

Пробиотический штамм можно выбрать из группы, состоящей из ЬайоЬасШик гейеп. ЬайоЬасШик асИорШик, ЬайоЬасШик ашшайк, ЬайоЬасШик гитэшк, ЬайоЬасШик _)ойп8опй, Ьас1оЬасШик сакег Ьас1оЬасШик рагасаке1, ЬайоЬасШик гйатпокик, ЬайоЬасШик ГегтепШт и вида В1йбоЬас1епит, Ейегососснк Гаесшт и вида Ейегососснк.

В предпочтительном варианте воплощения изобретения пробиотический штамм выбирают из группы, состоящей из ЬайоЬасШик гейеп (ЫСС2581; СЫСМ 1-2448), ЬайоЬасШик геШеп (ЫСС2592; СЫСМ I2450), ЬасЮЬасШик гйатиокик (ЫСС2583; СЫСМ 1-2449), ЬасЮЬасШик гейеп (ЫСС2603; СЫСМ 1-2451), ЬайоЬасШик гейеп (ЫСС2613; СЫСМ 1-2452), ЬайоЬасШик ас1борЫ1ик (ЫСС2628; СЫСМ 1-2453), В1йбоЬас1егшт або1ексепйк (например, ПСС2627), вида В|ПбоЬас1епит N6’6’2657 или Ейегососснк Гаесшт 8Р68 ^С1МВ 10415).

Новый бактериальный штамм можно использовать в количестве примерно от 10⁴ до 10¹²КОЕ/животное в день, и предпочтительно примерно от 10⁵ до 10¹¹ КОЕ/животное в день, наиболее предпочтительно примерно от 10⁷ до 10¹⁰ КОЕ/животное в день.

В одном своем варианте изобретение относится к применению бактериального штамма, описанного выше, и/или супернатанта его культуры, и/или его фракции для получения композиции, предназначенной

- 1 006428 для лечения и/или профилактики расстройств, связанных с колонизацией желудочно-кишечного тракта домашних животных патогенными микроорганизмами. Если в контексте нет ясных иных указаний, при упоминании штамма следует иметь в виду и супернатант его культуры и/или его фракции.

В другом варианте изобретение относится к применению бактериального штамма, описанного выше, и/или супернатанта его культуры и/или его фракции для получения композиции, предназначенной для регуляции иммунной реакции домашних животных. Термин регуляция иммунной реакции означает, что бактериальные штаммы, описанные выше, и/или супернатанты их культур и/или их фракции обладают способностью или стимулировать некоторые иммунные функции, важные для здоровья домашнего животного, или модулировать другие иммунные функции, которые потенциально могут вовлекаться в иммунные расстройства, такие как воспаление, аллергия и т.п. Стимуляции или модуляции таких иммунных функций можно достичь, используя различные сочетания бактериальных штаммов, описанных выше, и/или супернатантов их культур и/или их фракций.

Изобретение также относится к способу поддержания или улучшения здоровья желудочнокишечного тракта, кожи, и/или шерсти, или иммунной системы домашнего животного, включающему стадию кормления домашнего животного кормовой композицией для домашних животных, содержащей по меньшей мере один выделенный штамм, описанный выше.

Кроме того, изобретение относится к способу лечения и/или профилактики расстройств, связанных с колонизацией желудочно-кишечного тракта домашних животных патогенными микроорганизмами, включающему стадию кормления домашнего животного кормовой композицией для домашних животных, содержащей по меньшей мере один выделенный штамм по настоящему изобретению.

Изобретение также относится к способу регуляции иммунной реакции у домашних животных, включающему стадию кормления домашнего животного кормовой композицией для домашних животных, содержащей по меньшей мере один выделенный штамм по настоящему изобретению.

Изобретение также относится к способу облегчения или ослабления действия возраста на домашнее животное, включающему стадию кормления домашнего животного кормовой композицией для домашних животных, содержащей по меньшей мере один выделенный штамм по настоящему изобретению.

Указанные выбранные микроорганизмы оказывают на домашних животных особое благоприятное действие в желудочно-кишечном тракте, на их кожу и/или шерсть, на их иммунную систему и на эффекты старения.

Они обладают особенно благоприятным влиянием на кишечные патогенные микроорганизмы, такие как штаммы 8а1шопе11а Ινρΐιίιηιιπιιιη. ЕксйепсЫа сой, 8Ыде11а буксгИспаса. или другие патогенные энтеробактерии, колонизирующие желудочно-кишечный тракт домашних животных, или на паразитов, таких как гельминты (вид Тохосага), простейшие (вид СгурЮкропбшш вид С1атб1а, Реп1а1пс1тошопак йош1шк, ЕйатоеЬа Ык1о1уДса, Тохор1акша допби) или дрожжи.

В сочетании с кормом такие микроорганизмы, в частности, проявляют свое пробиотическое благоприятное действие на поедаемость, переваривание и здоровье кишечника, иммунную функцию и санитарное состояние, причем на последнее - путем снижения объема фекалий и по меньшей мере частичного дезодорирования фекалий собак. Таким образом, согласно второму варианту изобретения, кормовая композиция для домашних животных содержит микроорганизмы, обладающие пробиотической активностью в отношении домашних животных и способных выживать и колонизировать желудочно-кишечный тракт домашнего животного, поедающего ее.

Соответственно, изобретение относится к кормовой композиции для домашних животных, предназначенной для здорового состояния желудочно-кишечного тракта домашних животных, содержащей по меньшей мере один выделенный пробиотический штамм, описанный выше, и/или супернатант его культуры и/или его фракции, связанный с пищевым носителем или фармацевтической основой.

Изобретение также относится к кормовой композиции для домашних животных, предназначенной для регуляции иммунной реакции домашних животных, содержащей по меньшей мере один выделенный пробиотический штамм, описанный выше, и/или супернатант его культуры и/или его фракции, связанный с пищевым носителем или фармацевтической основой.

Изобретение также относится к кормовой композиции для домашних животных, предназначенной для ослабления или уменьшения влияния возраста на домашних животных, содержащей по меньшей мере один выделенный пробиотический штамм, описанный выше, и/или супернатант его культуры и/или его фракции, связанный с пищевым носителем или фармацевтической основой.

Наконец, изобретение относится к кормовой композиции для домашних животных, предназначенной для здорового состояния кожи и/или шерстяного покрова домашних животных, содержащей по меньшей мере один выделенный пробиотический штамм, описанный выше, и/или супернатант его культуры и/или его фракции, связанный с пищевым носителем или фармацевтической основой.

В одном из вариантов воплощения изобретения пищевой носитель содержит сбалансированную по питательным элементам кормовую композицию для домашних животных. Указанная композиция содержит предпочтительно количество выделенного штамма, супернатанта его культуры и/или его фракции, достаточное для эффективного обеспечения указанного профилактического действия, когда композицию скармливают домашнему животному в виде готовой муки.

- 2 006428

Далее в описании аббревиатура КОЕ (колониеобразующая единица) обозначает число бактериальных клеток, полученное путем определения количества микроорганизмов на агровых пластинках.

Кроме того, N00 обозначает Коллекцию культур №в11е (ЫекЙе Кевеатсй Сепйет. Уегв-с11сх-1евВ1апс, Лозанна, Швейцария).

Что касается первой цели настоящего изобретения, авторы скринировали и отобрали, с учетом их физиологических и технологических свойств, 20 лактобацилл и 18 бифидобактерий, выделенных из фекалий кошек и собак.

Первый скрининг на возможные пробиотические применения проводили ίη νίΐτο (см. примеры 1 и 2). определяли характеристики роста, толерантность к кислотности желудочного сока при различных рН и различных концентрациях жёлчных солей, присутствующих в двенадцатиперстной кишке, подобных обнаруживаемым у кошек и собак.

Кроме того, ясно показана хорошая выживаемость лиофилизованных клеток в двух различных криозащитных средах при 4 и 20°С, что определялось с помощью ускоренного испытания на хранение.

Указанные штаммы можно охарактеризовать коротким временем генерации, высоким числом микроорганизмов (свыше 10⁸ КОЕ/мл) во время их стационарной фазы и стабильностью с высоким числом через 8 и 24 ч после инокуляции, устойчивостью к лиофилизации с последующим хранением в любых условиях, устойчивостью к физиологическим концентрациям жёлчи, обнаруженным в двенадцатиперстной кишке (2% жёлчи) и их слабым угнетением при выращивании в присутствии до 4% жёлчи. Кроме того, при выборе бактерий, характерных для исследуемой разновидности, учитывались результаты анализа ДНК.

Штаммы, предназначенные для улучшения здоровья кошек и собак, можно вырастить по меньшей мере до 10⁶ КОЕ/мл в присутствии до 2% солей жёлчных кислот. Штаммы также можно вырастить по меньшей мере до 10⁶ КОЕ/мл через 2 ч в интервале рН от примерно 3.4 до примерно 4.2.

Бактериальные штаммы согласно изобретению можно выбрать из группы, состоящей из ЬасЮЬасй1ив теийеп. ЬасЮЬасШив ашйорШик. ЬасЮЬасШив аштаБв. ЬасЮЬасШив титйшв. ЬасЮЬасШив )ο1ιη5οηίί. ЬасЮЬасШив савей ЬасЮЬасШив рагасавей ЬасЮЬасШив тйатпокик. ЬасЮЬасШив ГеппепШт. вида ΒίΓίάοЬасЮпит. ЕЩею^сс^ Гаесшт, вида ЕЩею^сс^.

Следующие штаммы, а именно, ЬасЮЬасШив геи1еп N002581. ЬасЮЬасШив ^йатηοβиβ N002583. ЬасЮЬасШив геиЮп N002592. ЬасЮЬасШив геийеп N002603. ЬасЮЬасШив геиЮп N002613 и ЬасЮЬасШив ас^рШив N002628, депонированы, например, по Будапештскому договору, в Национальной коллекции культур микроорганизмов, 25 гие йи ^сЮт Кцих. 7524 Рале. Бтапсе. 19 апреля 2000. под обозначениями СЛОМ 1-2448. СМСМ 1-2449. СМСМ 1-2450. СМСМ 1-2451. СМСМ 1-2452 и СЫСМ 1-2453. соответственно. Все ограничения, такие как доступность указанных депозитов, будут сняты после первой публикации данной заявки или другой заявки, утверждающей преимущество приоритета данной заявки.

Биохимические характеристики выбранных штаммов

ЬасЮЬасШив геи1еп СИСМ 1-2448

- Грамположительный микроорганизм, неподвижный, бесспоровой.

- Довольно короткие и толстые палочки.

- Микроаэрофильный микроорганизм с гетероферментативным метаболизмом, продуцирование Ь(+) и Ό(-) молочной кислоты.

- Каталаза (-). продуцирование СО₂ из глюкозы, гидролиз аргинина = продуцирование КН₃.

- Рост с 5% и 10% №С1.

- Сбраживание сахаров Ь-арабинозы, галактозы, Ό-глюкозы, лактозы, сахарозы, Ό-рафинозы.

ЬасЮЬасШив Шатгювив СЫСМ 1-2449

- Довольно короткие и толстые палочки.

- Микроаэрофильный микроорганизм с гетероферментативным метаболизмом, продуцирование Ь(+) молочной кислоты.

- Каталаза (-).

- Сбраживание всех сахаров, типичное для ЬЬ. Шатгювив.

ЬасЮЬасШив геи1еп СЫСМ 1-2450

- Довольно короткие и толстые палочки.

- Каталаза (-). продуцирование СО₂ из глюкозы, гидролиз аргинина = продуцирование ЯН₃.

- Рост с 5% и 10% №С1.

- Сбраживание сахаров Ь-арабинозы, галактозы, Ό-глюкозы, Ό-ксилозы, лактозы, сахарозы, Όрафинозы.

- 3 006428

Ьас1оЬасШи8 геи!еп СЫСМ 1-2451

- Довольно короткие и толстые палочки.

- Каталаза (-), продуцирование СО₂ из глюкозы, гидролиз аргинина = продуцирование ΝΗ₃.

- Рост с 5% и 10% №С1.

- Сбраживание всех сахаров, типичное для ЬЬ. геи!еп.

Ьас1оЬасШи8 геи!еп СЖ.’М 1-2452

- Довольно короткие и толстые палочки.

- Каталаза (-), продуцирование СО₂ из глюкозы, гидролиз аргинина = продуцирование ΝΉ₃.

- Рост с 5% и 10% №С1.

- Сбраживание сахаров Ь-арабинозы, Ό-глюкозы, лактозы, сахарозы, Ό-рафинозы.

Ьас1оЬасШи8 геи!еп ί.’Νί.’Μ 1-2453

- Довольно короткие и толстые палочки.

- Каталаза (-).

- Сбраживание сахаров Ό-глюкозы, лактозы, сахарозы, Ό-рафинозы.

Три лактобациллы, полученные от кошек (N№2581, N№2592, N№2583), три лактобациллы от собак (N№2603, N№2613, N№2628), одна бифидобактерия от кошек (N№2627) и одна бифидобактерия от собак (N№'.'2657) испытывались далее на их возможную пробиотическую активность в организме домашних животных (см. примеры 3 и 4).

В другом варианте своего воплощения настоящее изобретение относится к применению бактериальных штаммов, описанных выше, для получения кормовой композиции, способной улучшать или поддерживать здоровье домашних животных.

Их можно применять в их жизнеспособной форме, инактивированной форме, в виде супернатанта культуры или их фракций, например, клеточных стенок, пептидогликана, цитоплазмы, очищенных белков, функциональных фракций, биологически активных молекул.

Их предпочтительно применять в количестве примерно от 10⁴ до 10¹¹ КОЕ/г и предпочтительно примерно от 10⁵ до 10¹⁰ КОЕ/г, наиболее предпочтительно примерно от 10⁶ до 10⁹ КОЕ/г.

В предпочтительном варианте их можно применять как пищевые добавки с тем, чтобы улучшить качество корма для домашних животных, и их можно включать в количестве примерно от 10⁴ до 1 0¹¹КОЕ/г. В качестве пищевых добавок их можно инкапсулировать или можно получить в форме порошка и упаковать в сочетании или отдельно от основной муки во влажном или сухом состоянии. Например, порошок, содержащий выбранные микроорганизмы по изобретению, или компоненты, или частицы супернатанта их культур, или выбранные фракции можно упаковать в пакетики в форме порошка, или в гель, или в жидкость, или в другой подходящий носитель. Такие отдельно упакованные единицы можно предоставить вместе с основной мукой или в виде упаковок с несколькими единицами для применения с основной мукой или обработкой согласно инструкциям изготовителя. В другом примере пробиотический(ие) штамм(ы) можно предоставить в виде многокамерной упаковки вместе со вторым поедаемым компонентом, например влажной или со средним содержанием влаги крупной крупкой или партией муки грубого помола, в эластичном мешке. Первая камера в мешке может содержать пробиотический штамм, а вторая отдельная герметично закрытая камера - второй поедаемый компонент.

Указанные выбранные микроорганизмы оказывают особое благоприятное действие на домашних животных в желудочно-кишечном тракте, на их кожу и/или шерсть, на их иммунную систему, на состояние здоровья зубов или ротовой полости, на их кости и на эффекты старения.

Также обнаружено, что они улучшают поедаемость корма, переваривание, иммунную функцию и санитарное состояние (снижение объема фекалий и частичное дезодорирование фекалий собак) у домашних животных.

Настоящее изобретение также относится к кормовой композиции для домашних животных для улучшения или поддержания здоровья животных, содержащей по меньшей мере один пробиотический штамм, обладающий вышеуказанными признаками, в сочетании с пищевым носителем или фармацевтической основой.

- 4 006428

По меньшей мере один бактериальный штамм, обладающий вышеуказанными признаками, и/или супернатант его культуры, и/или его фракцию, и/или его фракции можно давать домашнему животному в качестве добавки к его обычному рациону или в качестве компонента полного корма для домашних животных, содержащего необходимые питательные вещества.

Композиция полного содержащего необходимые питательные вещества корма для домашних животных по изобретению может находиться в форме сухого порошка или в виде влажного замороженного или устойчивого при хранении продукта. Такие корма для домашних животных можно получить способами, известными в технике, при условии, что когда требуется активность микроорганизма, предпринимаются меры, обеспечивающие выживание микроорганизма. Кроме штаммов бактерий и/или их ферментационной среды такие корма для домашних животных могут содержать любой один или несколько источников крахмала, белка и липидов.

Подходящими источниками крахмала являются, например, зерна и бобы, такие как кукуруза, рис, пшеница, ячмень, овес, соя, и их смеси.

Подходящие источники белка можно выбрать из числа любых источников животных или растительных белков, например мяса и мясной муки, муки из мяса птицы, рыбной муки, соевых белковых концентратов, молочных белков, глютена и т.п. Для более старых животных предпочтителен источник белка, содержащий высококачественный белок.

Подходящими источниками липидов являются различные виды мяса, животные жиры и растительные жиры.

Выбор источников крахмала, белка и липидов будет в значительной степени определяться потребностями животного в питательных веществах, соображениями поедаемости и типом применяемого продукта. Корм для более старых домашних животных предпочтительно содержит пропорционально меньше жиров, чем корма для более молодых домашних животных. Кроме того, источники крахмала могут включать один или несколько компонентов из числа риса, ячменя, пшеницы и кукурузы.

Кроме того, в корм для домашних животных при желании можно включать различные другие ингредиенты, например сахар, соль, пряности, приправы, витамины, минеральные вещества, ароматизаторы, жиры и т. п.

В случае сухих кормов для домашних животных подходящим способом (их получения) является пропаривание с экструзией, хотя можно использовать сушку и другие подходящие способы. При пропаривании с экструзией сухой корм, как правило, получают в форме муки грубого помола. Если используют пребиотический углевод, пребиотик можно смешивать с другими ингредиентами сухого корма до переработки. Подходящий способ описывается в заявке на европейский патент ЕР 0850569, включенной в данное описание в качестве ссылки. Если используют пробиотический микроорганизм, и желательна его активность в конечном продукте, организм лучше всего нанести на или подмешать в сухой корм для домашних животных. Подходящий способ описывается в заявке на европейский патент ЕР 0862863, включенной в данное описание в качестве ссылки. Когда выживание микроорганизма не требуется, его можно добавлять в смесь для экструзии, так же как, при желании, и супернатант его культуры или фракции.

В случае влажных кормов для получения продуктов, имитирующих мясо, можно использовать способы, описанные в патентах И8 4781939 и И8 5132137. Оба патента включены в данное описание в качестве ссылок. Также можно использовать другие процедуры для получения продуктов типа кусков, например варку в паровой печи. С другой стороны, продукты в виде кусков можно получить, эмульгируя подходящий мясной материал для получения мясной эмульсии, добавляя подходящее желирующее вещество и нагревая мясную эмульсию перед заполнением ею консервных банок или других емкостей. Как и в случае получения сухих кормов, когда выживание выбранного вида пробиотика не является существенным, его можно добавлять в кормовую смесь перед варкой или нагреванием или на любой подходящей и удобной стадии способа получения.

Количество пробиотика в корме для домашних животных составляет предпочтительно менее примерно 20 мас.% и предпочтительнее менее примерно 10 мас.%. Например, пребиотик может составлять от примерно 0,1 мас.% до примерно 5 мас.% корма для домашних животных. В случае кормов, в которых в качестве пребиотика используют цикорий, цикорий можно включать в таком количестве, чтобы он составлял от примерно 0,5 мас.% до примерно 10 мас.% кормовой смеси, предпочтительнее от примерно 1 мас.% до примерно 5 мас.%.

Корма для домашних животных могут содержать другие активные вещества, такие как длинноцепные жирные кислоты. Подходящими длинноцепными жирными кислотами являются альфа-линолевая кислота, гамма-линолевая кислота, линолевая кислота, эйкозапентановая кислота и докозагексановая кислота. Жиры рыб являются подходящим источником эйкозапентановой кислоты и докозагексановой кислоты. Масло бурачника, масло из семян черной смородины и энотеровое масло являются подходящими источниками гамма-линолевой кислоты. Сафлоровое масло, подсолнечное масло, кукурузное масло и соевое масло являются подходящими источниками линолевой кислоты.

При необходимости в корма для домашних животных добавляют минеральные вещества и витамины, с тем чтобы корма стали кормами с полным набором питательных веществ.

- 5 006428

Кроме того, при желании бактериальный штамм можно инкапсулировать, например, в сахарную матрицу, жировую матрицу или полисахаридную матрицу. На него также можно нанести покрытие, как описывается в ЕР 862863.

Новый пробиотический штамм используют предпочтительно таким образом, что корм для домашних животных содержит предпочтительно примерно от 10⁴ до 10¹⁰ клеток пробиотического микроорганизма на грамм корма для домашних животных, предпочтительнее примерно от 10⁶ до 10⁸ клеток пробиотического микроорганизма на грамм. Корм для домашних животных может содержать примерно от 0,005 до 10 мас.% пробиотического микроорганизма от массы смеси. Его содержание составляет, предпочтительно примерно от 0,02 до 6 мас.% и наиболее предпочтительно примерно от 1 до 6 мас.%.

Количество корма, потребляемое домашним животным для получения благоприятного эффекта, будет зависеть от размера домашнего животного, вида домашнего животного и возраста домашнего животного. Однако количество корма для домашнего животного, как правило, должно быть адекватным для обеспечения ежесуточного количества по меньшей мере одного штамма молочно-кислых бактерий в примерно 10³ - 10¹⁴ КОЕ и/или эквивалентного количества сбраживаемой среды. Предпочтительно назначают в день примерно 10⁹-10¹¹ КОЕ собакам или 10⁷-10¹⁰ КОЕ кошкам.

Композиция по настоящему изобретению обладает высокой пробиотической активностью, и/или обнаружено, что она особенно эффективна для улучшения и/или поддержания здоровой пищеварительной функции у домашних животных и улучшения и поддержания в здоровом состоянии желудочнокишечного тракта, кожи, и/или шерсти, и/или иммунной системы домашних животных. Такая композиция также оказывает благоприятное воздействие на явления старения у кошек и собак.

Настоящее изобретение не ограничивается по объему конкретными вариантами его воплощения, описанными в данном описании. Примерам предшествует краткое описание фигур.

Перечень фигур

Фиг. 1. Пролиферация мононуклеарных клеток периферической крови собак (РВМС) после стимуляции митогенами или эфирами форбола. РВМС от взрослых собак, которых в течение 4 недель кормили с Ь. ас1борЫ1и8 N002628 (темные столбики) или без него (светлые столбики), стимулируют различными митогенами в дозах (мкг/мл), указанных на диаграмме. Митогенами являются РНА (фитогемаглютин), СопА (канканавалин А), РАМ (митоген Поквида), и эфир форбола представляет собой РМА/ионо (миристат-ацетат форбола и иономицин). * = Р < 0,05, критерий Стъюдента.

Фиг. 2. Цитокины, продуцированные лейкоцитами собаки, стимулированными различными штаммами пробиотиков. Лейкоциты от здоровых взрослых собак стимулируют в течение 18 ч различными штаммами лактобацилл, полученными от домашних животных. Контрольные культуры содержат только среду (отрицательный контроль) или изолят лактобацилл человека 8Т11 (положительный контроль). Идентификацию цитокинов осуществляют методом КТ-РСК Их количественное определение осуществляют путем сканирования агарозных гелей, окрашенных этидиум бромидом, и определения соответственных отображений каждой полосы с использованием программного обеспечения ΝΙΗ 1таде. Результаты выражают в виде среднего двух независимых экспериментов в произвольных единицах. (А) 1Ь-12, (В) 1Ь-10, (С) ΙΕΝγ, (Ό) ΤΟΕβ.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения

Пример 1. Штаммы и условия культивирования.

Ряд штаммов (из коллекции культур №й1е = NСС) скринируют на их возможное пробиотическое применение для кошек и собак. В частности, оценивают возможности роста, устойчивость при лиофилизации с последующим хранением, толерантность к кислотности в желудке и различным концентрациям солей жёлчных кислот, обнаруженным в желудочно-кишечном тракте кошек и собак, для 20 лактобацилл и 18 бифидобактерий, выделенных из фекалий кошек и собак и представленных в табл. 1.

Таблица 1. Коды и характеристики бактерий, выбранных для анализов

Код ΝΓΓ	Код С14СМ	Код	Вид ЖИВОТНОГО	Тип ΝΗ3 из питания аргинина	Молочная кислота	Идентифицированы с АР150СН .
2578	-	ЬВ1-1	Кошка	Смешанное -	Ь	Ь. аштаНз/гипмшз
2581	1-2448	БВ1-2	Кошка	Смешанное +	ϋ/Ь	Ь. геШеп
2583	1-2449	ЬКЫ	Кошка	Смешанное -	ϋ/Ь	Ь. гЬатпозиз
2586	-	ЬК1-2	Кошка	Смешанное +	ϋ/Ь	Ь. геи(еп
2590	-	ЬН2-1	Кошка	Сухое -	Ц/Ь	Ь. ас1с1орЬ11и8
2592	1-2450	ЬК1-1	Кошка	Смешанное +	ϋ/Ь	Ь. геи1еп
2594	-	Ь81-1	Кошка	Смешанное -	ь	Ь, аттаПз/гипитз
2597	-	ЬА2-5	Собака	Влажное -	ь	Ь. аттаНз
2600	-	ЬС2-5	Собака	Влажное -	и/ь	Ь. 1егтепШт/геи1еп
2603	1-2451	ЬЕ2-5	Собака	Влажное -	ь	Ь. геи1еп
2606	-	ЬЕ2-6	Собака	Сухое +	Ц/Ь	Ь. геи1еп
2609	-	ЬН2-6	Собака	Сухое +	Ц/Ь	Ь. геи1еп

- 6 006428

2613	1-2452	ЬН2-7	Собака	Сухое	+	Ц/Ь	Ь. геи!еп
2616	-	Ы-1-1	Собака	Смешанное	+	ц/ь	Ь. геи!еп/ £егтеп1ит
2619	-	Ы-1-2	Собака	Смешанное	-	Ц/Ь	Ь. асНорйИиз
2621	-	ЬЗ-1-2	Собака	Смешанное	-	ь	Ь. агнтаНз/гипнтз
2625	-	Ц7-1-3	Собака	Смешанное	-	ь	Ь. аттаКз/гипишз
2628	1-2453	ЬА1-5	Собака	Смешанное	-	ϋ/Ь	Ь. ас1бор1111и8
2632	-	ЬА1-6	Собака	Смешанное	+	ц/ь	Ь. геи1еп/ ГегтепШт
2636		ЬВ1-5	Собака	Смешанное		ь	Ь. аттаНб/гипнтя .

Бифидобактерии

Код Код Вид Тип питания Вид

ИСС животного

2623	СО2-5	Кошка	Сухое	В1£ШоЬасСег1ит
2627	СС2-5	Кошка	Сухое	Βί£. ас!о1езсеп£1з
2630	СН2-5	Кошка	Сухое	Βί£. ас!о1езсеп£1з
2633	СЕЗ-1	Кошка	Сухое	Βί£. ас!о1езсеп£1з
2635	СС1-5	Кошка	Смешанное	Βί£. 1опдит/зи1з
2637	СЕ4-1	Кошка	Сухое	Βϊ£. аЦо1езсеп£1з
2640	СВЗ-5	Кошка	Сухое	Βί£. аЦо1езсеп£1з
2643	СД2-6	Кошка	Сухое	Βϊ£. ас1о1езсепЫз
2647	05-3-5	Собака	Влажное	Βί£. ас!о1езсеп£1з
2651	Б8-3-6	Собака	Сухое	Βί£. ап1таИз/1ас£1з
2654	Б9-3-7	Собака	Сухое	Βί£. ап1та11з/1ас£1з
2657	Бб-3-6	Собака	Сухое	В1£1с1оЬас£ег1ит
2660	ϋ7-3-5	Собака	Сухое	В1£1с1оЬас£ег1ит
2663	ЦВЗ-1	Собака	Сухое	ВгТШоЬасбегтит
2667	ЦСЗ-1	Собака	Сухое	В1£1с1оЬасСег1шп
2671	ϋΑ1-3	Собака	Смешанное	Βί£. ап1та11з/1ас£1з
2674	БАЗ-1	Собака	Сухое	В1£ШоЬас£ег1ит
2677	ББЗ-1	Собака	Сухое	Βί£. ас!о1езсеп£1з .

Все 20 лактобацилл и 18 бифидобактерий получают от кошек и собак, которых держат на разном питании, как показано в табл. 1. Начальную идентификацию проводят по морфологическим и физиологическим характеристикам. Используют системы АР1-50СН и Вар1б-ГО32А (ВюМепеих) для лактобацилл и бифидобактерий, соответственно. Чистые штаммы замораживают и депонируют при -80°С в Коллекции культур, Ыезйс (ЫСС).

Все бактерии для анализов культивируют в питательной среде. Образец каждого реактивированного штамма хранят при -80°С в 1 мл криозащитной среды (40% глицерина + 60% ^^). Культуры поддерживают путем еженедельного субкультивирования 1% инокулума в 10 мл среды для выращивания и анаэробной инкубации при 37° С.

Лактобациллы выращивают в МР8 в течение 18 ч. Бифидобактерии выращивают или в МР8 с добавлением 0,05% (мас./об.) гидрохлорида Б-цистеина (МК8-С) в течение 32 ч или в ВН1 с добавлением 0,05% (мас./об.) гидрохлорида ^-цистеина (ВН1-С) в течение 48 ч, исходя из 5% инокулума.

Все культуры между переносами хранят при +4°С. Анаэробиоз получают, как правило, с использованием анаэробной системы водород-диоксид углерода (ОазРак, Вес1оп Эюктзоп, США). Бифидобактерии во время их хранения всегда держат в таких анаэростатах.

Пример 2. Отбор бактериальных штаммов.

Данный скрининг ίη νίίΐΌ основан на характеристиках продуцирования для промышленного применения жизнеспособных клеток, их способности выживать в условиях подавления или во вредных условиях желудочно-кишечного тракта и их геномном различии. Различие штаммов или геномное подобие таких ^охарактеризованных штаммов учитывают с использованием ΚΑΡΌ и риботипирования.

Материалы и методы

Бактериальный рост

Необходимо идентифицировать штаммы, способные быстро продуцировать большое число клеток. Цикл их бактериального роста можно охарактеризовать короткой лагфазой, малым временем генерации, высоким максимальным числом бактерий и длительной стационарной фазой. Поэтому штаммы сравнивают, рассматривая их жизнеспособность: продолжительность их лагфазы, их время генерации (в часах) и их максимальное число, что соответствует наиболее важным свойствам.

- 7 006428

Для лактобацилл

Предварительно инкубированные при 37°С 200 мл питательной среды МК8 инокулируют 1% свежей субкультуры. Образцы в один мл собирают каждый час после инокуляции в течение восьми часов Последний образец берут через 24 ч. Один мл каждого образца разводят серийно 10 раз в ТБ для подсчета. Культуры выращивают в агаре с МКБ (метод посева наливом (роиг-р1аДп§)) в анаэробных условиях при 37°С в течение 48 ч. Все бляшки с числом колоний от 30 до 350 регистрируют в виде колониеобразующих единиц (КОЕ) на мл культуры и затем рассматривают для подсчета.

Для бифидобактерий в (МКБ-С)

При предварительных анализах проводят подсчет всех штаммов в питательной среде МКБ-С и ТРУО. Результаты выражают в КОЕ/мл. Кривые роста устанавливают, определяя число клеток при выращивании в МКБ-С через 0, 4, 12, 24, 32 и 48 ч, согласно протоколу, описанному для лактобацилл. Для того, чтобы определить влияние субкультуральной среды и оптимизации обезгаживания среды для выращивания, осуществляют такой анализ субкультуры, хранившейся в ВН1-С 48 ч при 4°С, и инокулированной в МКБ-С, субкультуры, хранившейся в ВН1-С 48 ч при 4°С, и инокулированной в тщательно обезгаженную МКБ-С (удаление кислорода оптимизируют путем двукратного автоклавирования среды и хранения ее в анаэростатах), свежей субкультуры в МКБ и инокулированной в тщательно обезгаженную и хранившуюся до эксперимента в анаэробных условиях МКБ-С.

Таблица 2. Среды для испытаний на бактериальный рост

Для лактобацилл

Состав

Ссылки

МКЗ	МКЗ без сахара (ϋίίοο)	35 г.л¹	6,5 Бе Мап еб а1.
	Глюкоза	20 г.л^-1	(1960)
	Дистиллированная вода	1000 мл

Для бифидобактерий

Состав

Ссылки т

МКЗ-С	МКЗ без сахара (ϋίίοο) Глюкоза Ь-цистеин.НС1 (Е1ика) Дистиллированная вода	35 г.л'¹ 6,0 РасЬег апб 20 г.л'¹ Кпе1Ее1 (1996) 0,5 г.л^-1 1000 мл .
ТРУС	Триптиказа (ВВЬ)	50 г.л'¹ 7,0
(дрожжевой	Пептон (ϋίίοο)	5 г.л’¹
экстракт с	Дрожжевой экстракт (ϋϊίοο)	20 г.л'¹
триптика-	Глюкоза (Мегск)	4 г.л’¹
зой и	Ь-цистеин.НС1 (Е1ика)	1 г. л'¹
пептоном	Дистиллированная вода	1000 мл .

Твердые среды получают путем добавления агара Вае1о, Όΐ&ο (15 г-л^-1). Среды автоклавируют при 121°С в течение 15 мин. Жидкие среды для бифидобактерий или хранят в анаэробных условиях, или обезгаживают перед применением.

Устойчивость к среде с желудочным рН и к жёлчи

При поедании животным, для того чтобы проявить благоприятную активность в желудочнокишечном тракте животного, микроорганизмы должны выживать в условиях, существующих в желудке и в двенадцатиперстной кишке. Величина рН в желудке и соли жёлчных кислот являются основными компонентами, ответственными за регуляцию бактериальной флоры. Поэтому необходимо проанализировать степень устойчивости штаммов к кислой среде и желчи.

Физиология пищеварительного тракта кошек и собак отличается от физиологии пищеварительного тракта человека. Средний рН составляет 3,4 и 4,2 для собак и кошек соответственно. Для таких анализов рекомендуется воспроизведенная жёлчь домашних животных (табл. 4). Концентрация жёлчи в тонкой кишке в ходе переваривания корма изменяется в интервале 0,5-2%.

В соответствии с экстремальными величинами рН, найденными для кошек и собак, число жизнеспособных организмов после 10-минутного пребывания при рН 2,6 и после двухчасового пребывания или при рН 3,4 (штаммы, полученные от собак), или рН 4,2 (штаммы, полученные от кошек) должно составлять не менее 10⁶ КОЕ/мл.

Устойчивость к среде с желудочным рН

Все лактобациллы инокулируют в количестве 1% в питательную среду МКБ и выращивают в анаэробных условиях при 37°С в течение ночи. Бифидобактерии, инокулированные в количестве 5% в ВН1С, выращивают в течение 48 ч при 37°С в анаэробных условиях. Культуры распределяют в 2 мл пробирки для аналитических качественных реакций (Бррепбог!) и центрифугируют при 3500 д в течение 10 мин при 20°С. Клетки три раза промывают раствором Рингера. Устойчивость к кислой среде желудка анали

- 8 006428 зируют ΐη νΐΐΓΟ в трех образцах модельного желудочного сока с уровнем рН 2,6, 3,4 и 4,2, полученных с помощью НС1 (Мегск). Для стерилизации фильтрованием используют фильтры одноразового использования (Ка1§епе). Выживание каждой бактериальной суспензии исследуют, добавляя по одному мл в серию образцов по пять мл модельного желудочного сока (разные рН), с добавлением 1,5 мл 0,5% раствора ЫаС1.

Образцы инкубируют при 37°С и подсчитывают число выживших организмов после пребывания в течение 0, 1, 5 и 10 мин в желудочном соке с рН 2,6, в течение 0, 1, 30, 60, 120 и 180 мин в желудочном соке с рН или 3,4 (для штаммов, полученных от собак), или 4,2 (для штаммов, полученных от кошек). Образцы разводят фосфатным буфером (рН 7,0), высевают на агар с МК8-С и подсчитывают.

Таблица 3. Модельный желудочный сок

Наименование Состав рН

Желудочный сок

0,3%, мае./об., пепсина свиньи (31дта) 2,1, 3,4

0,5%, мае./об., ЦаС1 или 4,2

НС1 (Мегск), для доводки рН

Устойчивость к солям жёлчных кислот

Определяют изменение числа жизнеспособных лактобацилл, растущих в течение 18 ч в присутствии различных концентраций модельной жёлчи домашних животных.

Числа для двух жизнеспособных бацилл считают существенно различающимися, когда отклонение их 1од₁₀ составляет выше 0,25. Каждый штамм характеризуют двумя переменными:

максимальной концентрацией испытываемых солей жёлчных кислот, при которой не обнаруживают существенного отличия от контроля, степенью снижения жизнеспособности при повышении концентрации жёлчи в среде для выращивания.

Штаммы, характеризующиеся потерей, превосходящей 1од₁₀ числа их жизнеспособных организмов, когда концентрация жёлчи возрастает поэтапно на 1%, считаются чувствительными к жёлчи. Снижение, превосходящее 1од₁₀ на единицу для клеток в присутствии 0 и 2% жёлчи и на единицу на дополнительный процент содержания жёлчи (свыше 2%), считается приемлемым. Кроме того, для того чтобы получить эффект в желудочно-кишечном тракте, следует отбирать только штаммы, продуцирующие при выращивании в присутствии солей жёлчных кислот в концентрации до 2% более 10⁶ КОЕ/мл.

Модельную жёлчь от кошек и собак получают так, как указано в табл. 4, и перед применением стерилизуют фильтрованием. При первом анализе лактобациллы выращивают в анаэробных условиях в течение 24 ч при 37°С в питательной среде МК8 и переносят в свежую питательную среду МК8 с добавлением 0, 0,1, 0,3, 0,5, 1, 2 и 4% стерильной модельной жёлчи домашних животных еще на 18 ч. Образцы для подсчета серийно разводят 10 раз в Т8. Разведения 10³ и 10⁵ высевают на агар с МК8 с использованием ^А8Р (^ЫЙеу Аи1ошайс 8рна1 Р1а1ег; Όοη ^Ы11еу 8с1енййс Ьхшйеб, Англия). Высушенные чашки переворачивают крышкой вниз и инкубируют 48 ч при 37°С в анаэростатах.

Р108Й е! а1. (1972) определяют подавление как существенное, когда 1од для испытываемого образца снижается по сравнению с результатами для контроля по меньшей мере на 2. На основании этого все лактобациллы, чувствительные к содержанию жёлчи при первом анализе, и две лактобациллы, устойчивые к 4% жёлчи, проверяют подобным образом в присутствии 0, 1, 1,5, 2, 2,5, 3 и 4% жёлчи. Второе испытание нацелено на воспроизводимость и определение того, существенно ли снижается число жизнеспособных бактерий при повышении концентрации жёлчи.

С другой стороны, замечено, что такие штаммы устойчивы к жёлчи в течение указанного 18часового периода. Строят кривые роста в присутствии солей жёлчных кислот для того, чтобы определить, нарушаются или нет лаг-фаза и скорость роста. Анализы проводят с лактобациллами, выращиваемыми в питательной среде МК8 с добавлением 1% модельной жёлчи домашних животных, согласно протоколу, описанному ранее для определения роста.

Бифидобактерии субкультивируют и выращивают в течение 32 ч при 37°С в анаэробных условиях с использованием питательной среды МКБ-С с добавлением 0, 1, 2, 3 и 4% модельной жёлчи домашних животных. При разведениях 10³, 10⁴ и 10⁵ применяют тот же метод подсчета, что и для лактобации.

Таблица 4. Модельная жёлчь домашних животных

Соединения_____________________мкмоль/мл мг/мл всего, %

Тауродезоксихолат (Згдта)	14,	00	7,00	18,0
Таурохолат (Зьдта)	59,	00	30,40	74,0
Холат (Пика)	0,	14	0,06	0,2
Таурахенодезоксихолат (Згдта)	6,	90	3,45	8,0

- 9 006428

Выживание штаммов Ьас1оЬас111и8 при лиофилизации и последующем хранении

Оценивают выживание. Число жизнеспособных бактерий менее 10⁵ КОЕ/мл рассматривают как слишком низкое.

В случае каждого штамма 100 мл питательной среды МК.8 инокулируют 3% свежей субкультуры. Культуры выращивают в течение 16 ч при 37°С. Предполагается, что условия без доступа воздуха (закрытые емкости) являются достаточно анаэробными. Число жизнеспособных клеток подсчитывают с использованием метода высева на чашку описанного ранее.

Культуры собирают методом центрифугирования при 3500 х д при +7°С в течение 20 мин (центрифуга РС3С, 8огуа1е 1и81гитеи1) и ресуспендируют в 10 мл двух разных криозащитных сред. Каждый штамм ресуспендируют в двух разных криопротекторах. Проводят подсчет для концентрированных бактериальных суспензий (метод высева на чашку) и распределяют их в сосуды (0,5 мл на ампулу). Образцы замораживают при -196°С в жидком азоте и сушат в вакууме в течение 18 ч. После лиофилизации через впускной клапан сублимационной сушилки вводят азот и все ампулы запаивают. Все сосуды хранят при +4°С и +20°С в течение 6 месяцев. Число жизнеспособных клеток на ампулу (для каждой бактерии и суспензионной среды) определяют ежемесячно.

В рамках отбора возможных пробиотиков для кошек и собак в табл.5 приводятся результаты такого скрининга ίη νίίτο 20 лактобацилл и 18 бифидобактерий, основанного на возможностях их роста, устойчивости к лиофилизации с последующим хранением и устойчивости к среде с желудочным рН и концентрацией жёлчи, найденным в желудочно-кишечном тракте кошек и собак.

Лактобациллы (20) классифицируют согласно критериям, определенным как существенные в данном исследовании. Четыре штамма показали хорошие результаты в отношении своих характеристик роста, устойчивости к среде с желудочным рН, устойчивости к жёлчи и своему выживанию во время хранения после лиофилизации, а именно, Ь. геи1еп ЫСС2581 (СЫСМ 1-2448), Ь. геи1еп ЫСС2592 (СЫСМ I2450), Ь. геи!ег1 ЫСС2603 (СЫСМ 1-2451) и Ь. геи1еп ЫСС2613 (СЫСМ 1-2452). Их свойства удовлетворяют следующим параметрам:

время генерации менее одного часа при выращивании в МК.8;

короткая лаг-фаза (менее двух часов);

высокое число жизнеспособных бактерий (свыше 1 0⁸ КОЕ/мл) во время стационарной фазы цикла роста и стабильное через 8 и 24 ч после инокуляции;

штаммы устойчивы при лиофилизации и последующем шестимесячном хранении при 4°С и 20°С;

штаммы устойчивы к предельным концентрациям жёлчи, возможно, имеющимся в желудочнокишечном тракте кошек и собак (2%);

не происходит существенного подавления в присутствии в среде до 4% жёлчи;

штаммы толерантны к среде с рН 2,6 в течение по меньшей мере 10 мин и могут оставаться на уровнях свыше 10⁸ КОЕ/мл;

штаммы устойчивы к желудочному соку со средним рН в течение по меньшей мере двух часов.

Поэтому для исследований на возможную пробиотическую активность отобраны две лактобациллы, полученные от кошек (Ь. геи!ег1 N0’0’2581 и Ь. геи!ег1 N002592). и две лактобациллы, полученные от собак (Ь. геи!ег1 N”2603 и Ь. геи!ег1 N”2613). Штаммы N”2581, N”2592, N”2603 и N”2613 идентифицированы как Ь. геи!ег1 по идентификации ΑΡΙ 50СН. Однако, риботипирование показывает, что Ж.’С2581 и Ж.’С2592 имеют очень близкие особенности, как и Ж.’С2603 и N”2613, что указывает, таким образом, на близкое родство. Штамм Ж'.’С.’2581 имеет очень хорошие характеристики по росту, а Ж'.’С2603 имеет лучшую устойчивость к жёлчи, чем NСС2613.

Результаты, относящиеся к восьми бифидобактериям, выделенным из фекалий кошек, допускают отбор по их характеристикам роста, переносимости ими желудочного рН и их чувствительности к жёлчи. Штамм N”2623 не имеет ни одного нужного свойства и поэтому не рекомендован для дальнейших исследований. С другой стороны, штамм N”2627 удовлетворяет всем критериям:

его время генерации менее одного часа при выращивании в МК8-С;

лаг-фаза такая же короткая, как у лактобацилл;

число жизнеспособных бактерий во время стационарной фазы цикла роста высокое;

штамм устойчив к предельным концентрациям жёлчи, возможно, имеющимся в желудочнокишечном тракте кошек и собак (2%);

штамм переносит рН 2,6 в течение по меньшей мере 10 мин и может сохраняться на уровнях свыше 10⁸ КОЕ/мл;

штаммы устойчивы к желудочному соку со средним рН в течение по меньшей мере 2 ч.

Штамм N”2627 значительно более устойчив, чем N”2623 и N”2635, в то время как указанные три штамма по риботипированию имеют очень близкие особенности, что указывает на возможное близкое родство (ферментативное расщепление двумя рестриктазами ЕсоР1 и ЕсоРУ).

Десять бифидобактерий, полученных от собак, при характеризации риботипированием соответствуют только двум характерным образцам. Поэтому анализы на устойчивость к жёлчи проводят только для четырех штаммов (для двух из каждой группы): N”2657, N”2660, N”2671 и N”2677. Указан

- 10 006428 ные четыре штамма все устойчивы к максимальной концентрации жёлчи, которую можно обнаружить ίη νίνο (2%), а в штаммах число жизнеспособных клеток N0'0'2660 и N002657 не снижается, когда штаммы подвергают воздействию среды с максимальным содержанием жёлчи (4%). Как вывод, все бифидобактерии, выделенные из фекалий собак, довольно устойчивы к высоким концентрациям жёлчи.

С учетом характеристик роста указанные десять бактерий можно, таким образом, разделить на две группы:

штаммы, устойчивые к жёлчи и с хорошими характеристиками роста - N002657, N002651, N002663 и N002667;

штаммы, устойчивые к жёлчи, но с характеристиками роста, которые в случае промышленного производства нуждаются в оптимизации - N002660, N002671, N002677, N002647, N002654 и N002674.

Полные результаты по устойчивости к среде с предельными значениями желудочного рН, обнаруженными в процессе переваривания у кошек и собак, должны позволить лучше определить штаммы, отбираемые для дальнейших исследований. Только штамм N002651 не удовлетворяет критериям отбора по устойчивости к среде с нужным рН.

Таблица 5. Итоговая

Код Код Критерий Устойчивость к Устойчивость Устойчивость

ЫСС_________роста_____желудочному соку к жёлчи_______к лиофилизации

ЬВ1-1

ЬВ1-2

ΣΚ1-1

2578

2581

2586

2590

2592

ЬК1-2

ЬН2-1

ЬК1->1

2594

2597

2600

2603

Ь31-1

ЬА2-5

ЬС2-5

ЬЕ2-6

2606

2609

ЬН2-6

ЪН2-7

2613

2616 +

2619 +

+

С учетом полученных результатов можно выбрать один штамм бифидобактерий, полученный от кошек, и три бифидобактерий, полученные от собак (соответственно, N002627, N002657, N002663 и N002667.

Таблица 6. Среды для разведения

Основа__________________________Состав_____________________рН

Фосфатный	К2НРО4	72 г.л^-1	7,0
буфер	КН2РО4		48 г.л^-1
	Дистиллированная	вода	1000 мл
Раствор	ИаС1		9 г.л’¹	7,0
Рингера	Дистиллированная	вода	1000 мл
ТЗ (физиолог.	№аС1		8,5 г.л'¹	7,0
раствор с	Триптон		1 г. л^-1
триптоном)	Дистиллированная	вода	1000 мл

В пробирки разливают по 9 мл среды и автоклавируют при 121°С в течение 15 мин.

Наконец, для дальнейших исследований отбирают 8 штаммов из 38 (см. пример 3): три лактобациллы, полученные от кошек (N002581, N002592, N002583), три лактобациллы от собак (N002603, N002613, N002628), одну бифидобактерию от кошек (N002627) и одну бифидобактерию от собак (N002657).

Указанные штаммы характеризуются малыми временами генерации, высокими числами жизнеспособных бактерий (свыше 10⁸ КОЕ/мл) во время стационарной фазы и сохранением высоких чисел через 8 и 24 ч после инокуляции, устойчивостью при лиофилизации с последующим хранением в любых условиях, устойчивостью к предельным концентрациям жёлчи, обнаруженным в двенадцатиперстной кишке (2% жёлчи), и низким их подавлением при выращивании в присутствии до 4% жёлчи. Кроме того, при отборе бактерий, представляющих исследуемое многообразие, учитывают результаты анализов ДНК.

Пример 3. Эффективность колонизации в организме кошек.

- 11 006428

Ь. геШеп N002581. Ь. геШеп N002592, Ь. тйатпокик N002583 и вид В1йбоЬас1етшт N002627 испытывают в опытах по кормлению с тем, чтобы оценить их способность выживать при прохождении желудочно-кишечного тракта кошки.

Шестнадцать котов и кошек, настолько одинаковых, насколько возможно, подвергают в течение 3 дней адаптации к рациону из тушёного мяса РгЫиез Отапб. Протокол кормления включает 7 дней с Етщкгек Отапб Мепи и 7 дней испытания с Етккгек Отапб Мепи, содержащим один из вышеуказанных штаммов Ь. геШеп N002581 (рацион А). Ь. геШеп N002592 (рацион В), Ь. гйатпокик N002583 (рацион С) и вид ВИ1боЬас1етшт N002627 (рацион Ό). Рационы распределяли как указано далее.

Кошка № 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

Период 1 АРСВРААСВАВСВРСР Период 2 ВАРАССРАСВСРРАВВ

Указанные штаммы получают в достаточном количестве и в устойчивой лиофилизованной форме для того, чтобы проверить указанные восемь различных бактерий на выживание штамма в желудочнокишечном тракте подопытных животных. Все штаммы смешивают с 4 г трегалозы для того, чтобы добавлять достаточный объем носителя для смешивания полученных штаммов с основным кормом для животных. Штаммы бактерий получают в отдельных пластиковых пробирках (10⁹ КОЕ/день), и ежедневно добавляют в часть корма, чтобы иметь уверенность в том, что все бактерии будут съедены.

Получают образцы свежих фекалий для анализа на членов бактериальной популяции и сравнивают с базовым уровнем (без добавления бактерий). Фекалии собирают в день и 8 (базовый уровень), и 15, и 22 (базовый уровень), и 29.

Для получения образца фекалий в по меньшей мере 0,1 г используют стерильный ректальный зонд. Этот образец точно взвешивают и 0,1 г смешивают с 10 мл физиологического раствора (раствора Рингера), содержащего 10% глицерина. Затем такой раствор переносят в 1-мл пробирки, стабильные при низкой температуре, и замораживают в жидком азоте. Затем все образцы хранят до анализа при -80°С.

Подсчитывают число эндогенных популяций лактобацилл, Вас1ето1бе8, Еп(гоЬас1епасеае. энтерококов, бифидобактерий и ОоЧпбшт регГгшдепз. Бактерии детектируют на селективных или полуселективных средах. Осуществляют стократные серийные разведения в растворе Рингера, содержащем 0,5% цистеина, из разведении в интервале от -2 до -8 высевают на чашки Петри с различными селективными средами и инкубируют (см. таблицу, приведенную ниже).

Бактерии	Среды	т (°С)	Время (час)	Атмосфера
ЕпЪго-	0г1да15к1 (Запо£1 01ад-	37	24	Аэробная
ЬасЪеЛасеае	ηοδϋίοδ Раз±еиг,
	Франция)
ВИшсЗоЬасЪегта	Еидоп ТотаЪо*	37	48	Анаэробная
Лактобациллы	МВБ (01£со, МЬ, США) +	37	48	Анаэробная
	антибиотики**
С1 .рег£г1пдепз	Агар ΝΝ***	37	48	Анаэробная
Вас±его1дез	5сИаес11ег Ыео-Уапсо	37	48	Анаэробная

(В1оМег1еих, Магсу________________I^х ЕЕоЛе, Франция)_____________________________ * \Уаб5\уог111 АпаетоЫс Вас(епо1оду Маппиа1, V. 8и1ет, Ό. Сйтоп апб 8. Ешедо1б, ТЫтб Еб. ** Фосфомицин (79,5 мг/л) + сульфаметоксазол (0,93 мг/л) + триметоприм (5 мг/мл). *** Агар NN от БомЬигу апб ЬШу, 1995.

Число жизнеспособных бактерий, выраженное в виде 1од по основанию 10, приведено в табл.7.

Таблица 7. Число жизнеспособных бактерий в фекалиях у кошек (среднее ± ст.откл, η = 8)

	ЫСС	2581	ысс	2592	исс	2583	ЫСС 2627
До	Тест	До	Тест	До	Тест	До Тест
Лактобациллы	6,38	7,63	6,12	7,62	5,31	7,47	6, 69	7,	65
	±2,25	±1,23	±2,45	±1,58	±2,04	±1,23	+ 1,44	+ 1	, 45
Βΐίίάο-	7,17	7,64	7,57	6, 31	6, 43	6, 80	8,04	6,	07
ЬасЪегга	±1,82	±0,42	+1, 68	±2,26	+2,25	±2,19	+ 1,03	±2	, 32
Еп±егоЬас-	4,25	4,27	4,37	4,58	5,09	4,40	4,59	3,	64
Ъеггасае	±1,71	±1,20	±1,35	±1,45	±1,50	±0, 63	±1,42	±0	, 64
Вас±его1ёез	6, 05	5,54	5, 94	6,15	6,19	5,52	6, 00	5,	48
	±1,38	±0, 49	±0,99	±1,43	±0,97	±0,46	±1, 11	+0	, 50
С. рег£г.	4,09	3,84	3, 61	3, 30	4,16	3,34	3, 84	3,	57
	±1,22	±1, 00	±0,57	±0, 00	+ 1, 64	±0,11	±0, 89	+0	, 56

- 12 006428

Во время обработки наблюдается повышение числа лактобацилл в фекалиях из-за поедания указанных пробиотических бактерий. Не наблюдается значительного повышения числа Еп1гоЬас1спаесас. что отражает тот факт, что в кишечной экосистеме не имеется повреждений, связанных с применением указанных пробиотиков.

Пример 4. Эффективность колонизации в организме собак.

Ь. гсШсп N002603, Ь. гсШсп N002613, Ь. ас1йорЫ1и8 N002628 и вид В1ййоЬас1егшт N002657 испытывают в опытах по кормлению с тем, чтобы оценить их способность выживать при прохождении желудочно-кишечного тракта собаки.

Данному специфическому испытанию подвергают десять собак, 5 кобелей и 5 сук, в возрасте 4-7 лет. Протокол кормления включает 5 дней адаптации с ΕτίδΕίοδ νίΐπΐίΐν без цикория и 5 дней испытания с ΕπδΕίοδ νίΐαΐίΐν без цикория, и 3 дня адаптации и 5 дней испытания с ΕτίδΕίοδ νίΐπΐίΐν без цикория, с добавлением бактерий Ь. гсШсп N002603 (рацион Е), Ь. гсШсп N002613 (рацион Ε), Ь. ас1йорЫ1и8 N002628 (рацион О) и вида В|ПйоЬас1егшт N0026527 (рацион Н). Рационы распределяли как указано далее.

Собака № 1_____2_____3_____4_____5_____6 7_____8_____9_____10Период 1ЕЕЕЕЕЕЕЕЕЕ Период 2СССССННННН

Указанные штаммы получают в достаточном количестве и в устойчивой лиофилизованной форме для того, чтобы проверить указанные восемь разных бактерий на выживание штамма в желудочнокишечном тракте подопытных животных. Все штаммы смешивают с 4 г трегалозы для того, чтобы добавлять достаточный объем носителя для смешивания полученных штаммов с основным кормом для животных. Штаммы бактерий получают в отдельных пластиковых пробирках (50⁹ КОЕ/день) и ежедневно добавляют в часть корма, чтобы иметь уверенность в том, что все бактерии будут съедены.

Для получения образца фекалий в по меньшей мере 0,1 г используют стерильный ректальный зонд. Этот образец точно взвешивают и 0,1 г смешивают с 10 мл физиологического раствора (раствора Рингера), содержащего 10% глицерина. Затем данный раствор переносят в 1-мл пробирки, стабильные при низкой температуре, и замораживают в жидком азоте. Затем все образцы хранят до анализа при -80°С. Бактерии подсчитывают в тех же средах, которые описаны в примере 3.

Число жизнеспособных бактерий, выраженное в виде 1од по основанию 10, приведено в табл.8.

Таблица 8. Число жизнеспособных бактерий в фекалиях у собак (среднее ± ст.откл, η = 5)

	ЫСС 2603	ЫСС 2613	ЫСС 2628	ЫСС 2657 .
До	Тест	До	Тест	До Тест	До	Тест
Лактобациллы	5,25	3, 92	4,00	3, 40	7, 93	8,30	6,47	7,00
	±1,34	±1,05	±1,56	±0,21	±1,75	±0, 99	±1,27	±1,35
В1£1с1оЬас.	7,32	4,48	6,09	4, 55	7,70	7,20	5,72	6,78
	±2,06	±2,64	±2,10	±2,79	±2,57	±1,88	±2, 51	±2,39
ЕпЪегоЬасЪ..	4,10	4, 62	3, 62	4, 39	4,58	4,04	4,51	4,85
	±0,89	±0,61	±0, 72	±0, 94	±1,54	±0,76	±1,51	±1,45
Вас£его1с1е8	7, 82	6, 70	6, 92	6, 69	7, 88	7, 53	7, 92	7, 66
	±0,53	±1,25	±1,37	±1,19	±1,13	±0, 61	±0, 63	±0,86
С. рег£г.	3, 70	3, 84	3,50	3,30	3, 70	3, 30	3, 93	3, 70
	±0,89	±0,87	±0, 45	±0	±0,62	±0	±1,25	±0,89

Во время обработки не наблюдается значительных изменений числа лактобацилл в фекалиях из-за поедания указанных пробиотических бактерий за исключением штамма Ь. аайорШик N002628. В условиях испытания ингибирующее действие на С. ретйшдеиз не существенно, так как базовый уровень С. рсгГппдсш очень низкий. Не наблюдается значительного повышения числа ЕийоЬаШепасеае, что отражает тот факт, что в кишечной экосистеме не имеется нарушений, связанных с применением указанных пробиотиков.

Пример 5. Влияние лактобацилл и их фракций на жизнеспособность 01агй1а ш1е8ЙиаШ.

Исследуется действие супернатантов культуральных фильтратов штаммов лактобацилл, полученных от кошек и собак.

Материалы и методы

Бактериальные штаммы и культуры. Микроорганизмы, принадлежащие к роду ЕаШоЬасШшу получают из Коллекции культур Еея1е и выращивают в среде ΜΤΥΙ. Супернатанты, содержащие фракции лактобацилл, нейтрализуют до рН 6 и стерилизуют фильтрованием.

- 13 006428

Контроль получают, подкисляя среду ΜΤΥΙ молочной кислотой до той же величины рН, какая характерна для бактериальных культур. Затем рН доводят до 6 с помощью 0,1 N раствора ЫаОН. Источники исследуемого штамма и рН супернатантов и контроля приводятся в табл.9.

Таблица 9

Штамм___________________Источник рН супернатанта рН контроля

ь.	геиЪег1 N002581	Кошка	6, 63	6, 63
ь.	гЬатпозиз ЦСС2583	Кошка	6,50	5, 97
ь.	геиЪегь N002592	Кошка	6,04	5,98
ь.	геиЪег1 N002603	Собака	6,04	5,99
ь.	геиЪег1 N002613	Собака	6,07	5,95
ь.	асШорИНиз N002528	Собака	6,01	5,93 .

Паразиты. Штамм О1агб1а ЫезйпаНз АВ (АТСС 30957) закупают у Американской коллекции типовых культур (Роквилл, США). Трофозоитов выращивают в среде ΤΥΙ-8-33, модифицированной по Кейстеру, содержащей в 1 л 20 г казеинового гидролизата (Эйсо), 10 г дрожжевого экстракта (ВВЬ), 10 г декстрозы (Мегск), 0,75 г бычьей жёлчи (ЭЦсо), 2 г №С1 (Мегск), 2 г гидрохлорида Ь-цистеина (81§та), 0,2 г натриевой соли аскорбиновой кислоты (Р1ика), 0,6 г К₂НРО₄ (Мегск), 22,8 мг двойного цитрата железа(3) и аммония (81§та), 100 мл бычьей сыворотки взрослого животного (81§та), 15 мл пенициллина/стрептомицина (ШЬсо, 1000 МЕ/мл, 1000 мкг/мл). Перед стерилизацией фильтрованием (размер пор 0,22 мкм) доводят рН до 6,9 с помощью 5 N раствора №О11.

Паразитов выращивают в полистирольных колбах для выращивания культур тканей (ЬИХ, Мйез ГаЬога1опез, 1пс. парегуШе Ш 60540), наполненных 40 мл культуральной среды. Субкультуры получают, отбрасывая супернатант с незакрепившимися паразитами, добавляя 5 мл охлажденной на льду культуральной среды, инкубируя на ледяной бане в течение 10 мин для того, чтобы отделить закрепившихся трофозоитов, и инокулируя 0,2 мл полученной суспензии в свежую среду. Инкубацию осуществляют при 37°С в темноте.

Анализ на пролиферацию. По 200 мкл суспензий трофозоитов (1,4 х 10⁵ паразитов/мл) смешивают со 100 мкл супернатантов или контролей и добавляют 1 мкКи ³Н-тимидина. Образцы инкубируют при 37°С в течение 24 ч в 96-луночных культуральных планшетах (Νιπιο Вгапб Ргобис18). Затем паразитов собирают и оценивают включение тимидина.

Включение тимидина приведено в табл. 10. Штамм №С 2628, полученный от собаки, сильно ингибируют пролиферацию штамма АВ (91%). Другие исследованные штаммы не ингибируют рост трофо зоитов.

Таблица 10. Влияние фильтратов культуральных супернатантов на пролиферацию штамма О1агШа т1еЦта118

Штамм Пролиферация ШагсИа тпСезбтпаИз (срт)

Ь. геибегт N00	2581	1720
Контроль		2000
Ь. гЪатпозиз N00 2583	2500
Контроль		1720
Ь. геибег1 N00	2592	1800
Контроль		1970
Ь. геибегт N00	2603	2100
Контроль		1900
Ь. геиСегт N00	2613	2510
Контроль		1950
Ъ. асШорЫ1из	N00 2628	150

Контроль

ΜΤΥΙ

1610

1870

Как следует из результатов эксперимента, образующиеся функциональные фракции, полученные во время роста Ь. асйорййиз №С 2628, обладают очень сильным ингибирующим действием на рост С1агб1а 1п1е811па118.

Пример 6. Ингибирующее действие штаммов лактобацилл по изобретению на кишечные патогенные бактерии.

Для того чтобы идентифицировать штаммы с сильными антагонистическими свойствами против патогенных бактерий в тонкой кишке, проводят эксперименты по совместному культивированию на модельной системе, имитирующей условия в тонкой кишке собаки (рН, состав и концентрация жёлчи, муцин, панкреатин). Модельный кишечный сок тонкой кишки собаки содержит воспроизведенную жёлчь собаки (0,345 г/л таурохенодезоксихолата, 81§та, Германия; 0,7 г/л тауродезоксихолата, 81§та, Германия; 3,04 г/л таурохолата, 81§та, Германия; 0,006 г/л холата, Ника, Швейцария), свиной муцин (1,9 г/л,

- 14 006428

81дта, Германия), свиной панкреатин (2,42 г/л, 81дта, Германия) и раствор электролита (5 г/л ЫаС1, 0,6 г/л КС1, 0,25 г/л СаС1₂, все Мегск, Германия). рН сока доводят до 6,5 ± 0,5 с помощью 0,1 N раствора ΝαΟΗ.

Штаммы и условия культивирования Патогенные бактерии тонкой кишки

Отбирают четыре потенциально патогенных штамма: 8. Ινρΐιίιηιιπιιιη 8Ь1344, Е. сой ЕТЕС 08:Н9 и Е. сой 0149:К88 (патогенный изолят собаки) и клинический изолят 8й. букейепае (человеческого происхождения, любезно предоставлен Сеи1ге Нокрйайег Уаибо18е - СНИУ, Лозанна, Швейцария). За исключением 8. (урйипипшп 8Й1344, размножаемого в питательной среде Йипа Вейаш (Обсо. США), все ейегоЬас1епасеае выращивают в питательной среде Вгат Неай 1пГи8юп (Обсо, США) при 37°С при встряхивании (240 об/мин).

Молочно-кислые бактерии

Широкий ряд лактобацилл, источником которых являются собаки и кошки, включая Ь. ашборййик N002628 (С^М 1-2453), Ь. гйатиокш N^2583 (СМЗМ 1-2449), Ь. геи1еп N^2581 (С^М 1-2448), Ь. геи1ег1 N0’0’2592 (СNСМ 1-2450), отбирают в Коллекции культур №§11е (ΝΟΟ, №йес, Швейцария) и скринируют на модели тонкой кишки собаки на выживание, физиологическую активность и ингибирующее действие на вышеуказанные патогенные бактерии в тонкой кишке. Лактобациллы культивируют в анаэробных условиях (апаегосий, Охо1б, Англия) в питательной среде Мап Кодора 8йагр (Обсо, США) при 37°С.

Определение числа жизнеспособных клеток

Образцы разводят стерильным фосфатным буфером (ΝηΗ₂ΡΟ₄, рН 7, 0,2 М) и 10-кратные разведения высевают на поверхность агаровых чашек: на агар с МК8 (О1бсо, США) в случае лактобацилл, агар 8а1топе11а-8й1де11а (Охо1б, Англия) в случае 8. (урйбпипит и 8й. буъеШепае и агар с сорбитом Мас Сопкеу (Охо1б, Англия) в случае Е. сой. Агаровые чашки инкубируют 48 ч при 37°С в анаэробных условиях в случае лактобацилл и 24 ч при 37°С в случае еп1егоЬас1епасеае. При опытах по совместному культивированию рост еп1егоЬас1епасеа на агаре с МК8 подавляют путем добавления полимиксина (Охо1б, Англия).

Эксперименты по совместному культивированию молочнокислых бактерий (ЬАВ) и патогенных организмов

Эксперименты по совместному культивированию потенциальных пробиотиков ЬАВ и патогенных штаммов осуществляют при 37°С в 20 мл (пробирки Фалькона) модельного кишечного сока тонкой кишки собаки, обогащенного различными источниками углерода (сахар, корм для домашних животных) для благоприятствования метаболической активности культур. ЬАВ инокулируют в количестве 10⁸ КОЕ/мл, патогенные бактерии - 10² КОЕ/мл, 1 0⁴ КОЕ/мл и 1 0⁶ КОЕ/мл. Образцы берут в разные моменты времени в течение 8 ч и число жизнеспособных клеток определяют путем поверхностного посева 1 0-кратных разведений на соответствующие среды.

Опыты по совместному культивированию осуществляют в разных условиях, включая обогащение модельного кишечного сока тонкой кишки собаки декстрозой (5 г/л) и различными концентрациями коммерчески доступного экструдированного сухого корма для домашних животных (5, 25 или 100 г/л; Рг15к1е8 АЬРО Сотр1е1е, США). Последний гомогенизируют (81отасйег ЬаЬ В1епбег) и суспендируют в растворе электролита. Все эксперименты осуществляют двукратно.

Пример 6. Эксперименты по совместному культивированию четырех молочнокислых бактерий и четырех потенциально патогенных штаммов Е. сой ЕТЕС 08:Н9, Е. сой 0149:К88, 8. (урйбпигйнп 8Й1344 и 8й. буъегИепае осуществляют в модельном кишечном соке двенадцатиперстной кишки собаки, обогащенном 5 г/л декстрозы (Эбсо). Лактобациллы инокулируют в количестве 10⁸ КОЕ/мл, а индикаторные грамотрицательные штаммы - в количестве 10² КОЕ/мл. Результаты приведены в табл. 11.

Таблица 11. Совместное культивирование ЬАВ и потенциально патогенных бактерий в модельном кишечном соке тонкой кишки собаки, обогащенном декстрозой

Патогенные	Е. сой	Е. соИ	8. (урЫшипиш
бактерии	ЕТЕС	0149:	81Л344	дузеп1епае
Пробиотики	Ο8.Ή9	К88
I.. асМорЬйий N002628	4-4-+	4-++	+4-+	+4-Ь
(0Ν0Μ1-2453)
Е. гЬатпозиз N002583	+++	4-4-+	+++	+++
(0Ν0Μ 1-2449)
Ь. геи1еп N002581	Нет	++	Нет	4-4-+
(0Ν0Μ1-2449)	ингибирования		ингибирования
Е. геи(еп N002592	Нет	++	Нет	+
(ΟΝ0Μ1-2450)	ингибирования		ингибирования

+ Ингибирование роста.

++ Ингибирование роста и частичная инактивация. +++ Ингибирование роста и полная инактивация.

- 15 006428

Все четыре исследуемые лактобациллы демонстрируют антимикробную активность, но только Ь. ас1борЫ1и§ N''2628 (СNСМ 1-2453) и Ь. гйашпозиз N''2583 (СМСМ 1-2449) демонстрируют высокую активность против всех испытываемых патогенных бактерий. Оба штамма не только способны ингибировать рост патогенных бактерий, но также способны полностью инактивировать патогенные бактерии, содержащиеся в экспериментальной системе (жизнеспособных клеток не остается).

Пример 7. Эксперименты по совместному культивированию лактобацилл [(Ь. ас1борЫ1и§ N2628 (СМ 1-2453), Ь. гйашпозиз N2583 (СNСМ 1-2449)] и 8. (урЫшипиш 8Ш344 осуществляют в модельном кишечном соке двенадцатиперстной кишки собаки, обогащенном коммерчески доступным экструдированным сухим кормом для домашних животных (5, 25 или 100 г/л; Рп§к1е§ ЛРРО Сотр1е(е, США). Лактобациллы инокулируют в количестве 10⁸ КОЕ/мл, а индикаторные грамотрицательные штаммы - в количестве 10² КОЕ/мл. Результаты приведены в табл. 12.

Таблица 12. Совместное культивирование ЬЛБ и потенциально патогенных бактерий в модельном кишечном соке тонкой кишки собаки, обогащенном сухим кормом для домашних животных

Патогенные бактерии	Обогащение кормом	3. ЪурЫтигтит ЗЫ344
Пробиотик
Ь. ас1борНИиз N002628	5 г/л	+++
(ΟΝΟΜ 1-2453)	25 г/л	+++
	100 г/л	+++
Ь. гЬатпозиз N002583	5 г/л	Нет ингибирования
(ΟΝΟΜ 1-2449)	25 г/л	+
	100 г/л	++ .

+ Ингибирование роста ++ Ингибирование роста и частичная инактивация +++ Ингибирование роста и полная инактивация

Результаты демонстрируют высокие возможности, особенно Ь. ас1борЫ1и§ N2628 (СNСМ I2453), в отношении ингибирования роста и даже полной инактивации патогенных бактерий в тонкой кишке в условиях, весьма близких к практическим, таких как смесь модельного кишечного сока и корма. Антимикробная активность Ь. ас1борЫ1и§ N2628 очень высокая даже при низких уровнях добавления коммерческого корма для домашних животных, служащего для организма источником сбраживаемых сахаров. В отличие от такого результата, полученного для Ь. ас1борЫ1и§ N2628, эффективность Ь. гйашпозиз N2583 (СNСМ 1-2449) зависит от уровня обогащения кормом таким образом, что повышение антимикробной активности наблюдают при повышении количества корма для домашних животных, добавляемого в экспериментальную систему.

Пример 8. Эксперименты по совместному культивированию Ь. аЛборййиз N2628 (СNСМ 1-2453) и 8. (урЫшипиш 8Ш344 при различных уровнях инокуляции осуществляют в модельном кишечном соке двенадцатиперстной кишки собаки, обогащенном декстрозой (5 г/л; Эйсо). Ь. ашборЫЫз N2628 (СМ 1-2453) инокулируют в количестве 10⁸ КОЕ/мл и 8. (урЫшипиш 8Ш344 инокулируют в количестве 10² КОЕ/мл, 10⁴ КОЕ/мл и 10⁶ КОЕ/мл. Результаты приведены в табл.1 3.

Таблица 13. Совместное культивирование Ь. ас14орЫ1из N2628 (СNСМ 1-2453) и 8. (урЫшипиш 81,1344 при различных уровнях инокуляции

Патогенные Уровень инокуляции 3. ЬурЫтигЬиш бактерии_____________ патогенной бактерии ЗЫ344

Пробиотик

Ъ. асьйорйНиз N002628	10² КОЕ/мл	+++
(ΟΝΟΜ 1-2453)	10⁴ КОЕ/мл	+++
	10^б КОЕ/мл	+++

Антимикробная активность Ь. аЫборЫЫз N2628 (СNСМ 1-2453) достаточно высокая для того, чтобы полностью инактивировать 8. (урЫшипиш 8Ш344 даже в высокой начальной концентрации.

Пример 9. Иммунная стимуляция ΐη у1уо на собаках.

Иммунностимулирующий потенциал предварительно выделенных штаммов пробиотиков проверяют при клиническом испытании с использованием штамма Ь. ашборЫЫз N2628.

Методы

Пролиферация мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) собаки после стимуляции различными митогенами

- 16 006428

Данному испытанию подвергают 20 собак в возрасте 4-7 лет. Протокол кормления включает недельную адаптацию с РгЦШек νίΐαΐίΐν без цикория и 4 недели испытания с РгЦШек Υιίαίιΐν без цикория с добавлением бактерий Ь. ас1йорЫ1и5 N0’0’2628.

Ь. ас1йорЫ1и5 N002628 получают в достаточном количестве и в стабильной лиофилизованной форме для того, чтобы проверить выживание штамма в желудочно-кишечном тракте подопытных животных. Бактерии смешивают с 4 г трегалозы для того, чтобы добавлять достаточный объем носителя для смешивания полученных бактерий с основным кормом для животных. Бактерии получают в отдельных пластиковых пробирках (5⁹ КОЕ/день) и ежедневно добавляют в часть корма, чтобы иметь уверенность в том, что все бактерии будут съедены.

Образцы крови у собак берут через четыре недели после введения пробиотика. Кровь фракционируют на колонке να^υΐαί^Γ™ (ВесЮп Июкшкоп, Моийаш ^ете, СА). Извлекают РВМС согласно рекомендациям изготовителя.

Клетки стимулируют различными митогенами или эфирами форбола, индуцирующими сильную пролиферацию Т-клеток (конканавалин А (соп А), фитогемаглутинин (РНА)) или В-клеток (митоген Поквида (Р^М)) и всех клеток (миристат-ацетат форбола/иономицин (РМА/ионо)). С митогенами или эфирами форбола (соответствующие дозы указаны на фигуре 1) в 96-луночных планшетах с плоскодонными лунками (М1пс) инкубируют 10⁵ клеток на лунку в конечном объеме 200 мкл культуральной среды КРМ1-1640 с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки и антибиотков.

Клетки выдерживают во влажной атмосфере с 5% СО₂ при 37°С в течение 48 ч. Еще в течение 18 ч клетки метят импульсами 1 мкКи [³Н]-тимидина (Атегкйат Рйагтас1а Вю1ес11. Швейцария). Затем клетки собирают на нитроцеллюлозных фильтрах (Раскагй), и определяют количество связанного [³Н]тимидина путем подсчета импульсов (ТорСоип!; Раскагй, Швейцария). Пролиферацию клеток вычисляют в виде среднего (числа импульсов в минуту (чим, с.р.т.) (±ст.откл) при трехкратном повторе.

Результаты

Фиг. 1. Наблюдается четкое усиление пролиферации клеток в ответ на все митогены в группе собак, которых кормили Ь. ас1йорЫ1и5 NСС2628, по сравнению с контрольной группой. Такое усиление существенно в культурах, стимулируемых эфирами форбола с добавлением иономицина. Такие результаты показывают, что лимфоидные клетки собак, питавшихся пробиотиком, более реакционноспособны после активации ίη уйго, и наводят на мысль, что иммунная система собак, питавшихся пробиотиком, стимулируется.

Пример 10. Модуляция ίη У11го иммунных функций штаммами лактобацилл, полученных от домашних животных.

Путем скрининга ίη У11го отбирают различные штаммы лактобацилл, полученных от домашних животных, описанные выше, для определения их иммунномодулирующего потенциала. С этой целью измеряют их способность индуцировать провоспалительные цитокины (Ш-12, ΙΡΝ-γ) и/или противовоспалительные цитокины (Ш-10, ΤΟΡ-β) (Апапй А.С., Айуа С.М., 1999, Тгор. Оа51гоеп!го1., 20(3):97-106; 8ре11Ьегд В., Ей\гагЙ5 Ι.Ε.Ιγ., 2001, С1ш. 1пГес1. Όίδ., 32(1):76-102). Данное измерение имеет целью отбор возможных штаммов-кандидатов по причине сильных антипатогенных или противораковых иммунных функций, а также антагонистических функций против патологий кишечника собак, таких как аллергия и воспаление (воспалительные болезни кишечника). Получают дополнительные культуры только с одной средой (отрицательный контроль), со штаммом Еп!егососси8 Гаесшт 8Ρ68 (ΝΙΟΜΒ 10415, СегЬюк Рйагта, Швейцария) и с изолятом лактобацилл человека 8Т11 (N0’0’ 2461, СNСМ Ι-2116) (положительный контроль).

Метод

Профили цитокинов, индуцированные различными штаммами пробиотиков в лейкоцитах собак.

Кровь здоровых взрослых собак обрабатывают 5 мин при комнатной температуре буфером для лизинга АСК (150 мМ ΝΗ^Ι, 1 мМ КНСО₃ и 0,1 мМ Ыа₂-ЭДТК в Н₂О, рН = 7,4). Лейкоциты дважды промывают средой КРМ1 (без антибиотиков) и высевают в количестве 2· 10⁶ клеток/мл в 24-луночные культуральные планшеты. В каждую лунку добавляют 1 мл бактериальной суспензии (описанной ниже), содержащей 1 0⁶ КОЕ.

Для контрольной обработки к лейкоцитам добавляют только среду. Образцы инкубируют 18 ч при 37°С и 5% СО₂. Затем лейкоциты собирают, промывают РВ8 и центрифугируют. Клеточный осадок лизируют в 500 мкл реагента тризола (01Ьсо ВКЬ). Из клеточных лизатов экстрагируют РНК с использованием набора МШео^рш КNА (Мас11егу-№де1). Осуществляют амплификацию цитокинов собаки с использованием генного набора АВ (Мегск). Ссылки для праймеров приводятся ниже (все получены от МюгокупШ). Денситометрический анализ полос РСК, обнаруженных в окрашенных бромидом этидия агарозных гелях, осуществляют с использованием программного обеспечения ΝΙΗ 1таде. Все полосы нормализуют по соответствующей полосе продукта РСК β-актина, полученной с каждым образцом (внутренний контроль), и результаты выражают в виде произвольных единиц, отражающих плотность изображения каждой полосы продукта РСК цитокина (фиг. 2).

- 17 006428

Получение бактерий. Различные штаммы лактобацилл выращивают в среде МК8 в течение приблизительно 8 ч до тех пор, пока они не достигнут идентичной плотности. Бактерии разводят в среде КРМ1 без антибиотиков до конечной концентрации 10⁶ КОЕ/мл.

Праймеры, используемые для КТ РСК цитокинов

Цитокины Ссылки

1Ь-12р40	ВиЬЬпег М.	еЬ а1., 1998,	СуЪоктпе, 10 (4) :241-248
ΙΕΝγ	ВиЬЬпег	М.	еЬ	а1., 1998,	СуЬоктпе,	10 (4) :241-248
ΊΌΕβΙ	Сгопе А.	еС	а1	1998, УеЬ. 1штипо1	. 1тпшпораЬо1.,
	65:11-27
1Ь-10	Ρίηθίΐί	Е.	еЬ	а1., 1999,	УвЬ. 1ттипо1. 1ттипораЬо1.,
	69:121-126

Результаты

Фиг. 2. Результаты показывают, что профили цитокинов, индуцированные лактобациллами, зависят от штамма. Например, штамм ПСС2628 индуцирует высокие уровни 1Б-10 и ΤΘΡβ, что подчеркивает возможности указанного определенного штамма в отношении иммунной модуляции воспалительных расстройств, таких как аллергия и воспалительные болезни кишечника. Напротив, штамм ЖС2583 индуцирует высокие уровни ΙΡΝ-γ и 1Б-12, что делает такой штамм хорошим кандидатом на случай антипатогенной или противораковой активности.

Пример 11.

В исследовании используют три сухих корма для домашних животных. Их обозначают А, В и С. Корм А представляет собой полный сухой корм для домашних животных с необходимыми питательными веществами, доступный под маркой АБРО (АБРО является зарегистрированным товарным знаком 8ОС1ЕТЕ ΌΕ8 РКОБШТЗ ΝΕ8ΤΕΕ 8.А., Швейцария).

Корм В представляет собой такой же полный сухой корм для домашних животных с необходимыми питательными веществами, как корм А, но с добавлением порошкообразной смеси выбранных пробиотических микроорганизмов, добавляемой из пакетика. Смесь содержит по существу равные количества Б. ас1борЫ1ик N^2628 и вида Ь1йбоЬас1епиш N^2657. Ею посыпают корм при каждой подаче, причем добавляемая доза составляет примерно 10⁸ КОЕ/день.

Корм для домашних животных С представляет собой полный сухой корм для домашних животных с необходимыми питательными веществами, по существу, идентичный корму А, но содержащий 1,2 мас.% высушенного супернатанта культуры Еп1егососсик Гаесшш 8Б68 (МСМВ 10415).

В данном исследовании используют 30 собак. Собак предварительно кормят в течение 8 недель с использованием корма А. Затем собак делят на 3 группы по 10 собак в каждой, обозначают группы А, В и С и дают рационы под соответствующими названиями в течение 8 недель.

Собаки имеют свободный доступ к воде и их кормят один раз в сутки. Распространение перхоти в шерстяном покрове определяет оценочная комиссия из 30 членов в начале испытания и затем спустя 7 недель.

Собак перед оценкой комиссией чистят, и члены комиссии не сравнивают замечания в ходе оценки.

При такой оценке собак представляют каждому члену комиссии в 20 разных парах. Членов комиссии просят указать в своих протоколах, какая собака из представленной пары имеет (1) меньше перхоти, (2) более высокий блеск шерстяного покрова и (3) шерстяной покров с меньшим запахом.

Общее состояние шерстяного покрова у всех собак визуально и на ощупь настолько хорошее, насколько можно ожидать у нормальных здоровых собак. Однако обнаружено, что собаки, которых кормят рационом С, имеют заметно меньше перхоти, чем собаки, которых кормят контрольным кормом А. Собаки на рационе В имеют заметно более блестящий шерстяной покров и обнаруживают менее заметный запах шерстяного покрова, чем собаки на рационе А. Обнаружено, что указанные характеристики статистически существенно не отличаются при сравнении с собаками в группе В.

Пример 12. Кормовая смесь содержит до примерно 58 мас.% кукурузы, примерно 6 мас.% кукурузного глютена, примерно 25 мас.% мяса и остальное составляют мука, соли, витамины и минеральные вещества.

Кормовую смесь загружают в аппарат для предварительного кондиционирования и увлажняют. К такой смеси добавляют порошок, содержащий смесь следующих штаммов БасФЬасШик: БасФЬасШик гБашпокик Ж''С2583 (СNСМ Ι-2449), БасФЬасШик асчборЫик ЖС2628 (СNСМ Ι-2453) и Еп1егососсик Гаесшш 8Б68 (МСМВ 10415). Порошок по существу равномерно диспергируют в смеси. Затем такую увлажненную кормовую смесь загружают в варочный котел с экструдером и желатинизируют. Желатинизированную основу, выходящую из экструдера, проталкивают через головку и экструдируют. Экструдат нарезают на кусочки, подходящие для кормления собак, сушат при примерно 110°С в течение примерно 20 мин и охлаждают, и получают гранулы. Куски экструдата проверяют на бактериальную активность добавленных штаммов. Ничего не обнаруживают.

- 18 006428

Пример 13. В данном исследовании используют 24 собаки. В указанное число входят более молодые и более старые животные, причем возраст последних составляет 8-12 лет. У отобранных более старых собак обнаруживаются внешние признаки воспаления суставов, соответствующие их возрасту, и собаки временами испытывают некоторые трудности при движении. Некоторые движения оказываются болезненными. Такие симптомы часто наблюдают у более старых собак и полагают, что они связаны с артритическим состоянием.

В данном исследовании используют три сухих корма для домашних животных, обозначаемых А, В и С. Корм А представляет собой полный сухой корм для домашних животных с необходимыми питательными веществами (ЛЬРО Вее1у Отпет). Этот корм является контрольным кормом.

Всех выбранных 24 животных предварительно в течение 8 недель кормят с использованием корма для домашних животных А. Затем собак делят на 3 группы А, В и С по 8 собак в каждой группе и с тем же соотношением более молодых и более старых животных в каждой группе. Затем каждую группу в течение 8 недель кормят соответствующими кормами, указанными далее.

Группа______Корм для домашних животных

А А

В В

С_________________________С______________

Корм В представляет собой полный сухой корм для домашних животных с необходимыми питательными веществами, по существу, идентичный корму А, но содержащий слой, составляющий до 2% его массы, причем слой содержит микроорганизмы Еп1егососсиз 1аесшт 8Е68 (МСМВ 10415). Количество корма, даваемого ежедневно каждой собаке, рассчитывают в соответствии с массой ее тела таким образом, что дозировка микроорганизмов составляет 10⁹ КОЕ/день.

Корм С содержит экструдированные кусочки, полученные выше в примере 12. Количество корма, даваемого ежедневно каждой собаке, рассчитывают в соответствии с массой ее тела таким образом, что дозировка микроорганизмов составляет 10¹¹ КОЕ/день.

Собаки имеют свободный доступ к воде и их кормят один раз в день. К ошейнику каждой собаки прикрепляют измеритель активности и проводят измерения ежедневно. Собаки также оцениваются на активность визуально персоналом питомника.

Состояние всех собак визуально и на ощупь настолько хорошее, насколько можно ожидать у нормальных здоровых собак. Однако собаки в группах, получавших рационы В и С, заметно более активны, чем собаки на рационе А. Показатели измерителя подтверждают такие наблюдения.

Кроме того, оказывается, что у более старых собак в группах В и С после пребывания на рационах В и С в период испытания обнаруживается меньше внешних признаков локального воспаления суставов. Кроме того, оказывается, что собаки испытывают меньше боли при физическом движении и более подвижны, чем прежде. Можно сделать вывод, что рационы В и С обеспечивают ослабление в отношении некоторых признаков старения и улучшают подвижность у более старых собак.

Пример 14. Сухой корм для кошек.

Получают кормовую смесь, содержащую до примерно 58 мас.% кукурузы, примерно 6 мас.% кукурузного глютена, примерно 23 мас. % куриной муки и остальное составляют соли, витамины и минеральные вещества.

Кормовую смесь загружают в аппарат для предварительного кондиционирования и увлажняют. Затем такую увлажненную кормовую смесь загружают в варочный котел с экструдером и желатинизируют. Желатинизированную основу, выходящую из экструдера, проталкивают через головку и эктрудируют. Экструдат нарезают на кусочки, подходящие для кормления кошек, сушат при примерно 110°С в течение примерно 20 мин и охлаждают, и получают гранулы. В этот момент для применения к гранулам подготавливают порошок из одного или нескольких штаммов вида Ьа^оЬасШиз Ьас1оЬасШи8 гйатпозиз ЖС2583 (СКСМ 1-2449), Ьас1оЬасШи8 асчборЫЖ ЖХ2628 (СКСМ 1-2453) или Еп1егососсиз 1аесшт 8Е68 (МСМВ 10415). Порошка подготавливают достаточно для потребления его кошкой в количестве примерно 10⁷-10⁹ КОЕ/день. Часть порошка смешивают с первой массой гранул и упаковывают в мешки. Другую часть порошка определяют и смешивают с жидким носителем, который затем разбрызгивают по второй массе гранул. Гранулы упаковывают в мешки после того, как покрытие высохнет в достаточной степени при 50-60°С в течение нескольких минут.

Пример 15. Консервированный корм для домашних животных и добавка.

Получают смесь из 73% тушек домашней птицы, свиного легкого и коровьей печени (измельченной), 16% пшеничной муки, 2% красителей, витаминов и неорганических солей. Полученную смесь эмульгируют при 1 2°С и экструдируют в форме густой каши, которую затем пропаривают при температуре 90°С. Ее охлаждают до 30°С и нарезают на куски. Такие куски (45%) смешивают с 55% заливки, полученной из 98% воды, 1% красителя и 1% гуаровой камеди. Смесью заполняют банки из белой жести и стерилизуют при 1 25°С в течение 40 мин. В качестве пробиотической добавки, смешиваемой с кормом для домашних животных перед подачей, поставляют дополнительные упаковки в форме пакетиков со штаммами видов Еас1оЬасй1из Еас1оЬасй1из гйатпозиз ЖХ2583 (СNСМ 1-2449), Еас1оЬасй1из асчборЫЖ

- 19 006428

ИСС2628 (СИСМ 1-2453) или Еп1егососси5 Гассшш 8Р68 (И1СМВ 10415). Соответствующее количество для домашнего животного составляет примерно 10⁶-10¹² КОЕ/день, в зависимости от того, кошка это или собака, и физических факторов, таких как масса тела. Это предоставляется в виде приложения, которое можно отсоединить от банки, вместе с инструкциями по кормлению.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Выделенный штамм молочно-кислых бактерий Ьас1оЬасШи5 геи1еп ИСС 2581 (СИСМ 1-2448), обладающий высокой пробиотической активностью в организме домашнего животного, способный выживать в желудочно-кишечном тракте домашнего животного и колонизировать его.
2. Выделенный штамм молочно-кислых бактерий Ьас1оЬасШи5 геи1еп ИСС 2592 (СИСМ 1-2450), обладающий высокой пробиотической активностью в организме домашнего животного, способный выживать в желудочно-кишечном тракте домашнего животного и колонизировать его.
3. Выделенный штамм молочно-кислых бактерий ЬасФЬасШик гйашпокик ИСС 2583 (СИСМ 12449), обладающий высокой пробиотической активностью в организме домашнего животного, способный выживать в желудочно-кишечном тракте домашнего животного и колонизировать его.
4. Выделенный штамм молочно-кислых бактерий Ьас1оЬасШи5 геи1еп ИСС 2603 (СИСМ 1-2451), обладающий высокой пробиотической активностью в организме домашнего животного, способный выживать в желудочно-кишечном тракте домашнего животного и колонизировать его.
5. Выделенный штамм молочно-кислых бактерий Ьас1оЬасШи5 геи1еп ИСС 2613 (СИСМ 1-2452), обладающий высокой пробиотической активностью в организме домашнего животного, способный выживать в желудочно-кишечном тракте домашнего животного и колонизировать его.
6. Выделенный штамм молочно-кислых бактерий ЬасФЬасШик ас1борЫ1и8 ИСС 2628 (СИСМ 12453), обладающий высокой пробиотической активностью в организме домашнего животного, способный выживать в желудочно-кишечном тракте домашнего животного и колонизировать его.
7. Выделенный штамм по любому из пп.1-6, обладающий способностью к росту с продуцированием по меньшей мере 10⁶ КОЕ/мл в присутствии до 2% солей жёлчных кислот.
8. Выделенный штамм по любому из пп.1-7, обладающий способностью продуцировать по меньшей мере 10⁶ КОЕ/мл в течение примерно 2 ч при рН примерно от 3,4 до 4,2.
9. Применение выделенного штамма молочно-кислых бактерий по любому из пп.1-6, и/или супернатанта его культуры, и/или его фракции для получения композиции, предназначенной для поддержания или улучшения здоровья домашнего животного.
10. Применение по п.9, согласно которому при введении указанной композиции в организм животного штамм образует примерно от 10⁴ до 10¹² КОЕ/животное в день.
11. Применение по любому из пп.9 и 10 для получения композиции, предназначенной для лечения и/или профилактики расстройств, связанных с колонизацией желудочно-кишечного тракта домашнего животного патогенными микроорганизмами.
12. Применение по любому из пп.9-11 для получения композиции, предназначенной для регуляции функционирования иммунной системы домашнего животного.
13. Применение по любому из пп.9-11 для получения композиции, предназначенной для поддержания здорового состояния кожи и/или шерсти домашнего животного или улучшения их состояния.
14. Применение по любому из пп.9-11 для получения композиции, предназначенной для облегчения или ослабления эффектов старения у домашнего животного.
15. Кормовая композиция для домашних животных, содержащая по меньшей мере один выделенный штамм молочно-кислых бактерий по любому из пп.1-6, и/или супернатант его культуры, и/или его фракцию, в сочетании с пищевой основой или фармацевтической основой.
16. Кормовая композиция для домашних животных, предназначенная для подержания здорового состояния желудочно-кишечного тракта домашнего животного или улучшения состояния желудочнокишечного тракта, содержащая по меньшей мере один выделенный штамм по любому из пп.1-6, и/или супернатант его культуры, и/или его фракцию, в сочетании с пищевой основой или фармацевтической основой.
17. Кормовая композиция для домашних животных, предназначенная для поддержания здорового состояния кожи и/или шерсти домашнего животного или улучшения их состояния, содержащая по меньшей мере один выделенный штамм по любому из пп.1-6, и/или супернатант его культуры, и/или его фракцию, в сочетании с пищевой основой или фармацевтической основой.
18. Кормовая композиция для домашних животных, предназначенная для регуляции функционирования иммунной системы домашнего животного, содержащая по меньшей мере один выделенный штамм по любому из пп.1-6, и/или супернатант его культуры, и/или его фракцию, в сочетании с пищевой основой или фармацевтической основой.
19. Кормовая композиция для домашних животных, предназначенная для облегчения или ослабления эффектов старения у домашнего животного, содержащая по меньшей мере один выделенный штамм

- 20 006428 по любому из пп.1-6, и/или супернатант его культуры, и/или его фракцию, в сочетании с пищевой основой или фармацевтической основой.
20. Кормовая композиция по любому из пп. 15-19, при введении которой в организм животного штамм образует примерно от 10⁴ до 10¹² КОЕ/животное в день.
21. Кормовая композиция по любому из пп.15-19, дополнительно содержащая пребиотик.
22. Кормовая композиция по любому из пп.15-21, изготовленная в виде порошкообразной, сухой или влажной, замороженной или устойчивой при хранении форме.
23. Кормовая композиция по любому из пп.15-21, представляющая собой добавку или дополнение к корму.
24. Кормовая композиция по п.23, поставляемая вместе с кормом для домашнего животного в дополнительной упаковке, такой как пакетик.
25. Способ поддержания здорового состояния желудочно-кишечного тракта домашнего животного или улучшения состояния желудочно-кишечного тракта, включающий стадию кормления домашнего животного кормовой композицией по п.16.
26. Способ поддержания здорового состояния кожи и/или шерсти домашнего животного или улучшения их состояния, включающий стадию кормления домашнего животного кормовой композицией для животных по п.17.
27. Способ регуляции функционирования иммунной системы домашнего животного, включающий стадию кормления домашнего животного кормовой композицией по п.18.
28. Способ облегчения или ослабления эффектов старения у домашнего животного, включающий стадию кормления домашнего животного кормовой композицией по п.19.
29. Способ лечения и/или профилактики расстройств, связанных с колонизацией желудочнокишечного тракта домашнего животного патогенными микроорганизмами, включающий стадию кормления домашнего животного кормовой композицией для домашних животных, содержащей по меньшей мере один выделенный штамм по любому из пп.1-6, и/или супернатант его культуры, и/или его фракцию.
30. Способ по п.29, в котором патогенными микроорганизмами являются штаммы 8а1шопе11а 1урЫшигшш, ЕксйепсЫа сой, 8Ыде11а букейепаеа или другие патогенные энтеробактерии, колонизирующие домашних животных, или паразиты, такие как гельминты Тохосага, простейшие Стур1окропбшш, С1агб1а, Рейа1пс1ютопак йотшй, Еп1ашоеЬа Ык1о1убса, Тохор1акша допбй или дрожжи.