MXPA02011595A

MXPA02011595A - Nuevos probioticos para aplicaciones de alimento de mascotas.

Info

Publication number: MXPA02011595A
Application number: MXPA02011595A
Authority: MX
Inventors: Roberto Reniero
Original assignee: Nestle Sa
Priority date: 2000-05-25
Filing date: 2001-05-22
Publication date: 2003-03-27
Also published as: ES2284089T3; KR100796963B1; JP4343477B2; JP2003534003A; US20100266549A1; PL207930B1; US7189390B2; UY26734A1; IL152695A; CN100396769C; NO330276B1; DE60127731D1; US20050106133A1; BR0111275A; US20070178079A1; EP1541673B1; US20080171106A1; IL152695A0; EA006428B1; DE60119515T2

Abstract

La presente invencion se refiere a nuevos microorganismos bacterianos de acido lactico que se han aislado y seleccionado por su potencial probiotico y su uso para la preparacion y composiciones de alimento para mascotas propuestas para mejorar la salud de las mascotas, y a composiciones que contienen los mismos.

Description

NUEVOS PROBIOTICOS PARA APLICACIONES DE ALIMENTO DE MASCOTAS La presente invención se refiere a nuevas bacterias de ácido láctico y de manera más particular a microorganismos de los géneros Lactobacilll us , Bífidobacterium y Streptococcus (Enterococcus ) que se han aislado y seleccionado por su potencial probiótico. La presente invención también se refiere a su uso en la preparación de composiciones de alimento para mascotas, propuestas para mejorar la salud de las mascotas y a composiciones que contienen la misma. También se proporcionan métodos para mantener o mejorar la salud de las mascotas a través de la alimentación a una mascota de estos microorganismos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El bienestar de los animales domésticos se relaciona estrechamente a su alimentación. La alimentación correcta debe dar por resultado una mascota en forma y saludable. Además de proporcionar valor nutritivo, la composición alimenticia influye en el equilibrio de la microflora intestinal y puede conducir o prevenir trastornos gastrointestinales. Por lo tanto, el conocimiento con respecto a los procesos de digestión y el tracto gastrointestinal de los animales saludables es integral al entendimiento de una práctica alimenticia factible. Como carnívoros, los gatos y perros se caracterizan por tracto digestivo corto y una rápida velocidad de flujo del bolo alimenticio . Entre los constituyentes de la microflora gastrointestinal de gatos y perros, se pueden recuperar Bacteroides sp . , Clostridi um sp . , Enterobacte iaceae , Bifidobacterium sp . , Lactobacillus sp . , Streptococcus sp . , Staphylococcus sp . y levaduras. El número y composición de esta flora endógena tiende a ser más bien estable, aunque la edad y en un menor grado, el alimento pueden modificarla. La acidez gástrica, bilis, peristalsis intestinal e inmunidad local son factores que se consideran importantes en la regulación de la flora bacteriana en el intestino delgado de los seres humanos y varios otros mamíferos. Frecuentemente, los trastornos gastrointestinales de felinos y caninos se enlazan al sobrecrecimi'ento bacteriano y la producción de enterotoxinas producidas por bacterias patógenas. Durante los últimos años, la investigación se ha enfocado en algunas cepas valiosas de bacterias de ácido láctico y su uso potencial como agentes probióticos. Los probióticos se consideran que son preparaciones microbianas viables que promueven la salud de los mamíferos al conservar la microflora natural en el intestino. Los probióticos se piensa que se unen a la mucosa intestinal, colonizan el tracto intestinal y de este modo impiden la unión de microorganismos peligrosos al mismo. Un prerrequisito para su acción reside en que tienen que alcanzar la mucosa del intestino de una forma apropiada y viable y especialmente que no se destruyan por la influencia del bajo pH que prevalece en el estómago. En particular, la fisiología del tracto digestivo de perros y gatos difiere de los humanos. Por ejemplo, el pH promedio en el estómago es de aproximadamente 3.4 para perros y 4.2 para gatos. Aunque la US 5,968,569 describe la inclusión de un microorganismo probiótico en un cereal de alimento para mascota, ni ésta, ni la técnica anterior restante, disponible proporciona información con respecto a las cepas propuestas específicamente para la salud de las mascotas. En consecuencia, existe una necesidad por proporcionar nuevas cepas bacterianas que se adapten particularmente para mascotas y que se hayan seleccionado por sus altas propiedades probiót cas benéficas para la salud de mascotas e incorporen estas cepas en una composición de alimento para mascotas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN De acuerdo con un primer aspecto de la invención, se proporciona un nuevo microorganismo probiótico de bacterias de ácido láctico, seleccionado por su capacidad para sobrevivir y colonizar el tracto gastrointestinal de una mascota y para ejercer una actividad probiótica benéfica en la salud de la mascota. La cepa probiótica se puede seleccionar de lactobacilos, bifidobacterias o enterococos. La cepa probiótica se puede seleccionar a partir del grupo que consiste de Lactobacill us reuteri , Lactobacillus acidophil us, Lactobacillus animalis, Lactobacillus ruminis, Lactobacillus johnsonii , Lactobacillus caseí , Lactobacillus paracaseí .

Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus fermentum y Bifidobacterium spp . , Enterococcus faecium y Enterococcus spp . En una modalidad preferida, la cepa probiótica se selecciona del grupo que consiste de Lactobacillus reuteri (NCC2581; CNCM 1-2448) , Lactobacillus reuteri (NCC2592; CNCM 1-2592); CNCM I-2450), Lactobacillus rhamnosus (NCC2583; CNCM 1-2449), Lactobacillus reuteri (NCC2603; CNCM 1-2451), Lactobacillus reuteri (NCC2613; CNCM 1-2452), Lactobacillus acidophilus (NCC2628 ; CNCM 1-2453), Bifidobacterium adolescentis (por ejemplo NCC2627) , Bifidobacterium sp . NCC2657 o enterococcus faecium SP68 (NCIMB 10415) . La nueva cepa bacteriana se puede usar en cualquier cantidad desde aproximadamente 1.0E+04 a aproximadamente 1.0E+12 cfu/animal y día y de manera preferente 1.0E+05 a aproximadamente 1.0E+11 cfu/animal y día, de manera más preferente de 1.0E+07 a 1.0E+10 cfu/animal y día. En un aspecto, la invención se refiere al uso de la cepa bacteriana como se describe anteriormente y/o su sobrenadante de cultivo y/o sus metabolitos, para la preparación de una composición propuesta para el tratamiento y/o profilaxis de trastornos asociados para la colonización del tracto intestinal de mascotas por microorganismos patogénicos . A menos que se indique de otro modo claramente en el contexto, la referencia a "cepa" se debe entender que incluye su sobrenadante de cultivo y/o un metabolismo de la misma.

En otro aspecto, la invención se refiere al uso de la cepa bacteriana como se describe anteriormente y/o su sobrenadante de cultivo y/o un metabolito del mismo, para la preparación de una composición propuesta para regular la respuesta inmunitaria de mascotas. Por el término "regular" la respuesta inmunitaria, se quiere decir que las cepas bacterianas descritas anteriormente y/o su sobrenadante de cultivo y/o sus metabolitos tienen la capacidad para estimular ya sea ciertas funciones inmunitarias que son importantes a la salud de la mascota o para modular otras funciones inmunitarias que se podrían implicar potencialmente en los trastornos inmunitarios , tal como inflamación, alergia, etc. La estimulación o modulación de estas funciones inmunitarias se puede lograr al usar diferentes combinaciones de las cepas bacterianas descritas anteriormente y/o su sobrenadante de cultivo y/o sus metabolitos. La invención proporciona adicionalmente un método para mantener o mejorar la salud del tracto gastrointestinal, la piel y/o el sistema de revestimiento o el sistema inmunitario de una mascota que comprende el paso de alimentar una mascota con una composición de alimento para mascotas que contiene al menos una cepa aislada como se describe anteriormente.

Además, la invención proporciona un método para el tratamiento y/o profilaxis de trastornos asociados con la colonización del tracto gastrointestinal de mascotas por microorganismos patogénicos, que comprende el .paso de alimentar una mascota con una composición de alimento para mascotas que contiene al menos una cepa aislada de acuerdo con la presente invención. La invención también proporciona un método para regular la respuesta inmunitaria en mascotas, que comprende el paso de alimentar una mascota con una composición de alimento para mascotas que contiene al menos una cepa aislada de acuerdo con la presente invención. La invención también proporciona un método para mejorar o reducir los efectos del envejecimiento en una mascota, que comprende el paso de alimentar una mascota con una composición de elemento para mascotas que contiene al menos una cepa aislada de acuerdo con la presente invención. Estos microorganismos seleccionados tienen un impacto benéfico particular en mascotas en su tracto gastrointestinal, o en su piel y/o revestimiento, o sus sistema inmunitario y en los efectos del envejecimiento.

Tienen un impacto benéfico particular en los patógenos intestinales tal como las cepas Salmonella typhimurium, Escherichia coli , Shigella dysenteriaea u otras Enterobacteriaceae patogénicas que colonizan mascotas o parásitos tal como helmintos ( Toxocara spp . ) , protozoarios ( Cryptosporidium spp, Giardia spp . , Pentatrichomonas hominis, Entamoeba histolytica, Toxoplasma gondii , ... ) , o levaduras. Combinados con el alimento, estos microorganismos ejercen de manera particular sus efectos benéficos probióticos en el buen sabor, digestión y salud del intestino, función inmunitaria y condiciones sanitarias, estas últimas por medio de la contribución a una reducción del volumen fecal y al menos una desodorización parcial de las heces caninas. De esta manera, de acuerdo con un segundo aspecto de la invención, una composición de alimento para mascotas comprende un microorganismo que tiene una alta actividad probiótica en mascotas y que es capaz de sobrevivir y colonizar el tracto gastrointestinal de una mascota que lo ingiere. Por consiguiente, la invención se refiere a una composición de alimento para mascotas propuesta para la salud del tracto gastrointestinal de las mascotas, que contiene al menos una cepa probiótica aislada como se describe anteriormente y/o un sobrenadante de su cultivo y/o un metabolito de la misma, asociada con un soporte ingerible o una matriz farmacéutica . También, la invención se refiere a una composición de alimento para mascotas propuesta para la reducción de la respuesta inmunitaria de mascotas, que contiene al menos una cepa aislada como se describe anteriormente y/o un sobrenadante de su cultivo y/o un metabolito de la misma, asociado con un soporte ingerible o una matriz farmacéutica. También, la invención se refiere a una composición de alimento para mascotas propuesta para la mejora o reducción de los efectos del envejecimiento en mascotas, que contiene al menos una cepa aislada como se describe anteriormente y/o un sobrenadante de su cultivo y/o un metabolito de la misma, asociada con un soporte ingerible o una matriz farmacéutica. Finalmente', la invención se refiere a una composición de alimento para mascotas propuesta para la salud de la piel y/o pelaje de mascotas, que contiene al menos una cepa aislada como se describe anteriormente- y/o un sobrenadante de su cultivo y/o un metabolito de la misma, asociada con un soporte ingerible o una matriz farmacéutica.

En una modalidad, el soporte ingerible comprende una composición de alimento para mascotas, nutricionalmente balanceada. Esta composición contiene de manera preferente una cantidad suficiente de la cepa aislada, sobrenadante de cultivo y/o un metabolito de la misma, para ser efectiva en la provisión del efecto profiláctico cuando la composición se alimenta a una mascota como una comida completa.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Dentro de la siguiente descripción, la abreviación cfu ("unidades de formación de colonias") designa el número de células bacterianas como se revela por las cuentas micriobológicas de placas de agar. Además, "NCC" designa Colección de Cultivos Nestlé (Nestlé Research Center, Vers-chez- les-Blanc , Lausanne, Suiza) . Con respecto al primer objeto de la presente invención, 20 lactobacilos y 18 bifidobacterias aisladas de heces de perros y gatos, se detectaron y seleccionaron con respecto a sus parámetros tecnológicos y fisiológicos. Un primer examen para las aplicaciones probióticas potenciales se realizó in vi tro (ver Ejemplos 1 y 2). Las características de crecimiento, tolerancia a la acidez gástrica a diferentes pH y diferentes concentraciones de sales virales presentes en el duodeno probablemente se van a encontrar en gatos y perros . Adicionalmente, la buena supervivencia de las células liofilizadas en dos diferentes medios crioprotectores se demostró claramente a 4°C y 20°C como se indica por la prueba acelerada de almacenamiento . Estas cepas se pueden caracterizar por tiempos cortos de generación, altas cuentas (más de l.OE+08 cfu/ml) durante su fase estacionaria y estabilidad en altos números a 8 y 24 horas postinoculación, estabilidad a liofilización seguido ya sea por condiciones de almacenamiento, resistencia a concentraciones fisiológicas de bilis encontradas en el duodeno (2% de bilis) y su baja inhibición cuando crecen en la presencia de hasta 4% de bilis. Adicionalmente, los resultados de los análisis de ADN se tomaron en cuenta para seleccionar bacterias representativas de la diversidad investigada. Las cepas propuestas para la salud de perros y gatos pueden crecer hasta al menos 1.0E+06 cfu/ml en la presencia de hasta 2.0% de sales biliares. Las cepas también pueden crecer hasta al menos 1.0E+06 cfu/ml después de aproximadamente 2 horas a un intervalo de pH de aproximadamente 3.4 a aproximadamente 4.2. Las cepas bacterianas de acuerdo con la invención se pueden seleccionar a partir del grupo que consiste de Lactobaci ll us reuteri , Lactobacillus acidophil us , Lactobacillus animalis, Lactobacill us ruminis, Lactobacillus johnsonii , Lactobacillus casei , Lactobacillus paracasei , Lactobacill us rhamnosus, Lactobacill us fermentum, Bifidobacterium sp . , Enterococcus faecium y Enterococcus sp . Las siguiente cepas Lactobacillus reuteri NCC2581 , Lactobacillus rhamnosus NCC2583, Lactobacillus reuteri NCC2592, Lactobacillus reuteri NCC2603, Lactobacillus reuteri NCC2613 y Lactobacill us acidophilus NCC2628 se depositaron a manera de ejemplo bajo el tratado de Budapest, en la Colección Nacional de Cultivo de Microorganismos, 25 rué du docteur, Roux, 75724, París, Francia, el 19 de abril del 2000, bajo las siguientes referencias CNCM 1-2448, CNCM 1-2449, CNCM 1-2450, CNCM 1-2451, CNCM 1-2452 y CNCM 1-2453, respectivamente. Todas las restricciones en cuanto a la disponibilidad de estos depósitos se reintegrarán en la primera publicación de esta solicitud u otra solicitud que reivindique el beneficio de prioridad de esta solicitud.

CARACTERIZACIÓN BIOQUÍMICA DE LAS CEPAS SELECCIONADAS Lactobacillus reuteri CNCM 1-2448 Microorganismo gram-positivo, no móvil, no espurulento Varillas pequeñas más o menos cortas y gruesas Microorganismo microaerófilo con metabolismo heterofermentable, producción de ácido L(+) y D(-) láctico catalasa (-), producción de C02 de glucosa, hidrólisis de arginina = producción de NH3 Crecimiento con NaCl al 5% y 10% Fermentación de azúcares: L-arabinosa, galactosa, D-glucosa, lactosa, sacarosa, D-rafinosa.

LactobacilluB rhamnosus CNCM 1-2449 - Microorganismo gram-positivo, no móvil, no espurulento - Varillas pequeñas más o menos cortas y gruesas - Microorganismo microaerófilo con metabolismo heterofermentable, producción de ácido L(+) láctico - catalasa '( - ) , - Fermentación de todos los azúcares .típicos para Lb . rhamnosus Lactobacillus reuteri CNCM 1-2450 - Microorganismo gram-positivo , no móvil, no espurulento - Varillas pequeñas más o menos cortas y gruesas - Microorganismo microaerófilo con metabolismo heterofermentable, producción de ácido L(+) y D(+) láctico - catalasa (-), producción de C02 de glucosa, hidrólisis de arginina = producción de NH3 - Crecimiento con NaCl al 5% y 10% - Fermentación de azúcares: L-arabinosa, galactosa, D- glucosa, D-xilosa, lactosa, sacarosa, D-grafinosa Lactobacillus reuteri CNCM 1-2451 — Microorganismo gram-posit ivo, no móvil, no espurulento — Varillas pequeñas más o menos cortas y gruesas — Microorganismo microaerófilo con metabolismo heterofermentable, producción de ácido L(+) y D(+) láctico — catalasa (-), producción de C02 de glucosa, hidrólisis -de arginina = producción de NH3 — Crecimiento con NaCl al 5% y 10% — Fermentación de todos los azúcares que son típicos para Lb . reuteri Lactobacillus reuteri CNCM 1-2452 — Microorganismo gram-positivo, no móvil, no espurulento — Varillas pequeñas más o menos cortas y gruesas — Microorganismo microaerófilo con metabolismo heterofermentable, producción de ácido L(+) y D(-) láctico - Catalasa (-), producción de C02 de glucosa, hidrólisis de arginina = producción de NH3 — Crecimiento con NaCl al 5% y 10% — Fermentación de azúcares: L-arabinosa, D-glucosa, lactosa, sacarosa, D-rafinosa Lactobacillus reuteri CNCM 1-2453 — Microorganismo gram-positivo, no móvil, no espurulento — Varillas pequeñas más o menos cortas y gruesas - Microorganismo macroaerófilo con metabolismo heterofermentable, producción de ácido L(+) y D(-) láctico — Catalasa (-) — Fermentación azúcares: D-glucosa, lactosa, sacarosa, D-rafinosa Tres lactobacilos aislados de gatos (NCC2581, NCC2592, NCC2583), tres lactobacilos de perros (NCC2603, NCC2613, NCC2628), una bifidobacteria de gatos (NCC2627) y una bifidobacteria de perros (NCC2657) se probaron adicionalmente para su actividad potencial probiótica en mascotas (ver Ejemplos 3 y 4) . En otra modalidad, la presente invención se refiere al uso de cepas bacterianas como se describe anteriormente, para la preparación de una composición alimenticia capaz de mejorar o mantener la salud de las mascotas . Se pueden usar en forma viable, forma inactivida, como un sobrenadante de un cultivo o fracciones de la misma, por ejemplo, paredes cerebrales, peptidoglicano, citoplasma, proteínas purifdicadas, metabolitos funcionales, moléculas bioactivas . De manera preferente, se usan en una cantidad de aproximadamente 1.0E+04 cfu/g a aproximadamente 1.0E+11 cfu/g y de manera preferente de 1.0E+05 cfu/g a aproximadamente 1.0E+10 cfu/g, de manera más preferente de 1.0E+06 cfu/g a 1.0E+09 cfu/g. En una modalidad preferida, se pueden usar como adjuntos dietéticos para mejorar la calidad del alimento para mascotas y se pueden incluir en una cantidad desde aproximadamente 1.0E+04 cfu/g a aproximadamente 1.0E+11 cfu/g. Como adjuntos dietéticos, se pueden encapsular o se pueden proporcionar en la forma de polvo y empacar en unión con, o de manera separada de una comida principal, esté seca o húmeda. A manera de ejemplo, un polvo que contiene microorganismos seleccionados de acuerdo con la invención, o componentes o porciones del sobrenadante de sus cultivos en metabolitos seleccionados, se pueden empacar en sobrecitos en una forma de polvo o en un gel o lípido u otro portador adecuado. Estas unidades empacadas de manera separada se pueden proporcionar conjuntamente con una comida principal o en paquetes de varias unidades para el uso con una comida principal o tratamiento, de acuerdo a las instrucciones del usuario. En otro ejemplo, las cepas probióticas se pueden proporcionar en una unidad de empaque de varias cámaras junto con un segundo componente ingerible, por ejemplo, una comida abundante húmeda o con un contenido medio de humedad, o un lote de tamaño de porción de productos molidos secos en una configuración de bolsa flexible. Una primera cámara en la bolsa contendrá la cepa probiótica y una segunda cámara sellada, separada contendrá el segundo componente ingerible. Estos microorganismos seleccionados tienen un impacto benéfico particular en mascotas en su tracto gastrointestinal, en su piel y/o pelaje, en su sistema inmunitario, en la salud dental u oral, en sus huesos y en los efectos del envejecimiento. También se encuentra que mejoran el buen sabor de la comida, digestión, función inmunitaria y funciones sanitarias (reducción de volumen fecal y desodorización parcial de las heces caninas) en mascotas . La presente invención también se refiere a una composición de alimento para mascotas para mejorar o mantener la salud de mascotas, la cual contiene al menos una cepa probiótica que contiene los rasgos anteriores, asociada con un soporte ingerible o una matriz farmacéutica. Se puede administrar a la mascota como un complemento de su dieta normal o como un componente de un alimento para mascota nutricionalmente completo, al menos una cepa bacteriana que tiene los rasgos anteriores y/o su sobrenadante de cultivo o una fracción de la misma y/o sus metabolitos . La composición de alimento para mascotas, nutricionalmente completa de acuerdo con la invención puede_ estar en la forma de polvo, seco o en un producto de alimento para mascotas, húmedo, molido o auto-estable. Estos alimentos para mascotas se pueden producir por maneras conocidas en la técnica con la condición que donde se desee la actividad de microorganismo, se tome cuidado para asegurar la supervivencia del microorganismo. Aparte de las cepas bacterianas y/o su medio fermentado, estos alimentos para mascotas pueden incluir cualquiera de una fuente de almidón, una fuente de proteína y una fuente de lípidos . Las fuentes de almidón adecuadas son por ejemplo, granos y legumbres, tal como maíz, arroz, trigo, cebada, avena, soya y mezclas de éstas. Las fuentes de proteína adecuada se pueden seleccionar de cualquier fuente de proteína animal o vegetal adecuada; por ejemplo carne y comida, carne de aves de corral, carne de pescado, concentrado de proteína de soya, proteínas lácteas, gluten y similares. Para animales de varios años, se prefiere que esta fuente de proteína contenga una proteína de alta calidad. Las fuentes adecuadas de lípidos incluyen comidas, grasas animales y grasas vegetales. La elección de las fuentes de almidón, prote.ína y lípido se determinarán ampliamente por las necesidades nutricionales del animal, consideraciones de buen sabor y el tipo de producto aplicado. Para mascotas con varios años, el alimento para mascotas contiene de manera preferente, proporcionalmente menos grasa que los alimentos para mascotas jóvenes. Adicionalmente, las fuentes de almidón pueden incluir uno o más de arroz, cebada, trigo y maíz. Adicionalmente, también se pueden incorporar conforme se desee en el alimento para mascotas, varios ingredientes diferentes, por ejemplo, azúcar, sal, especies, agentes de sazón, vitaminas, minerales, agentes saborizantes, grasas y similares. Para los alimentos secos para mascotas, un proceso adecuado es la cocción por extrusión, aunque se puede usar el horneado y otros procesos adecuados. Cuando se cuece por extrusión, el alimento seco para mascotas usualmente se proporciona en la forma de un producto molido. Si se usa un carbohidrato prebiótico, el prebiótico se puede mezclar con los otros ingredientes del alimento seco para mascotas antes del procesamiento. En la solicitud de Patente Europea No. 0850569, se- describe un proceso adecuado; la descripción del cual se incorpora por referencia. Si se usa un microorganismo probiótico y si se desea la actividad en el producto final, el organismo se reviste mejor o se rellena en el alimento seco para mascotas. En la solicitud de Patente Europea No. 0862863 se describe un proceso adecuado; la descripción del cual se incorpora como referencia. Donde no se requiera la supervivencia del microorganismo, se puede adicionar a la mezcla de pre-extrusión, como puede ser el sobrenadante de su cultivo o metabolito, como se desee. Para alimentos húmedos, los procesos descritos en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 4,781,939 y 5,132,137 se pueden usar para producir productos de carne simulada. La descripción de estas patentes se incorporan como referencia. También se pueden usar otros procesamientos para producir productos tipo trozo; por ejemplo la cocción en un horno de vapor. De manera alternativa, los productos tipo pan se pueden producir al emulsionar un material de carga adecuado para producir una emulsión de carne, adicionando un agente adecuado de formación de gel, y calentando la emulsión de carne antes del relleno en botes u otros recipientes . Como en el caso de la producción de alimentos secos para mascotas, donde no es esencial la supervivencia de las especies probióticas elegidas, se puede adicionar a la mezcla de alimentación antes de la cocción o calentamiento, o en cualquier etapa apropiada conveniente en el proceso de producción. La cantidad de probiótico en el alimento para mascotas es de manera preferente menor de aproximadamente 20 % en peso y de manera adicional, preferentemente menos de 10 % en peso. Por ejemplo, el probiótico puede comprender de aproximadamente 0.1% a aproximadamente 5 % en peso del alimento para mascotas. Para los alimentos para mascotas, que usan achicoria como el prebiótico, la achicoria se puede incluir para comprender desde aproximadamente 0.5% a aproximadamente 10 % en peso de la mezcla alimenticia, de manera más preferente de aproximadamente 1 % a aproximadamente 5 % en peso. Los alimentos para mascotas pueden contener otros agentes activos tal como ácidos grasos de cadena larga. Los ácidos grasos de cadena larga, adecuados incluyen ácido alfa-linoleico, ácido gamma-linoleico, ácido linoleico, ácido eicosapentanoico, y ácido docosahexanoico. Los aceites de pescado son una fuente adecuada de ácidos eicosapentanoico y ácido docosahexanoico. El aceite de borraja, aceite de semilla de grosella negra, y el aceite de primavera vespertina son fuentes adecuadas de ácido gamma-linoleico. Los aceites de cártamo, aceites de girasol, aceites de maíz y aceites de soya son fuentes adecuadas de ácido linoleico. Si es necesario, los alimentos para mascotas se complementan con minerales y proteínas de modo que son nutricionalmente completos. Adicionalmente, si se desea, la cepa bacteriana se puede encapsular; por ejemplo en una matriz de azúcar, matriz de grasa o matriz de polisacárido. También se puede revestir como se describe en EP 862 863. La nueva cepa probiótica se usa de manera preferente de modo que el alimento para mascotas contiene de manera preferente cerca 1.0E+04 a aproximadamente 1.0E+10 células del microorganismo probiótico por gramo del alimento para mascotas; de manera más preferente cerca de 1.0E+06 a aproximadamente 1.0E+08 células del microorganismo probiótico por gramo. El alimento para mascotas puede contener aproximadamente 0.005% a aproximadamente 10 % en peso de la mezcla del microorganismo probiótico. Contiene de manera preferente cerca de 0.02% a aproximadamente 6 % en peso y de manera más preferente cerca de 1 % a aproximadamente 6 % en peso. La cantidad del alimento para mascotas que se va a consumir por la mascota para obtener un efecto benéf-ico dependerá del tamaño de la mascota, el tipo de mascota y la edad de la mascota. Sin embargo, una cantidad del alimento para mascotas para proporcionar una cantidad diaria de aproximadamente 1. OE+03 - 1.0E+14 cfu de al menos una cepa de bacteria de ácido láctico y/o el medio de fermentación equivalente, usualmente serán adecuados. De manera preferente, se administran cerca de 1.0E+09 a l.OE+ll cfu/día para perros y 1.0E+07 a 1.0E+10 cfu/día para gatos. La composición de acuerdo con la invención tiene una alta actividad probiótica y/o se encuentra que es particularmente efectiva para mejorar y/o mantener la función digestiva saludable en mascotas, y mejorar y mantener el tracto gastrointestinal, piel y/o pelaje, y/o sistema inmunitario, salud de las mascotas. Esta composición tiene un impacto benéfico en los efectos del envejecimiento en gatos y perros. La presente invención no se limita en el alcance por las modalidades específicas descritas en la presente. Los ejemplos se presiguen por una breve descripción de las Figuras .

FIGURAS Figura 1: Proliferación de linfocitos de células mononucleares de la sangre periférica, canina (PMBC) en la estimulación con mitógenos o esteres de forbol. Las PMBC de perros alimentados durante 4 semanas con (barras negras) o sin (barras blancas) L. acidofilus NCC2628 se estimularon con diferentes mitógenos a dosis (µg/ml) indicadas en la gráfica. Los mitógenos con PHA (Fitohemaglutina) , ConA (concanavalina A) , PWM (mitógeno de hierba) y éster de forbol son PMA/iono (miristato-acetato de forbol y ionomiicina) . *=P<0.05, prueba t de Student. Figura 2 : Citocinas producidas por leucocitos caninos estimulados con diferentes cepas de probióticos. Los leucocitos de perros adultos normales se estimularon con diferentes cepas de lactobacilos aisladas de mascotas durante 18 horas. Los cultivos de control contuvieron medio solo (control negativo) o un aislado de lactobacilo humano ST11 (control positivo) . La identificación de las citocinas se hizo por TR-PCR. Su cuantificación se realizó al explorar los agarogeles teñidos con bromuro de etidio y determinar el pixel relativo de cada banda usando el programa NIH Image. Los resultados se expresan como las medias de dos experimentos independientes en humedades arbitrarias . (A) IL-12, (B) IL-10, (C) IFN?, (D) TGFß.

EJEMPLOS Ejemplo 1: Cepas y condiciones de cultivo Se examinaron numerosas cepas (de la colección de cultivos Nestlé = NCC) Para su uso probiótico potencial para gatos y perros. En particular, potenciales de crecimiento, resistencia a la liofilización con almacenamiento subsecuente, tolerancia al ácido gástrico y diferentes concentraciones de sales biliares encontradas en el tracto gastrointestinal de gatos y perros, se valoraron para estos 20 lactobacilos y 18 bifidobacterias de heces de gatos y perros presentado en la Tabla 1.

TABLA 1: Códigos y características de bacterias seleccionadas para los ensayos Bif idobacteria .

Los 20 lactobacilos y 18 bifidobacterias se aislaron de gatos y perros mantenidos en diferentes dietas, como se muestra en la Tabla 1. Se determinó la identificación inicial por características morfológicas y fisiológicas. Se usaron los sistemas API-50CH y Rapid-ID32A (BioMérieux) para lactobacilus y bifidobacterias , respectivamente. Se congelaron y se depositaron cepas puras a -80 °C en la colección de cultivos Nestec (NCC) . Todas las bacterias se cultivaron en un medio de caldo para los ensayos . Una muestra de cada cepa reactivada se almacenó a -80°C en 1 ml de crioprotector (40% de glicerol + 60% de LL) . Los cultivos se mantuvieron al subcultivar en una base semanal un inoculo al 1% en 10 ml de medio de cultivo e incubación anaeróbica a 37°C. Se cultivaron los lactobacillos en MRS durante 18 horas. Las bifidobacterias se cultivaron ya sea en MRS + 0.05 % (p/v) clorhidrato de L-cisteína (MRS-C) durante 32 horas o en BHI + 0.05% de clorhidrato de L-cisteina (BHI-C) durante 48 horas iniciando con un inoculo al 5%. Todos los cultivos se almacenaron a +4°C entre las diferentes transferencias. En general se obtuvo la anaerobiosis usando un sistema anaeróbico de hidrógeno-dióxido de carbono (GasPak, Becton Dickinson, USA) .. Las bifidobacterias se mantuvieron siempre en estas jarras durante su periodo de almacenamiento.

Ejemplo 2: Selección de cepas bacterianas Este examen in vi tro se basó en las características de producción para una aplicación industrial de células viables, su capacidad para sobrevivir la inhibición o condiciones gastrointestinales perjudiciales y su diversidad genómica. La diversidad de la cepa o similitud genómica de estas cepas no caracterizadas se tomó en cuenta, usando RAPD y ribotipificación.

MATERIALES Y MÉTODOS - Crecimiento Bacteriano Las cepas que son capaces de producir rápidamente un alto número de células tienen que ser identificadas. Su ciclo de crecimiento bacteriano se puede caracterizar por una fase de retraso corto, un tiempo de regeneración corto, altas cuentas máximas y una fase estacionaria larga. Por lo tanto, se compararon cepas al considerar tres variables: la duración de su fase de retraso, su tiempo de generación (en horas) y sus cuentas máximas, que correspondieron a las características más importantes.

Para lactobacilos: Se inocularon 200 ml de caldo MRS preincubado a 37°C con 1% de su cultivo fresco. Se recolectaron muestras de un ml a cada hora después de la inoculación durante ocho horas. Se tomó una muestra final después de 24 horas. Un ml de cada muestra se diluyó en serie 10 veces en TS para enumeración. Se cultivaron los cultivos en agar MRS (técnica de puesta en placa por derrame), anaeróbicamente , 37°C, durante 48 horas. Todas las placas con los números de colonia entre 30 y 350 se registraron como unidades formadoras de colonia (cfu) por ml de cultivo y por lo tanto se tomaron en consideración para enumeraciones .

Para bifidobacterias en (MRS-C) : En ensayos preliminares, todas las cepas se enumeraron durante 24 horas de crecimiento en MRS-C y caldo TPYG. Los resultados se expresaron en cfu/ml. Las curvas de crecimiento se establecieron al determinar los números celulares cuando se cultivaron en MRS-C después de 0 , 4, 12, 24 32 y 48 horas, de acuerdo al protocolo descrito para lactobacterias . A fin de determinar la influencia del medio de subcultivo y de la optimización de la desgasificación del medio de crecimiento, se realizó este ensayo: - De un subcultivo, en BHI-C almacenado 48 horas a 4°C, e inoculado en MRS-C - De un subcultivo, en BHI-C almacenado 48 horas a 4°C, e noculado en una cavidad MRS- C desgasificada (la remoción de oxígeno se ha optimizado por tratamiento de autoclave del medio dos veces y almacenarlo directamente en jarras anaeróbicas - De un subcultivo fresco, en MRS-C, e inoculado en una cavidad MRS-C desgasificada y almacenado bajo condiciones anaeróbicas antes del experimento.

TABLA 2 Medios de prueba para el crecimiento bacteriano Se obtuvieron medios sólidos por la adición de agar Difco Bacto (15 g.l"1) . Los medios se sometieron a autoclave a 121°C durante 15 minutos. Los medios líquidos para las bifidobacterias ya sea se almacenaron bajo condiciones anaerobícas o se desgasificaron antes de la utilización.

Resistencia a pH gástrico y bilis Cuando se ingirieron, los microorganismos han sobrevivido al estómago y las condiciones del doudeno para ser capaces de ejercer una actividad benéfica en el tracto gastrointestinal de animal. El pH gástrico y las sales biliares son los principales componentes responsables de la regulación de la flora bacteriana. Por lo tanto, tiene que ser valorado el grado de resistencia de las cepas a la acidez y bilis. La figiología del tractodigestivo de gatos y perros difiere de humanos. El pH promedio pH 3.4 y 4.2, respectivamente en perros y gatos. Una bilis reconstituida de mascotas se recomendó para los ensayos (Tabla 4) . La concentración biliar en el intestino delgado varían en un intervalo de 0.5 a 2% cuando se digiere el alimento. De acuerdo a los valores de pH extremos encontrados en gatos y perros, las cuentas viables después de 10 minutos a pH 2.6 y después de dos horas a ya sea pH 3.4 (cepas aisladas de perros) ó pH 4.2 (cepas aisladas de gatos) no deben estar por debajo de 1.0E+06 cfu/ml.

Resistencia a pH gástrico Todos los lactobacilos se inocularon a 1% en caldo MRS y se cultivaron anaeróbicamente a 37°C durante la noche. Las bifidobacterias , inoculadas a 5% en BHI-C, se cultivaron 48 horas a 37°C bajo condiciones anaerógicas . Los cultivos se distribuyeron en tubos de reacción de dos ml (Eppendorf) y se centrifugaron a 3 , 500xg/l0min/20°C . las células se lavaron tres veces con solución Ringer. La resistencia a las condiciones acidas del estómago se valoró in vi tro en tres jugos gástricos simulados con niveles de pH de 2.6, 3.4 y 4.2 ajustados con HCl (Merck). Se usó utensilios de filtro desechables (Nalgene) para todas las esterilizaciones de los filtros. La supervivencia de cada suspensión bacteriana se estudió al adicionar un ml en una serie de cinco ml de jugo gástrico smulado (diferentes pH) complementado con 1.5 ml de una soluicion de NaCl al 0.5%. Las muestras se incubaron a 37°C y los organismos viables se numeraron en: - 0, 1, 5, 10 minutos con el jugo gástrico de pH 2.6 - 0, 1, 30, 60, 120, 180 minutos con el jugo gástrico tiene un pH de ya sea 3.4 (para cepas aisladas de perros) ó 4.2 (para cepas aisladas de gato) . Se diluyeron muestras en amortiguador de fosfato (pH 7.0) , se colocaron en placas sobre agar MRS-C y se enumeraron.

TABLA 3 Jugo gástrico smulado Resistencia a sales biliares La evolución de las cuentas viables de los lactobacilos cultivados durante 18 horas en la presencia de varias concentraciones de la bilis reconstituida de mascota se determinó. Se consideraron dos cuentas viables significativamente diferentes cuando la desviación de su log10 estaba por arriba de 0.25. Cada cepa se caracterizó por dos variables: - La concentración máxima de sal biliar probada donde no se encontró diferencia significativa con el control. - La velocidad de la disminución en la viabilidad cuando se incrementa la concentración biliar en el medio de crecimiento. Las cepas caracterizadas por una pérdida superior a un logio de sus cuentas viables cuando la concentración biliar aumenta en pasos de 1% se consideró sensible a la bilis. Una reducción superior a un log10 entre células cultivadas en la presencia de 0 y 2% de bilis, y un log10 por por ciento adicional de bilis (por arriba de 2%) se consideró aceptable. Adicionalmente, se deben detectar solo cepas que produzcan más de 1.0E+06 cfu/ml cuando se cultivan en la presencia de hasta 2% de sales biliares, a fin de producir un efecto en el tracto gastrointestinal. La bilis reconstituida en mascota a partir de gatos o perros se preparó como se indica en la Tabla 4, y se esterilizó por filtración antes del uso. En un primer ensayo, se cultivaron lactobacilos anaeróbicamente durante 24 horas en calco MRS a 37°C y se transfirieron en el caldo MRS fresco más bilis de mascota, reconstituida, estéril, al 0, 0.1, 0.3, 0.5, 1, 2, 4% durante 18 horas adicionales. Las muestras se diluyeron en serie 10 veces en TS para enumeración. Las diluciones 1.0E-03 y 1.0E-05 se colocaron en placas de agar MRS, usando un WASP «Whitley Automatic Spiral Plater»; Don Whitley Scientific Limited, Inglaterra). Cuando se secaron, las placas se invirtieron e incubaron 48 horas a 37°C en jarras anaeróbicas. Floch y al. (1972) definieron una inhibición como significativa cuando al menos 2 logs en la prueba comparada con el tubo de control cultivado se redujeron. En base a esto, todos los lactobacilos sensibles a las concentraciones biliares en el primer ensayo y los dos lactobacilos resistentes a la bilis al 4% se probaron similarmente en la presencia de bilis al 0, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 4%. La segunda prueba se enfocó a una capacidad de repetición y se estailizó si el número de bacterias viables disminuyó dramáticamente con el incremento de la concentración biliar. Por otra parte, se señala que estas cepas son resistentes a la bilis durante este periodo de 18 horas. Se establecieron curvas de crecimiento en la presencia de sales biliares para determinar si la fase de retraso y la velocidad de crecimiento se afectaron o no. . Los. ensayos se emprendieron con lactobacilos cultivados en caldo MRS complementario con bilis reconstituida de mascota, al 1%, de acuerdo al protocolo descrito para la medición de crecimiento anterior . Las bifidobacterias se subcultivaron y crecieron 32 horas/37 °C/anaeróbicamente , usando caldo MRS-C con bilis reconstituida de mascota al 0 , 1, 2, 3 y 4%. Se aplicó el mismo método de numeración a diluciones 1.0E-03, 1.0E-04 y 1.0E-05 para lactobacilos .

TABLA 4 Bilis reconstituida por mascota Supervivencia a liofilización y almacenamiento subsecuente de las cepas de lactobacilos.

Se evaluó la evolución de la supervivencia. Se consideraron cuentas viables inferiores a 1.0E+05 CFU/ml como que son demasiado bajas. Para cada cepa, se inocularon 200 ml de caldo MRS a 3% con un subcultivo fresco. Los cultivos se hicieron crecer durante 16 horas a 37°C. Se asumieron condiciones no aereadas (recipientes cerrados) que son esencialmente anaeróbicos. Se numeraron las células viables, usando el método de colocación en placa por derrame descrito anteriormente. Los cultivos se recolectaron por centrifugación a 3 , 500xg/+7°C/20 minutos (centrífuga RC3C Sorvall Instrument) y se redispersaron en 10 ml de dos diferentes medios crioprotectores. Cada cepa se redispersó en dos diferentes crioprotectores. Se enumeraron sus peticiones bacterianas concentradas (método de colocación en placa por derrame) y se distribuyeron en frascos (0.5 ml por ampolleta). Las muestras se congelaron a -196°C en nitrógeno líquido y se secaron al vacío durante 18 horas. Después de la liofilización, se introdujo un nitrógeno a través de la válvula de admisión de aire del liofilizador y se sellaron todas las ampolletas. Todos los frascos se almacenaron a +4°C y +20°C durante seis meses. El número de células viables por ampolleta (para cada medio-_ de bacterias y suspensión) se determinó mensualmente .

RESULTADOS En la estructura de la selección de probióticos potenciales para gatos y perros, los resultados de este examen in vi tro para 20 lactobacilos y 18 bifidobacterias, en base a sus potenciales de crecimiento, resistencia a la liofilización con almacenamiento subsecuente, resistencia al pH gástrico y concentraciones biliares encontradas en el tracto gastrointestinal de gatos y perros se presentan en la Tabla 5. Los 20 lactobacilos se clasificaron con respecto a los criterios que se pueden cumplir en el estudio corriente. Cuatro cepas mostraron tener buenos resultados con respecto a sus características de crecimiento, resistencia al pH gástrico, resistencia a bilis y su supervivencia durante el almacenamiento después de la liofilizacion: L. reuteri NCC2581 (CNCM 1-2448) , L. reuteri NCC2592 (CNCM 1-2450) , L . reuteri NCC2603 (CNCM 1-2451) y L. reuteri NCC2613 (CNCM I- 2452) . Se cumplieron las siguientes características: — el tiempo de generación fue menor que una hora cuando crecieron en MRS - la fase de retraso fuer corta (menos de dos horas) - las cuentas bacterianas son altas (más de 1.0E+08 CFU/ml) durante la fase estacionaria del ciclo de crecimiento estable a 8 y 24 horas después de la inoculación - las cepas fueron estables a través de la liofilización y almacenamiento subsecuente de seis meses a 4°C y 20°C. — las cepas fueron resistentes a concentraciones extremas de bilis que probablemente se van a encontrar en el tracto gastrointestinal de gatos y perros (2%) — no hay inhibición significativa en la presencia de hasta 4% de bilis en el medio — las cepas se mostraron que toleran pH 2.6 durante al menos 10 minutos y podrían permanecer a niveles mayores de 1.0E+08 CFU/ml — las cepas que fueron resistentes a un pH gástrico promedio durante al menos dos horas . Por lo tanto, se seleccionaron dos lactobacilos aislados de gatos L . reuteri NCC2581 y L. reuteri NCC2592) y dos aislados de perros ( L . reuteri NCC2603 y L . reuteri NCC2613) para ser estudiados para la potencial actividad probiótica. Las cepas NCC2581, NCC2592, NCC2603 y NCC2613 se identificaron como L . reuteri por identificacioni con API 50CH. Sin embargo, la ribotipificación reveló que NCC25891 y NCC2592 tienen patrones muy cercanos, así como NCC2603 y NCC2613, indicando de esta manera una probable relación cercana. La cepa NCC2581 tiene muy buenas características de su crecimiento y NCC2603 tiene una mejor resistencia a la bilis que la NCC2613. Los resultados con respeto a las ocho bifidobacterias aisladas de las heces de gato permitida una selección en función de sus características de crecimiento, su resistencia al pH gástrico y su sensibilidad a la bilis. La cepa NCC2623 no tiene ninguna de las características deseadas y por lo tanto no se recomendará para estudios adicionales. Por otra parte, la cepa NCC2627 cumplió con todos los criterios: — su tiempo de generación fue menor que una hora cuando creció en MRS-C — la fase de retraso fue tan corta como para los lactobacilos - las cuentas fueron altas y estables durante la fase estacionaria del ciclo de crecimiento — la cepa fue resistente a una concentración extrema de bilis que se va a encontrar probablemente en el tracto gastrointestinal de gatos y perros (2%) — no hay inhibición significativa en la presencia de hasta 4% de bilis en el medio - la cepa mostró tolerar el pH 2.6 durante al menos 10 minutos y puede permanecer a niveles mayores de 1.0 1.0E+06 CFU/ml - las cepas fueron resistentes a un pH gástrico promedio durante al menos dos horas. La cepa NCC2627 fue mucho más resistente que la NCC2623 y NCC2635, mientras que estas tres cepas tuvieron un patrón cercano por ribotipificación, indicando por lo tanto una probable relación cercana (digestión con dos enzimas de restricción: EcoRI y EcoRV) . Las diez bifidobacterias aisladas de perros mostraron solo dos diferentes patrones cuando se caracterizaron por ribotipificación. Por lo tanto, los ensayos de resistencia a bilis se llevaron a cabo solo con cuatro cepas (dos de cada grupo): NCC2657, NCC2660, NCC2671 y NCC2677. Estas cuatro cepas fueron todas resistentes a la concentración máxima de la bilis que se puede encontrar in vi vo (2% de bilis) y las cepas NCC2660 y NCC2657 no tuvieron disminución en las cuentas viables cuando se sometieron a un valor máximo de 4% de 'bilis. Como consecuencia, todas las bifidobacterias aisladas de las heces de perros son más bien resistentes a altas concentraciones de bilis. ° _ considerando las características de crecimiento, estas diez bacterias de este modo se pueden dividir en dos grupos : — cepas resistentes a bilis y con buenas características de crecimiento: NCC2657, NCC2651, NCC2663 y NCC2667 — cepas resistentes a bilis pero con características de crecimiento que necesitan ser optimizadas para producción industrial: NCC2660, NCC2671, NCC2677, NCC2647, NCC2654 y NCC2674.

Los resultados completos de la resistencia a pH gástrico extremo encontrado durante la digestión de gatos y perros debe permitir una mejor determinación de las cepas que se van a seleccionar para estudios adicionales. Solo la cepa de NCC2651 no cumplió los criterios de selección para la resistencia de pH.

TABLA 5 Resumen Con respecto a los resultados corrientes, una cepa bifidobacteriana aislada de gatos y tres bifidobacterias aisladas de perros (respectivamente) , NCC2627, NCC2657, NCC2663 y NCC2667) se pueden seleccionar.

TABLA 6 Medios de dilución Se distribuyeron porciones de 9 ml en tubos y se sometieron autoclave a 121°C durante 15 minutos.

Finalmente, se seleccionaron ocho de las 38 cepas para estudios adicionales (ver Ejemplo 3) : tres lactobacilos aislados de gatos (NCC2581, NCC2592, NCC2583, NCC2583) , tres lactobacilos de perros (NCC2603, NC2613, NCC2628), una bifidobacteria de gatos (NCC2627) y una bifidobacteria de perros (NCC2657) . Estas cepas se caracterizan por tiempos de generación cortos, altas cuentas (más de 1.0E+08 cfu/ml) durante su fase estacionaria y capacidad en altos números a 8 y 24 horas después de la inoculación, estabilizada a liofilización seguido por ya sea condiciones de almacenamiento, resistencia a concentraciones extremas de bilis encontradas en el doudeno (2% de bilis) y su baja inhibición cuando crecen en presencia de hasta 4% de bilis. Adicionalmente, los resultados de los análisis de ADN se tomaron en cuenta para seleccionar las bacterias representativas de la diversidad investigada.

Ejemplo 3: Eficacia de colonización en gatos Se probaron L . reuteri NCC2581, L . reuteri NCC2592, L . rhamnosus NCC2583 y bifidobacterium sp . NCC2627 en ensayos de alimentación para evaluar su capacidad para sobrevivir el paso del tracto gastrointestinal de gatos. Se sometieron 16 gatos machos y hembras tan iguales como sea posible a 3 días de adaptación con un menú Friskies Grand. El protocolo de alimentación consistió en 7 días con "Menú Friskies Grand" y 7 días de prueba con "Menú Friskies Grand" que contiene una de las cepas mencionadas anteriormente: L . reuteri NCC2581 (dieta A) , L. reuteri NCC2592 (dieta B) , L. rhamnosus NCC2583 (dieta C) y Bi fidobacteri um sp . NCC2627 (dieta D) . La asignación de dieta fue la siguiente: Estas cepas se prepararon en una cantidad suficiente y en una forma liofilizada, estable para aplicar estas ocho diferentes bacterias con respecto a la supervivencia de la cepa en el tracto gastrointestinal de los animales probados. Todas las cepas se examinaron con 4 g de trehalosa a fin de adicionar un volumen suficiente de portador para mezclar las cepas preparadas con la matriz de alimento para los animales. Las cepas bacterianas se prepararon en tubos plásticos individuales (1.0E+0.9 cfu/día) y se adicionaron diariamente en una parte del alimento para asegurarse que se comerán las bacterias totales . Se obtuvieron muestras fecales frescas para analizar los números de población bacteriana y se compararon con la línea base (sin bacterias adicionales .

Se re.colectaron heces en el día 7 y 8 (línea base), 14 y 15 21 y 22 (línea base) 28 y 29 Se usa una sonda rectal estéril para obtener una muestra fecal de' la menos 0. lg . Esta muestra se pesa exactamente y se mezcla 0. lg con 10 ml de solución fisiológica (Ringer) que contiene 10% de glicerol. Esta solución luego transfiere en criotubos de 1 ml y se congelan en nitrógeno líquido. Todas las muestras entonces se almacenan a -80°C hasta el análisis. Las poblaciones endógenas de lactobacilos, Bacteroides , Enterobacteriaceae, Enterococus, bifidobacterias y Clostridi um perfringens se contaron. Se detectaron bacterias en medios selectivos o semiselectivos . Se realizaron dluciones en serie cien veces en solución de Ringer que contiene 0.5% de cisteína, de las soluciones en el intervalo de -2 a -8. Cajas de Petri de varios medios selectivos se inocularon e incubaron (ver Tabla a continuación) *: Wadsworth .Anaerobic Bacteriology Manual, V. Suter, D.

Citrón y S. Finegold Third ed. **: Fosfomicina (79.5mg/l) + sulfametoxazol (0.93 mg/l) + trimetoprima (5mg/l) . ***: Agar NN de Lowbury y Lilly, 1995. Resultados: Las cuentas bacterianas se expresan como el logaritmo base 10 y se presentan en la Tabla 7.

TABLA 7 Cuentas de bacterias fecales en gatos (media + desviación estándar, n=8) Durante el tratamiento se observó un incremento de las cuentas fecales de lactobacilos, debido a las ingestiones de las bacterias probióticas citadas. No se observó incrementó drástico en la cuenta de enterobacteriaceae ue reflejan que no hay daño en el ecosistema intestinal relacionado al uso de los probi'óticos relacionados.

Ejemplo 4: Eficacia de colonización en perros Se probaron L . reuteri NCC2603, L . reuteri NCC2613, L . acidophil us NCC2628 y bifidobacteri u8m sp . NCC2657 en pruebas de alimentación para evaluar su capacidad para sobrevivir el paso del tracto gastrointestinal de perros. Se sometieron 10 perros, 5 hembras y 5 machos de 4 a 7 años de edad, a esta prueba específica. El protocolo de alimentación consistió en 5 días de adaptación con "Friskies Vitality" con/sin achicoria y 5 días de prueba con "Friskies Vitality" con/sin achicoria y 3 días de adaptación, 5 días de prueba con "Friskis Vitality" con/sin achicoria + bacteria: L . reuteri NCC2603 (dieta E) , L. reuteri NCC21613 (dieta F) , L . acidophilus NCC2628 (dieta G) y bifidobacteri um sp . NCC2657 (dieta H) . La asignación de dieta fue como sigue : Estas cepas se prepararon en una cantidad suficiente y en una forma liofilizada, estable para aplicar estas ocho diferentes bacterias con respecto a la .supervivencia de la cepa en el tracto gastrointestinal de los animales probados. Todas las cepas se mezclaron con 4g de trihalosa a fin de adicionar un volumen suficiente de portador para mezclar las cepas preparadas con la matriz de alimentación para los animales. Las cepas bacterianas se prepararon en tubos plásticos individuales (5.0E+09 cfu/día) y se adicionaron diariamente en una parte del alimento para asegurarse que se ingieren las bacterias totales . Se obtuvieron muestras fecales frescas para analizar los números de población bacteriana y se compararon con la línea base (sin bacterias adicionadas) . Se recolectaron heces el día 7 y 8 (línea base) , 14 y 15 21 y 22 (línea base) 28 y 29 Se usa una sonda rectal estéril para obtener una muestra fecal de al menos 0.1 g. Esta muestra se pesa exactamente y se mezclan 0. lg con 10 ml de solución fisiológica (ringer) que contiene 10% de glicerol. Esta solución luego se transfiere en tubos de 1 ml y se congelan en nitrógeno líquido. Todas las muestras se almacenan entonces a -80°C hasta el análisis. Las bacterias se cuentan en el mismo medio que se describe en el Ejemplo 3. Resultados: Las cuentas bacterianas, expresadas en logaritmo base 10, se presentan en la Tabla 8.

TABLA 8 Cuentas de bacterias fecales en perros (media + división estándar, n=5) .

Durante el tratamiento no se observó cambio principal en las cuentas fecales de los lactobacilos, debid.o a las ingestiones de las bacterias probióticas seleccionadas excepto en el caso de la cepa L. acidophil us NCC2628. Bajo las condiciones de prueba, el efecto inhibidor en C. perfringens puesto que el nivel basal de C. perfringens fue muy bajo. No se observó incremento drástico en la cuenta de enterobacteriaceae que reflejan que no hay disturbio del ecosistema intestinal relacionado al uso de los probióticos seleccionados.

Ejemplo 5: Efecto de lactobacilos y sus metabolitos en la viabilidad de Giardia intestinalis Se estudia el efecto de los sobrenadantes de filtrados de cultivo de cepas de lactobacilos aisladas de gatos y perros.

Materiales y métodos Cepas y cultivos bacterianos.: Los microorganismos que corresponden al género Lactobacillus fueron de la colección de cultivo Nestlé. Las bacterias se cultivaron en el medio MTYI . Los sobrenadantes que contienen metabolitos de lactobacilos se neutralizaron a pH 6 y se esterilizaron por filtración. Se realizaron controles al acidificar el medio MTYl con ácido láctico al mismo pH que uno de los cultivos bacterianos. Posteriormente, el pH se ajustó a pH 6 con NaOH 0.1 N. El origen de la cepa bajo estudio y el pH de los sobrenadantes y controles se muestran en la Tabla 9.

TABLA 9 Parásitos: La cepa WB de giardia intestinalis (ATCC 30957) se compró a la colección americana de Cultivo de Especies (Rockville, USA). Se cultivaron trofozoitos en elm edio TYI-S-33 modificado de Keister's que contiene por litro: extracto de caseína (Difeto) , 20g; extracto de levadura (BBL) , 10g; dextrosa (Merck), 10g; bilis bovina (Difco), 0.75g; NaCl (Merck), 2g; L-cisteína . HCl (Sigma), 2g; sal sódica de ácido ascórbico (Fluka), 0.2g; K2HP04 (Merck), 0.6g; citrarto de amonio férrico (sigma), 22.8 mg, suero de bovino adulto (Sigma), 100 ml; penicilina/estreptomicina (Gibco, 1000 IU/ml) , 15 mL . Se ajustó el pH a 6.9 con NaOH 5N antes de la esterilización con filtración (tamaño de poro de 0.22 µm) . Se cultivaron parásitos en matraces de cultivo de tejido de poliestireno (LUX, Miles Laboratories, Inc., Naperville IL 60540) rellenos con 40 ml de medio de cultivo. Se realizaron los subcultivos al descargar el sobrenadante sin parásitos unidos, adicionando 5ml del medio de cultivo enfriado con hielo, incubando en un baño de hielo durante 10 minutos para separar los trofozoitos adheridos e inoculando 0.2ml de la suspensión resultante en el medio fresco. Las incubaciones se realizaron a 37°C en la oscuridad. Ensayos de proliferación: Se mezclaron doscientos microlitros de suspensiones de trofozoitos (1.4 x 105 parásitos/ml) se mezclaron con 100 µl de sobrenadantes o controles y 1 µCi de 3H timidina se adicionó. Se incubaron las muestras a 37°C durante 24 horas en placas de cultivo de tejido de 96 cavidades (Nunc Brand Products) . Luego, los parásitos se recolectaron y se evaluó la incorporación de timidina.

Resultados En la Tabla 10 se muestra la incorporación de timidina. La cepa NCC2628 aislada de un perro produjho una fuente inhibición de la proliferación de la cepa WB (91%) . Otras cepas estudiadas no inhibieron el crecimiento de los trofozoitos .

TABLA 10 Efecto de los sobrenadantes del filtrado de cultivo en la proliferación de la cepa Giardia Intestinalis En este experimento, se puede demostrar que los metabolitos funcionales producidos durante el crecimiento de L. acidophi l us NCC 2628 tienen une efecto inhibitorio muy fuerte en el crecimiento de Giardia intestinalis.

Ejemplos 6 a 8: Efectos inhibitorios de las cepas lactobacillus de acuerdo a la invención en bacterias patogénicas intestinales Para identificar las cepas con propiedades antagonísticas fuertes contra patógenos del intestino delgado, se realizaron experimentos de co-cultivo en un sistema modelo que simula las condiciones del intestino delgado canino (pH, composición biliar y concentración, morfina, pancreatina) . El jugo del intestino delgado, canino, simulado contuvo bilis canina reconstituida (0.345 g/1 tauroquenodesoxicolato, Sigma, Alemania; 0.7 g/1 de taurodesoxicolato, Sigma, Alemania, 3.04 g/1 de taurocolato, Sigma, Alemania; 0.006 g/1 de colato, Fluka, Suiza), morfina poricna (1.9 g/1 Sigma, Alemania), panecreatina porcina (2.42 g/1 Sigma, Alemania) y solución de electrolitos (5 g/1 de NaCl, 0.6 g/1 de KCl, 0.25 g/1 de CaCl2, todo de Merck, Alemania) . El pH del jugo se ajustó a pH 6.5 ± 0.5 con NaOH 0.1 N.

Cepas y condiciones de cultivo Patógenos del intestino delgado Se seleccionaron cuatro cepas potencialmente patógenas: S . Typhimuri um SL1344, E. Coli ETEC 08:H9 y e. COLI 0149 :K88 (aislado patógeno canino) y un aislado clínico de Sh . Dysen teriae (origen humano, amablemente proporcionado por el Centre Hospitaller Universitaire, Vaudoise-CUV Lausanne, Suiza) . Con la excepción de S . Typhimuri um SL 1344 propagado en caldo Luria Bertani (Difco, USA) , todo el enterobacteriaceae se cultivaron en caldo de infusión de cerebro-corazón (Difco, USA) a 37°C bajo agitación (240 rpm).

Bacteria de ácido láctico Se seleccionaron un amplio intervalo de lactobacilos de origen canino y felino que incluyen: L . Acidophilus NCC2628 (CNCM 1-2453), L. rahmnosus NCC2583 (CNCM 1-2449) , L. reuteri NCC2581 (CNCM I-2448), L. reuteri NCC2592 (CNCM 1-2450) de la colección de' cultivos Nestlé (NCC, Nestec, Suiza) y se examinaron en el modelo de intestino delgado canino para la supervivencia, actividad fisiológica y afectos inhibitorios en los patógenos del intestino delgado, mencionados con anterioridad. Los lactobacilos se cultivaron anaeróbicamente (anaerocult Oxoid, Inglaterra) en el caldo Man Rogosa Sharp (Difco, USA) a 37°C.

Determinación de cuentas de células viables Se diluyeron muestras en amortiguador de fosfato estéril (NaH P04, pH 7, 0.2M) y se colocaron en placa superficial de diluciones de 10 veces en placas de agar: agar MRS (Difco, USA) para lactobacillus, agar Salmonella-Shigella (Oxoid, Inglaterra) para S . Typhimuri um y Sh . Dysenteriae , y agar Sorbitol-Mac-Conkey (Oxoid, Inglaterra) para E. Coli . Se incubaron placas de agar 48 horas a 37°C de manera anaeróbica para lactobacilos, y 24 horas a 37°C para epterojbacteriaceae . Para pruebas de co-cultivo, se inhibió el crecimiento de kenterobacteriacea en agar MRS por la adición de polimixina (Oxoid, Inglaterra) .

Experimentos de co-cultivos entre bacterias de ácido láctico (LAB) y patógenos Se realizaron experimentos de co-cultivo con « LAB probióticas, potenciales y cepas patógenas a 37°C en 20 ml (tubos Falcon) de jugo simulado del intestino delgado, canino con diferentes fuentes de carbón (azúcar, alimento para mascota) para favorecer la actividad metabólica de los cultivos. Las LAB se inocularon a 10E+08 cfu/ml, patógenos a 10E+02 cfu/ml, 10E+04 cfu/ml y 10E+06 cfu/ml. Las muestras se tomaron en diferentes puntos de tiempo hasta 8 horas y se determinaron las cuentas de células viables por placa superficial de diluciones de 10 veces en medios respectivos . Las pruebas de co-cultivo se realizaron bajo diferentes condiciones incluyendo enriquecimiento del jugo simulado de intestino delgado, canino con dextrosa (5g/l) y diferentes concentraciones de alimento para mascotas, seco, extruido, comercialmente viable (5, 25, ó 5 g/1; Frisktes ALPO Complete, USA) . Este último se homogeneizó (Mezclador Stomacher Lab Blender) y se dispersó en solución de electrolitos. Todos los experimentos se realizaron en duplicado.

Ejemplo 6 Los experimentos de co-cultivo entre cuatro lactobacilos y las cuatro cepas potencialmente patógenas, E . Col i ETC 08:H9, E . Coli 0149 :K88, S . Typhimuri um SL1344 y Sh dysenteriae se realizaron en jugo simulado de duodeno canino enriquecido con 5 g/1 de de.xtrosa (Difco) . Los lactobacilos se inocularon a 10E+08 cfu/ml y las cepas indicadoras gram-negativas a 10E+02 cfu/ml. Los resultados se compilan en la Tabla 11.

TABLA 11 Co-cultivo entre LAB y bacterias potencialmente patógenas en jugo simulado de intestino delgado canino enriquecido con dextrosa + Inhibición de crecimiento ++ Inhibición de crecimiento e inactivación parcial +++ Inhibición de crecimiento e inactivación completa Los cuatro lactobacilos investigados demostraron actividad microbiana pero solo L. acidophilus NCC2628 (CNCM 1-2453) y L . rhamnosus NCC2583 (CNCM 1-2449) demostraron alta actividad contra todos los patógenos probados. Ambas cepas no solo fueron capaces de inhibir el crecimiento, sino también fueron capaces de inactivar completamente los patógenos contenidos en el sistema de prueba (no células viables restantes) .

Ejemplo 7 Se realizaron experimentos de co-cultivo entre lactobacilos [(L. acidophilus NCC2628 (CNCM I-2453), L . rhamnosus NCC2583 (CNCM 1-2449) y S . Typhimarium SL 1344 en jugo simulado de doudeno canino enriquecido con alimento seco para mascotas, extruido, comercialmente disponible (5, 25 ó 100 g/1; Friskies ALPO Complete, USA) . Se inocularon lactobacilos a 10E+08 cfu/ml y las cepas indicadoras Gram-negativas a 10E+02 cfu/ml. Los resultados se compilan en la Tabla 12.

TABLA 12 Co-cultivo entre LAB y bacterias potencialmente patógenas en jugo simulado del intestino delgado canino enriquecido con alimento seco para mascotas + Inhibición de crecimiento ++ Inhibición de crecimiento e inactivación parcial +++ Inhibición de crecimiento e inactivación completa Los resultados de muestran que el alto potencial de especialmente de L . acidophilus NCC2628 (CNCM 1-2453) y S . Typhimuri um SL1344 para inhibir el crecimiento y aún para inactivar completamente los patógenos del intestino delgado bajo varias condiciones prácticas tal como en una mezcla de jugo simulado de intestino delgado y alimento para mascotas. La actividad antimicrobiana de L. acidophi l us NCC2628 fue muy alta aún a bajos niveles de enriquecimiento con alimento comercial para mascotas que sirve como una fuente de azúcares fermentables para el organismo. En contraste a esta observación hecha para L. acidophi l us NCC2628, la efectividad de L. rhamnosus NCC2583 (CNCM 1-2449) fue dependiente del nivel de enriquecimiento en alimento para mascotas de la manera en que una actividad antimicrobiana creciente se observó con cantidades crecientes de alimento para mascotas adicionado al sistema de prueba Ejemplo 8 Se realizaron experimentos de co-cultivo con L . acidophil us NCC2628 (CNCM 1-2453) y diferentes niveles de inoculacon de S . Typhimuri um SL1344 en jugo simulado de doudeno canino enriquecido con dextrosa (5 g/1, Difco). Se inoculó L . acidophil us NCC2628 (CNCM 1-2453) a 10E+08 cfu/ml, S . Typhimurium SL 1344 se inoculó a 10E+02 cfu/ml, 10E+04 cfu/ml y 10E+06 cfu/ml. Los resultados se compilan en la Tabla 13.

TABLA 13 Co-cultivo de L. acidophilus NCC2628 (CNCM 1-2453) y diferentes niveles de inoculación de S. Typhimurium SL 1344 + Inhibición de crecimiento ++ Inhibición de crecimiento e inactivación parcial +++ Inhibición de crecimiento e inactivación completa La actividad antimicrobiana de L . acidophilus NCC2628 (CNCM 1-2453) fue suficientemente alta para inactivar completamente aún concentraciones iniciales altas de S . Typhimuri um SL1344.

Ejemplo 9: Estimulación inmunitaira in vivo en perros El potencial de estimulación inmunitaria para cepas aisladas de mascotas de los probióticos se probó en una prueba clínica usando la cepa L. acidophilus NCC 2628.

Métodos : Proliferación de células mononucleares de la sangre periférica canina (PBMC) en la estimulación con diferentes mitógenos 20 perros de 4 a 7 años de edad se sometieron a esta prueba. El protocolo de alimentación consistió en una semana de adaptación con "Frisakies Vitality" con/sin achicoria y 4 semanas de prueba con "Frielkies Vitality" con/sin achicoria + bacterias de L. acidofilus de NCC2628. Se preparó L . acidophil us NCC2628 en una cantidad suficiente y en una forma liofilizada, estable con respecto a la supervivencia de la cepa en el tracto gastrointestinal de los animales probados. Las bacterias se mezclaron con 4g de trehalosa a fin de adicionar un volumen suficiente de portador para mezclar las bacterias preparadas con una matriz de alimento para los animales . Se prepararon bacterias en tubos de plástico individuales (5.0E+09 cfu/día) y se adicionaron diariamente en una parte del alimento para asegurarse que las bacterias totales se comerán. Se recolectó sangre de los perros después de cuatro semanas de administración de los probióticos . La sangre se fraccionó a través de una vacuna VaccutainerMR (Becton Dickinson, Mountain View, CA) , se recuperaron las PBMC de acuerdo a las recomendaciones del fabricante. Se estimularon células con diferentes mítógenos o esteres de formol que inducen una fuerte proliferacon de células T (concavalina A (conA), fitohemaglutinina (PHA) ) , de células B (mitógeno de hierba (PWM)), y de todas las células (forbol-miristato-acetato/ionomicina (PMA/Iono) ) . Se incubaron 105 células por cavidad con mitógenos o los esteres de forbol (las dosis respectivas se indican en la Figura 1) en un volumen final de 200 µl de medio de cultivo RPMI-1640 complementado con suero de becerro vegetal al 10% y antibióticos en placas de cultivo de fondo plano de 96 cavidades (Nunc) . Se administraron células en atmósfera de C02 al 5% humidificada a 37°C durante 48 horas. Las células se marcaron por impulsos con 1 µCi de [3H] timidina (Amerscham Pharmacia Biotech, Suiza) durante 18 horas adicionales. Las células luego se recolectaron en filtros de nitrocelulosa (Parckard, TopCount; suiza) y la [3H] unida se midió con conteo con escintilación (TopCount; Packard, Suiza). Se calculó la proliferación celular como la media (cuentas por minuto (c.p.m.) (±SD) de los triplicados.

Resultados : Figura 1: Hubo un incremento claro en la proliferación celular en respuesta a todos los mitógenos en el grupo de los perros alimentados con L . acidophilus NCC2628 en comparación con el grupo de control. Este incremento fue significativo en cultivos estimulados con los esteres de forbol PMA + ionomicina. Estos datos muestran que las células linfoides de los perros alimentados con probióticos son más reactivas en la activación in vi tro y sugierne que el sistema inmunitario de los perros alimentados con probióticos se ha estimulado.

Ejemplo 10: Modulación in vi tro de funciones inmunitarias por cepas de lactobacilus aisladas de mascotas . Un examen in vi tro de las diferentes cepas de lactobacilus aisladas de mascotas, descritas anteriormente, se ajustó para determinar su potencial de modulación inmunitaria. Para este fin, se midió su capacidad para inducir las citocinas pro-inflamatorias (IL-12, IFN?) y/o citocinas anti-inflamatorias (IL-10, TGF-ß) (Anand A.C., Adya C.M. 1999, Trop . Gastroenterol . ; 20 (3 ) : 97 -106 ; Spelberg B., Edwards J.E. Jr. 2001, Clin . Infect . Dis . ; 32 ( 1) : 76- 102 ) . Esto tiende en .las cepas candidatas potenciales de selección para funciones inmunitarias anti-patogénicas o anticáncer, fuertes así como funciones antagonísticas contra patologías intestinales caninas tal como alergia e inflamación (enfermedades inflamatorias en el intestino) . Se establecieron cultivos adicionales con el medio solo (control negativo) , con la cepa SF68 de Enterococcus faecium (NCIMB 10415, Cerbios- Pharma, Suiza) y con un aislado de lactobacilo humano STll (NCC 2461, CNCM 1-2116) (control positivo) .

Método: Perfiles de citocina inducidos por diferentes cepas probióticas en leucocitos caninos: La sangre de perros adultos normales se trató minutos a temperatura ambiente con amortiguador de lisis ACK (150 mM de NH4C1, 1 mM de KHC03 y 0.1 mM de Na2EDTA en H20, pH = 7.4) . Los leucocitos se lavaron dos veces con el medio RPMl (sin antibióticos) y se sembraron a 2.10s células/ml en placas de cultivo de tejido de 24 cavidades. Se adicionó 1 ml de una suspensión bacteriana (descrita posteriormente) que contiene 106 CFU a cada cavidad. . Para el tratamiento de control, se adicionó al medio solo a los leucoticos. Las muestras se incubaron. 18 horas a 37°C y C02 al 5%. Subsecuentemente, se recolectaron los leucocitos, se lavaron en PBS y se centrifugaron. El sedimento celular se liso con 500 µl del reactivo Trizol (Gibco BRL) . Se extrajo el ARN de los lisado celulares usando el equipo de ARN Nucleospin (Macherey-Nagel) . La RT-PCR para amplificaciones de citocina canina se realizaron usando el equipo AB gene (Merck) . Las referencias de cebadores (todos producidos por Microsynth) se indican posteriormente. El análisis densitométrico de las bandas de PCR reveladas en los geles de agarosa teñidos con bromuro de etidio se realizó usando el programa NIH Image. Todas las bandas se normalizaron con la banda del producto de PCR de ß-actina, respectiva obtenida con cada muestra (control interno) , y los resultados expresan comunidades arbitrarias que reflejan las densidades de pixeles de cada banda de producto de PCR de citocina (Figura 2) . — Preparación de las bacterias: las diferentes cepas de los lactobacilos se cultivaron en el medio MRS durante aproximadamente 8 horas hasta que alcanzaron una densidad idéntica. Las bacterias se diluyeron en el medio RPMl sin antibióticos a concentraciones finales de 10e CFU/ml. Los cebadores usados para citocina- RT-PCR: Resultados : Figura 2 : Los datos muestran que los perfiles de citocina inducidos por lactobacilos son dependientes de la cepa. Por ejemplo, la cepa NCC2628 indujo altos niveles de IL-10 y TGF-ß, resaltando el potencial para esta cepa particular para la modulación inmunitaria de los trastornos inflamatorios tal como alergia y enfermedades inflamatorias del intestino. En contraste, la cepa NCC2583 indujo fuertes niveles de IFN? e IL-12; que hace esta cepa un buen candidato para la actividad anti-patógena y anti-cáncer.

Ejemplo 11: Se usaron tres alimentos secos para mascotas en el estudio. Estos se referirán como "A", "B" y "C" . El alimento "A" para mascotas es un alimento para mascotas seco, nutricionalmente completo, disponible bajo la marca comercial ALPO (ALPO es una marca comercial registrada de SOCIETE DES PRODUTTS NESTRLE S.A. de Suiza) El alimento B para mascota es el mismo alimento seco para mascotas, nutricionalmente completo como el alimento A para mascotas, pero está complementado con una mezcla en polvo de los microorganismos probióticos seleccionados, alimentados de un sobrecito. La mezcla comprende cantidades substancialmente iguales de kL. Acidophilus NCC2628 y Bifidobacterium sp . NCC2657. Se rocía sobre el alimento en cada comida que se sirve, la dosis suministrada que es de aproximadamente 1.0E8 cfu/día. El alimento C para mascotas es una alimento seco para mascotas, nutricionalmente completo que es substancialmente idéntico al alimento A para mascotas, pero que contiene 1.2 % en peso de un sobrenadante seco de un cultivo de Enterococcus faecium SF68 (NCIMB 10415) Se usan 30 perros en el estudio. Los perros se pre-alimentan durante 8 semanas usando alimento A para mascotas. Los perros luego se dividen en 3 grupos de 10 perros cada uno, designados grupos A, B y C y se alimentan con las dietas correspondientemente nombradas durante 8 semanas . Los perros tienen acceso libre a agua y se alimentan una vez al día. La prevalencia de caspa en el pelaje se determina por un panel de valoración de 30 miembros al comienzo y luego de 7 semanas. Los perros se peinan antes de la evaluación por el panel y los miembros del panel no comparan las notas durante la evaluación. En esta evaluación, los perros se presentan a cada uno de los panelistas individuales en 2^ diferentes parejas. Se preguna a los panelistas que indiquen en sus hojas de registro qué perro del par presentado exhibe (1) menos capas (2) mayor brillo de pelaje y (3) menor olor de pelaje. La condición completa de pelaje de todos los perros es visualización y táctilmente buena como se puede esperar de perros saludables, normales. Sin embargo, los perros que se' alimentan con la dieta C se encuentra que tienen notablemente menos caspa que aquellos alimentados con la dieta A de control. Estos alimentados en la dieta D tienen un pelaje notablemente más brilloso y exhiben notablemente menos olor de pelaje que los de A. Estas características se encuentra que no difieren significativamente de forma estadística cuando se comparan con los perros en el grupo B- .

Ejemplo 12: Se elabora una mezcla de alimentación de aproximadamente 58 % en peso de maíz, aproximadamente 6 % en peso de gluten de maíz, aproximadamente 23% en peso de carne y harina, sales, vitaminas y minerales que constituyen el resto. La mezcla de alimentación se alimenta en un pre-acondicionador y se humecta. Esta mezcla se adiciona a un polvo que contiene una mezcla de las siguientes cepas de lactobacilos: Lactobacillus rhamnosus NCC26583 (CNCM 1-2449) , Lactobacill us acidophilus NCC2628 (CNCM 1-2453) y Enterococcus faecium SF68 (NCIMB 10415) . El polvo se dispersa de una manera substancialmente a todo lo largo de la mezcla. Esta mezcla de alimentación humectada luego se alimenta en el extrusor-hornillo y se gelatiniza. La matriz gelatinizada que deja el extrusor se fuerza a través de una boquilla y se extruye. El producto extruido se corta en piezas adecuadas para alimentar los -perros, se seca aproximadamente 110°C durante aproximadamente 20 minutos, y se enfría para formar granulos. Las piezas extruidas se verifican para la actividad de bacterias de las cepas adicionadas. No se detecta nada.

Ejemplo 13 Se usan en el estudio 24 perros. Se incluyen perros jóvenes y viejos, estos últimos que son de 8 a 12 años de edad. Los perros viejos seleccionados, exhiben signos externos de inflamación de articulaciones en proporción con sus edades y parecen experimentar alguna dificultad en el movimiento a veces . Ciertos movimientos parecen ser doloros . Estos síntomas frecuentemente se observan en perros viejos y se cree que están relacionados a la condición artrítica. Se usan tres alimentos secos para mascotas en el estudio. Designados A, B y C. El alimento A es un alimento seco para mascotas nutricionalmente completo (ALPO de Beffy Dinner) . Esto es el alimento de control . Los 24 miembros de los seleccionados se pre-alimentan durante 8 semanas usando alimento A para mascotas. Los perros luego se dividen en 3 grupos, A, B y C cada uno que tiene 8 perros y la misma proporción de jóvenes y viejos dentro del mismo. Cada grupo luego se alimenta con las siguientes dietas respectivas durante 8 semanas .

El alimento B para mascotas es un alimento seco para mascotas nutricionalmente completo que substancialmente es idéntico al alimento "A" para mascotas pero que contiene un revestimiento que constituye el 2% de su peso, el revestimiento comprende los microorganismos de Enterococcus faecium SF68 (NCIMB 10415) . La cantidad de alimento alimentado diariamente a cada perro se calcula de acuerdo a la masa individual corporal, de modo que la dosis de 1.0E+09 cfu/día. La dieta C comprende productos molidos, extruidos producidos en el Ejemplo 12 anterior. La cantidad de alimento alimentado diariamente a cada perro se calcula de acuerdo a la masa corporal individual, de modo que la dosis de microorganismos es de 1.0E+11 cfu/día.

Los perros tienen acceso libre al agua y se alimentan una vez al día. Se une un medidor de actividad al collar de cada perro y las mediciones se toman diariamente. Los perros también se evalúan visualmente para la actividad por personal de la perrera. La condición de todos los perros es visual y táctilmente buena como se puede esperar de perros saludables, normales. Sin embargo, los perros en los grupos que reciben las dietas B y C de alimento para mascotas son notablemente más activas que sus contrapartes en la dieta A. en las lecturas del medidor soportan esas observaciones. Adicionalmente, los perros más viejos en los grupos B y C, después de que se alimentan de las dietas B y C durante el periodo de prueba, parecen exhibir pocos signos externos de inflamación de articulaciones locales. Adicionalmente, los perros parecen experimentar menos niveles de dolor en el movimiento físico y se mueven más libremente que antes. Se puede concluir que las dietas B y C parecen proporcionar alivio con respecto a ciertas señales de envejecimiento y mejorar la motilidad de las mascotas más antiguas.

Ejemplo 14: Alimento seco para gatos Se elabora una mezcla de alimento de aproximadamente 58 % en peso de maíz, aproximadamente 6 % en peso de gluten de maíz, aproximadamente 23 % en peso de harina de pollo, sales, vitaminas y minerales que substituyen el resto. La mezcla de alimentación se alimenta en el pre-acondicionador y se humecta. La alimentación humectada luego se alimenta en un extrusor-hornillo y se gelatiniza. La matriz gelatinizada que deja el extrusor se fuerza a través de una boquilla y se extruye. El producto extruido se corta en piezas adecuadas para alimentar a los gatos, se seca a aproximadamente 110 °C durante aproximadamente 20 minutos, y se enfría para formar granulos: en este punto, se proporciona un polvo liofilizado de una o más cepas de los siguientes especies de lactobacilos, para la aplicación a los granulos: Lactobacillus rhamnosus NCC2583 (CNCM 1-2449) , Lactobacill us acidophi l us NCC2628 (CNCM 1-2453) o Enterococcus SF86 (NCLBM. 10415) . De esta manera, se proporciona suficiente polvo de modo que la cantidad de consumo dietético correspondiente para el gato es de aproximadamente 1. OE+07-1. OE+9 cfu/día. Algo del polvo se mezcla en una primera masa de granulos y se embolsa. Una segunda cantidad del polvo se mide y se mezcla con un portador lípido que luego se rocía en una segunda masa de gr nulos. Los granulos se embolsan después de que el revestimiento se ha secado de manera suficiente a 50-60°C durante aglunos minutos.

Ejemplo 15: Alimento en bote para mascotas y complemento Se prepara una mezcla de 73% de carga de ave de corral, pulmones de cerde e hígado de res ( molido) , 16% de harina de trigo, 2% de tintes, vitaminas y sales inorgánicas. Esta mezcla se emulsiona a 12°C y se extruye en la forma de un budín que luego se cuece a una temperatura de 90°C. Se enfría a 30°C y se corta en trozos. Se mezcla n 45% de estos trozos con 55% de una salsa preparada de 98% de agua, 1% de tinte y 1% de goma de guar. Se rellenan de botes de hojalata y se utilizan a 125°C durante 40 minutos. Como un complemento probiótico que se va a mezclar con el alimento para mascotas antes de servir, el empaque adicional en la forma de sobrecitos con cepas de las siguientes especies de lactobacilos se proporcionan Lactobacillus rhamnosus NCC2583 (CNCM 1-2449) , Lactobacill us acidophil us NCC2628 (CNCM 1-2453) o Enterococcus faeci um SF68 (NCIMB 10415) . La cantidad correspondiente para la mascota es de aproximadamente 106-1012 cfu/día, dependiendo de si es un gato o un perro y de factores físicos tal como la masa muscular. Esto se suministra como un complemento unido de una forma removible al bote, conjuntamente con instrucciones de alimentación.

Claims

REIVINDICACIONES 1. Nuevas cepas aisladas de bacterias de ácido láctico que tienen alta actividad probiótica en mascotas, seleccionadas por su capacidad para sobrevivir y colonizar el tracto gastrointestinal de mascotas . 2. Cepa aislada según la reivindicación 1, que tiene la capacidad de crecer produciendo al menos 1.0E+06 cfu/ml en la presencia de hasta
2.0% de sales biliares. 3. Cepa aislada según la reivindicación 1 ó 2, que tiene la capacidad de producir al menos 1.0E+06 cfu/ml después de aproximadamente 2 horas a un intervalo de pH de aproximadamente
3.4 a aproximadamente 4.2
4. Cepa aislada según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que tiene se selecciona de los géneros Lactobacillus, Bi fidobacterium o Enterococcus .
5. Cepa aislada según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que se selecciona del grupo que consiste de Lactobacillus reuteri , Lactobacill us acidophilus , Lactobacill us animalis , Lactobacillus rumínis , Lac.tobacillus johnsonii , Lactobacillus casei , Lactobacillus paracasei , Lactobacillus rhamnosus , Lactobacillus fermentum, Bifidobacterium sp . , Enterococcus faeci um y Enterococcus sp .
6 . Cepa aislada según la reivindicación 5, que es Lactobaci l lus reuteri NCC2581 (CNCM 1-2448) LactoJacillus reuteri NCC2592 (CNCM 1-2450) , Lactobacill us rhamnosus NCC2583 (CNCM 1-2449) , Lactobacillus reuteri NCC2613 (CNCM 1-2451) , Lactobacillus reuteria NCC2613 (CNCM 1-2452) , Lactobacillus acidophil us NCC2628 (CNCM 1-2453) .
7. Uso de una cepa aislada de bacterias de ácido láctico y/o su sobrenadante de cultivo y/o un metabolito de la misma, que tiene alta actividad probiótica en mascotas, para la preparación de una composición propuesta para el mantenimiento o mejora de la salud de las mascotas .
8. El uso según la reivindicación 7, en donde la cepa tiene capacidad para crecer produciendo al menos 1.0E+06 cfu/ml en la presencia de hasta 2.0% de sales biliares o para producir al menos 1.0E+06 cfu/ml después de aproximadamente 2 horas a un intervalo de pH de 3.4 a aproximadamente 4.2
9. El uso según la reivindicación 7 u 8, en donde la bacteria de ácido láctico se selecciona del genero Lactobacillus, Bi fidobacterium o Enterococcus .
10. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en el cual la cepa se / / selecciona del grupo que consiste de Lactobaci ll us reuteri , Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus animalis , Lactobacillus ruminis , Lactobaci llus johnsonii , Lactobacill us casei , Lactobacillus paracasei , Lactobacillus rhamnosus , Lactobacill us fermentum, Bifidobacterium sp . , Enterococcus faecium y Enterococcus sp .
11. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, en el cual la cepa es L Laaccttoobbaacciilllluuss reuteri NCC2581 (CNCM 1-2448) Lactobacillus reuteri NCC2592 (CNCM 1-2450) , Lactobacillus rhamnosus NCC2583 (CNCM 1-2449) , Lactobacillus reuteri NCC2603 (CNCM 1-2451) , Lactobacillus reuteria NCC2613 (CNCM 1-2452) , Lactobacillus acidophil us NCC2628 (CNCM 1-2453) , Enterococcus faeci um SF 68 (NCIMB 10415) .
12. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11, en donde la cepa seca está contendida en la composición en una cantidad cde aproximadamente 1.0E+04 cfu/animal y día a aproximadamente 1.0E+12 cfu/animal y día.
13. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12, para la preparación de una composición propuesta para el tratamiento y/o profilaxis de trastornos asociados con la colonización del ._ tracto gastrointestinal de mascotas por microorganismos patógenos.
14. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12, para la preparación de una composición propuesta para regular el sistema inmunitario de mascotas .
15. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12, para la preparación de una composición propuesta para mantener o mejorar la salud de la piel y/o sistema de pelaje de mascotas.
16. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12, para la preparación de una composición propuesta para la mejora o reducción de los efectos de envejecimiento en mascotas.
17. Composición de alimento para mascotas que contiene al menos una cepa aislada de bacterias de ácido láctico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y/o un sobrenadante de su cultivo y/o un metabolito de la misma, asociado con un soporte ingerible o una matriz farmacéutica.
18. Composición de alimento para mascotas propuesto para la salud del tracto gastrointestinal de mascotas, que contiene al menos una cepa aislada de bacterias de ácido láctico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y/o un sobrenadante de su cultivo y/o un metabolito de la misma, asociado con un soporte ingerible a una matriz farmacéutica.
19. Composición de alimento para mascotas propuesta para la salud de la piel y/o pelaje de mascotas, que contiene al menos una cepa aislada de bacterias de ácido láctico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y/o un sobrenadante de su cultivo y/o un metabolito de la misma, asociado con un soporte ingerible a una matriz farmacéutica.
20. Composición de alimento para mascotas propuesta para regular el sistema inmunitario de mascotas que contiene al menos una cepa aislada de bacterias de ácido láctico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y/o un sobrenadante de su cultivo y/o un metabolito de la misma, asociado con un soporte ingerible a una matriz farmacéutica.
21. Composición de alimento para mascotas propuesta para mejorar o reducir los efectos de envejecimiento en mascotas, que contiene al menos una cepa aislada de bacterias de ácido láctico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y/o un sobrenadante de su cultivo y/o un metabolito de la misma, asociado con un soporte ingerible a una matriz farmacéutica .
22. Una composición según una de las reivindicaciones 17 a 21, en donde la cepa aislada está en una cantidad de aproximadamente 1.0E+04 cfu/animal y se dice que es de aproximadamente 1.0E+12 cfu/animal y día.
23. Una composición según una de las reivindicaciones 17 a 22, que contiene adicionalmente un probiótico.
24. Una composición según una de las reivindicaciones 17 a 23, que está en la forma de i) un alimento para mascotas nutricionalmente completo en una forma en polvo, seca o húmeda, molida o estable en anaquel; ii) en la forma de un adjunto dietético o un complemento .
25. Un* adjunto dietético o un complemento según la reivindicación 24, que se proporciona junto con un alimento para mascotas en un empaque adicional tal como un sobrecito.
26. Un método para mantener o mejorar la salud del tracto gastrointestinal de una mascota, que comprende alimentar una mascota con una composición de alimento para mascotas que contiene al menos una cepa aislada según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y/o un sobrenadante de su cultivo y/o un metabolito de la misma.
27. Un método para mantener o mejorar la salud de la piel y/o el sistema de pelaje de una mascota, que comprende alimentar una mascota con una composición de alimento para mascotas que contiene al menos una cepa aislada según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y/o un sobrenadante de su cultivo y/o un metabolito de la misma.
28. Un método para modular el sistema inmunitario de una mascota, que comprende alimentar una mascota con una composición de alimento para mascotas que contiene al menos una cepa aislada según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y/o un sobrenadante de su cultivo y/o un metabolito de la misma.
29. Un método para mejorar o reducir los efectos del envejecimiento de una mascota que comprende alimentar una mascota con una composición de alimento para mascotas que contiene al menos una cepa aislada según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y/o un sobrenadante de su cultivo y/o un metabolito de la misma.
30. Un método para el tratamiento y/o profilaxis de trastornos asociados con la colonización del tracto gastrointestinal de mascotas por microorganismos patógenos, que comprende el paso de alimentar una mascota con una composición de alimento para mascotas que contiene al menos una cepa aislada según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y/o un sobrenadante de su cultivo y/o un metabolito de la misma .
31. Un método según la reivindicación 30, en donde los microorganismos patógenos son cepas Salmonella typhimurium, Escherichia coli , Shigella, dysenteriaea u otras Enterobacteriaceae patógenas que colonizan mascotas o parásitos tal como helmintos (Toxocara spp.), protozoarios ( Cryptosporidium spp, Giardia spp, Pentatrichomonas hominis , Entamoeba histolytica, Toxoplasma gondií , . . . ) o levaduras.