FI122247B - Probioottinen valmiste koiran maha- ja suolistokanavassa ilmenevien häiriöiden ennaltaehkäisemiseksi tai hoitamiseksi - Google Patents

Description

Probioottinen valmiste koiran maha-suolistokanavassa ilmenevien häiriöiden ennaltaehkäisemiseksi tai hoitamiseksi 5 Keksinnön ala

Esillä oleva keksintö koskee probioottista valmistetta koiran maha-suolistokanavassa ilmenevien häiriöiden ennaltaehkäisemiseksi tai hoitamiseksi. Keksintö koskee lisäksi menetelmää probioottisen valmisteen valmistamiseksi, tätä 10 probioottista valmistetta sisältävää koiranruokaa sekä probioottisen valmisteen käyttöä farmaseuttisten tuotteiden tai koiranruokatuotteiden valmistamiseksi.

Keksinnön tausta 15 Jatkuva tai keskeytyvä ripuli on hyvin yleinen koirilla. Kun oireet ovat lievät, omistaja voi yrittää helpottaa ripulia pidättymällä syöttämisestä, muuttamalla ruokavaliota, syöttämällä fermentoituja meijerituotteita ja lääketuotteita, joita on saatavilla ilman reseptiä. Mikäli koiran tila heikkenee, eläin viedään eläinlääkäriin tarkastamista ja laboratoriotutkimuksia varten. Ripuli saattaa olla peräisin ohut-20 suolesta, paksusuolesta tai kumpikin suoli voi olla osallisena. Diagnoosi tehdään oireiden, ulosteen ulkonäön, anamneesin, fyysisen tutkimuksen ja laboratoriokokeiden perusteella.

o Koiran maha-suolistohäiriöiden, joihin liittyy krooninen ripuli, kirjo on laaja: g 25 proteiinin menetystä aiheuttava enteropatia; lymphangiectasis; ruuan aiheuttama LO ripuli; tulehduksellinen suolistosairaus, mukaan lukien lymfosyyttinen-plasma- x syyttinen gastroenteriitti, eosinofiilinen gastroenterokoliiti, alueellinen granulo-

CL

maenteriitti, histiosyyttincn haavainen koliitti ja märkivä enterokoliitti; ärsyyn-

CO

oo tyvän suoliston oireyhtymä; villus-atrofia; ripuli, jonka aiheuttajia ovat suoliston σ> g 30 loiset ja alkueläimet; bakteeri- ja virustartunnat; antibioottiin reagoiva ripuli c\i (ohutsuolen bakteereiden liikakasvu). Ripulin muitakin aiheuttajia on myös 2 tunnistettu, kuten opportunistiset sienet ja levät, suoliston kasvaimet ja suoliston tukkeutuminen sekä eräät maha-suolistokanavaan liittymättömät häiriöt kuten munuaisten vajaatoiminta, maksan häiriöt, oikea sydämen vajaatoiminta, lisämunuaisten vajaatoiminta ja diabetes mellitus. Myös stressi saattaa laukaista 5 ripulia vähentämällä mahassa kloorivetyhapon eritystä tai muuttamalla suolisto-bakteerien populaatiota tai aktiivisuutta. Monissa tapauksissa sairauden syy jää epäselväksi ja ripulia hoidetaan symptomaattisesti.

Perinteinen lähestymistapa koiran maha-suolistokanavan ongelmien hoidossa 10 perustuu ruokavalion muuttamiseen, hoitoon antibiooteilla ja erityisiin tulehduksia toruviin ja immuunijärjcstelmää tukahduttaviin lääkeaineisiin joko yksinään tai yhdistelminä. Monia koiran maha-suolistokanavan häiriöitä hoidetaan antibiooteilla silloinkin, kun diagnoosi on epäselvä tai alustava. Tähän hoitoon voi liittyä jopa viikkoja kestävää antibioottihoitoa lukuisine uusintoineen. Johtuen jatkuvasti 15 pahenevista ongelmista, joita mikrobien kyky vastustaa niitä torjuvia aineita aiheuttaa, huomioon tulisi ottaa vaihtoehtoisia hoitomuotoja. Alalla on ehdotettu eräänä vaihtoehtoisena hoitomuotona hoitoa probioottisilla bakteereilla, erityisesti maitohappobakteerilla, johtuen niillä olevista terveyttä edistävistä ominaisuuksista.

20

Maitohappobakteerit muodostavat gram-positiivisten bakteereiden heterogeenisen ryhmän. Tähän ryhmään kuuluvat bakteerit ovat itiöitä muodostamattomia, hen-i- gittämättömiä kokkeja tai sauvoja, jotka tuottavat maitohappoa pääasiallisena lopputuotteena hiilihydraatteja fermentoitaessa. Parhaiten tunnetut suvut ovat o 25 Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Strepto-

LO

1- coccus ja Weissella, Lactobacillus .in ollessa suurin suku, joka koostuu noin 80 g tunnistetusta lajista. Maitohappobakteerit muodostavat tärkeän osan ihmisen ja cd eläinten suolistomikrobeista. Vaikka maitohappobakteereiden tiedetäänkin S näyttelevän tärkeätä osaa suolistossa siinä suhteessa, että ne suoj aavat isäntää o o 30 patogeenisiltä lajeilta, niin kuitenkin vain vähän tiedetään näiden bakteerilajien 3 osasta koiran suolistossa. Useimmat tunnistetut koiran suoliston maitohappo-bakteerit kuuluvat Streptococcus- ja Lactobacillus-sukuihin.

Probiootit ovat eläviä mikrobeja, mikrobisoluvalmisteita tai mikrobisolujen 5 komponentteja, joiden avulla edistetään terveyttä sellaisenaan tai elintarviketuotteena. Nämä mikrobit kuuluvat tavallisesti lajeihin Lactobacillus sp. tai Bifidobacterium sp. Probioottisten maitohappobakteereiden nauttimisella on monia dokumentoituja tai mahdollisia etuja, kuten maha-suolistokanavan modulointi, antagonismi patogeenisiä mikrobeja vastaan ja kyky ylläpitää 10 suoliston limakalvoestettä. Adheesiota suoliston limakalvoon pidetään eräänä pääasiallisena mekanismina probioottisten maitohappobakteereiden tapauksessa isännän terveyden edistämistä ajatellen. Probioottisten maitohappobakteereiden on esitetty toimivan lukuisilla mekanismeilla niillä olevien, isäntään kohdistuvien edullisten biologisten vaikutusten aikaansaamiseksi: kilpailu ravinteista ja epi-15 teelin kiinnittymiskohdista estää isännän kolonisaation. Probiootit tuottavat mikrobeja torjuvia yhdisteitä ja happoja, jotka alentavat suoliston pH:ta, jolloin ympäristö muuttuu epäedulliseksi epätoivotuille mikrobeille kuten patogeeneille. Lisäksi probioottiset maitohappobakteerit värväävät immuunisoluja ja ne aktivoivat immuuni- ja/tai tulehdusvasteita muuttamalla sytokiinien ja kemo-20 kiinien vapautumista, ja samoin ne erittävät mikrobeja torjuvia peptidejä. Se, että probioottisia bakteereita nauttimalla kyetään muuttamaan nenän ja emättimen mikrobikasvustoa, viittaa siihen, että suoliston mikrobikasvusta aktivoi lima-i- kalvoon liittyvissä imukudoksissa sijaitsevia immuunivasteita. Probioottien cm antaminen on yhdistetty systeemisten tilojen kuten allergian ja korva-, virtsatie- ja i o 25 emätintulehduksen pienentyneeseen vaaraan, tn g Maitohappobakteereiden joillakin kannoilla on osoitettu olevan edullisia cd vaikutuksia koirien terveyteen. Jotta bakteerit olisivat onnistuneesti probiootteja, S niiden täytyy pysyä hengissä maha-suolistokanavassa ja näin ollen niiden täytyy o o 30 sietää sappea ja suolen happamia olosuhteita. Bakteereiden probioottiset tunnuspiirteet liittyvät myös isäntäspesifisyyteen, joka on hyvin tärkeä kriteeri 4 probioottia valittaessa. Laki vaatii isäntäspesifisyyttä ihmisille tarkoitettujen probioottien tapauksessa. Useimmat kaupalliset koirille tarkoitetut probioottiset kannat eivät ole peräisin koirasta. Lisäksi suurin osa eläimille tarkoitetuista probioottisista valmisteista sisältää Enterococcus faeciunr.ia, jolla on osoitettu 5 negatiivisia vaikutuksia sen mahdollisista patogeenisistä tunnuspiirteistä johtuen.

Beasley S. et ai, (Lactic acid bacteria isolated from canine faeces, Journal of Applied Microbiology, 101 (2006) 131 - 138) kuvaa maitohappobakteereiden eristämisen terveiden koirien ulosteesta ja sekvenssin määrityksen. Viisi näistä 10 kannoista, Lactobacillus fermentum, L. mucosae, L. rhamnosus, L. salivarius ja Weissella confusa, valittiin ehdokasprobiooteiksi niiden esiintymistiheyden, ulosteessa olevan määrän, kasvutiheyden, haponsietokyvyn ja mikrobeja toijuvan aktiivisuutensa perusteella.

15 Manninen T. et ai. (Alteration of the Canine Small-Intestinal Lactic Acid Bacterium Microbiota by Feeding of Potential Probiotics, Applied and Environmental Microbiology, lokakuu 2006, s. 6539 - 6543) jatkoi Beasleyn et al tutkimuksia selvittämällä maitohappobakteereiden edellä mainitun viiden ehdokasprobioottikannan in vitro -sietokyvyt koiran ohutsuolessa olevalle 20 massalle. Kantoja syötettiin kahdesti päivässä sekoitettuna koiranruokaan 7 päivän ajan viidelle beaglelle, joille oli tehty pysyvä avanne. Kantojen todettiin pysyvän elossa ohutsuolen massan maitohappomikrobikasvustossa ja hallitsevan i- sitä syöttämisen aikana, ja niiden todettiin kykenevät muokkaamaan suoliston cm mikrobikasvustoa.

g 25 ί Probioottien käytön ohella alalla on esitetty myös muita lähestymistapoja koiran g suoliston kasvuston muuttamiseksi. Oligosakkaridien kuten inuliinin ja erilaisten cd frukto-oligosakkaridien on esitetty olevan edullisia bifidobaktereiden ja lakto- lo bakteereiden kasvulle maha-suolistokanavassa sekä vähentävän sellaisten pato- o o 30 geenien kuten Clostridium perfringens :in määrää. Patenttijulkaisussa EP 0 850 569 B1 kuvataan lemmikkien muassa käyttökelpoinen viljatuote, joka 5 sisältää gelatinoitua tärkkelystä olevan matriisin, jossa on inuliinin muodossa olevaa prebioottista oligosakkaridia sekä valinnaisesti myös prebioottista frukto-oligosakkaridia. Tällä tuotteella sanotaan olevan edullinen vaikutus nauttijansa maha-suolistokanavaan ja näin ollen koko sitä nauttineeseen yksilöön. Koirille 5 syöttämiseen liittyen on raportoitu parantuneesta maittavuudesta, bifidobakteerei-den suuremmista lukumääristä, C. perfringens:in pienentyneistä lukumääristä ja ulosteen alentuneesta pH:sta, vähentyneestä hajusta ja pienentyneestä tilavuudesta.

10 Alalla on samoin kuvattu probiootteja, jotka on yhdistetty muihin mahdollisesti edullisiin aineisiin. Patenttijulkaisussa WO 2007/076534 kuvataan koostumus, joka sisältää vähintään yhtä antioksidanttia, kuten E-vitamiinia, C-vitamiinia ja/tai β-karoteenia valinnaisesti yhdistettynä yhteen tai useamman probioottin ja pre-biootin kanssa. Sopivina probiootteina on mainittu useita Bifidobacterium- ja 15 Lactobacillus-lajeja, kun taas oligosakkaridit, galaktaanit ja β-glukaanit on mainittu sopivina prebiootteina. Tämä koostumus esitetään käyttökelpoiseksi ajatellen edullisten ja haitallisten bakteereiden tasapainon parantamista eläimen maha-suolistokanavassa, jossa vaarana on tulehduksellinen suolistosairaus, joita eläimiä ovat mm. ihmiset sekä lintu-, nauta-, koira-, hevos-, kissa-, vuohi-, hiiri-, 20 lammas-ja sikaeläimet.

Patenttijulkaisussa US 2005/0175598 AI kuvataan menetelmiä probioottisten ^ bifidobakteereiden, joita voidaan saada eristämällä nisäkkäiden, edullisesti koirien δ ^ irtileikatusta ja pestystä maha-suolistokanavasta, käyttämiseksi seuraeläimissä, 05 ? 25 joita menetelmiä ovat mm. immuunijärjestelmän käsittely, painonhallinta ja kehon tn koostumus, virtsateiden terveys, ihon ja turkin sairaudet sekä ikääntyminen. Mai-

X

£ nittuja probiootteja voidaan antaa suun kautta elinkelpoisessa tai elinkelvottomas- $3 sa muodossa, esimerkiksi siten, että niistä on valmistettu koostumus ravinnon oo ^ tavanomaista ottamista varten kuten ravintonappuloita tai kosteata eläinruokaa, tai o oj 30 niitä on tarkoitus käyttää ravintolisänä, joiden esimerkkejä ovat keksit, pureskel tavat tuotteet, herkut, jauheet, suspensiot tai kapselit. Koostumukset voivat sisäl- 6 tää ylimääräisinä komponentteina proteiinia, rasvaa, hiilihydraattia, prebiootteja, pitkäketjuisia rasvahappoja ja sinkkiä. Prebioottien esimerkkejä ovat mm. oligosakkaridit, fmkto-oligsakkaridit, galakto-oligosakkaridit, ksylo-oligosakkaridit ja tärkkelyksen oligojohdannaiset.

5

Patenttijulkaisussa EP 1 290 136 B1 kuvataan kuusi uutta probioottista maito-happobakteereiden kantaa: kissan Lactobacillus reuteri NCC2581, Lactobacillus reuteri NCC2592 ja Lactobacillus rhamnosus NCC2583 sekä koiran Lactobacillus reuteri NCC2603, Lactobacillus reuteri NCC2613 ja Lactobacillus 10 acidophilus NCC2628. Samoin kuvataan menetelmä probioottisten kantojen saamiseksi kissoille ja koirille, mukaan lukien maitohappobakteerikantojen eristäminen kissojen ja koirien ulosteista, ja niiden kantojen valinta, jotka kannat kykenevät kasvamaan tuottaen vähintään l,0E+06 cfu/ml jopa olosuhteissa, joissa on läsnä jopa 2,0 % sappisuoloja, ja jotka kykenevät kasvamaan tuottaen vähintään 15 l,0E+06 cfu/ml sen jälkeen, kun ne ovat olleet 2 tuntia pH-alueella 3,4-4,2.

Samoin kuvataan menetelmä koiran tai kissan ruokakoostumuksen valmistamiseksi, johon menetelmään kuuluu lisävaiheena yhden tai useamman valitun kannan sisällytys koiran tai kissan ruokakoostumukseen. Sopivina bakteerikantoina on lueteltu Lactobacillus reuteri, L. acidophilus, L. animalis, L. ruminis, 20 L. johnsonii, L. casei, L. paracasei, L. rhamnosus, L. fermentum, Bifidobacterium sp., Enterococcus faecium ja Enterococcus sp.. Tämä lemmikkien ruoka on tarkoitettu kissojen ja/tai koirien maha-suolistokanavan ja iho- ja/tai turkkijärjestelmän terveyttä varten, sekä ikääntymisen vaikutusten parantamiseksi tai vähentämi-cu seksi. Lemmikin ruoka voi sisältää bakteerikantojen ja/tai sen fermentointialustan o 25 lisäksi tärkkelyksen lähteen, proteiinin lähteen ja lipidin lähteen, prebioottista ^ hiilihydraattia määränä, joka on vähemmän kuin noin 20 paino-% kuivatusta g lemmikin ruuasta, sekä pitkäketjuisia rasvahappoja, mineraaleja ja vitamiineja co lemmikin ruuan täydentämiseksi ravitsemuksellisesti täydelliseksi tuotteeksi.

oo io σ> o o 30 Tunnetun tekniikan mukaisten ratkaisujen kirjavuudesta ja tämän alan viimeaikai sista kehityksistä huolimatta on selvää, että edelleen tarvitaan erityisesti koiralle 7 tarkoitettu valmiste, jonka avulla voidaan ennaltaehkäistä ja hoitaa monia erilaisia koiran maha-suolistokanavan häiriöitä sekä näistä häiriöistä johtuvia sekundaarisia tiloja edullisesti siten, että vältetään antibioottien käyttö. Esillä olevan valmisteen edut nähdään erityisesti kroonisissa häiriöissä, joissa tarvitaan 5 pitkäaikaista hoitoa, sekä häiriöissä, jotka eivät reagoi muihin hoitoihin tai erityiseen ruokavalioon.

Keksinnön tavoite 10 Esillä olevan keksinnön tavoitteena on tarjota käyttöön probioottinen valmiste koiran maha-suolistokanavassa esiintyvien häiriöiden ennaltaehkäisemiseksi ja hoitamiseksi.

Esillä olevan keksinnön toinen tavoite on saada aikaan koiranruokatuote, joka 15 sisältää tätä koiran maha-suolistokanavassa esiintyvien häiriöiden ennaltaehkäisyyn ja hoitoon tarkoitettua probioottista valmistetta, joka ylläpitää koiran terveyttä parantamalla koiran luonnollista immuunijärjestelmää tukahduttavaa tilaa.

Keksinnön vielä eräs tavoite on menetelmä probioottisen valmisteen valmista-20 miseksi.

Esillä olevan keksinnön lisätavoite on probioottisen valmisteen ainesosien käyttö i- koiran maha-suolistokanavassa esiintyvien häiriöiden ennaltaehkäisyyn ja hoitoon cm tarkoitetun farmaseuttisen tuotteen tai koiranruokatuotteen valmistamiseksi, o 25 i ^ Probioottisen valmisteen, koiranruokatuotteen, valmistusmenetelmän ja probioot- g tisen valmisteen ainesosien käytön koiranruuan tai farmaseuttisen koostumuksen cd valmistamiseksi tunnuspiirteet on esitetty patenttivaatimuksissa, oo

LO

05 o o

CM

8

Yhteenveto keksinnöstä

Keksinnön kohteena on probioottinen valmiste koiran maha-suolistokanavan häiriöiden ja niistä johtuvien toissijaisten tilojen ennaltaehkäisemiseksi ja 5 hoitamiseksi, joka valmiste sisältää 40 - 95 paino-% kalsiumin lähdettä ilmaistuna CaCC>3:na valmisteen kuivapainosta, 0,5 - 20 paino-% vähintään yhtä prebioottia, vähintään kahta Lactobacillus-sukmm kuuluvaa koiran ulosteesta, koiran suolistosta tai suoliston fluideista eristettyä maitohappoa tuottavaa bakteerikantaa, jotka on valittu bakteerikantojen Lactobacillus fermentum NCIMB 41636, 10 Lactobacillus plantarum NCIMB 41638 ja Lactobacillus rhamnosus NCIMB 41640 joukosta, ja valinnaisesti muita koiran ulosteesta, koiran suolistosta tai suoliston fluideista eristettyjä Lactobacillus-sukmm, Pediococcus-sukuun tai Weis sella-sukuun kuuluvia maitohappoa tuottavia bakteerikantoja, apuaineita ja kantajia.

15

Keksinnön kohteena on myös menetelmä probioottisen valmisteen valmistamiseksi. Tässä menetelmässä viljellään joko toisistaan erillään tai yhdessä vähintään kahta Lactobacillus-sukmm kuuluvaa, koiran ulosteesta, koiran suolistosta tai suoliston fluideista eristettyä maitohappoa tuottavaa bakteerikantaa, jotka on 20 valittu bakteerikantojen Lactobacillus fermentum NCIMB 41636, Lactobacillus plantarum NCIMB 41638 ja Lactobacillus rhamnosus NCIMB 41640 joukosta, ja prosessoidaan yhdestä tai useammasta saadusta viljelmästä, 0,5-20 p-% i- vähintään yhtä prebioottia ja 40-95 p-% kalsiumin lähdettä ilmaistuna CaCCkina ° lopullisen valmisteen kuivapainosta, sekä valinnaisesti muista koiran ulosteesta, o 25 koiran suolistosta tai suoliston fluideista eristetyistä Lactobacillus-sukuun, ^ Pediococcus-sukmm tai Weissella-sukuun kuuluvista maitohappoa tuottavista g bakteerikannoista, apuaineista ja kantajista homogeeninen valmiste, co

CO

00 co Keksinnön mukaista probioottista valmistetta voidaan käyttää koiran maha-suolis- o o 30 tokanavassa esiintyvien häiriöiden ennaltaehkäisyyn ja hoitoon joko kuivana jau heena, jota sekoitetaan koiranruokaan tai josta tehdään erityisempiä farmaseuttisia 9 valmisteita tai koiranruokatuotteita, joita voidaan antaa esimerkiksi suun kautta, kuten rakeita, tabletteja, pureskeltavia välipaloja ja fermentoituja tuotteita.

Keksintöä havainnollistetaan seuraavassa yksityiskohtaisen kuvauksen ja esimerk-5 kien avulla, pyrkimättä rajoittamaan keksintöä niihin.

Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus

Nyt on todettu, että probioottisella valmisteella, joka sisältää erityisenä 10 yhdistelmänä 40 - 95 paino-% kalsiumin lähdettä ilmaistuna CaC03:na valmisteen kuivapainosta, 0,5 - 20 paino-% vähintään yhtä prebioottia, vähintään kahta Lactobacillus-sukmm kuuluvaa koiran ulosteesta, koiran suolistosta tai suoliston fluideista eristettyä maitohappoa tuottavaa bakteerikantaa, jotka on valittu bakteerikantojen Lactobacillus fermentum NCIMB 41636, Lactobacillus 15 plantarum NCIMB 41638 ja Lactobacillus rhamnosus NCIMB 41640 joukosta, on edullinen vaikutus koiriin, jotka kärsivät monista erilaisista maha-suolistokanavan häiriöistä, joiden etiologia voi olla tunnettu tai tuntematon, sekä näistä häiriöistä johtuvista sekundäärisistä tiloista. Keksinnön mukainen probioottinen valmiste voi sisältää lisäksi muita koiran ulosteesta, koiran 20 suolistosta tai suoliston fluideista eristettyjä Lactobacillus-sukmin, Pediococcus-sukuun tai Weissella-mkmm kuuluvia maitohappoa tuottavia bakteerikantoja, tavanomaisia täytcaincitaja kantajia.

° Kunkin koira-spesifisen maitohappobakteerin kannan määrä voi vaihdella pro- i o 25 bioottiseen vaikutukseen tarvittavan vähimmäismäärän eli 1*106 cfii/g:n ja 1*1013 ^ cfii/g:n välillä. Probioottista vaikutusta ja taloudellisia seikkoja ajatellen £ edullisemmassa valmisteessa kunkin koira-spesifisen maitohappobakteerin co kannan määrä vaihtelee alueella 1*107-1*1010 cfu/g, edullisesti alueella 5*108- OO o co 2,5*10 cfu/g probioottista valmistetta. Tämä pitoisuus muodostaa mainittujen o o 30 kantojen riittävän määrän maha-suolistokanavaan edullista vaikutusta ajatellen.

Koira-spesifisiä maitohappobakteerin kantoja voidaan sisällyttää keksinnön 10 mukaiseen probioottiseen valmisteeseen lyofilisoituina viljelminä, jolloin fermentointialustan jäännöksiä siirtyy valmisteeseen. Nämä jäännökset toimivat probiootteja suojaavina aineina ja bakteereiden alustavana kasvumateriaalina maha-suolistokanavassa ruuansulatuksen jälkeen, joko sellaisenaan tai muiden 5 suolistossa olevien mikrobien edeltäkäsin fermentoimina. Nämä jäännökset muodostavat tyypillisesti korkeintaan 15 paino-% probioottisen valmisteen kuivapainosta, edullisesti 5 paino-% probioottisen valmisteen kuivapainosta.

Tässä ilmauksella "koira-spesifiset maitohappobakteerin kannat" tarkoitetaan 10 maitohappoa tuottavia bakteereita, jotka on eristetty koiran ulosteesta, koiran suolistosta tai suoliston fluideista. Bakteerikantojen valinta perustuu niiden hallitsevaan kasvuun koiran suolistossa, kykyyn säilyä hengissä maha-suolistokana-vassa, tuottaa mikrobeja torjuvaa vaikutusta ja sietää anaerobista ja aerobista ilmakehää. Edullisessa tapauksessa vähintään yksi valituista kannoista vastustaa 15 antibiootteja.

Koira-spesifisiä maitohappobakteerin kantoja voidaan saada eristämällä erilaisia koira-spesifisiä maitohappobakteerin kantoja terveiden koirien ulosteesta ja valikoimalla näistä eristetyistä kannoista vähintään kaksi Lactobacillus-svkmm 20 kuuluvaa kantaa. Koira-spesifisten maitohappobakteerin kantojen eristäminen terveiden koirien ulosteesta voidaan toteuttaa Beasleyn et ai. esittämällä tavalla (Lactic acid bacteria isolated from canine faeces, Journal of Applied T- Microbiology, 101 (2006) 131-138). Valintakriteereitä voivat olla mm. kyky ° kasvaa matalassa pH:ssa (pH-alueella 1-2), sappihapon ja hapen sieto, tiettyjen o 25 spesifisten antibioottien kuten amoksisilliinin, crytromysiinin, kloramfenikolin, ^ ampisilliinin, siprofloksasiinin, enrofloksasiinin, gentamisiinin, kanamysiinin, g kinupristiinin/dalfopristiinin, streptomysiinin, vankomysiinin, tetrasykliinin, cd trimetopriimin, rifampiinin, linetsolidin, kefalosporiinien ja klindamysiinin vas- uo tustuskyky tai mikrobeja torjuvat vaikutukset eräitä erityisiä patogeenejä kuten o o 30 Micrococcus luteus:ia vastaan tai tiettyjä, tilaisuutta hyväksi käyttäviksi patogee neiksi tunnistettuja Enterococcus- ja Clostridia-lajeja vastaan. Edullisessa tapauk- 11 sessa käsittely proteaaseilla ei vaikuta valittuihin bakteereihin, mikä osoittaa joko proteaasien vastustuskyvyn tai mikrobeja torjuvan aineen proteiinista poikkeavan luonteen.

5 Mahdollisia, koira-spesifisiä, Lactobacillus-sukmm kuuluvia maitohappobakteerin kantoja, joita voidaan käyttää keksinnön mukaisessa probioottisessa valmisteessa, ovat rajoituksetta mm. L. acetotolerans, L. acidophilus, L. agilis, L. alimentarius, L. animalis, L. bifermentans, L. brevis, L. buchneri, L. casei, L. crispatus, L. crustorum, L. curvatus, L. delbrueckii, L. fermentum, L. gallinarum, L. gasseri, 10 L. gastricus, L. helveticus, L. intestinalis, L.jensenii, L. johnsonii, L. kefiri, L. leichmannii, L. mucosae, L. murinus, L. oligofermentans, L. parabuchneri, L. parakefiri, L. paraplantarum, L. pentosus, L. plantarum, L. rennini, L. reuteri, L. rhamnosus, L. rogosae, L. salivarius, L. sharpeae, L. ultunensis, L. vaccinostercus, L. vaginalis, L. zeae, ja L. zymae.

15

Keksinnön mukaisessa probioottisessa valmisteessa edullisesti vähintään yksi koira-spesifisistä Lactobacillus-sukmm kuuluvista maitohappobakteerin kannoista on valittu seuraavista: Lactobacillus fermentum, Lactobacillus plantarum,

Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus salivarius ja Lactobacillus mucosae.

20 Edullisemmassa tapauksessa mainittuja koira-spesifisiä Lactobacillus-sukmm kuuluvia maitohappobakteerin kantoja ovat 2-5 kantaa, jotka on valittu seuraavista: Lactobacillus fermentum, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus i- rhamnosus, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus casei, Lactobacillus ° paraplantarum, Lactobacillus pentosus, Lactobacillus reuterii, Lactobacillus o 25 murinus ja Lactobacillus mucosae. Näiden kaikkien bakteereiden uloshuuhtoutu- ί misaika on pitkä, niitä voidaan eristää koiran tyhjäsuolesta avanteen kautta kol- | men viikon ajan viimeisestä ruokinnasta. Eräs erityisen edullinen suoritusmuoto cd sisältää kannat Lactobacillus fermentum NCIMB 41636 ja Lactobacillus oo cd plantarum NCIMB 41638 koira-spesifisinä Lactobacillus-sukmm kuuluvina o o 30 maitohappobakteerin kantoina. Toinen edullinen suoritusmuoto sisältää kannat

Lactobacillus fermentum NCIMB 41636, Lactobacillus plantarum NCIMB 41638 12 ja Lactobacillus rhamnosus NCIMB 41640 koira-spesifisinä Lactobacillus-sukuun kuuluvina maitohappobakteerin kantoina. Nämä kannat on tallennettu 30. kesäkuuta 2009 kantakokoelmaan National Collections of Industrial, Food and Marine Bacteria (NCIMB).

5

Valmiste voi valinnaisesti sisältää muitakin koira-spesifisiä, muunkinlaisia kuin Lactobacillus-sukmm kuuluvia maitohappobakteerin kantoja, esimerkiksi Pediococcus-sukmm kuuluvia kantoja kuten P. acidolactici tai Weis sella-sukuun kuuluvia kantoja kuten W. confusa ja W. cibaria. Edullisten muiden, koira-10 spesifisten, muunkinlaisten kuin Lactobacillus- maitohappobakteerin kantojen esimerkkejä ovat P. acidolactici NCIMB 41637 ja W. confusa NCIMB 41639. Nämä kannat talletettiin 30. kesäkuuta 2009 kantakokoelmaan National Collections of Industrial, Food and Marine Bacteria (NCIMB).

15 Kalsiumin lähde voi olla mikä tahansa kalsiumia sisältävä aine, jonka käyttö on hyväksyttävää suun kautta annettavissa koiria varten tarkoitetuissa valmisteissa. Keksinnössä käyttökelpoisen kalsiumin lähteen rajoittamattomia esimerkkejä ovat kalsiumkarbonaatti, kalsiumaskorbaatti, kalsiumalginaatti, kalsiumstearoyyli-2-laktylaatti, kalsiumsorbaatti, kalsiumformiaatti, kalsiumasetaatti, kalsiumpropio-20 naatti, kalsiumlaktaatti, kalsiumsitraatti, kalsiumstearaatit, synteettinen kalsium-silikaatti, kalsiumtetravety-diortofosfaatti, kalsiumvety- ortofosfaatti, kalsiumhyd-roksidi, kalsiumoksidi, dikalsiumdifosfaatti, kalsiumglukonaatti, kalsiumsulfiitti, i- kalsiumvetysulfiitti, kalsiumalumiinisilikaatti, kalsiumdiglukonaatti, kalsiumgua- cm nylaatti, kalsiuminosinaatti, kalsium-5’-ribonukleotidit, kalsiummalaatti, kalsium- i o 25 tartraatti, kalsium-dinatrium-EDTA, mono- ja dikalsiumdifosfaatti, (natrium)kal-

LO

*- siumpolyfosfaatti, kalsiumkloridi, kalsiumferrosyanidi, kalsiumortofosfaatti sekä £ niiden yhdistelmät.

to

CO

00 g Kalsiumin lähde on edullisesti kalsiumkarbonaatti sen yleisesti hyväksyttävästä o o 30 luonteesta ja sen imeytyvyydestä johtuen. Lisäksi kalsiumkarbonaatti on kustan nustehokas samanarvoisiin kalsiumin lähteisiin verrattuna. Kalsiumin imeytymi- 13 nen parantuu prebioottien läsnä ollessa suurentaen koko elimistön mineraalipitoi-suutta. Kalsiumin lähteen määrä vaihtelee alueella 40 - 95 paino-% ja tätäkin edullisemmin alueella 60 - 90 paino-%, esittäen yhdisteenä CaCC>3 valmisteen kuivapainosta. Kalsiumina Ca laskien nämä painoalueet ovat vastaavasti 16-38 5 paino-% ja 24 - 36 paino-%.

Ilmaisulla "prebiootti" tarkoitetaan yleisesti ruuansulatuksessa sulamattomia ravinnon ainesosia, jotka vaikuttavat edullisesti isäntään stimuloiden selektiivisesti yhden suolistossa olevan bakteerin tai suolistossa olevien 10 bakteereiden rajallisen lukumäärän kasvua ja/tai aktiivisuutta, ja näin ollen ne parantavat isännän terveyttä. Sopivia prebiootteja, joita voidaan käyttää keksinnön mukaisissa probioottisissa valmisteissa, ovat mm. rajoituksetta, soijapapujauhe; psyllium, carob, arabikumi, guarkumi, kassia, tamarindin ydin, karayakumi, traganttikumi, ksantaanikumi, gellaanikumi, tarakumi; beeta-glukaani ja sen 15 hydrolysaatit; kauran oligosakkaridit; monosakkaridit kuten tagatoosi ja sen johdannaiset; disakkaridit kuten laktoosi, laktuloosi, trehaloosi, melibioosi, sellobioosi, raffinoosi, stakyoosi, isomaltoosi, isomaltuloosi ja niiden johdannaiset; frukto-oligosakkaridit, gluko-oligosakkaridit, galakto-oligosakkaridit, ksylo-oligosakkaridit, gentio-oligosakkaridit, malto-20 oligosakkaridit, isomalto-oligosakkaridit, kito-oligosakkaridit, manno-oligosakkaridit ja niiden johdannaiset; poly- ja oligosakkaridit kuten arabinogalaktaani, galaktomannaani, pektiini, ligniini, soijapavun hemiselluloosa, ksylaani, pullulaani, inuliini, nuolijuuri, lakritsajuuri, sokerijuurikasmassa, cm tapioka, maissin, ohran, kauran vastustuskykyinen tärkkelys sekä niiden johdan- o 25 naiset; dekstriinit kuten maltodekstriinit, syklodekstriinit ja niiden johdannaiset,

LO

>- jaostettu Eucheuma-meriruoho, Irish moss-jäkälä; sekä niiden mikä tahansa yhdis- £ telmä. Prebioottien on osoitettu säilyvän elossa maha-suolistokanavassa, jossa ne co edistävät maitohappobakteereiden metaboliaa ja kasvua, sekä muuttavan jo 00 co olemassa olevia suolistomikrobeja edullisen mikrobikasvuston suuntaan. Yhden o ....

o 30 tai useamman prebiootin määrä vaihtelee alueella 0,5 - 20 paino-%. Prebioottisten aineiden yhdistelmä valitaan riippuen niiden kyvystä edistää valittujen 14 laktobasillien hengissä pysymistä tuotteiden säilyvyysjakson aikana ja edistää kasvua koirille syötettäessä.

Keksinnön mukainen probioottinen valmiste voi sisältää lisäksi sellaisia tavan-5 omaisia täyteaineita kuten kolloidista piidioksidia, kalsiumsilikaattia, magnesium-silikaattia, magnesiumtrisilikaattia, talkkia, natriumalumiinisilikaattia, kaliumalu-miinisilikaattia, kalsiumalumiinisilikaattia, bentoniittia, alumiinisilikaattia, mag-nesiumstearaattia, makua parantavia aineita ja väriä tuottavia aineita valmisteen säilyvyyden, juoksevuusominaisuuksien, ulkonäön, maun, jne. parantamiseksi. 10 Täyteaineita on tyypillisesti läsnä määränä, joka vaihtelee alueella 0-5 paino-%, edullisesti 0,9 - 1,5 paino-% valmisteen kuivapainosta.

Vaikka ohessa ei halutakaan rajoittua mihinkään teoriaan, niin kuitenkin uskotaan, että kun esillä olevaa valmistetta käytetään koiran maha-suolistokanavassa ilme-15 nevien häiriöiden hoitoon, sillä saavutettavat edut johtuvat maitohappobaktee-reiden kantojen spesifisyydestä koiran suhteen, kunkin kannan suhteellisen suuresta määrästä ja useamman kuin yhden Lactobacillus-sukuun kuuluvan kannan käytöstä. Tiedetään, että Lactobacillus sp:t ovat turvallisia ja ne on osoitettu kykeneviksi pesiytymään suolistoon, jolloin niiden uloshuuhtoutumisajat ovat 20 pitemmät, ja samoin myötävaikuttamaan käsiteltävän kohteen suolistossa jo olevien edullisten bakteereiden pesiytymiskykyyn. Suuri Ca-pitoisuus tuottaa positiivisen vaikutuksen lumenin vakauteen mahdollisesti vaikuttamalla suoliston epi-i- teelin välitiloihin ja vähentämällä fluidien vuotoa elimistöstä suolistoon. Keksinet nön mukaisessa valmisteessa käytetyt prebiootit myötävaikuttavat valmisteessa o 25 olevien kantojen elinkelpoisuuteen sekä niiden kykyyn pesiytyä suolistoon naut-

LO

T- timisen jälkeen. Prebiootit muuttavat valikoitua suoliston mikrobikasviistoa fer- g mentoinnilla ja näin ollen ne takaavat probioottien tehokkuuden. Prebiootit voivat cd myös toimia kalsiumin imeytymisen edistäjinä ja sitoa liiallista nestettä ulosteesta.

00 co Täsmälliset mekanismit, esillä olevan valmisteen edulliset vaikutukset mukaan σ> o o 30 lukien, ovat kuitenkin edelleen tuntemattomat.

15

Keksinnön mukainen probioottinen valmiste voidaan valmistaa menetelmällä, jossa viljellään joko erikseen tai yhdessä vähintään kahta, koira-spesifistä Lactobacillus-sukxmn kuuluvaa maitohappobakteereiden kantaa ja yhdestä tai useammasta saadusta viljelmästä, vähintään yhdestä probiootista ja kalsiumin läh-5 teestä, jota on läsnä yhdisteenä CaCC>3 esittäen alueella 40 - 95 paino-% olevana määränä lopullisen valmisteen kuivapainosta, ja valinnaisesti muista koira-spesifisistä maitohappobakteereiden kannoista, tavanomaisista täyteaineista ja kantajista muodostetaan homogeeninen valmiste.

10 Maitohappobakteereiden kannat, kalsiumin lähde ja yksi tai useampi prebiootti sekä tavanomaiset täyteaineet ja niiden määrät valitaan keksinnön mukaisen pro-bioottisen valmisteen yhteydessä esitetyllä tavalla.

Kaikkia koira-spesifisiä maitohappobakteereiden kantoja viljellään yhdessä tai 15 kantoja viljellään edullisesti erikseen nestemäisessä viljelyalustassa, joka sisältää vähintään yhden hiilen lähteen ja typen lähteen. Sopivien hiilen lähteiden esimerkkejä ovat rajoituksetta mm. glukoosi, dekstroosi ja hera yksinään tai yhdistelminä. Sopivien typen lähteiden esimerkkejä ovat mm., rajoituksetta, soija-jauhe, peptoni, kaseiinihydrolysaatti, lihauute ja hiivauute, kuivahiiva, epäspesi-20 flset proteiinipitoiset lähteet, esim. farmamedia yksinään tai yhdistelminä. Koira-spesifisiä maitohappobakteereiden kantoja viljellään hapen rajoittavan pitoisuuden läsnä ollessa, sekoittamatta tai kevyesti sekoittaen, kunnes suurin mahdollinen T- solutiheys on saavutettu. Jatkaminen edelleen johtaa vain solujen voimistuneeseen cm kuolemaan. Viljelmien pH voi vaihdella alueella 3,5-7, ollen edullisesti alueella i o 25 4-6. Lämpötila voi vaihdella arvojen +25 °C ja 37 °C välillä, ollen edullisesti +30 LO 9 ·,_ °C + 2 °C. Tällä tavalla voidaan saavuttaa vähintään 1x10 cfu/ml olevat

X

£ solutiheydet.

CD

co 00 ^ Viljellyt solut erotetaan elatusalustasta millä tahansa menetelmällä, mukaan o ° 30 lukien mm. rajoituksetta sentrifugointi, suodatus tai dekantointi. Fermentointi- alustasta erotetut solut pestään valinnaisesti vedellä, suolaliuoksella (0,9 % NaCl) 16 tai millä tahansa sopivalla puskurilla. Saatu märkä solumassa kuivataan sopivalla menetelmällä ja edullisesti lyofilisoimalla. Veden imeytymisen edistämiseen on käytettävissä lukuisia aineita, joita voidaan käyttää kuivaukseen, samalla kun ne parantavat probioottien pysyvyyttä, mukaan lukien, rajoituksetta, mm. sakkaroosi, 5 maltodekstriini, tärkkelys ja muut hiilihydraatit.

Lukuisia lisäaineita voidaan käyttää probioottien valmistuksessa fermentointia käyttäen. Olemassa on lukuisia mahdollisia lisättäviä komponentteja laktobasillien kasvun edistämiseksi fermentoimalla ja hyvin pienet määrät ovat edullisia lopulli-10 selle koostumukselle. Tällaisia mahdollisia aineita ovat esimerkiksi joukko vaah-donestoaineita kuten öljypohjaisia aineita, silikonipohjaisia materiaaleja, structol ja polypropyleeni- tai polyetyleeniglykolit, näihin kuitenkaan rajoittumatta.

Homogeenisen valmisteen muodostukseen saaduista viljelmistä ja kalsiumin läh-15 teestä sekä vähintään yhdestä prebiootista voi kuulua mikä tahansa seuraavista missä tahansa j äij estyksessä: lyofilisointi, sentrifugointi, suodatus, kuivaus, sekoitus, vaivaus, ekstruusio, rakeistus, kokoonpuristus, kapselointi, kalvopäällystys ja upotus tai sisällytys hallitusti vapauttaviin valmisteisiin. Kannat mikrokapseloi-daan valinnaisesti ennen kalsiumin lähteen ja prebioottien kanssa tapahtuvaa muo-20 dostusta, mikä on edullista, kun lopputuote on runsaasti vettä sisältävä valmiste kuten tahna tai geeli.

i- Menetelmän erässä edullisessa suoritusmuodossa mainitun vähintään yhden pre- ° biootin ensimmäinen määrä sisällytetään koira-spesifisten maitohappobak- i o 25 teereiden kantojen viljelyalustaan, saadut viljelmät valinnaisesti yhdistetään ja ^ pestään, lyofilisoidaan ja sekoitetaan tämän jälkeen kalsiumin lähteeseen ja valin- g naisesti mainitun vähintään yhden prebiootin toiseen määrään. Ilmauksella cd "ensimmäinen määrä" tarkoitetaan mitä tahansa alueella 0-100 paino-% vaihtele- lo vaa osuutta prebioottien kokonaismäärästä, joka mainittu ensimmäinen määrä o o 30 vaihtelee tavallisesti alueella 0,001 - 30 paino-%, ollen edullisesti korkeintaan 15 paino-% valmisteen kuivapainosta. Ilmauksella "toinen määrä" tarkoitetaan 17 jäljellä olevaa osaa prebioottien kokonaismäärästä, jota jäljellä olevaa osaa ei ole sisällytetty ensimmäisenä määränä. Sisällyttämällä prebioottien ensimmäinen määrä jo viljelyalustaan sen osittain fermentoituneita jäännöksiä saattaa jäädä -valituista käsittelyvaiheista riippuen - probioottiseen valmisteeseen, jolloin aikaan 5 saadaan helposti saatavilla olevaa, probioottisten kantojen pesiytymistä helpottavaa materiaalia.

Keksinnön mukaiseen menetelmään voi lisäksi kuulua vaihe, jossa maitohappo-bakteereista, kalsiumin lähteestä ja yhdestä tai useammasta prebiootista sekä 10 valinnaisesti muista koira-spesifisistä maitohappobakteereiden kannoista, tavanomaisista täyteaineista ja kantajista muodostetaan suun kautta annettavia valmisteita, jotka ovat jauheina, rakeina, pillereinä, tabletteina, kapseleina, pastilleina, kuivina tuotteina, jotka palautetaan nestemäiseen muotoon vedellä tai muulla sopivalla kantajalla, vesipohjaisina tai öljypohjaisina suspensioina, geeleinä, 15 tahnoina, emulsioina tai siirappeina, tai tavanomaisia koiranruuan ainesosia käyttäen tehdään kuivia ruokapellettejä, ruokalohkoja, purkkiruokaa, ruokahalua herättävää kastiketta, keksejä, pureskeltavia välipaloja, pennuille tarkoitettua maidon korviketta tai fermentoituja tuotteita. Valmistus voi tapahtua tavanomaisilla tekniikoilla, kuten on kuvattu esimerkiksi teoksessa “Remington: The 20 Science and Practice of Pharmacy”, Lippincott, Williams and Wilkins Eds, joulukuu 2000, käyttäen sopivia tunnettuja sideaineita, laimentimia, tabletointi-aineita, liukasteita, hajotusaineita, kostutusaineita, suspendointiaineita, emulgaat-i- toreita, muita kantajia kuin vettä, säilöntäaineita, makua parantavia aineita tai cv väriaineita täyteaineina ja kantajina. Valmisteesta voidaan tehdä myös tavan- i 0 25 omainen koiranruokatuote tai erikoiskoiranruokatuote käyttäen tavanomaisia ί valmistusmenetelmiä j a ainesosia.

cc

CL

co Keksinnön mukaista valmistetta käytetään sellaisina annoksina, että päivittäiset 00 jo nautitut määrät saadaan seuraaville, esimerkkeinä esitetyille alueille: o 30 - kutakin probioottista kantaa: 2*106 - 2*1010 cfu/kg/vrk, edullisesti 1*108 - 5*108 cfu/kg/vrk 18 - kalsiumia: 40 - 198 mg/kg/vrk, edullisesti 80 - 190 mg/kg/vrk (kalsiumkarbo-naattina esittäen) - prebiootit: 1-100 mg/kg/vrk, edullisesti 1-40 mg/kg/vrk.

Esimerkit keksinnön mukaisen, kuivajauheena olevan valmisteen annoksesta, joka 5 syötetään vaikeuksitta koiran 10 painokiloa kohden, vaihtelevat alueella 0,5 - 4 g, edullisen annoksen ollessa 2 g koiran 10 painokiloa kohden.

Koska valmisteessa olevat maitohappobakteerit ovat peräisin koirasta ja koska valmisteessa käytetään vain tunnettuja, elintarvikkeissa hyväksyttäviä prebiootteja 10 ja kalsiumin lähteitä, niin haitallisia vaikutuksia ei ole odotettavissa. Keksinnön mukaista probioottista valmistetta syötetään tavallisesti 5-10 vuorokauden pituisten ajanjaksojen ajan. Turvallisuudestaan johtuen keksinnön mukainen probiootti-nen valmiste on erityisen käyttökelpoinen hoidettaessa maha-suolistokanavan kroonisia häiriöitä. Kroonisten häiriöiden tapauksessa probioottista valmistetta 15 voidaan syöttää olennaisesti pitempien aj anjaksojen aj an kuten useita kuukausia.

Probioottinen valmiste on edullisesti sellaisessa muodossa, että valmisteen määrä voidaan helposti annostella koirille niiden painon perusteella esimerkiksi mitta-lusikan avulla. Valmisteen tyyppi vaikuttaa myös tuotteen säilyvyyteen, kuivien 20 valmisteiden ollessa edullisia niiden paremmasta pysyvyydestä johtuen. Edullisten muotojen esimerkkejä ovat mm. kuivat jauheet ja rakeet.

Keksinnön mukaista probioottista valmistetta voidaan myös sisällyttää käyttöval-cu miiseen koiranruokaan kuten tuoreeseen koiranruokaan, koiranmakkaroihin, i cp 25 pakastettuun koiranruokaan, purkitettuun koiranruokaan, tahnoihin, paloihin, kui- 5? viin pelletteihin, ruokanappeihin tai esiseoksiin. Tässä tapauksessa valmisteen g määrä koiranruuassa asetetaan siten, että yksi ateria tai sen osa tai kaikki ateriat to voidaan korvata koiranruualla, joka sisältää keksinnön mukaista probioottista valio mistetta. Keksinnön mukainen probioottinen valmiste voidaan myös laittaa koi- o o 30 ranruokapakkaukseen kiinnitettyyn erilliseen pakkaukseen, esimerkiksi pieneen pussiin, sekoitettavaksi koiranmokaan ennen sen nauttimista. Keksinnön mukaista 19 probioottista valmistetta voidaan myös sisällyttää koiralle tarkoitettuihin erityistuotteisiin kuten fermentoituihin tuotteisiin, pennuille tarkoitettuun maidon korvikkeeseen, kapseleihin, maittavuutta parantavaan kastikkeeseen, kekseihin, pureskeltaviin välipaloihin tai herkkuihin. Fermentoidun meijerituotteen tapauk-5 sessa tuote voi sisältää esillä olevan keksinnön mukaisen valmisteen lisäksi vettä tai maitoa, makua parantavia aineita, teknisiä bakteerikantoja fermentointia varten ja muita tavanomaisia ainesosia, joita on juoksettuneessa maidossa, happamassa kokomaidossa, jogurtissa, jne. Pennuille tarkoitetun maidon korvikkeen tapauksessa keksinnön mukaista valmistetta sisällytetään pennuille tarkoitetun maidon 10 korvikkeen tavanomaisiin ainesosiin joko käyttövalmiina tuotteena, tai tuotetta, joka on erillisenä, esimerkiksi pienessä pussissa, sekoitetaan pennuille tarkoitettuun maidon korvikkeeseen juuri ennen käyttöä tai valmistetta on sisällytetty kuivana jauhemaisena esiseoksena olevaan, pennuille tarkoitetun maidon korvikkeeseen, joka palautetaan nestemäiseen muotoon ennen käyttöä vedellä, maidolla tai 15 muulla sopivalla nesteellä. Kapseleiden tapauksessa keksinnön mukainen valmiste, joka on esimerkiksi jauheena tai suspensiona, täytetään tavanomaisiin koviin tai pehmeisiin, esimerkiksi gelatiinia oleviin kapseleihin. Koirankeksien, pureskeltavien välipalojen, herkkujen tai maittavuutta parantavien kastikkeiden tapauksessa keksinnön mukaista valmistetta sisällytetään keksien, pureskeltavien 20 välipalojen, herkkujen tai maittavuutta parantavien kastikkeiden tavanomaisiin ainesosiin, esim. sekoittamalla tai päällystämällä käyttövalmiiksi tuotteeksi.

Keksinnön mukaisen probioottisen valmisteen avulla voidaan ennaltaehkäistä ja cm käsitellä erilaisia koiran maha-suolistokanavassa ilmeneviä häiriöitä. Keksinnön o 25 mukaisen probioottisen valmisteen avulla voidaan hoitaa erityisen hyvin ohutsuoli leen liittyviä häiriöitä. Tällaisten häiriöiden esimerkkejä ovat virus- ja bakteerini tartunnat, antibioottiin reagoiva enteropatia (ARE) sekä tulehduksellinen suolisto tosairaus (IBD). Lisäksi probioottisen L. salivarius:in on osoitettu hävittävän S patogeenejä maha-suolistokanavassa, jolloin se vähentää sitä vaaraa, että per- o o 30 heessä on oireeton patogeenin kantaja. Hyvin tunnettua on se, että perheen jäse net, eli pienet lapset voivat saada patogeenitartunnan lemmikeistä.

20

Keksinnön mukaisen probioottisen valmisteen avulla voidaan hoitaa erityisesti maha-suolistokanavassa ilmeneviä häiriöitä, jotka eivät reagoi muihin hoitoihin. Keksinnön mukaisen probioottisen valmisteen avulla voidaan myös hoitaa maha-suolistokanavan häiriöitä, joiden aiheuttaja on tuntematon tai joilla on lukuisia 5 aiheuttajia tai joihin liittyy muuttuvia tai monimutkaisia oireita. Sitä voidaan käyttää yksinään tai samanaikaisesti lääkkeen kanssa, myös eräiden antibioottien kanssa. Erityisen edullista on keksinnön mukaisen probioottisen valmisteen käyttö sellaisen lääkkeen yhteydessä, jonka lääkkeen tiedetään aiheuttavan ongelmia maha-suolistokanavassa.

10

Edullisen käyttösovelluksen muita esimerkkejä ovat käyttö ennen stressitilannetta ja sen aikana, joita stressitilanteita ovat mm. juoksuaika, palvelu, tiineys, synnytys, maidoneritys, vieroitus ja vastasyntyneen erotus emästä. Tiineet nartut voivat hyötyä valmisteesta erityisesti sen ansiosta, että immuunijärjcstclmä paranee, 15 stressistä johtuvat oireet saadaan ennaltaehkäistyiksi ja synnytyksen jälkeiset tartunnat voidaan ennaltaehkäistä. Vastasyntyneet ja pennut voivat hyötyä valmisteesta erityisesti sen ansiosta, että mikrobien luonnollinen vuorovaikutus maha-suolistokanavassa voimistuu, immuunijärjestelmä paranee, allergiat tukahtuvat ja pennun ripuli vältetään, kun ruokavalio vaihtuu kiinteään ruokaan. Täysikasvuiset 20 koirat voivat hyötyä valmisteesta erityisesti siksi, että sen avulla voidaan parantaa ja ennaltaehkäistä maha-suolistokanavan tiloja kuten antibioottiin liittyvää ripulia, ennaltaehkäistä allergioita, ennaltaehkäistä tartuntoja kuten korvassa, iholla, emät--r- timessä ja virtsateissä esiintyviä tartuntoja, ylläpitää suun ja hampaiden hygieniaa cm ja ennaltaehkäistä stressistä johtuvia oireita. Ikääntyvät koirat voivat hyötyä vai- i o 25 misteesta sen ansiosta, että mikrobien luonnollinen vuorovaikutus maha-suolisto- ^ kanavassa voimistuu, immuunijärjestelmä paranee ja kykyä vastustaa sairauksia g kyetään ylläpitämään, stressiin liittyviä oireita kyetään ennaltaehkäisemään ja tar- cd tuntoja kuten korvassa, iholla, emättimessä ja virtsateissä esiintyviä tartuntoja S kyetään ennaltaehkäisemään. Keksinnön mukainen probioottinen valmiste voi- o o 30 daan myös todeta edulliseksi maha-suolistokanavan tilojen ennaltaehkäisemiseksi matkustettaessa autolla, junalla tai lentokoneella, muutettaessa toiseen paikkaan, 21 muutettaessa ruokavaliota, käytäessä eläinlääkärin vastaanotolla ja/tai ennen kirurgisesta toimenpiteestä johtuvaa sairaalaan viemistä tai sen aikana sekä metsästys- ja kilpailukoirissa. Keksinnön mukainen probioottinen valmiste ylläpitää terveellistä tasapainoa koiran maha-suolistokanavassa raskaiden harjoittelu-, 5 kilp ailu- j a lepoj aksoj en aikana.

Ensisijaisten ja toissijaisten häiriöiden, jotka saattavat hyötyä keksinnön mukaisen probioottisen valmisteen käytöstä, rajoittamattomia esimerkkejä ovat mm. tuleh-dushäiriöt, immuunikato, tulehduksellinen suolistosairaus, ärsyyntyvän suolen 10 oireyhtymä, syöpä (erityisesti maha-suolistokanavan ja immuunijäqestelmän syöpä), sairaudet, joihin liittyy ripulia, antibioottiin liittyvä ripuli, umpilisäkkeen tulehdus, autoimmuunihäiriöt, multippeliskleroosi, Alzheimerin tauti, amyloi-doosi, nivelreuma, artriitti, nivelten liikkuvuus, diabetes mellitus, insuliinin vastustuskyky, bakteeri-, virus- ja sienitartunnat, hampaiden ympäryskudoksen sai-15 raudet, suuonkalon sairaudet, urogenitaalisairaudet, kirurgiseen toimenpiteeseen liittyvä trauma, kirurgisen toimenpiteen aiheuttama metastaattinen sairaus, sepsis, painonmenetys, painonnousu, liiallinen rasvakudoksen kerääntyminen, anoreksia, kuumeen säätely, riutuminen, haavan paraneminen, haavaumat, suoliesteen tartunta, allergia, astma, hengityshäiriöt, verenkierron häiriöt, sydämen sepelvaltimoi-20 den tauti, anemia, veren hyytymisjäqestelmän häiriöt, munuaistauti, keskushermoston häiriöt, maksasairaus, iskemia, ravitsemukseen liittyvät häiriöt, osteoporoosi, endokriiniset häiriöt, epidermin häiriöt sekä fiirunkuloosi. Edullisia ovat — maha-suolistokanavan hoito, mukaan lukien ripulin hoito ja ennaltaehkäisy; ° immuunijäqestelmän säätely, edullisesti autoimmuunisairauden ja tulehduksen 0 25 hoito tai ennaltaehkäisy; ihon ja/tai turkkijärjestelmän ylläpito ja parantaminen, ^ edullisesti ihon atooppisen sairauden hoito ja ennaltaehkäisy; kynsien terveyden g ylläpito tai parantaminen; ikääntymisen vaikutusten parantaminen tai vähentämi- cd nen, mukaan lukien mm. henkinen valppaus ja aktiivisuustasot; sekä paino häviön S ennaltaehkäisy tartunnan aikana ja sen jälkeen.

22

ESIMERKIT

Probioottisen valmisteen valmistus 5 Probioottisten kantojen valinta

Beasley et ai eristivät vuonna 2006 Lactobacillus fermentum-, Lactobacillus plantarum- ja Lactobacillus rhamnosus-eliöt terveiden koirien ulosteesta (vastaaviin artikkeleihin viitataan lyhenteillä LAB8 (L. fermentum), LAB9 (L. plantarum, joka on aikaisemmin tunnistettu eliöksi L. salivarius) sekä LAB11 (L. 10 rhamnosus). Tässä kantoihin viitataan niiden talletusnumeroilla NCIMB 41636, NCIMB 41638 and NCIM 41640, vastaavasti. Näiden bakteereiden on osoitettu säilyvän hengissä alhaisessa pH:ssa (pH 1) ja niitä voidaan viljellä sen jälkeen, kun niitä on kerätty koiran ohutsuolesta (Beasley et ai 2006; Manninen et ai, 2006). Nämä kannat muuttavat suolistossa jo olemassa olevaa mikrobikasvustoa, 15 helpottaen isännän suhteen spesifisten, jo läsnä olevien maitohappobakteereiden säilymistä hengissä. Suoliston muokkautuminen mikrobeja torjuvaan aktiivisuuteen yhdistyneenä edistää näiden kantojen probioottista luonnetta. Näiden kantojen on myös osoitettu sietävän tavallisia, koirille suun kautta annettavia antibiootteja. Tämän piirteen johdosta näitä kantoja voidaan antaa samanaikaisesti anti-20 bioottien kuten kefalosporiinien kanssa antibiootin aiheuttaman ripulin vähentämiseksi.

i- Viljelyolosuhteet ° Kantoja Lactobacillus fermentum NCIMB 41636, Lactobacillus plantarum 05 o 25 NCIMB 41638 ja Lactobacillus rhamnosus NCIMB 41640 siirrostettiin erikseen

LO

>- juuri valmistetusta agarmaljaviljelmästä tai pakastetusta varasto viljelmästä 20- £ prosenttisessa glyserolissa MRS-alustaan (De Man, Rogosa & Sharpe), joka cd sisältää 10 g/1 peptonia (Bacto Peptone, Becton Dickinson), 8 g/1 lihauutetta oo g (Organotechnie), 4 g/1 hiivauutetta (DSM Food Specialties), 20 g/1 dekstroosia, ° 30 2,6 g/1 yhdistettä K2HPO4 x 3 H2O, 5 g/1 yhdistettä CHsCOONa x 3H2O, 2 g/1 triammoniumsitraattia, 0,2 g/1 yhdistettä MgSC>4 x 7 H20 ja 0,04 g/1 yhdistettä 23 M11SO4 x 1 H2O, ja viljelyä jatkettiin 16-18 tuntia 30 °C:ssa ravistelematta. Saatua viljelylientä käytettiin siirrosteena 500 litrassa fermentointialustaa, siirtosuhteen ollessa 1 %. Tuotantoalusta oli seuraava:

Komponentti Toimittaja g/1 glukoosi (dekstroosi) 24 soijajauhe 7B ADM tuotekoodi 063130 30 hivauute R1012-1592F 10 K2HPO4_A687601604_2,5 natriumasetaatti-trihydraatti Riedel de Haen 32318 7,5

MnS04 x 1 H2O MP Biomedicals 194702 0,1 5

Vaahdonestoaineena käytettiin silikonipohjaista ainetta. Fermentointi toteutettiin 30 °C:ssa ilman ilmastusta ja käyttäen vain vähäistä sekoitusta yhden päivänä ajan. Kun OD600-arvoksi oli saatu 10, mikä vastaa 6,0*109; 4,0*109; 4,0*109 cfu/ml mikronien Lactobacillus fermentum NCIMB 41636, Lactobacillus plantain rum NCIMB 41638 ja Lactobacillus rhamnosus NCIMB 41640 tapauksessa, vastaavasti, solut otettiin talteen erotuslaitteen avulla (Seital SE 12 X). Kunkin Lactobacillus-kann&n märkä solumassa, joka saatiin 500 litran fermentointivilje-lyn liemestä, pestiin vedellä, sitä täydennettiin maltodekstriinillä ja sitä kuivattiin lyofilisoimalla (Hetosicc Freeze dryer CD 15-1) 3 vuorokautta. Cfu/mg-arvot 15 huomioon ottaen saannot lyofilisoinnin jälkeen olivat 90,1 %, 47,1 % ja 45,6 %, vastaavasti mikrobien Lactobacillus fermentum NCIMB 41636, Lactobacillus plantarum NCIMB 41638 ja Lactobacillus rhamnosus NCIMB 41640 tapaukses-cm sa. Fermentointiliemen jäännökset sisältävät pesun jälkeen pieniä määriä soija- o> .

cp jauhoa, esim. 1-5 g/1, eikä muiden jäännösten todettu olevan täysin liukoinen

LO

>- 20 komponentti viljelyalustassa.

X

tr

CL

Seuraavat komponentit lisättiin lyofilisoituihin probiootteihin: psyllium 80-100 00 [g mesh lopputuotteen prebioottisten ominaisuuksien parantamiseksi ja probioottisen o ^ tuotteen pysyvyyden parantamiseksi määränä 1,5 paino-% sekä 87,5 paino-% 25 yhdistettä CaCCN. Tuotteen stabiilius tutkittiin ja se havaittiin yleisesti ottaen 24 hyväksi. Elinkelpoisten Lactobacillus-sohx)en tiitterit säilyivät lähes vakaina arvossa 9,7x108 cfu/g.

Alustava koe ripulista kärsivällä koiralla 5

Keksinnön mukaista probioottista valmistetta (jauhemainen valmiste, joka sisälsi 3x10 - 6,7x10 cfu/g kutakin Lactobacillus-kantaa L. fermentum NCIMB 41636, L. plantarum NCIMB 41638 ja L. rhamnosus NCIMB 41640; 87,5 paino-% yhdistettä CaCCb; 5,0 paino-% psylliumia; 5,0 paino-% soijapapujauhoa; ja 1 paino-10 % piioksidia) syötettiin koirille, jotka kärsivät maha-suolistokanavan häiriöistä kuten ripulista, allergiasta ja paino-ongelmista, annoksena, joka oli 1 g valmistetta koiran 10 painokiloa kohden 3-7 vuorokauden ajan. Maitoa tuottavat nartut (n=2, ikä 4 vuotta) ja niiden vieroitettavat pennut (n=7 ikä 1 viikko, n=6 ikä 4 viikkoa, n=3 ikä 5 viikkoa) kärsivät synnytyksen jälkeisestä ripulista. Täysikasvuisten koi-15 rien tapauksessa valmistetta syötettiin koiranruokaan sekoitettuna. Vastasyntyneiden pentujen annettiin nuolla valmistetta siihen kastetusta sormenpäästä. Yksi gramma valmistetta lisättiin päivittäin 4 viikon ja 5 viikon ikäisille pennuille tarkoitettuihin kasteltuihin kuivaruokapelletteihin. Kaikissa tapauksissa ripuli lakkasi 2-3 vuorokaudessa hoidon aloituksesta eikä se ilmaantunut uudestaan 1 viikon ja 20 5 viikon ikäisissä pennuissa hoidon päättymisen jälkeen. Neljän viikon ikäisten pentujen uloste havaittiin ajoittain löysäksi sen jälkeen, kun ne olivat olleet yhden viikon ilman valmistetta.

cv Alustava koe vakavasta ruoka-allergiasta kärsivällä koiralla S 25 ^ Samaa keksinnön mukaista probioottista valmistetta kuin edellisessäkin esimer- g kissä testattiin mäyräkoiralla, joka kärsi vakavasta ruoka-allergiasta (n=l, ikä 1 to vuotta) käyttäen annosta, joka oli 1 g valmistetta koiran 10 painokiloa kohden 7 S vuorokautta, hyvin tuloksin: yksilö sieti valmistetta ja kaikkea ruokaa 7 o o 30 vuorokauden ajan ilman minkäänlaisia oireita.

25

Alustava koe kroonisesta keskeytyvästä ripulista kärsivällä koiralla

Samaa keksinnön mukaista probioottista valmistetta kuin edellisissäkin esimerkeissä testattiin urosrottweilerilla, joka kärsi kroonisesta ajoittaisesta ripulista 5 (n=l, ikä 7 vuotta) käyttäen annosta, joka oli 1 g valmistetta koiran 10 painokiloa kohden (eli 4 teelusikallista) 7 vuorokautta, hyvin tuloksin: ripuli lakkasi 3 viikoksi.

δ

CM

CD

O

in x

X

Q-

CD

CO

00 in

CD

o o

CM

Claims (15)

1. Probioottinen valmiste koiran maha-suolistokanavan häiriöiden ennaltaehkäisemiseksi ja hoitamiseksi, joka valmiste sisältää: 5 - 40 - 95 paino-% kalsiumin lähdettä ilmaistuna CaCC^ma valmisteen kuivapainosta, - 0,5 - 20 paino-% vähintään yhtä prebioottia, tunnettu siitä, että valmiste sisältää - vähintään kahta Lactobacillus-sukmm kuuluvaa koiran ulosteesta, koiran 10 suolistosta tai suoliston fluideista eristettyä maitohappoa tuottavaa bakteerikantaa, jotka on valittu bakteerikantojen Lactobacillus fermentum NCIMB 41636, Lactobacillus plantarum NCIMB 41638 ja Lactobacillus rhamnosus NCIMB 41640 joukosta, ja valinnaisesti muita koiran ulosteesta, koiran suolistosta tai suoliston fluideista 15 eristettyjä Lactobacillus-sukmm, Pediococcus-sukuun tai Weissella-sukmm kuuluvia maitohappoa tuottavia bakteerikantoja, apuaineita ja kantajia.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen probioottinen valmiste, tunnettu siitä, että kunkin koiran ulosteesta, suolistosta tai suoliston fluideista eristetyn maitohappoa 20 tuottavan bakteerikannan määrä vaihtelee alueella 1*107 - 1*1010 cfu/g.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen probioottinen valmiste, tunnettu siitä, 1—— että kunkin koiran ulosteesta, suolistosta tai suoliston fluideista eristetyn cm maitohappoa tuottavan bakteerikannan määrä vaihtelee alueella 5*108 - 2,5*109 i o 25 cfu/g. tn

£ 4. Jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mukainen probioottinen valmiste, tunnettu co siitä, että valmiste sisältää 2-5 Lactobacillus-sukmm kuuluvaa bakteerikantaa, oo g jotka on valittu seuraavista: Lactobacillus fermentum NCIMB 41636, o o 30 Lactobacillus plantarum NCIMB 41638, Lactobacillus rhamnosus NCIMB 41640, Lactobacillus salivarius ja Lactobacillus mucosae.

5. Jonkin patenttivaatimuksen 1-4 mukainen probioottinen valmiste, tunnettu siitä, että valmiste sisältää Lactobacillus fermentum NCIMB 41636 ja Lactobacillusplantarum NCIMB 41638 bakteerikantoja.

6. Jonkin patenttivaatimuksen 1-5 mukainen probioottinen valmiste, tunnettu siitä, että valmiste sisältää Lactobacillus fermentum NCIMB 41636, Lactobacillus plantarum NCIMB 41638 ja Lactobacillus rhamnosus NCIMB 41640 bakteerikantoja.

7. Jonkin patenttivaatimuksen 1-6 mukainen probioottinen valmiste, tunnettu siitä, että kalsiumin lähde valitaan kalsiumkarbonaatin, kalsiumaskorbaatin, kalsiumalginaatin, kalsiumstearoyyli-2-laktylaatin, kalsiumsorbaatin, kalsiumformiaatin, kalsiumasetaatin, kalsiumpropionaatin, kalsiumlaktaatin, kalsiumsitraatin, kalsiumstearaattien, synteettisen kalsiumsilikaatin, 15 kalsiumtetravetydiortofosfaatin, kalsiumvetyortofosfaatin, kalsiumhydroksidin, kalsiumoksidin, dikalsiumdifosfaatin, kalsiumglukonaatin, kalsiumsulfiitin, kalsiumvetysulfiitin, kalsiumalumiinisilikaatin, kalsiumdiglukonaatin, kalsiumguanylaatin, kalsiuminosinaatin, kalsium-5 ’-ribonukleotidien, kalsiummalaatin, kalsiumtartraatin, kalsiumdinatrium-EDTAn, mono- ja 20 dikalsiumdifosfaatin, (natri umjkalsi umpol yfosfaatin, kalsiumkloridin, kalsiumferrosyanidin, kalsiumortofosfaatin tai niiden yhdistelmien joukosta. i-

8. Jonkin patenttivaatimuksen 1-7 mukainen probioottinen valmiste, tunnettu cv siitä, että prebiootti on valittu seuraavista: soijapapujauhe; psyllium, carob, o 25 arabikumi, guarkumi, kassia, tamarindin ydin, karayakumi, traganttikumi, ^ ksantaanikumi, gellaanikumi, tarakumi; beeta-glukaani ja sen hydrolysaatit; g kauran oligosakkaridit; monosakkaridit kuten tagatoosi ja sen johdannaiset; disak- co karidit kuten laktoosi, laktuloosi, trehaloosi, melibioosi, sellobioosi, raffinoosi, co g stakyoosi, isomaltoosi, isomaltuloosi ja niiden johdannaiset; frukto-oligosakkari- o 30 dit, gluko-oligosakkaridit, galakto-oligosakkaridit, ksylo-oligosakkaridit, gentio- oligosakkaridit, malto-oligosakkaridit, isomalto-oligosakkaridit, kito-oligosakka- ridit, maimo-oligosakkaridit ja niiden johdannaiset; poly-ja oligosakkaridit kuten arabinogalaktaani, galaktomannaani, pektiini, ligniini, soijapavun hemiselluloosa, ksylaani, pullulaani, inuliini, nuolijuuri, lakritsajuuri, sokerijuurikasmassa, tapioka, maissin, ohran, kauran vastustuskykyinen tärkkelys sekä niiden johdan-5 naiset; dekstriinit kuten maltodekstriinit, syklodekstriinit ja niiden johdannaiset, jalostettu Eucheuma-meriruoho, Irish moss-jäkälä; sekä niiden yhdistelmät.

9. Jonkin patenttivaatimuksen 1-8 mukainen probioottinen valmiste, tunnettu siitä, että probioottinen valmiste on kuivien jauheiden, rakeiden, pillereiden, 10 tablettien, kapselien, pastillien tai sellaisten kuivien tuotteiden muodossa, jotka voidaan veden tai muun sopivan kantajan avulla saattaa nestemäiseen muotoon, tai vesipohjaisten tai öljypohjaisten suspensioiden, geelien, tahnojen, emulsioiden tai siirappien muodossa.

10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen probioottinen valmiste, tunnettu siitä, että probioottinen valmiste on kuivan jauheen muodossa.

11. Koiranruokavalmiste koiran maha-suolistokanavan häiriöiden ennaltaehkäisemiseksi ja hoitamiseksi, tunnettu siitä, että valmiste sisältää jonkin 20 patenttivaatimuksen 1-10 mukaista probioottista valmistetta ja probioottinen valmiste on formuloitu tuoreruoaksi, makkaroiksi, pakasteruoaksi, kuiviksi ruoka-pelleteiksi, nappuloiksi, ruokalohkoiksi, purkkiruoaksi, tahnoiksi, f- puolivalmisteiksi, maittavuutta parantavaksi kastikkeeksi, kekseiksi, cm pureskeltaviksi välipaloiksi, herkuiksi, pennulle tarkoitetuksi maidon korvikkeeksi i o 25 tai fermentoiduksi tuotteeksi. i LO

12. Menetelmä jonkin patenttivaatimuksen 1-10 mukaisen probioottisen co valmisteen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että menetelmässä co LO - viljellään joko toisistaan erillään tai yhdessä vähintään kahta Lactobacillus- o o 30 sukuun kuuluvaa, koiran ulosteesta, koiran suolistosta tai suoliston fluideista cm ’ ’ eristettyä maitohappoa tuottavaa bakteerikantaa, jotka on valittu bakteerikantojen Lactobacillus fermentum, NCIMB 41636, Lactobacillus plantarum NCIMB 41638 ja Lactobacillus rhamnosus NCIMB 41640 joukosta, ja - prosessoidaan yhdestä tai useammasta saadusta viljelmästä, 0,5-20 p-% vähintään yhtä prebioottia ja 40-95 p-% kalsiumin lähdettä ilmaistuna CaC03:na 5 lopullisen valmisteen kuivapainosta, sekä valinnaisesti muista koiran ulosteesta, koiran suolistosta tai suoliston fluideista eristetyistä Lactobacillus-sukmin, Pediococcus-sukuun tai Weissella-sukmm kuuluvista maitohappoa tuottavista bakteerikannoista, apuaineista ja kantajista homogeeninen valmiste.

13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ensim mäinen määrä prebioottia sisällytetään koiran ulosteesta, koiran suolistosta tai suoliston fluideista eristetyn maitohappoa tuottavan bakteerikannan viljelyalastaan, saadut viljelmät valinnaisesti yhdistetään ja pestään, lyofilisoidaan ja sekoitetaan myöhemmin kalsiumin lähteeseen ja valinnaisesti toiseen määrään 15 prebioottia.

14. Patenttivaatimuksen 12 tai 13 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että menetelmä lisäksi käsittää vaiheen, jossa koiran ulosteesta, koiran suolistosta tai suoliston fluideista eristetyistä maitohappoa tuottavista bakteerikannoista, 20 kalsiumin lähteestä ja yhdestä tai useammasta prebiootista sekä valinnaisesti muista koiran ulosteesta, koiran suolistosta tai suoliston fluideista eristetyistä maitohappoa tuottavista bakteerikannoista, täyteaineista ja kantajista 1—— formuloidaan suun kautta annosteltavia formulaatioita, jotka ovat jauheiden, cm rakeiden, pillerien, tablettien, kapselien, pastillien, vedellä tai muulla sopivalla i o 25 kantajalla nestemäiseen muotoon saatettavien kuivien tuotteiden, vesipohjaisten ^ tai öljypohjaisten suspensioiden, geelien, tahnojen, emulsioiden tai siirappien g muodossa, tai niistä formuloidaan yhdessä koiranruuan ainesosien kanssa cd tuoreruuaksi, makkaroiksi, pakasteruuaksi, kuiviksi ruokapelleteiksi, nappuloiksi, S palasiksi, purkkiruuaksi, tahnoiksi, puolivalmisteiksi, maittavuutta parantaviksi o o 30 kastikkeiksi, kekseiksi, pureskeltaviksi välipaloiksi, herkuiksi, pennulle tarkoitetuksi maidon korvikkeeksi tai fermentoiduiksi tuotteiksi.

15. Probioottisen valmisteen käyttö koiran maha-suolistokanavassa esiintyvien häiriöiden estämiseksi ja hoitamiseksi, joka probioottinen valmiste muodostuu - vähintään kahdesta Lactobacillus-sukmin kuuluvasta koiran ulosteesta, koiran suolistosta tai suoliston fluideista eristetystä maitohappoa tuottavasta 5 bakteerikannasta, jotka on valittu bakteerikantojen Lactobacillus fermentum NCIMB 41636, Lactobacillus plantarum NCIMB 41638 ja Lactobacillus rhamnosus NCIMB 41640 joukosta, - 40-95 p-% kalsiumin lähdettä ilmaistuna CaCC>3:na valmisteen kuivapainosta ja - 0,5-20 p-% vähintään yhtä prebioottia, 10 valinnaisesti yhdessä muiden koiran ulosteesta, koiran suolistosta tai suoliston fluideista eristettyjen Lactobacillus-sukuun, Pediococcus-sukuun tai Weissella-sukuun kuuluvia maitohappoa tuottavien bakteerikantojen, apuaineiden ja kantajien kanssa farmaseuttisen tuotteen valmistamiseksi tai koiranruuan ainesosien kanssa koiranruokatuotteen valmistamiseksi, edullisesti tuoreruoaksi, 15 makkaroiksi, pakasteruuaksi, kuiviksi ruokapelleteiksi, nappuloiksi, palasiksi, purkkiruuaksi, tahnoiksi, puolivalmisteiksi, maittavuutta parantaviksi kastikkeiksi, kekseiksi, pureskeltaviksi välipaloiksi, herkuiksi, pennulle tarkoitetuksi maidon korvikkeeksi tai fermentoiduiksi tuotteiksi. δ CM 05 O LO X cc CL CD CO 00 LO 05 O O CM