ES2792106T3 - Métodos y grupos - Google Patents

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ES2792106T3 ES13725429T ES13725429T ES2792106T3 ES 2792106 T3 ES2792106 T3 ES 2792106T3 ES 13725429 T ES13725429 T ES 13725429T ES 13725429 T ES13725429 T ES 13725429T ES 2792106 T3 ES2792106 T3 ES 2792106T3
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Trevor D Lawley
Simon Clare
Gordon Dougan
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Genome Research Ltd
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Abstract

Un método para la identificación de cepas aisladas bacterianas adecuadas para su uso en bacterioterapia, comprendiendo el método: (i) preparar una suspensión de material recogido de un hospedador que alberga microbiota, en donde el material recogido del hospedador es material fecal del receptor previsto de la bacterioterapia antes de la necesidad de bacterioterapia o de un donante sano; (ii) adición de un activador de esporas bacterianas suficiente para permitir el crecimiento de bacterias de esporas presentes en la suspensión, en donde el activador comprende un derivado de colato; (iii) cultivar la suspensión de material; y (iv) identificación de un grupo de especies bacterianas en donde las cepas aisladas individuales identificadas en la suspensión cultivada resultante se evalúan en combinaciones para identificar subconjuntos de las cepas aisladas bacterianas para su uso en, o adecuados para su uso en, bacterioterapia administrando el grupo de cepas aisladas a un modelo de ratón y midiendo un desplazamiento en la microbiota de receptores a una composición similar a la de una microbiota sana en donde el subconjunto comprende 3 a 6 cepas aisladas de bacterias.

Description

DESCRIPCIÓN
Métodos y grupos
Campo técnico
La divulgación se refiere a métodos y grupos de cepas aisladas bacterianas relevantes para bacterioterapia. En particular, la divulgación se refiere a métodos de identificación de cepas aisladas bacterianas adecuada para bacterioterapia, a cepas aisladas bacterianas identificadas por dichos métodos y al uso de dichas cepas aisladas bacterianas en bacterioterapia.
Antecedentes
Clostridium difficile, una bacteria Gram-positiva anaerobia, es una causa importante de diarrea asociada a antibióticos y supone un reto para las medidas de control de infecciones sanitarias produciendo esporas altamente infecciosas y resistentes. El tratamiento con antibióticos, la edad avanzada y la hospitalización son los principales factores de riesgo para la colonización por C. difficile, que conduce a un espectro de desenlaces que varían desde estado de diseminador asintomático, diarrea grave, colitis pseudomembranosa o incluso muerte. Los actuales tratamientos de primera línea para la enfermedad por C. difficile son vancomicina o metronidazol, aunque en 20-35 % de estos casos la enfermedad recurrente (recaída o reinfección) sigue al cese de la terapia con antibióticos. La enfermedad recurrente por C. difficile está asociada con un desequilibrio patológico dentro de la comunidad microbiana intestinal residente, o "disbiosis", por lo que las terapias que restauran una microbiota sana se consideran alternativas prometedoras. La enfermedad recurrente por Clostridium difficile en seres humanos está asociada con un desequilibrio patológico dentro de la microbiota intestinal residente, denominada disbiosis.
Se ha investigado la bacterioterapia fecal, la administración de heces homogeneizadas de un donante sano, como una terapia alternativa para la enfermedad recurrente por C. difficile en seres humanos. Sin embargo, el mecanismo de bacterioterapia usando flora fecal y mezcla probiótica específica en las heces que son de uso en bacterioterapia ha sido poco claro hasta la fecha.
Sumario
En un primer aspecto, la invención proporciona un método para la identificación de cepas aisladas bacterianas adecuadas para su uso en bacterioterapia, comprendiendo el método:
(i) preparar una suspensión de material recogido de un hospedador que alberga microbiota, en donde el material recogido del hospedador es material fecal del receptor previsto de la bacterioterapia antes de la necesidad de bacterioterapia o de un donante sano;
(ii) adición de un activador de esporas bacterianas suficiente para permitir el crecimiento de bacterias de esporas presentes en la suspensión, en donde el activador comprende un derivado de colato;
(iii) cultivar la suspensión de material; y
(iv) identificación de un grupo de especies bacterianas dentro del cultivo, en donde las cepas aisladas individuales identificadas en la suspensión cultivada resultante se evalúan en combinaciones para identificar subconjuntos de las cepas aisladas bacterianas para su uso en, o adecuadas para su uso en, bacterioterapia administrando el grupo de cepas aisladas a un modelo de ratón y midiendo un desplazamiento en la microbiota de receptores a una composición similar a la de una microbiota sana en donde el subconjunto comprende 3 a 6 cepas aisladas de bacterias.
En un segundo aspecto, la invención proporciona un grupo de cepas aisladas bacterianas obtenible o identificable según el método anterior para su uso en el tratamiento de un estado disbiótico, en donde el grupo de cepas aisladas bacterianas comprende una secuencia de ADN que codifica ARN 16S que tiene SEQ ID NO.13, SEQ ID NO.14, SEQ ID NO 15. SEQ ID NO.16, SEQ ID NO.17 y SEQ ID NO.18.
Los presentes inventores también desvelan un método de preparación de material fecal adecuado para bacterioterapia o un método de identificación de cepas aisladas bacterianas adecuado para su uso en bacterioterapia, comprendiendo el método preparar una suspensión de material fecal, seguido por incubación de la suspensión en un cultivo en reposo en condiciones anaerobias o aerobias.
Los presentes inventores también desvelan un método de preparación de material adecuado para su uso en bacterioterapia, comprendiendo el método:
(i) preparar una suspensión de material fecal;
(ii) adición de un activador de esporas bacterianas suficiente para permitir el crecimiento de bacterias de esporas presentes en la suspensión; y
(iii) cultivar la suspensión.
Los presentes inventores también desvelan un grupo de cepas aisladas bacterianas obtenible o identificable según el método desvelado para su uso en bacterioterapia.
Los presentes inventores también desvelan el uso de un grupo de cepas aisladas bacterianas obtenible o identificable según el método desvelado en la fabricación de un medicamento para proporcionar bacterioterapia.
Los presentes inventores también desvelan material fecal cultivado para su uso en bacterioterapia, y/o para la identificación de cepas bacterianas adecuadas para su uso en bacterioterapia, en donde la bacterioterapia es para facilitar la repoblación del intestino y/o la prevención o el tratamiento de enfermedades asociadas a infecciones o la microbiota, o enfermedades relacionadas con ella, y/o la prevención de la transmisión de infección. En una realización, la infección es una infección bacteriana. En una realización, la infección es una infección viral. En una realización, la infección es infección por C. difficile.
Los presentes inventores también desvelan un subconjunto de bacterias obtenible o identificable de material fecal para su uso en facilitar la repoblación del intestino y/o en la prevención o el tratamiento de infecciones bacterianas o virales, disfunción asociada a la microbiota o enfermedades relacionadas con ella y/o en la prevención de la transmisión de infección bacteriana o viral, en donde el subconjunto comprende 3 a 9, opcionalmente no más de 6, cepas aisladas de bacterias.
Los presentes inventores también desvelan el uso de 3 a 9, opcionalmente no más de 6, cepas aisladas bacterianas en la preparación de un medicamento para facilitar la repoblación del intestino y/o en la prevención o el tratamiento de infecciones bacterianas o virales, disfunción asociada a la microbiota o enfermedades relacionadas con ella y/o en la prevención de la transmisión de infección bacteriana o viral.
Los presentes inventores también desvelan una composición que comprende o que consiste esencialmente en un grupo de cepas aisladas bacterianas según cualquiera de los aspectos previos. La composición es adecuada para proporcionar bacterioterapia.
Los presentes inventores también desvelan un método para proporcionar bacterioterapia, comprendiendo el método suministrar a un animal humano o no humano un grupo de cepas aisladas bacterianas según cualquiera de los aspectos previos.
Las características preferidas se pueden combinar según convenga, como sería evidente para un experto, y se pueden combinar con cualquiera de los aspectos de la divulgación.
Breve descripción de los dibujos
Las realizaciones de la divulgación se describirán, a modo de ejemplo, con referencia a los siguientes dibujos, en los que:
Figura 1. C. difficile 027/BI epidémico induce un estado de superdiseminador persistente con transmisibilidad potenciada en comparación con otras variantes virulentas.
Figura 2. La bacterioterapia fecal resuelve la enfermedad recidivante por C. difficile 027/BI-7 y el carácter contagioso del hospedador.
Figura 3. La bacterioterapia eficaz restablece un perfil sano de diversa microbiota en ratones superdiseminadores de C. difficile 027/BI epidémico.
Figura 4. Filogenia del genoma completo (máxima probabilidad) de bacterias intestinales que demuestran la colocación filogenética de bacterias protectoras de bacterioterapia (Mezcla B) y los miembros dominantes de la microbiota de superdiseminadores.
Figura 5. Producción de toxina A por C. difficile 027/BI-7, 012/630 y 017/M68.
Figura 6. Los superdiseminadores de C. difficile son altamente contagiosos.
Figura 7. C. difficile 027/BI-7 epidémico induce disbiosis intestinal en ratones.
Figura 8. Impacto de diversos tratamientos por vía oral sobre el estado de superdiseminador de C. difficile 027/BI epidémico en ratones.
Figura 9. Distintas estructuras de la comunidad de microbiota intestinal de ratones sanos/intactos (n=17), superdiseminadores de clindamicina (ratones infectados por C. difficile 027/BI-7 que toman clindamicina; n=10) y superdiseminadores persistentes (ratones infectados por C. difficile 027/BI-7 que no toman clindamicina; n=17) Figura 10. Patógenos oportunistas rutinariamente cultivados de las heces de ratones superdiseminadores de C. difficile 027/BI epidémico.
Figura 11. La bacterioterapia fecal suprime la colonización intestinal por C. difficile y diversifica la comunidad bacteriana intestinal de ratones superdiseminadores.
Figura 12. Derivados fecales simplificados enriquecidos en componentes fácilmente cultivables suprimen eficazmente el estado de superdiseminador epidémico de C. difficile 027/BI en ratones.
Figura 13. Curvas de rarefacción que demuestran la diversidad bacteriana observada de heces de ratones intactos sanos y sus derivados sometidos a sucesivos pases.
Descripción detallada
Los presentes inventores también desvelan métodos de identificación de cepas aisladas bacterianas deseables adecuadas para bacterioterapia. Los presentes inventores también desvelan métodos de preparación de material fecal adecuado para bacterioterapia.
En un aspecto, el método puede comprender las etapas de preparar una suspensión de material recogido de un hospedador que alberga microbiota, añadir un activador de esporas bacterianas suficiente para permitir el crecimiento de bacterias de esporas presentes en la suspensión y cultivar la suspensión. La suspensión se puede cultivar en condiciones aerobias o anaerobias. La suspensión cultivada se puede incubar en un cultivo en reposo en condiciones aerobias o anaerobias. En una realización, el cultivo en reposo está en condiciones aerobias.
En un aspecto, el método puede comprender las etapas de preparación de una suspensión de material seguido por la incubación de la suspensión en un cultivo en reposo en condiciones aerobias o anaerobias. En una realización, el cultivo en reposo está en condiciones aerobias. Se puede añadir a la suspensión un activador de esporas bacterianas suficiente para permitir el crecimiento de bacterias de esporas antes de que la suspensión se incube en un cultivo en reposo en condiciones aerobias.
Los presentes inventores también desvelan métodos de identificación de cepas bacterianas adecuadas para su uso en bacterioterapia que comprenden las etapas de cualquiera de los aspectos previos y que comprenden la etapa adicional de identificación de al menos una, preferentemente un grupo de, cepas aisladas bacterianas dentro del cultivo.
Los presentes inventores también desvelan un método de preparación de material que comprende cepas aisladas bacterianas deseables, comprendiendo el método preparar una suspensión de material recogido de un hospedador que alberga microbiota, tal como material fecal, diluir el material en PBS estéril; sembrar en placas de agar nutriente; añadir medios de cultivo anaerobios y un activador de esporas bacterianas suficiente para permitir el crecimiento de bacterias de esporas presentes en la suspensión y cultivar o aerobia o anaerobiamente a una temperatura adecuada, tal como aproximadamente 37 °C, durante 24-72 horas. Se pueden aislar distintos tipos de colonias y purificar el cultivo.
En una realización, el material que se cultiva se somete a sucesivos pases y se selecciona el material preparado después del 1° o 2° pase para su uso en los métodos según la divulgación. El material recogido de un hospedador que alberga microbiota, tal como heces sanas, se puede someter a pases durante la noche en caldo nutriente a una temperatura adecuada, tal como aproximadamente 37 °C, para reducir la complejidad de la comunidad bacteriana y para enriquecer en bacterias fácilmente cultivables.
En una realización, los métodos de preparación de identificación según la divulgación incluyen la incubación de la suspensión en un cultivo en reposo en condiciones aerobias para proporcionar los microbios con un gradiente de oxígeno.
En una realización, los medios de cultivo usados durante el cultivo de la suspensión en los métodos de preparación de identificación según la divulgación pueden ser medios de cultivo anaerobios.
En una realización, se pueden identificar cepas aisladas bacterianas según cualquier aspecto previo a partir de dicho material preparado aislando ADN genómico de las distintas colonias y haciendo un perfil a nivel de especie de la microbiota intestinal. El perfil a nivel de especie puede ser la secuenciación de genes específicos, tales como el gen ARNr 16S, y compara con las bases de datos GenBank y RDP para identificar las especies bacterianas. También se puede llevar a cabo la secuenciación del genoma completo y el análisis filogenético de bacterias intestinales para identificar genes comunes entre las cepas aisladas de interés. Se puede medir la diversidad de especies en cada muestra calculando el índice de diversidad de Shannon (tal como se describe en P. D. Schloss et al. referenciado en la sección de ejemplos).
En un aspecto, la cepa aislada bacteriana comprende una secuencia de ADN que codifica ARNr 16S que es una de las 6 siguientes secuencias, o que tiene homología o identidad con una de las 6 siguientes secuencias, adecuadamente a un nivel superior a 85 %, tal como superior a 86 %, superior a 87 %, superior a 88 %, superior a 89 %, superior a 90 %, superior a 91 %, superior a 92 %, superior a 93 %, superior a 94 %, superior a 95 %, superior a 96 %, superior a 97 %, superior a 98 %, superior a 99 % o más, en la secuencia.
Los presentes inventores también desvelan una cepa aislada bacteriana que comprende una secuencia de ADN que codifica ARNr 16S que tiene la secuencia de secuencia SEQ ID Nos. 1,2 o 6 a continuación.
SEQ ID N o . : 1 ,
1318 p b (97 % c o n A d l e r c r e u t z i a e q u o l i f a c i e n s )
ACGGGTGAGT AACACGTGAC CAACCTGCCC CGCGCTCCGG GACÁCCGCTG GAAACGGCGG
c t a a t a c c g g ATACTCCGGG a g g g c c c c a t g g c c c tg c c g g g a a a g c c g a gacg g cg cg g
GATGGGGTCG CGGCCCATTA GGTAGACGGC GGGGTAACGG CCCACCGTGC CCGCGATGGG
TAGCCGGACT GAGAGGTCGA CCGGCCACAT TGGGACTGAG ATACGGCCCA GACTCCTACG
GGAGGCAGCA GTGGGGAATT TTGCGCAATG GGGGGAACCC TGACGCAGCA ACGCCGCGTG
CGGGACGAAG GCCCTCGGGT TGTAAACCGC TTTCAGCAGG GAAGATCCAA GACGGTACCT
GCAGAAGAAG CTCCGGCTAA CTACGTGCCA GCAGCCGCGG TAATACGTAG GGGGCGAGCG
TTATCCGGAT TCATTGGGCG TAAAGCGCGC GTAGGCGGCC GCCTAAGCGG GACCTCTAAC
CCCGGGGCTC AACCCCGGGC CGGGTCCCGG ACTGGGCGGC TCGAGTGCGG TAGAGGAGAG
CGGAATTCCC GGTGTAGCGG TGGAATGCGC AGATATCGGG AAGAACACCG ATGGCGAAGG
CAGCTCTCTG GGCCGTCACT GACGCTGAGG CGCGAAAGCT GGGGGAGCGA ACAGGATTAG
ATACCCTGGT AGTCCCAGCC GTAAACGATG GGCGCTAGGT GTGGGGGGAC GATCCCTCCG
TGCCGCAGCC AACGCATTAA GCGCCCCGCC TGGGGAGTAC GGCCGCAAGG CTAAAACTCA
AAGGAATTGA CGGGGGCCCG CACAAGCAGC GGAGCATGTG GCTTAATTCG AAGCAACGCG
AAGAACCTTA CCAGGGCTTG ACATGCCGAT GAAGCCGGGG AGACCCGGTG GCCGAGAGGA
GTCGGCGCAG GTGGTGCATG GCTGTCGTCA GCTCGTGTCG TGAGATGTTG GGTTAAGTCC
CGCAACGAGC GCAACCCCCG CCCCGTGTTG CCAGCATTCA GTTGGGGACT CGCGGGGGAC
TGCCGGCGTC AAGCCGGAGG AAGGTGGGGA CGACGTCAAG TCATCATGCC CCTTATGCCC
TGGGCTGCAC ACGTGCTACA ATGGCCGGTA CAGAGGGTTG CCACCCCGCG AGGGGGAGCG
GATCCCGGAA AGCCGGTCCC AGTTCGGATC GCAGGCTGCA ACCCGCCTGC GTGAAGCCGG
AGTTGCTAGT AATCGCGGAT CAGCACGCCG CGGTGAATAC GTTCCCGGGC CTTGTACACA
CCGCCCGTCA CACCACCCGA GTCGTCTGCA CCCGAAGCCG CCGGCCGAAC CCCCGGGG
S e c u e n c ia 2
1292 p b (98 % c o n A n a e r o s t ip e s c a c c a e )
AGTGGCGGAC GGGTGAGTAA CGCGTGGGGA ACCTGCCCTA TACAGGGGGA TAACAGCTGG
AAACGGCTGC TAATACCGCA TAAGCGCACA GAATCGCATG ATTCGGTGTG AAAAGCTCCG
GCAGTATAGG ATGGTCCCGC GTCTGATTAG CTGGTTGGCG GGGTAACGGC CCACCAAGGC
GACGATCAGT AGCCGGCTTG AGAGAGTGGA CGGCCACATT GGGACTGAGA CACGGCCCAA
ACTCCTACGG GAGGCAGCAG TGGGGAATAT TGCACAATGG GGGAAACCCT GATGCAGCGA
CGCCGCGTGA GTGAAGAAGT ATTTCGGTAT GTAAAGCTCT ATCAGCAGGG AAGAAAAAAG
ACGGTACCTG ACTAAGAAGC CCCGGCTAAC TACGTGCCAG CAGCCGCGGT AATACGTAGG
GGGCAAGCGT TATCCGGAAT TACTGGGTGT AAAGGGTGCG TAGGTGGCAT GGTAAGTCAG
AAGTGAAAGC CCGGGGCTTA ACCCCGGGAC TGCTTTTGAA ACTGTCATGC TGGAGTGCAG
GAGAGGTAAG CGGAATTCCT AGTGTAGCGG TGAAATGCGT AGATATTAGG AGGAACACCA
GTGGCGAAGG CGGCTTACTG GACTGTCACT GACACTGATG CACGAAAGCG TGGGGAGCAA
ACAGGATTAG ATACCCTGGT AGTCCACGCC GTAAACGATG AATACTAGGT GTCGGGGCCG
TAGAGGCTTC GGTGCCGCAG CAAACGCAGT AAGTATTCCA CCTGGGGAGT ACGTTCGCAA
GAATGAAACT CAAAGGAATT GACGGGGACC CGCACAAGCG GTGGAGCATG TGGTTTAATT
CGAAGCAACG CGAAGAACCT TACCTGGTCT TGACATCTAA CTGACCGGTT CGTAATGGGA
CCTTTCCTTC GGGACAGTTA AGACAGGTGG TGCATGGTTG TCGTCAGCTC GTGTCGTGAG
ATGTTGGGTT AAGTCCCGCA ACGAGCGCAA CCCCTATCTT TAGTAGCCAG CATATAAGGT
GGGCACTCTA GAGAGACTGC CAGGGATAAC CTGGAGGAAG GTGGGGACGA CGTCAAATCA
TCATGCCCCT TATGGCCAGG GCTACACACG TGCTACAATG GCGTAAACAA AGGGAAGCGA
AGTCGTGAGG CGAAGCAAAT CCCAGAAATA ACGTCTCAGT TCGGATTGTA GTCTGCAACT
CGACTACATG AAGCTGGAAT CGCTAGTAAT CGTGAATCAG AATGTCACGG TGAATACGTT
CCCGGGTCTT GTACACACCG CCCGTCACAC CA
S e c u e n c ia 3
[1324 p b , 100 % c o n S ta p h y lo c o c c u s w a r n e r i ]
AGCGGCGGAC GGGTGAGTAA CACGTGGATA ACCTACCTAT AAGACTGGGA TAACTTCGGG
AAACCGGAGC TAATACCGGA TAACATATTG AACCGCATGG TTCAATAGTG AAAGGCGGCT
TTGCTGTCAC TTATAGATGG ATCCGCGCCG TATTAGCTAG TTGGTAAGGT AACGGCTTAC
CAAGGCAACG ATACGTAGCC GACCTGAGAG GGTGATCGGC CACACTGGAA CTGAGACACG
GTCCAGACTC CTACGGGAGG CAGCAGTAGG GAATCTTCCG CAATGGGCGA AAGCCTGACG
GAGCAACGCC GCGTGAGTGA TGAAGGTCTT CGGATCGTAA AACTCTGTTA TCAGGGAAGA
ACAAATGTGT AAGTAACTGT GCACATCTTG ACGGTACCTG ATCAGAAAGC CACGGCTAAC
TACGTGCCAG CAGCCGCGGT AATACGTAGG TGGCAAGCGT TATCCGGAAT TATTGGGCGT
AAAGCGCGCG TAGGCGGTTT TTTAAGTCTG ATGTGAAAGC CCACGGCTCA ACCGTGGAGG
GTCATTGGAA ACTGGAAAAC TTGAGTGCAG AAGAGGAAAG TGGAATTCCA TGTGTAGCGG
TGAAATGCGC AGAGATATGG AGGAACACCA GTGGCGAAGG CGACTTTCTG GTCTGTAACT
GACGCTGATG TGCGAAAGCG TGGGGATCAA ACAGGATTAG ATACCCTGGT AGTCCACGCC
GTAAACGATG AGTGCTAAGT GTTAGGGGGT TTCCGCCCCT TAGTGCTGCA GCTAACGCAT
TAAGCACTCC GCCTGGGGAG TACGACCGCA AGGTTGAAAC TCAAAGGAAT TGACGGGGAC CCGCACAAGC GGTGGAGCAT GTGGTTTAAT TCGAAGCAAC GCGAAGAACC TTACCAAATC TTGACATCCT TTGACCGCTC TAGAGATAGA GTCTTCCCCT TCGGGGGACA AAGTGACAGG TGGTGCATGG TTGTCGTCAG CTCGTGTCGT GAGATGTTGG GTTAAGTCCC GCAACGAGCG CAACCCTTAA GCTTAGTTGC CATCATTAAG TTGGGCACTC TAAGTTGACT GCCGGTGACA AACCGGAGGA AGGTGGGGAT GACGTCAAAT CATCATGCCC C TTATG A TTT GGGCTACACA CGTGCTACAA TGGACAATAC AAAGGGCAGC TAAACCGCGA GGTCAAGCAA ATCCCATAAA GTTGTTCTCA GTTCGGATTG TAGTCTGCAA CTCGACTACA TGAAGCTGGA ATCGCTAGTA ATCGTAGATC AGCATGCTAC GGTGAATACG TTCCCGGGTC TTGTACACAC CGCCCGTCAC ACCA
S e c u e n c ia 4
1323 p b , 100 % c o n L a c t o b a c i l l u s r e u t e r i
AGTGGCGGAC GGGTGAGTAA CACGTAGGTA ACCTGCCCCG GAGCGGGGGA TAACATTTGG AAACAGATGC TAATACCGCA TAACAACAAA AGCCACATGG C TTTTG TTTG AAAGATGGCT TTGGCTATCA CTCTGGGATG GACCTGCGGT GCATTAGCTA GTTGGTAAGG TAACGGCTTA CCAAGGGGAT GATGCATAGC CGAGTTGAGA GACTGATCGG CCACAATGGA ACTGAGACAC GGTCCATACT CCTACGGGAG GCAGCAGTAG GGAATCTTCC ACAATGGGCG CAAGCCTGAT GGAGCAACAC CGCGTGAGTG AAGAAGGGTT TCGGCTCGTA AAGCTCTGTT GTTGGAGAAG AACGTGCGTG AGAGTAACTG TTCACGCAGT GACGGTATCC AACCAGAAAG TCACGGCTAA CTACGTGCCA GCAGCCGCGG TAATACGTAG GTGGCAAGCG TTATCCGGAT TTATTGGGCG TAAAGCGAGC GCAGGCGGTT GCTTAGGTCT GATGTGAAAG CCTTCGGCTT AACCGAAGAA GTGCATCGGA AACCGGGCGA CTTGAGTGCA GAAGAGGACA GTGGAACTCC ATGTGTAGCG GTGGAATGCG TAGATATATG GAAGAACACC AGTGGCGAAG GCGGCTGTCT GGTCTGCAAC TGACGCTGAG GCTCGAAAGC ATGGGTAGCG AACAGGATTA GATACCCTGG TAGTCCATGC CGTAAACGAT GAGTGCTAGG TGTTGGAGGG TTTCCGCCCT TCAGTGCCGG AGCTAACGCA TTAAGCACTC CGCCTGGGGA GTACGACCGC AAGGTTGAAA CTCAAAGGAA TTGACGGGGG CCCGCACAAG CGGTGGAGCA TGTGGTTTAA TTCGAAGCTA CGCGAAGAAC CTTACCAGGT CTTGACATCT TGCGCTAACC TTAGAGATAA GGCGTTCCCT TCGGGGACGC AATGACAGGT GGTGCATGGT CGTCGTCAGC TCGTGTCGTG AGATGTTGGG TTAAGTCCCG CAACGAGCGC AACCCTTGTT ACTAGTTGCC AGCATTAAGT TGGGCACTCT AGTGAGACTG CCGGTGACAA ACCGGAGGAA GGTGGGGACG ACGTCAGATC ATCATGCCCC TTATGACCTG GGCTACACAC GTGCTACAAT GGACGGTACA ACGAGTCGCA AGCTCGCGAG AGTAAGCTAA TCTCTTAAAG CCGTTCTCAG TTCGGACTGT AGGCTGCAAC TCGCCTACAC GAAGTCGGAA TCGCTAGTAA TCGCGGATCA GCATGCCGCG GTGAATACGT TCCCGGGCCT TGTACACACC GCCCGTCACA CCA S e c u e n c ia 5
1323 p b , 100 % c o n E n te r o c o c c u s h i r a e
AGTGGCGAAC GGGTGAGTAA CACGTGGGTA ACCTGCCCAT CAGAAGGGGA TAACACTTGG
AAACAGGTGC TAATACCGTA TAACAATCGA AACCGCATGG TTTC G ATTTG AAAGGCGCTT
TCGGGTGTCG CTGATGGATG GACCCGCGGT GCATTAGCTA GTTGGTGAGG TAACGGCTCA
CCAAGGCGAC GATGCATAGC CGACCTGAGA GGGTGATCGG CCACATTGGG ACTGAGACAC
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S e c u e n c ia 6
1308 p b (87 % c o n B a r n e s i e l l a i n t e s t i n i h o m i n i s )
ACCGGCGCAC GGGTGAGTAA CACGTATGCA ACCTGCCCTC TTCAGGGGGA CAACCTTCCG
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En una realización, las cepas aisladas individuales identificadas en la suspensión cultivada resultante se evalúan en combinaciones para identificar subconjuntos de la suspensión cultivada para su uso en, o adecuadas para su uso en, bacterioterapia. La idoneidad de una cepa aislada bacteriana para bacterioterapia se puede evaluar por administración de las cepas aisladas o grupos de cepas aisladas al receptor y midiendo un desplazamiento en la microbiota de receptores a una composición similar a la de una microbiota sana. El desplazamiento en la microbiota de receptores se asocia con el aumento en la diversidad de especies que se pueden medir calculando el índice de diversidad de Shannon descrito en los ejemplos más adelante.
En una realización, las cepas aisladas bacterianas adecuadas para bacterioterapia según cualquier aspecto previo se pueden identificar por evaluación in vivo, por ejemplo en un modelo animal, tal como un modelo de ratón.
En una realización, las cepas aisladas bacterianas adecuadas para bacterioterapia según cualquier aspecto previo se pueden identificar por evaluación del tracto UTI. Dichas cepas aisladas identificadas se pueden secuenciar como se describe en el presente documento para determinar la especiación y la posición filogenética.
En una realización, las cepas aisladas bacterianas se identifican inicialmente según un método descrito anteriormente, mientras que las cepas aisladas reales usadas para bacterioterapia son cepas aisladas previamente caracterizadas de las cepas aisladas identificadas. Las cepas aisladas previamente caracterizadas se pueden obtener de un banco biológico de bacterias previamente identificadas evaluadas para ser adecuadas para bacterioterapia usando los procedimientos descritos en el presente documento. La restauración de una microbiota sana con bacterioterapia se visualiza como un tratamiento alternativo prometedor para enfermedad recurrente por C. difficile y otras formas de disbiosis intestinal, pero no se usa ampliamente debido al tiempo requerido para identificar un donante adecuado, el riesgo de introducir patógenos oportunistas, así como una aversión general del paciente. Los inventores han demostrado que también es posible erradicar la enfermedad por C. difficile y el carácter contagioso usando una mezcla simple de componentes definidos cultivables de la microbiota.
El material recogido de un hospedador puede ser material fecal o material obtenido por biopsia o muestreo del intestino del hospedador. El material puede ser del receptor previsto de la bacterioterapia antes de la necesidad de bacterioterapia o de un donante sano. El donante puede ser un cónyuge o un miembro de la familia más cercana del receptor de la bacterioterapia. Un donante sano con el fin de la presente divulgación es un individuo que no padece una infección, tal como infección por C. difficile, dando como resultado una disminución de la heterogeneidad de flora intestinal.
En una realización, la suspensión preparada se administra al receptor o se usa para la identificación de cepas bacterianas en el plazo de 10 minutos a 2 horas después de la preparación. En una realización, la suspensión preparada se administra o se usa en el plazo de aproximadamente 30 minutos después de la preparación. En una realización, no deben haber transcurrido más de 6 horas entre la recogida de material y la administración al receptor o identificación de cepas bacterianas.
En una realización, la suspensión cultivada o subconjunto de la misma comprende una bacteria formadora de esporas.
La adición de un activador de esporas bacterianas suficiente para permitir el crecimiento de bacterias de esporas es una realización de los métodos según la divulgación. El activador puede ser un derivado de colato o puede comprender uno o más derivados de colato, tales como taurocolato y/o glucocolato. En una realización, el activador puede comprender un derivado de colato, tal como taurocolato, y glicina.
Se espera que un activador de esporas bacterianas estimule las esporas metabólicamente durmientes para empezar el crecimiento. Por tanto, la adición de un activador de esporas bacterianas al medio aumenta la probabilidad de aislar dichas bacterias de cultivo exigente de la muestra.
Los presentes inventores también desvelan un grupo de cepas aisladas bacterianas adecuadas para bacterioterapia obtenibles o identificables por el método de cualquiera de los aspectos previamente descritos.
El grupo puede comprender 3, 4, 5,6, 7, 8 o 9 cepas aisladas bacterianas. En una realización, el grupo comprende 4, 5 o 6 cepas aisladas bacterianas. En una realización, el grupo comprende 6 cepas aisladas bacterianas. En una realización, el grupo comprende no más de 6 cepas bacterianas. En una realización, el grupo comprende al menos 4 cepas bacterianas.
El grupo de cepas aisladas bacterianas puede comprender una o más de las siguientes: Barnesiella intestinihominis, Lactobacillus reuteri, Enterococcus hirae/faecium/durans, Anaerostipes caccae/Clostridium indolis, Staphylococcus warneri/pasteuri, Adiercreutzia equolifaciens, Anaerostipes caccae/Clostridium indolis, Staphylococcus warneri/pasteuriy Barnesiella intestinihominis. En una realización, el grupo de cepas aisladas bacterianas comprende Barnesiella intestinihominis, Lactobacillus reuteri, Enterococcus hirae/faecium/durans, Anaerostipes caccae/Clostridium indolis y Staphylococcus warneri/pasteuri. En una realización, el grupo de cepas aisladas bacterianas comprende Staphylococcus warneri, Enterococcus hirae, Lactobacillus reuteri, Anaerostipes sp., Bacteroidetes sp. y Enterorhabdus sp. En una realización, el grupo de cepas aisladas bacterianas comprende o consiste en 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9, tal como 5 o 6, de estas cepas aisladas. En una realización, el grupo de cepas aisladas bacterianas comprende o consiste en 4, 5 o 6 cepas aisladas e incluye Enterococcus hirae, Lactobacillus reuteri y Bacteroidetes sp. En una realización el grupo de cepas aisladas bacterianas comprende o consiste en 4, 5 o 6 cepas aisladas e incluye miembros de los filos Firmicutes y Bacteroidetes opcionalmente con miembros de los filos Actinobacteria y Proteobacteria.
Los presentes inventores también desvelan una composición que comprende o que consiste esencialmente en un grupo de cepas aisladas bacterianas según cualquiera de los aspectos previos. La composición es adecuada para proporcionar bacterioterapia.
En un aspecto, el grupo de cepas aisladas bacterianas o composición como se desvela para su uso en bacterioterapia.
Los presentes inventores también desvelan un subconjunto de bacterias obtenible o identificable de material fecal para su uso en bacterioterapia en donde el subconjunto comprende 3 a 9, tal como 4 a 6, tal como no más de 6, cepas aisladas de bacterias.
Los presentes inventores también desvelan un método para proporcionar bacterioterapia, comprendiendo el método suministrar a un animal humano o no humano un grupo de cepas aisladas bacterianas o una composición según cualquier aspecto de la divulgación.
Los presentes inventores también desvelan el uso de un grupo de cepas aisladas bacterianas según la divulgación en la fabricación de un medicamento para proporcionar bacterioterapia. En una realización, no se usan más de 6 cepas bacterianas en la preparación del medicamento.
Los presentes inventores también desvelan material fecal aeróbicamente cultivado para su uso en bacterioterapia, y/o para la identificación de cepas aisladas bacterianas adecuadas para su uso en bacterioterapia.
Bacterioterapia se refiere al uso de una mezcla de bacterias para resolver un desequilibrio patológico dentro de la microbiota de un individuo. La mezcla puede ser una mezcla de bacterias vivas obtenida de una fuente externa (otro cultivo humano, animal, in vitro, etc.). En el contexto de la presente divulgación, la bacterioterapia también se puede referir a aumentar la diversidad de especies de la flora colónica introduciendo flora bacteriana sana en un receptor. Flora bacteriana sana se refiere a flora intestinal heterogénea tal como la presente en un individuo que no padece una infección bacteriana, tal como infección por C. difficile, dando como resultado la reducida heterogeneidad de la flora intestinal. La bacterioterapia puede ser para facilitar la repoblación del intestino con flora bacteriana sana y/o para prevenir o tratar infecciones bacterianas o virales, o enfermedades relacionadas con ella, y/o para prevenir la transmisión de infección bacteriana o viral.
La bacterioterapia puede ser para la prevención o el tratamiento de cualquier trastorno influido por la microbiota, tal como trastornos intestinales. En una realización, la bacterioterapia puede ser para el tratamiento de una infección bacteriana por C. difficile o la prevención de la transmisión de C. difficile. En una realización, la bacterioterapia puede ser para el tratamiento de síndromes por C. difficile tales como diarrea recurrente, colitis, colitis pseudomembranosa. La bacterioterapia puede ser para el tratamiento de enfermedades intestinales tales como enfermedad inflamatoria del intestino o síndrome del intestino irritable. Además, se puede usar bacterioterapia para tratar la obesidad. Debido a que la microbiota intestinal en individuos obesos es diferente de individuos no obesos, y debido a que la microbiota intestinal influye en el metabolismo de la energía, desplazar la microbiota intestinal de un individuo obeso con la microbiota intestinal de un individuo no obeso. En una realización, la bacterioterapia puede ser para restaurar la flora intestinal alterada por el tratamiento con antibióticos.
Como tal, el grupo de cepas aisladas bacterianas, medicamentos o composiciones según la divulgación puede ser para su uso en bacterioterapia terapéutica o preventiva (por ejemplo, para tratar un estado disbiótico o promover el mantenimiento de una microbiota sana). Por ejemplo, para su uso en el tratamiento o la prevención de diarrea recurrente, colitis, colitis pseudomembranosa; colitis ulcerosa; reservoritis; diarrea inducida por antibióticos; infección viral; obesidad; enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad de Crohn o síndrome del intestino irritable, opcionalmente donde el tratamiento es de un síndrome por C. difficile que provoca o está asociado con el trastorno.
Las cepas aisladas bacterianas, medicamentos o composiciones según la divulgación se pueden administrar por medio de una cápsula gastrorresistente (por ejemplo, biorresistente a los ácidos para llegar al tubo digestivo, que tiene un exterior estéril), tubo entérico, tubo duodenal, tubo nasogástrico o colonoscopio. Las cápsulas se pueden preparar por técnicas tales como la microencapsulación descrita en la patente de EE. UU. N° 5.733.568.
Se pueden aplicar tratamientos o procesos específicos para mejorar la estabilidad o viabilidad de las cepas aisladas bacterianas en la composición. Las cepas aisladas bacterianas se pueden aplicar en una forma seca o en una forma húmeda. Las cepas aisladas bacterianas se pueden liofilizar.
Las composiciones pueden comprender una dosis que se demuestra que tiene un efecto fisiológico, tal como entre 104 y 1011 unidades formadoras de colonias (UFC) por g de la composición seca. En una realización, la composición comprende entre 106 y 5 x 1011 UFC/g.
Las cepas aisladas bacterianas o medicamentos según la divulgación se pueden proporcionar a una dosis de 1 -50 g/día, tal como 5, 10, 15, 20 o 25 g/día.
La bacterioterapia según la divulgación se puede combinar con otros tratamientos. El otro tratamiento puede incluir tratamiento con antibióticos, tales como con antimicrobianos que incluyen metronidazol, vancomicina o rifamicina, y tratamiento con inmunoglobulinas. En un ejemplo, la bacterioterapia para tratar C. difficile o una o varias de otras enfermedades o aflicciones del tubo digestivo se puede proporcionar usando una combinación de antibióticos y/o antiácidos y repoblación de una flora bacteriana sana o deseada.
En un aspecto, se puede crear un kit de partes para ayudar en los métodos de la divulgación. El kit de donación puede incluir equipo para la recogida de material del hospedador. Debido a que gran parte de la microbiota intestinal es anaerobia, muchos organismos pueden morir con la exposición al aire. En un ejemplo, el kit puede incluir materiales para transportar el material recogido sin dañar las muestras (por ejemplo, congelación rápida, nieve carbónica, etc.). El kit puede incluir el material procesado o tratamiento en un recipiente estéril, tal como un tubo nasogástrico (NG), un vial (por ejemplo, para su uso con un enema de retención), una cápsula gastrorresistente (por ejemplo, biorresistente a ácidos para llegar al tubo digestivo, que tiene un exterior estéril), etc.
Los receptores de la bacterioterapia pueden ser animales humanos o no humanos.
Se entenderá que los aspectos y realizaciones particulares descritos en el presente documento se muestran a modo de ilustración y no como limitaciones de la invención. Las principales características de la presente invención se pueden emplear en diversas realizaciones sin apartarse del alcance de la invención. Los expertos en la técnica reconocerán, o serán capaces de determinar usando no más que estudio rutinario, numerosos equivalentes a los procedimientos específicos descritos en el presente documento. Se considera que dichos equivalentes están dentro del alcance de la presente invención y se cubren por las reivindicaciones. Todas las publicaciones y solicitudes de patente mencionadas en la memoria descriptiva son indicativas del nivel de habilidad de los expertos en la técnica a la que se refiere la presente invención. El uso de la palabra "un" o "una", cuando se usa junto con el término "que comprende" en las reivindicaciones y/o la memoria descriptiva, puede significar "uno", pero también está de acuerdo con el significado de "uno o más", "al menos uno" y "uno o más de uno". El uso del término "o" en las reivindicaciones se usa para significar "y/o", a menos que se indique explícitamente, para referirse a alternativas solo o las alternativas sean mutuamente excluyentes, aunque la divulgación soporte una definición que se refiere a solo alternativas y "y/o". En toda la presente solicitud, el término "aproximadamente" se usa para indicar que un valor incluye la variación inherente de error para el dispositivo, siendo el método empleado para determinar el valor, o la variación que existe entre los sujetos del estudio.
Como se usa en esta memoria descriptiva y la(s) reivindicación (reivindicaciones), las palabras "comprender" (y cualquier forma de comprender, tal como "comprenden" y "comprende"), "tener" (y cualquier forma de tener, tal como "tienen" y "tiene"), "incluir" (y cualquier forma de incluir, tal como "incluye" e "incluyen") o "contener" (y cualquier forma de contener, tal como "contiene" y "contienen") son incluyentes o de extremos abiertos y no excluyen elementos adicionales no citados o etapas de método. En un aspecto, dichos términos de extremos abiertos también comprenden dentro de su alcance una definición restringida o cerrada, por ejemplo, tal como "que consiste esencialmente en" o "que consiste en". El término "o combinaciones de los mismos", como se usa en el presente documento, se refiere a todas las permutaciones y combinaciones de los artículos enumerados que preceden al término. Por ejemplo, "A, B, C o combinaciones de los mismos pretende incluir al menos uno de: A, B, C, AB, AC, BC, o ABC, y si el orden es importante en un contexto particular, también BA, CA, CB, CBA, BCA, ACB, BAC, o CAB. Continuando con este ejemplo, se incluyen explícitamente combinaciones que contienen repeticiones de uno o más artículos o términos, tal como BB, AAA, AB, b Bc , AAABCCCC, CBBAAA, Ca BABB, y demás. El experto entenderá que normalmente no existe límite en el número de artículos o términos en ninguna combinación, a menos que sea de otro modo evidente del contexto
La presente divulgación se describe además como referencia a los siguientes ejemplos, que no limitan la presente divulgación.
Ejemplo
Diseño racional de una bacterioterapia simple definida que cura enfermedad por Olostrídium diffieile
SUMARIO
La enfermedad recurrente por Clostridium difficile en seres humanos está asociada con un desequilibrio patológico dentro de la microbiota intestinal residente, denominada disbiosis. Los presentes inventores muestran que la infección de ratones con C. difficile epidémico (genotipo 027/BI) produjo enfermedad intestinal crónica que se asoció a disbiosis persistente y a un estado altamente contagioso. La infección por C. difficile 027/BI epidémico fue resistente al tratamiento con vancomicina, dando como resultado enfermedad recurrente. A diferencia, el tratamiento de ratones infectados por C. difficile 027/BI con heces de ratones sanos erradicó rápidamente C. difficile, restaurando una microbiota sana variada, que conduce a la resolución de la enfermedad y el carácter contagioso. Los presentes inventores usaron este modelo para diseñar una mezcla simple de seis bacterias intestinales filogenéticamente variadas, que incluyen novedosas especies, que pueden restablecer una microbiota asociada a la salud y erradicar C. difficile 027/BI de ratones infectados tan eficazmente como trasplantes fecales completos. Así, los presentes inventores demuestran un enfoque racional para aprovechar el potencial terapéutico de las comunidades microbianas asociadas a la salud y para refinar los tratamientos basados en bacterioterapia para enfermedad por C. difficile y posiblemente otras formas de disbiosis intestinal.
Durante la última década, emergió una variante genética distinta de C. difficile, genotipificada como el ribotipo 027 por PCR o el grupo BI de REA, y causó epidemia asociada a la salud en América del Norte, Europa, Australia y más allá (7, 8). C. difficile 027/BI epidémico está asociado con la producción de toxinas de alto nivel (9) (Figura 5), enfermedad grave y altas tasas de reaparición (10, 11). Aquí, los presentes inventores muestran que la infección de ratones C57BL/6 con una cepa aislada 027/BI (cepa BI-7) representativa de C. difficile epidémico (8) produjo enfermedad crónica intestinal que se caracterizó por una respuesta inflamatoria patológica (Figura 1a y Figura 6). Los ratones infectados por C. difficile 027/BI también se caracterizaron por un estado altamente contagioso (>108 UFC de C. difficile/gramo de heces), al que los presentes inventores se refieren como un estado de "superdiseminador persistente", que duró meses (Figura 1b). En comparación, la infección de ratones con otras variantes de C. difficile virulento humano, que incluye ribotipos 012 (cepa 630) y 017 (cepa M68) de PCR (8), produjo enfermedad intestinal autolimitante y un estado contagioso transitorio (Figura 1b) (12, 13). De hecho, el alojar juntos ratones infectados con C. difficile 027/BI-7, 017/M68 o 012/630 junto con ratones intactos durante 30 días produjo que la mayoría (86 %) de los ratones intactos se infectaran con C. difficile 027/BI-7 epidémico (Figura 1c). Por tanto, la capacidad de C. difficile 027/BI-7 epidémico para inducir enfermedad intestinal crónica y un estado de superdiseminador persistente proporciona una ventaja competitiva con respecto a otras variantes dentro de una población de hospedadores susceptibles.
El tratamiento con vancomicina de superdiseminadores persistentes a C. difficile 027/BI suprimió rápidamente la excreción de C. difficile hasta por debajo del límite de detección del cultivo (Figura 2a), como era de esperar debido a que C. difficile 027/BI-7 es susceptible a vancomicina. Sin embargo, el cese del tratamiento con vancomicina fue seguido en el plazo de 5-7 días por una recaída (por la misma cepa) hasta la diseminación de alto nivel de C. difficile (>108 UFC/gramo) en todos los ratones (n=120) (Figura 2a). La recaída ocurrió incluso después de que los ratones se movieran a jaulas estériles individuales para reducir la transmisión de hospedador a hospedador y la recolonización por esporas medioambientales. El estado de superdiseminador recidivante provocado por C. difficile 027/BI fue muy fuerte puesto que ocurrió en ratones de diferentes acervo genético (Figura 7; Tabla 1). Así, los presentes inventores muestran por primera vez que la infección natural de ratones con C. difficile 027/BI epidémico imita muchos aspectos de la enfermedad recurrente y la transmisión de hospedador a hospedador observada en seres humanos.
Se ha investigado la bacterioterapia fecal, la administración de heces homogeneizadas de un donante sano, como una terapia alternativa para enfermedad recurrente por C. difficile en seres humanos (6, 14). Por tanto, los presentes inventores probaron la capacidad de la bacterioterapia fecal para suprimir el estado de superdiseminador de C. difficile 027/BI en ratones. Un único tratamiento por vía oral de ratones superdiseminadores de C. difficile 027/BI-7 con heces homogeneizadas de un donante sano suprimió rápida (4-7 días) y fuertemente (23 de 25 intentos) los niveles de diseminación de C. difficile hasta por debajo de los límites de detección del cultivo y, a diferencia de la terapia con vancomicina, esto duró durante meses (Figura 2a). En comparación, el tratamiento de superdiseminadores con PBS, heces esterilizadas en autoclave, filtrado fecal, ácidos grasos de cadena corta o E. coli de laboratorio tuvieron un efecto despreciable sobre los niveles de diseminación de C. difficile (Figura 8). Y, lo que es más importante, la supresión de los niveles de diseminación de C. difficile usando heces de ratones sanos se asoció coherentemente a una pérdida completa del carácter contagioso (Figura 2b), una resolución de patología intestinal y una expresión reducida de genes proinflamatorios (Figura 2c).
Los presentes inventores supusieron que el estado de superdiseminador persistente provocado por C. difficile027/BI-7 estaba asociado a disbiosis intestinal, que se resuelve por bacterias asociadas con la salud presentes dentro de trasplantes fecales. Por tanto, los presentes inventores realizaron el perfilado a nivel de especie de la microbiota intestinal de ratones (basado en el gen ARNr 16S) y demostraron que los distintos perfiles de microbiota están de hecho asociados a o ratones "sanos/intactos", "superdiseminadores persistentes", o a ratones que se someten a "tratamiento con clindamicina" (Figura 3a). La microbiota de ratones sanos se caracterizó por alta diversidad de especies (Figura 7), mientras que durante el tratamiento con clindamicina de ratones intactos la microbiota se simplificó en la composición y tuvo un aumento de abundancia proporcional de grupos tales como Enterobacteriaceae (Figuras 7 y 9). La microbiota de superdiseminadores persistentes de C. difficile 027/BI-7 también se simplificó en estructura (Figura 7 y 9), sin embargo, contuvo coherentemente secuencias del gen ARNr 16S derivadas de C. difficile y Blautia producta y generó regularmente secuencias del gen ARNr 16S representativas de patógenos oportunistas bien conocidos que se han identificado dentro de la microbiota de seres humanos con enfermedad de C. difficile (4, 15), que incluyen Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Proteus mirabilis, Parabacteroides distasonis y Enterococcus faecalis (Tabla 1 y Figura 7 y 9 y 10). Además, el perfil metabólico derivado de la microbiota de ratones superdiseminadores persistentes se alteró significativamente en comparación con el de ratones sanos (Figura 7b). Significativamente, los presentes inventores pudieron trasplantar reproduciblemente la microbiota de superdiseminador en ratones libres de gérmenes y se mantuvo la estructura de microbiota del superdiseminador, que conduce a patología intestinal y a un estado altamente contagioso (datos no mostrados), Por tanto, los superdiseminadores de C. difficile 027/BI albergan una microbiota intestinal estable, persistente y disbiótica.
A continuación, los presentes inventores monitorizaron cambios en la microbiota de superdiseminadores después de la bacterioterapia fecal. La supresión de los niveles de diseminación de C. difficile se asoció a un desplazamiento en la microbiota de superdiseminador del receptor hacia una composición similar a la de una microbiota sana (Figura 3a) y esto se asoció estrechamente a un rápido aumento en la diversidad de especies (Figura 11 y 12). Por consiguiente, los presentes inventores dedujeron que existen bacterias clave dentro de la microbiota de ratones sanos que son responsables de suprimir el estado de superdiseminador de C. difficile 027/BI. Para identificar bacterias candidatas, los presentes inventores sometieron a pases heces sanas durante la noche en caldo nutriente a 37 °C para reducir la complejidad de la comunidad (Figura 13) y para enriquecer fácilmente las bacterias cultivables. El tratamiento de ratones superdiseminadores con derivados fecales cultivados sometidos dos veces a pases sucesivos (Pase 1 y 2) suprimió eficazmente el estado de superdiseminador (Figura 12) y desplazó su composición de microbiota hacia un perfil de microbiota sano (Figura 3a). Sin embargo, un tercer pase (Pase 3) produjo una pérdida de los efectos protectores del derivado fecal frente al estado de superdiseminador de C. difficile 027/BI. Estos resultados confirman la presencia de bacterias cultivables dentro de la microbiota de ratones sanos que pueden suprimir la infección por C. difficile 027/BI tan eficazmente como la bacterioterapia fecal completa.
A continuación, los presentes inventores cultivaron una colección diferente de 18 especies bacterianas del derivado fecal de Pase 1, que incluyó representantes de los cuatro filos que constituyen la mayoría de la microbiota intestinal de mamífero (Firmicutes, Bacteroidetes, Actinobacteria y Proteobacteria; Tabla 2). Entonces, los presentes inventores realizaron una serie de experimentos de análisis reductores en ratones superdiseminadores persistentes que probaron diferentes combinaciones de bacterias mientras que maximizaron la diversidad filogenética en cada mezcla (mezclas resumidas en la Tabla 2). Por último lugar, los presentes inventores identificaron una mezcla definida simple de seis bacterias que suprimieron eficaz y reproduciblemente (20/20 ratones) el estado de superdiseminador de C. difficile 027/BI ("Mezcla B"; Figura 3b). Significativamente, el tratamiento de superdiseminadores con las bacterias de Mezcla B desplazó la microbiota intestinal de los receptores al perfil de un perfil sano (Figura 3a) y desencadenó un aumento en la diversidad bacteriana que se asoció a la resolución de enfermedad intestinal y carácter contagioso (Figura 3c). El análisis de las secuencias del gen ARNr 16S derivadas de ratones tratados confirmó la presencia de cuatro de las seis bacterias de la Mezcla B en las heces durante los días 6-14 después del tratamiento (Tabla 1). Sin embargo, gran parte del aumento de la diversidad derivó de bacterias comensales que estaban todavía presentes a bajos niveles pre-tratamiento (Tabla 1), sugiriendo que las bacterias de la Mezcla B habían alterado la colonización por C. difficile 027/BI y los otros miembros de la microbiota de superdiseminadores, desencadenando una expansión de las bacterias suprimidas asociadas a la salud y una redistribución de la microbiota a una composición sana.
Los derivados de colato (es decir, taurocolato y glucocolato) estimulan metabólicamente las esporas durmientes para empezar el crecimiento. Por tanto, la adición de derivados de colato al medio aumenta la probabilidad de aislar dichas bacterias de cultivo exigente de la muestra. Esto es cómo los presentes inventores identificaron una de las seis bacterias de la Mezcla B (Anaerostipes).
Significativamente, y a diferencia de los resultados con la Mezcla B, el tratamiento de ratones superdiseminadores de C. difficile 027/BI con subdivisiones adicionales de esta mezcla bacteriana, que incluyen las bacterias de la Mezcla B administradas individualmente, o mezclas que contienen seis o siete de otras cepas bacterianas cultivadas, tuvieron un impacto despreciable sobre el estado de superdiseminador (Figura 3b). Para ilustrar adicionalmente la eficacia particular de la recogida de Mezcla B de cepas de los presentes inventores, el tratamiento de superdiseminadores con una mezcla de Bacteroides/Lactobacillus, representativa de grupos bacterianos probióticos más tradicionales ( 16, 17), dejó de resolver el estado de superdiseminador y restaurar la microbiota de receptores a un perfil sano (Figura 3a y Figura 12). Así, los presentes inventores definieron racionalmente una simple mezcla novedosa que consistía en seis cepas bacterianas intestinales fácilmente cultivables que puede curar la infección por C. difficile 027/BI en ratones.
Para entender mejor la composición genética y definir completamente la identidad de las seis cepas bacterianas presentes en la Mezcla B (Tabla 2), los presentes inventores secuenciaron sus genomas (y sus especies derivadas de humano equivalentes más próximas) y realizaron una comparación filogenética con los genomas bacterianos intestinales de referencia representativos de la microbiota de mamífero (Figura 4 y Tabla 4). Basándose en este análisis, los presentes inventores determinaron que la Mezcla B incluye tres especies previamente descritas, Staphylococcus warneri, Enterococcus hirae, Lactobacillus reuteri y tres especies novedosas, Anaerostipes sp. nov., Bacteroidetes sp. nov. y Enterorhabdus sp. nov. (Tabla 2). Esta mezcla de bacterias es, por tanto, filogenéticamente diversa, que incluye tanto las especies anaerobias estrictas como facultativas, y representa tres de los cuatro filos de microbiota intestinal predominante. Y, lo que es más importante, ninguna de estas especies se conoce por ser expresamente patógena, parecen ser habitantes comunes del intestino de ratón en sanos y son filogenéticamente distintas de los miembros dominantes de la microbiota de superdiseminadores (Figura 4). Dada la ineficacia demostrada de las heces esterilizadas en autoclave, filtrados fecales, SFCAs y cepas bacterianas individuales parece, por tanto, que el desplazamiento de C. difficile y la microbiota de superdiseminador puede requerir la rivalidad de un conjunto filogenéticamente diverso y fisiológicamente distinto de bacterias vivas.
En conclusión, los presentes inventores demuestran que C. difficile 027/BI epidémico puede ser mejor que las bacterias asociadas a la salud para potenciar el periodo contagioso del hospedador, aumentando su probabilidad de infectar un hospedador susceptible. La restauración de una microbiota sana con bacterioterapia se visualiza como un tratamiento alternativo prometedor para enfermedad recurrente de C. difficile y otras formas de disbiosis intestinal (6, 14), pero no se usa ampliamente debido al tiempo requerido para identificar un donante adecuado, el riesgo de introducir patógenos oportunistas, así como una aversión general de los pacientes (18). Por primera vez, los presentes inventores demuestran que también es posible erradicar la enfermedad por C. difficile y el carácter contagioso usando una simple mezcla de componentes definidos cultivables de la microbiota. Así, los resultados de los presentes inventores posibilitan aprovechar racionalmente el potencial terapéutico de las comunidades microbianas asociadas a la salud para tratar enfermedad recurrente por C. difficile y la transmisión en seres humanos, y posiblemente otras formas de disbiosis asociada a la enfermedad.
Figura 1. C. d iffic ile 027/BI epidémico induce un estado de superdiseminador persistente con transm isibilidad potenciada en comparación con otras variantes virulentas. a) i-ii) tinción con hematoxilina y eosina para comparar la patología cecal de i) ratones sanos tratados con clindamicina con ii) superdiseminadores persistentes de C. difficile 027/BI-7 (día 49 después de la infección; C57BL/6) que muestran signos de hiperplasia, edema y filtrado de células inmunitarias. Las barras de escala representan 100 pm. b) Patrones representativos de diseminación fecal de ratones C57BL/6 (n=5 ratones por grupo) tratados simultáneamente con clindamicina y expuestos a esporas de C. difficile virulentas humanas para imitar la transmisión natural. Los ratones se infectaron con el ribotipo 027 de C. difficile (cepa BI-7; n= 300), 017 (cepa M68; n=240) y 012 (cepa 630; n=50). Los ratones que superdiseminan altos niveles de C. difficile (>108 UFC/gramo de heces frescas) son altamente contagiosos (i y iii), mientras que los ratones que diseminan bajos niveles de C. difficile (ii; <102 UFC/gramo de heces frescas) no son contagiosos. La línea horizontal discontinua indica el límite de detección del cultivo. En los resultados en esta figura, la línea superior en el gráfico que no se encuentra con la línea horizontal discontinua en ningún momento representa los resultados del ribotipo 027 de C. difficile. La línea central que se encuentra con la línea horizontal rota entre el día 25 y 30 en el eje X representa los resultados del ribotipo 017 de C. difficile. La línea más próxima al eje Y que se encuentra con la línea horizontal rota alrededor del día 20 en el eje X representa los resultados del ribotipo 012 de C. difficile. c) C. difficile 027/BI-7 es mejor que C. difficile 012/R y 017/CF dentro de las poblaciones de hospedadores susceptibles. Se muestra el resumen de dos experimentos independientes donde 3 ratones donantes infectados se alojaron con 7 ratones receptores intactos durante 30 días en cada experimento. La tasa de transmisión de C. difficile 027/BI-7 es significativamente diferente (p<1,1e-4) en comparación con la de C. difficile 012/630 (p<0,02) y 017/M68 (p<0,22).
Figura 2. La bacterioterapia fecal resuelve la enfermedad recidivante por C. diffie ile 027/BI-7 y el carácter contagioso del hospedador. a) Patrones de diseminación de C. difficile de ratones (promedio de 5 ratones/jaula) que demuestran que la infección por C. difficile 027/BI es resistente al tratamiento con vancomicina (van) y da como resultado un estado de superdiseminador recidivante. La bacterioterapia suprime la diseminación de altos niveles de C. difficile 027/BI-7 (marrón) mientras que la administración de PBS no tuvo impacto sobre los niveles de diseminación (negro). b) Los ratones superdiseminadores transmiten eficientemente C. difficile a ratones intactos, mientras que los ratones tratados con heces y transformados en portadores llegan a ser malos donantes de infección a ratones intactos. La eficiencia de transmisión se refiere al porcentaje de ratones receptores intactos (n=10/grupo) que llegaron a infectarse con C. difficile 027/BI-7. c) RT-PCR cuantitativa de ARN extraído de tejido cecal de ratones superdiseminadores que muestran la expresión de alto nivel de los genes proinflamatorios IL-6, iNOS y Ly6G, que se suprimieron hasta niveles comparables a los de los ratones intactos después de la bacterioterapia. Se normalizó la expresión de citocinas a Gapdh y se muestra como valores relativos.
Figura 3. La bacterioterapia eficaz restablece un perfil sano de microbiota variada en ratones superdiseminadores de C. d iffic ile 027/BI epidémico. a) El análisis de los principales componentes de las secuencias del gen ARNr 16S demuestra que distintos perfiles de microbiota (circulados) están asociados con ratones "sanos/intactos", ratones que se someten a "tratamiento con clindamicina" y "superdiseminadores persistentes" de C. difficile 027/BI-7. PC1 y PC2 representan 38 % de la variación. Cada símbolo representa una comunidad de microbiota (punto) o tratamiento (estrella). El tratamiento de ratones superdiseminadores con heces de ratones sanos, el derivado fecal cultivado o las mezclas de bacterias cultivadas definidas son como se indica: marrón - diseminación para heces sanas, azul - diseminación para cultivo de derivados fecales sometidos a pases una vez, verde -diseminación para mezcla de seis bacterias supresoras (Mezcla B) y gris - diseminación para mezcla de Bacteroides/Lactobacillus. El símbolo que representa el tratamiento con Bacteroides/Lactobacillus se basa en cultivar recuentos y se modifica para reflejar la abundancia relativa de cada organismo en la mezcla. A continuación de la diseminación: pre=pre-tratamiento; 3=3 días después del tratamiento; 4=4 días después del tratamiento; 6=6 días después del tratamiento; 14=14 días después del tratamiento. Las flechas de fondo gris indican los desplazamientos en los perfiles de microbiota de ratones tratados durante un periodo de 14 días. b) Perfiles de diseminación fecal de ratones superdiseminadores (n=5/grupo) que se trataron con Mezcla A, Mezcla B o Mezcla C (Tabla 2). En los resultados en esta figura, la línea superior en el gráfico representa los resultados de la Mezcla C; la línea central en el gráfico representa los resultados de la Mezcla A; la línea más próxima al eje Y que se encuentra con la línea horizontal discontinua en aproximadamente el día 15 representa los resultados de la Mezcla B. c) Índices de diversidad de Shannon de la microbiota intestinal de superdiseminadores antes y después del tratamiento (día 3, 6 y 14) con Mezcla B y los de la comunidad de entrada correspondiente.
Figura 4. Filogenia del genoma completo (máxima probabilidad) de bacterias intestinales que demuestran la colocación filogenética de las bacterias protectoras de la bacterioterapia (Mezcla B) y los miembros dominantes de la microbiota superdiseminadora. Se produjo filogenia de máxima probabilidad usando FastTree a partir de la secuencia concatenada de proteínas de 44 genes comunes (véanse los métodos). Los nombres de especies marcados en verde indican miembros de la mezcla supresora Mezcla B, los nombres marcados en rojo indican especies que fueron comúnmente detectadas en las heces de ratones superdiseminadores, los nombres en negro son genomas de referencia de bacterias intestinales comunes que se incluyeron para proporcionar el contexto filogenético al árbol. Las designaciones taxonómicas se dan en los nodos de ramas relevantes. Las imágenes adyacentes son las micrografías electrónicas de transmisión de cepas bacterianas seccionadas que constituyen la Mezcla B. Se han descrito métodos de procesamiento de muestras y obtención de imágenes (13). Se muestran barras de escala debajo de las bacterias.
REFERENCIAS
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Figura 5. Producción de toxina A por C. d iffic ile 027/BI-7, 012/630 y 017/M68. C. difficile 027/BI produjo TcdA a 200,3 ng/gL, C. difficile 630/012 produjo TcdA a 21,5 ng/gL y C. difficile M68/017 no produjo TcdA. Los datos son de 3 experimentos independientes con determinantes triplicados en cada uno.
Figura 6. Los superdiseminadores de C. d iffic ile son altamente contagiosos. Se alojaron ratones donantes (de la Figura 1) infectados con la variante de C. difficile indicada durante 1 hora en jaulas estériles sin lecho y luego se retiraron las heces y se dejaron las jaulas durante la noche de manera que solo permaneció la contaminación por esporas. Al día siguiente se dispusieron asépticamente ratones receptores intactos en jaulas durante 1 hora y luego se sacaron asépticamente y se alojaron individualmente en jaulas estériles y se les dio clindamicina en su agua para beber. Después de 4 días se muestrearon los ratones receptores para determinar si se infectaron con C. difficile. La eficiencia de transmisión representa el porcentaje de ratones receptores que llegaron a infectarse con C. difficile. Los experimentos se repitieron al menos dos veces e incluyeron 10 ratones receptores por experimento. n.d = no determinado
Figura 7. C. d iffic ile 027/BI-7 epidémico induce disbiosis intestinal en ratones. a) Análisis de secuencias del gen ARNr 16S derivadas de heces de ratones intactos (n=17), portadores de C. difficile (n=5; 35-49 días después de la infección), ratones que se someten a tratamiento con clindamicina (n=12), ratones recuperados del tratamiento con clindamicina (n=4; 42 días después del cese del tratamiento) y superdiseminadores persistentes de C. difficile 027/BI-7 (n=15; 35-49 días después de la infección). SD=superdiseminador; por=portador; recup clin=ratones tratados con clindamicina durante 7 días y luego muestreados 42 días después; intactos clin=ratones intactos tratados con clindamicina durante 7 días antes del muestreo; 027 clin (017 clin)=ratones infectados con C. difficile 027/BI-7 (017/M68) y tratados con clindamicina durante 7 días antes del muestreo. También se muestra el genotipo de ratón (C57BL/6, C3H/HeN y C3H/HeJ). b) Perfiles de ácidos grasos de cadena corta fecales de ratones C57BL/6 intactos, ratones C57BL/6 tratados con clindamicina, ratones que no se expusieron a C. difficile 027/BI-7 y así se dejó que se recuperara su microbiota y ratones C57BL/6 superdiseminadores de C. difficile 027/BI-7 (n=5 ratones/grupo).
Figura 8. Impacto de diversos tratamientos por vía oral sobre el estado superdiseminador de C. d iffic ile 027/BI epidémico en ratones. Perfil de diseminación fecal de ratones superdiseminadores (n=5/grupo) que se trataron con heces o derivados fecales. Los tratamientos estándar con a) heces y b) PBS son los mismos que en la Figura 2. Se administraron los siguientes tratamientos en ratones superdiseminadores por sonda nasogástrica oral con un volumen de 200 gL. c) Se esterilizaron en autoclave heces equivalentes usando condiciones estándar y luego se resuspendieron en PBS estéril para una concentración final de 100 mg/mL. d) Para producir filtrado fecal, se homogeneizaron heces en PBS estéril a una concentración de 100 mg/mL y luego se centrifugaron a 14.000 rpm durante 10 minutos para separar las bacterias/materia en partículas de la fracción soluble que entonces se filtró a través de un filtro de 0,22 pm. Esto se denominó el filtrado fecal. e) SCFA indica una mezcla de acetato:propionato:butirato en una relación 6:1:2 a una concentración de 100 mM que estaba a pH 6,5. f) Se alimentó por sonda nasogástrica a ratones la cepa C600 de E. coli adaptada en laboratorio (resistente a ácido nalidíxico) a una dosis de 108 UFC. Se confirmó la colonización de E. coli cultivando heces de ratones superdiseminadores. La línea horizontal discontinua indica el límite de detección.
Figura 9. Distintas estructuras de la comunidad de microbiota intestinal de ratones sanos/intactos (n=17), superdiseminadores de clindamicina (ratones infectados con C. diffie ile 027/BI-7 que tomaron clindamicina; n=10) y superdiseminadores persistentes (ratones infectados con C. diffie ile 027/BI-7 con que no tomaron clindamicina; n=17). a) Representación que ilustra el porcentaje de clones del gen ARNr 16S de C. diffieile en bibliotecas de ratones sanos/intactos (n=4.926 clones), superdiseminadores de clindamicina (n=4.433 clones) y superdiseminadores persistentes (n=2.956 clones). b) Comparación de SDI para la microbiota intestinal de ratones sanos/intactos, superdiseminadores de clindamicina y superdiseminadores persistentes. Se usó la prueba de Wilcoxon para datos independientes para comparar diferencias entre grupos.
Figura 10. Patógenos oportunistas rutinariamente cultivados de las heces de ratones superdiseminadores de C. diffie ile 027/BI epidémico. Se identificaron bacterias como se describe en la sección de métodos y se muestran aquí cultivadas en línea sobre una placa de agar de diagnóstico de UTI (Oxoid, Cambridge, R. U.).
Figura 11. La bacterioterapia fecal suprime la colonización intestinal por C. diffie ile y diversifica la comunidad bacteriana intestinal de ratones superdiseminadores. a) Se suprime rápidamente el nivel de excreción de C. diffieile después de la inoculación por vía oral de ratones superdiseminadores con heces homogeneizadas de un ratón sano (heces de entrada). La línea roja mostrada en el gráfico representa los niveles de diseminación promedio de 5 ratones y las barras de error indican la desviación estándar. La flecha vertical negra indica el día 58 cuando se administraron las heces sanas y las puntas de flecha verdes indican los tiempos cuando se extrajo ADN fecal durante el análisis del gen ARNr 16S. b) La composición de la comunidad bacteriana intestinal de ratones superdiseminadores (n=2) se desplaza para reflejar la del ratón donante sano después de la bacterioterapia. c) La diversidad de microbiota intestinal de ratones superdiseminadores aumenta después de la bacterioterapia como se indica por un aumento en las puntuaciones del índice de diversidad de Shannon.
Figura 12. Derivados fecales simplificados enriquecidos en componentes fácilmente cultivables suprimen eficazmente el estado superdiseminador de C. diffie ile 027/BI epidémico en ratones. a) Perfiles de diseminación fecal de ratones superdiseminadores (n=5/grupo) que se trataron con heces sanas, una mezcla de Bacteroides/Lactobacillus (Bacteroides acidifaciens, Bacteroides vulgatus, Lactobacillus murinus y Lactobacillus reuteri), heces cultivadas en caldo anaerobio de Wilkins-Chalgren a 37 °C bien aerobia o anaerobiamente. Los gráficos de sectores ilustran la composición de los tratamientos de entrada basándose en bibliotecas de clones del gen ARNr 16S para heces sanas, entradas sometidas a pases aerobios y sometidas a pases anaerobios o basadas en cultivo para la mezcla de Bacteroides/Lactobacillus. b) Índices de diversidad de Shannon de la microbiota intestinal de superdiseminadores antes y después del tratamiento (día 3, 4, 6 y 14) y los de la comunidad de entrada correspondiente.
Figura 13. Curvas de rarefacción que demuestran la diversidad bacteriana observada de heces de ratones intactos sanos y sus derivados sucesivamente sometidos a pases. Además, la calculadora Chao1 estimó la diversidad total de comunidades (OTU definida a >98 % de similitud) para las heces sanas como 142 filotipos (intervalo de confianza del 95 % 105-225), pase 1 como 30 filotipos (intervalo de confianza del 95 % 27-46), pase 2 como 6 filotipos (intervalo de confianza del 95 % 5-18) y pase 3 como 4 filotipos (intervalo de confianza del 95 % 4-4). Juntos, estos resultados demuestran que los pases sucesivos de heces sanas en caldo nutriente redujeron progresivamente la complejidad de la comunidad de bacterias.
MÉTODOS
Cultivo bacteriano. Se han descrito cepas BI-7 de C. difficile (genotipo 027/BI; clindamicinaR, tianfenicolR, eritromicinaS), M68 (genotipo 017/CF; clindamicinaR, tianfenicolS, eritromicinaS) y 630 (genotipo 012/R; clindamicinaR, tianfenicolS, eritromicinaS (1, 2). Se describió previamente el cultivo de C. difficile para infecciones y de heces (1). Para aislar las bacterias intestinales de heces de ratón o derivados fecales sometidos a pases, las muestras se diluyeron sucesivamente en PBS estéril, se sembraron en placa sobre un panel de placas con agar nutriente; Luria Bertani, infusión de cerebro-corazón, Man Rogosa Sharpe, medios anaerobios de cultivo exigente, medio base Columbia complementado con 10 % de sangre de caballo desfibrinada, medio anaerobio de Wilkins-Chalgren (todos los medios de Becton, Dickinson, Oxford, R. U.) y cultivados bien aerobia o anaerobiamente a 37 °C durante 24-72 horas. Se aislaron distintos tipos de colonias, se cultivaron en cultivo y se aisló ADN genómico para secuenciar el gen ARNr 16S usando cebadores de amplio intervalo como se describe en la sección de microbiota más adelante. Se compararon las secuencias del gen ARNr 16S con las bases de datos GenBank y RDP para identificar las especies bacterianas.
ELISA de TcdA. Se cultivaron cultivos de C. difficile en caldo de Wilson (1) con agitación durante 30 h, se sedimentaron por centrifugación y se retiró el sobrenadante para cuantificación por TcdA. Se recubrieron placas de microtitulación (96 pocilios) con anticuerpo de captura añadiendo 50 pL/pocillo de una disolución de 2 pg/mL de anti-TcdA (TGCBiomics GmbH, Mainz, Alemania) en PBS, e incubando durante la noche a 42C. Entonces se lavaron tres veces las placas en 0,05 % de Tween20 en PBS (PBS-T) y se bloquearon con 200 pL de 1 % de BSA (albúmina de suero bovino) en PBS durante 2 h a temperatura ambiente. Se diluyó TcdA purificado de la cepa VPI10463 de C. difficile (TGCBiomics GmbH, Mainz, Alemania) en 1 % de BSA-PBS (50 pL/pocillo) y se usó para construir una curva patrón. Se diluyeron los filtrados de cultivo como antes para generar lecturas dentro del intervalo lineal de la curva patrón. Entonces se incubaron las placas a temperatura ambiente durante 2 h, seguido por lavado en PBS-T como antes. El anticuerpo de detección (toxina A de conejo anti-Clostridium difficile; antibodies-online GmbH, Aachen, Alemania) se diluyó 1:5000 en 1 % de BSA-PBS, se añadió a pocillos (50 pL/pocillo) y se incubó durante 2 h a temperatura ambiente. Después de lavar, se diluyó IgG policlonal de cerdo anti-conejo conjugada con peroxidasa de rábano picante (Dako, Cambridgeshire, R. U.) 1:1000 en 1 % de BSA-PBS, se añadió a los pocillos (50 pL/pocillo) y se incubó durante 2 h a temperatura ambiente. Finalmente, se lavaron las placas y se añadieron 100 pL de sustrato 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB; Sigma Aldrich, Doreset, R. U.) durante 30 min a temperatura ambiente en la oscuridad. Se añadieron 50 pL de H2SO40,5 M para detener la reacción. Entonces se midió la absorbancia a 450 nm en un FLUOStar Omega (b Mg Labtech, Bucks, R. U.).
Infecciones de ratón. Se usaron rutinariamente ratones hembra de entre 5-9 semanas de edad y del acervo genético C57BL/6, C57BL/6 p40-/-, C3H/HeN y C3H/HeJ. Se infectaron los ratones que se iban a usar como donantes de esporas de C. difficile con 105 células de C. difficile por sonda nasogástrica oral y se añadió inmediatamente clindamicina (250 mg/L; Apollo Scientific Ltd, Chesire, R. U.) al agua para beber durante 1 semana para inducir la excreción de esporas de alto nivel. Para infectar ratones experimentales, se retiró una placa de Petri de lecho contaminado de las jaulas de donantes de esporas, se dispuso en jaulas de ratones receptores y se añadió clindamicina (250 mg/L) al agua de beber agua durante 1 semana para inducir el fenotipo superdiseminador. Para infectar ratones C3H/HeN libres de gérmenes, se recogieron heces de ratones superdiseminadores, se diluyeron en PBS sucesivamente y se inocularon en ratones por sonda nasogástrica oral. Para suprimir la infección, se añadió vancomicina (300 mg/L; Sigma Aldrich, York, R. U.) al agua para beber durante 10 días. Para evaluar el impacto de la infección, se sacrificaron los ratones en los momentos indicados y se recogió asépticamente el tejido cecal y se fijó para patología como se describió (1 ), o se fijó para extracción de ARNs sumergiendo las muestras en ARN-later (Applied Biosystems, Warrington, R. U.).
Tratamiento con bacterioterapia. Para preparar la entrada para bacterioterapia, se recogió 1 gramo de heces frescas de 5 ratones intactos, se homogeneizó en 5 mL de PBS estéril y se centrifugó durante 30 segundos a 14.000 RPM para sedimentar la materia en partículas. Se recogió la suspensión de sobrenadante y se alimentaron por sonda nasogástrica 200 pL en cada ratón en el plazo de 30 minutos desde la excreción. Para crear las mezclas bacterianas definidas, se cultivaron en bacterias individuales caldo Wilkins-Chalgren (Lactobacillus en caldo Man Rogosa Sharpe) durante 48-72 horas en condiciones anaerobias a 37 °C. Se recogieron las bacterias por centrifugación y resuspensión del sedimento en 2 mL de PBS estéril previamente reducido. Se alimentaron por sonda nasogástrica aproximadamente 1010 de cada bacteria en cada ratón en un volumen de 200 pL. Para someter a pases las heces sanas, se recogieron asépticamente dos sedimentos fecales (~50 mg) y se dispusieron inmediatamente en 20 mL de caldo anaerobio Wilkins-Chalgren o caldo Luria que se calentó previamente hasta 37 °C en condiciones aerobias o anaerobias. Se rompieron físicamente los sedimentos fecales dentro del caldo usando una punta de pipeta estéril y posteriormente se incubaron dejando reposar durante 16 horas. Para los pases sucesivos, se inocularon 200 pL del derivado fecal en caldo fresco y se cultivaron como se describe. Para las inoculaciones, se sedimentaron los cultivos de 20 mL y luego se resuspendieron en 2 mL de PBS estéril previamente calentado hasta 37 °C en condiciones aerobias o anaerobias. Basándose en los recuentos visuales, se alimentaron por sonda nasogástrica aproximadamente 4 x 108 (pase anaerobio) y 8 x 108 (pase aerobio) bacterias en cada ratón en un volumen de 200 pL.
Micromatrices. Se realizó purificación de ARN de tejido de mucosa cecal usando un minikit Qiagen RNeasy (Qiagen, Austin, TX, EE. UU.) según el protocolo del fabricante. Se realizaron control de calidad y cuantificación usando Bioanalyser 2100 (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, EE. UU.) y Nanodrop ND100 (Nanodrop Technologies, Wilminton, DE). Entonces se amplificaron las muestras de ARN y se marcaron usando el kit Illumina TotalPrep 96 (Ambion, Austin, TX, EE. UU.) y se hibridaron sobre chips de perlas Illumina™ Mouse WG-6-V2 (Illumina, San Diego, CA, EE. UU.). Se barrieron los chips con un lector de matrices de perlas Illumina y se extrajeron las intensidades sin procesar usando Illumina BeadStudio Gene Expression Module.
Se realizaron la normalización y el análisis de las micromatrices usando el software GeneSpring X (Agilent Technologies, Berkshire, R. U.). Los procedimientos de normalización utilizados fueron la normalización por cuantiles y la mediana de la corrección al nivel inicial de todas las muestras. Para cada comparación, se definieron genes diferencialmente expresados por tener un cambio en veces > 2 y un valor de p corregido por FDR (tasa de falsos descubrimientos) < 0,05. Se calcularon los valores de p ajustados usando el método de Benjamini y Hochberg (3).
RT-PCR. Se realizó el análisis de expresión cuantitativa en tiempo real RT-PCR TaqMan en el sistema de detección de secuencias ABI PRISM 7900HT (Applied Biosystems, Warrington, R. U.) como se describió previamente (4). Se normalizó la expresión de IL-6, iNOS y Ly6G a ARNm de Gapdh. Se diseñaron cebadores y sondas de TaqMan para abarcar empalmes de exones o para disponer diferentes exones para prevenir la amplificación de ADN genómico, como se describió (4). Se muestran secuencias de cebadores y sondas en la Tabla 3. Las sondas se marcaron con el colorante indicador FAM en el extremo 5' y el colorante extintor TAMRA en el extremo 3'.
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Experimentos de transmisión. Se han descrito protocolos para probar el carácter contagioso de donantes infectados (superdiseminadores o portadores) (1). Para comparar el carácter contagioso de diferentes cepas de C. difficile, se alojaron juntos ratones infectados con o C. difficile 012 (cepa 630), 017 (cepa M68) y 027 (cepa BI-7) (inmediatamente después del cese de 7 días de tratamiento con clindamicina) con 7 ratones receptores intactos durante 30 días. Los experimentos se repitieron para un total de 14 ratones intactos. Para determinar si los ratones receptores se infectaron con C. difficile, se dispusieron individualmente (asépticamente) en jaulas estériles durante 3 días y se les dio clindamicina en su agua para beber durante 4 días (1). Después, se recogieron las heces de ratones individuales y se enumeró C. difficile por métodos convencionales (1). Se usaron perfiles de resistencia a antibióticos para determinar qué cepa de C. difficile tenía ratones infectados.
Análisis de microbiota. Se llevaron a cabo extracción de ADN fecal, construcción de bibliotecas de clones y secuenciación como se describió previamente (1). Las secuencias se alinearon usando el alineador RDP (5) y estos alineamientos se curaron manualmente en el paquete de ARB (6) antes del análisis adicional. De otro modo, se comprobaron las secuencias y se clasificaron como se describió previamente (7). En total, se generaron 19.991 secuencias y éstas se depositaron en GenBank (números de acceso JF241944 - JF260864 y HE605382 - HE608150).
Se midió la diversidad de especies en cada muestra calculando el índice de diversidad de Shannon, que tiene en cuenta tanto la riqueza de especies como la abundancia proporcional relativa (uniformidad), usando el paquete de software mothur (8). También se calcularon en mothur curvas de rarefacción y estimaciones de Chao1 de diversidad bacteriana total (8).
Se basaron dendrogramas de clústeres y gráficos de PCA en un alineamiento maestro, que se construyó usando el alineador RDP y se sometió a curación manual. Usando este alineamiento se creó una matriz de distancia, con corrección de Felsenstein, usando ARB. Entonces se usó la matriz de distancia como entrada para DOTUR (9) usando un corte de 98 % de identidad en el parámetro por defecto del vecino más cercano. Se consideró que las secuencias con >98 % de similitud filogenética pertenecían al mismo OTU. Entonces se usaron estos OTUs para calcular los dendrogramas de clústeres, usando la calculadora Bray Curtis, en el paquete mothur (8). 336 OTUs (12.308 clones) contribuyeron a este análisis. Se visualizaron los dendrogramas de clústeres, con diagramas de barras añadidos que muestran la composición microbiana de cada muestra y los índices de diversidad de Shannon, usando el paquete de bandas iTOL (10). Para los OTUs, se generaron los gráficos de PCA como antes, pero con un corte de identidad del 97 %. La descomposición de PCA se realizó en la matriz (simétrica) de similitud de muestras por parejas, donde la métrica de similitud se basó en la suma de las diferencias absolutas en la frecuencia de OTU. 344 OTUs (16.154 clones) contribuyeron al análisis, que fue insensible a la retirada de OTUs de baja frecuencia.
Para determinar el perfil de SCFA, se reunieron los contenidos cecales de 5 ratones por grupo y entonces se resuspendieron en PBS estéril a una concentración de 500 mg/mL, se homogeneizaron y se centrifugaron a 14.000 rpm durante 10 minutos. Se recogió el sobrenadante, se acidificó y tras la conversión en derivados de tbutildimetilsililo se analizó por cromatografía de gases ( 11 ).
Secuenciación de genoma completo y análisis filogenético de bacterias intestinales. Los presentes inventores secuenciaron los genomas (y sus especies derivadas de humano equivalentes más próximas) usando la plataforma MiSeq, y realizaron ensamblaje de novo usando Velvet {(12) y la predicción génica usando GLIMMER3 (13). Los presentes inventores identificaron entonces los genes que estuvieron en común entre las 6 especies de la Mezcla B, y genomas bacterianos intestinales de referencia conseguidos del proyecto MetaHIT, el proyecto HGMI y el proyecto Human Microbiome (Tablas 4 y 5). Se identificaron 44 genes comunes usando búsquedas de TBLASTN (14) por comparación con el conjunto de datos completo de los genomas de referencias y ensamblados para 80 bacterias (Tabla 5). Aunque el genoma de núcleo "verdadero" entre estas muestras puede ser más alto - los presentes inventores estuvieron limitados por el hecho de que en varios casos solo estuvieron disponibles ensamblajes de refuerzo, y así algunos genes que cabría haber esperado que estuvieran presentes en el grupo de "núcleo", no estuvieron de hecho presentes, debido a su ausencia en una o más de las secuencias del genoma de refuerzo usadas. Se clasificó que un gen estaba 'presente' si tenía un porcentaje mínimo de identidad de aminoácidos en todo el gen de 30 % en comparación con la referencia. Los genes de referencia usados para la consulta se tomaron de la cepa de Staphylococcus warneri tomada de la Mezcla B. Los genes comunes así identificados se comprobaron manualmente, se tradujeron, se extrajeron y se concatenaron juntos. Los presentes inventores usaron entonces FastTree 2.1 (15), con sus parámetros por defecto (BLOSUM45 y el modelo de CAT de Jones-Taylor-Thorton, con categorías de 20 tasas), para generar una filogenia de máxima probabilidad de la secuencia de proteínas concatenada, para poner las bacterias en su contexto correcto y para distinguir especies.
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1
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2 Tabla 2. Especies bacterianas aisladas de derivado fecal cultivado.
La designación de especies se basa en la secuencia del gen ARNr 16S o la secuenciación del genoma completo y la genómica comparativa usando los genomas de bacterias intestinales.
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Tabla 3. Cebadores usados para los experimentos de RT-PCR mostrados en la Figura 3.
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Tabla 4. Resumen de datos usados para la filogenia del genoma completo de las bacterias intestinales presentadas en la Figura 4.
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Tabla 5: Genes seleccionados Gen
30S proteína ribosómica S1
30S proteína ribosómica S10
30S proteína ribosómica S13
30S proteína ribosómica S14 tipo Z
30S proteína ribosómica S16
30S proteína ribosómica S17
30S proteína ribosómica S19
30S proteína ribosómica S3
30S proteína ribosómica S5
30S proteína ribosómica S7
30S proteína ribosómica S8
50S proteína ribosómica L1
50S proteína ribosómica L11
50S proteína ribosómica L14
50S proteína ribosómica L15
50S proteína ribosómica L16
50S proteína ribosómica L18P
50S proteína ribosómica L2
50S proteína ribosómica L22
50S proteína ribosómica L24
50S proteína ribosómica L34
50S proteína ribosómica L5
50S proteína ribosómica L7/L12
Adenilato cinasa
Adenilosuccinato sintetasa
Factor 2 de liberación de la cadena de péptido bacteriano Transportador ABC de D-metionina, proteína de unión a ATP ADN girasa subunidad B
ADN primasa
Excinucleasa ABC subunidad B
Proteína de unión a ATP de transporte de glutamina GlnQ GMP sintasa
Proteína de choque térmico GrpE
ADN helicasa de unión a Holliday RuvA
Proteína KdpE reguladora de la transcripción del operón KDP Proteína de unión a ATP de importación de L-cistina TcyC Meteniltetrahidrofolato ciclohidrolasa
Fenilalanil-ARNt sintetasa, subunidad alfa Polirribonucleótido nucleotidiltransferasa
Factor Ts de elongación de la traducción de proteínas (EF-Ts) Factor terminación/anti-terminación de la transcripción NusG Factor de inicio de la traducción SI-1
Triosefosfato isomerasa
Proteína de la familia YmdA/YtgF

Claims (10)

REIVINDICACIONES
1. Un método para la identificación de cepas aisladas bacterianas adecuadas para su uso en bacterioterapia, comprendiendo el método:
(i) preparar una suspensión de material recogido de un hospedador que alberga microbiota, en donde el material recogido del hospedador es material fecal del receptor previsto de la bacterioterapia antes de la necesidad de bacterioterapia o de un donante sano;
(ii) adición de un activador de esporas bacterianas suficiente para permitir el crecimiento de bacterias de esporas presentes en la suspensión, en donde el activador comprende un derivado de colato;
(iii) cultivar la suspensión de material; y
(iv) identificación de un grupo de especies bacterianas en donde las cepas aisladas individuales identificadas en la suspensión cultivada resultante se evalúan en combinaciones para identificar subconjuntos de las cepas aisladas bacterianas para su uso en, o adecuados para su uso en, bacterioterapia administrando el grupo de cepas aisladas a un modelo de ratón y midiendo un desplazamiento en la microbiota de receptores a una composición similar a la de una microbiota sana en donde el subconjunto comprende 3 a 6 cepas aisladas de bacterias.
2. Un método según la reivindicación 1, en donde el activador comprende taurocolato y/o glucocolato
3. Un método según la reivindicación 1 o 2 que comprende la etapa de cultivar el material en condiciones aerobias o anaerobias, tales como condiciones aerobias.
4. Un método según cualquier reivindicación precedente que comprende una etapa de incubación de la suspensión en un cultivo en reposo en condiciones aerobias o anaerobias, tales como condiciones aerobias.
5. Un método según cualquier reivindicación precedente, en donde el material recogido de un hospedador es material fecal o material obtenido por biopsia o muestreo del intestino del hospedador.
6. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el material que se cultiva en la etapa (iii) es el derivado fecal de pase 1 o 2.
7. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde las cepas aisladas bacterianas adecuadas para su uso en bacterioterapia comprenden una bacteria formadora de esporas.
8. Un grupo de cepas aisladas bacterianas obtenible o identificable según el método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes para su uso en el tratamiento de un estado disbiótico, en donde el grupo de cepas aisladas bacterianas comprende las secuencias de ADN que codifican ARN 16S que tienen SEQ ID NO.13, SEQ ID NO.14, SEQ ID NO.15, SEQ ID NO.16 y SEQ ID NO.17.
9. Un método o grupo según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes en donde la bacterioterapia es para su uso en seres humanos o animales no humanos.10
10. Un grupo según la reivindicación 8, en donde el tratamiento de disbiosis es para el tratamiento o la prevención de enfermedades caracterizadas por disbiosis, tales como diarrea recurrente, colitis, colitis pseudomembranosa; colitis ulcerosa; reservoritis; diarrea inducida por antibióticos; infección viral; obesidad; enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad de Crohn o síndrome del intestino irritable, infección bacteriana por Clostridium difficile, prevención de la transmisión de Clostridium difficile.
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