JP2020525034A - プロバイオティクス活性がある枯草菌株 - Google Patents

Abstract

本発明は、ブタ及び家禽関連の病原体を強力に阻害する新規の枯草菌株、及び、プロバイオティクスとしてのその使用に関する。

Description

本発明は、ブタ及び家禽に関連する病原体を強力に阻害する新しい枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株、並びに、プロバイオティクスとしてのその使用に関する。

飼料産業におけるプロバイオティック成分としての枯草菌株の使用は、当該技術分野では以前から開示されてきた。プロバイオティクス（「直接給餌微生物」又は「ＤＦＭ」ともいう）の機能は、有用細菌の増殖を高め、及び／又は病原菌の増殖を抑制して、腸内細菌叢に積極的に影響を及ぼすことである。理想的には、プロバイオティクスを用いると、抗生物質成長促進剤（ＡＧＰ）を用いる必要がなくなる。しかし、それに加えて、プロバイオティクスが特定の飼料成分の消化を促進する等の、さらなる機能を発揮することが望ましい。

そこで、当技術分野の技術水準を考慮すると、積極的に腸内細菌叢に影響を及ぼし、かつ、それに加えて、少なくとも１つのさらなる機能を満たすプロバイオティクスが望まれている。

驚くべきことに、本発明の細菌は、多くの有利な特徴を示すことが見出された。それは、ブタ及び家禽の主要な商業関連の病原体であるウェルシュ菌（Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、ディフィシル菌（クロストリディオイデス（クロストリジウム）・ディフィシル菌、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、黄色ブドウ球菌亜種アウレウス菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ｓｕｂｓｐ．ａｕｒｅｕｓ）、ガリナセウス菌（Ｓ．ｇａｌｌｉｎａｃｅｕｓ）、豚レンサ球菌（Ｓ．ｓｕｉｓ）、カンピロバクター・コリ菌（Ｃ．ｃｏｌｉ）及びエンテロコッカス・セコラム菌（Ｅ．ｃｅｃｏｒｕｍ）の増殖阻害能があり、特に胆汁の存在下では増殖率が極めて高く、及びセルロースを著しく効果的な方法で消化するのに役立つことである。

枯草菌株ＤＳＭ ３２５４０株は、天然分離株の標的スクリーニングにより同定された。本株は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の規定に基づき、上記寄託番号でＥｖｏｎｉｋ Ｄｅｇｕｓｓａ ＧｍｂＨ名で、２０１７年６月１４日、ＤＳＭＺに寄託された。

そこで、本発明の第１態様は、以下の群：
ａ）ＤＳＭＺにＤＳＭ ３２５４０として寄託された枯草菌株；
ｂ）前記ＤＳＭ ３２５４０株の全ての同定特性を有する、前記ＤＳＭ ３２５４０として寄託された枯草菌株の変異体であって、ここで、前記変異体のＤＮＡ配列は、ＤＳＭ ３２５４０株のＤＮＡ配列と少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９６、９７若しくは９８％、より好ましくは少なくとも９９若しくは９９．５％同一であり、及び／又は、前記変異体のゲノムＤＮＡ配列は、ＤＳＭ ３２５４０株のゲノムＤＮＡ配列と少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９６、９７若しくは９８％、より好ましくは少なくとも９９若しくは９９．５％同一、特に１００％同一である、変異体；
ｃ）前記ａ）又はｂ）の調製物；
ｄ）前記ａ）、ｂ）又はｃ）に含まれる代謝産物の有効な混合物を含有する調製物；
から選択される枯草菌株、及び／又は前記枯草菌株の調製物である。

ＤＳＭＺにＤＳＭ ３２５４０として寄託された枯草菌株は、以下の特定の配列：
ａ）配列番号１で表されるポリヌクレオチド配列と、少なくとも９９％又は９９．５％、特に１００％の配列同一性を有する、１６Ｓ ｒＤＮＡ配列；
ｂ）配列番号２で表されるポリヌクレオチド配列と、少なくとも９９．５％、好ましくは少なくとも９９．８％、特に１００％の配列同一性を有する、ｙｑｆＤ配列；
ｃ）配列番号３で表されるポリヌクレオチド配列と、少なくとも９９％又は９９．５％、特に１００％の配列同一性を有する、ｇｙｒＢ配列；
ｄ）配列番号４で表されるポリヌクレオチド配列と、少なくとも９９％又は９９．５％、特に１００％の配列同一性を有する、ｒｐｏＢ配列；
ｅ）配列番号５で表されるポリヌクレオチド配列と、少なくとも９９％又は９９．５％、特に１００％の配列同一性を有する、ｇｒｏＥＬ配列；
を表す。

したがって、本発明のさらなる態様は、枯草菌株、特に、前記特徴を有する枯草菌株、又はその調製物であり、ここで、前記枯草菌株は、以下の特徴：
ａ）配列番号２で表されるポリヌクレオチド配列と、少なくとも９９．５％、好ましくは少なくとも９９．８又は９９．９％、とりわけ１００％の配列同一性を有する、ｙｑｆＤ配列；
ｂ）配列番号３で表されるポリヌクレオチド配列と、少なくとも９９．５％、より好ましくは少なくとも９９．８又は９９．９％、とりわけ１００％の配列同一性を有する、ｇｙｒＢ配列；
ｃ）配列番号４で表されるポリヌクレオチド配列と、少なくとも９９．５％、より好ましくは少なくとも９９．８又は９９．９％、とりわけ１００％の配列同一性を有する、ｒｐｏＢ配列；
ｄ）配列番号５で表されるポリヌクレオチド配列と、少なくとも９９．５％、より好ましくは少なくとも９９．８又は９９．９％、とりわけ１００％の配列同一性を有する、ｇｒｏＥＬ配列；
の少なくとも１つ、好ましくは全てを示す枯草菌株であって、ここで、前記枯草菌株は、さらに、配列番号１のポリヌクレオチド配列と、少なくとも９９％、より好ましくは少なくとも９９．５、９９．８又は９９．９％、とりわけ１００％の配列同一性を有する、１６Ｓ ｒＤＮＡ配列をさらに表すのが好ましい。

したがって、本発明のさらなる態様は、枯草菌株又はその調製物、特に前記特徴を有する枯草菌株であり、以下の特徴：
ａ）配列番号１で表されるポリヌクレオチド配列と、少なくとも９９％、好ましくは少なくとも９９．５％、より好ましくは少なくとも９９．８又は９９．９％、とりわけ、１００％の配列同一性を有する、１６Ｓ ｒＤＮＡ配列；
ｂ）配列番号２で表されるポリヌクレオチド配列と、少なくとも９９％、好ましくは少なくとも９９．５％、より好ましくは少なくとも９９．８又は９９．９％、とりわけ、１００％の配列同一性を有する、ｙｑｆＤ配列；
ｃ）配列番号３で表されるポリヌクレオチド配列と、少なくとも９９％、好ましくは少なくとも９９．５％、より好ましくは少なくとも９９．８又は９９．９％、とりわけ、１００％の配列同一性を有する、ｇｙｒＢ配列；
ｄ）配列番号４で表されるポリヌクレオチド配列と、少なくとも９９％、好ましくは少なくとも９９．５％、より好ましくは少なくとも９９．８又は９９．９％、とりわけ、１００％の配列同一性を有する、ｒｐｏＢ配列；
ｅ）配列番号５で表されるポリヌクレオチド配列と、少なくとも９９％、好ましくは少なくとも９９．５％、より好ましくは少なくとも９９．８又は９９．９％、とりわけ、１００％の配列同一性を有する、ｇｒｏＥＬ配列；
の２つ、３つ又は４つ、好ましくは全てを示す。

したがって、本発明の特定の態様はまた、以下の特徴：
ａ）配列番号１で表される１６Ｓ ｒＤＮＡ配列；
ｂ）配列番号２で表されるｙｑｆＤ配列；
ｃ）配列番号３で表されるｇｙｒＢ配列；
を示す、枯草菌株である。
好ましくは、この枯草菌株は、さらに、以下の特徴：
ｄ）配列番号４で表されるｒｐｏＢ配列；
ｅ）配列番号５で表されるｇｒｏＥＬ配列；
を示す。

本発明の菌株は、好ましくは、以下のさらなる特徴の少なくとも１つ、より好ましくは全てにより特徴付けられる：
本発明の菌株は、好ましくは、嫌気性条件下で増殖しうる。さらに、当該菌株は、そのような嫌気性条件下で、水不溶性セルロース及びタンパク質を分解することができることが、好ましい。

さらに、本発明の菌株は好気性条件下で、さらに、水不溶性セルロースを分解することができることが、好ましい。

本発明の菌株は、好ましくは、感染性細菌、特に、ウェルシュ菌ＡＴＣＣ １３１２４株；ウェルシュ菌ＢＢ−０８１＿Ｃｐｅ株；ウェルシュ菌ＢＢ＿０３１＿Ｃｐｅ株；ディフィシル菌ＤＳＭ １２９６株；黄色ブドウ球菌亜種アウレウス菌ＤＳＭ ２０２３１株；ガリナセウス菌ＤＳＭ １５３４９株；豚レンサ球菌ＤＳＭ ９６８２株；カンピロバクター・コリ菌ＤＳＭ ４６８９株及びエンテロコッカス・セコラム菌ＤＳＭ ２０６８３株から選択される少なくとも１つの株、好ましくは全ての株を、極めて効果的に阻害する。

本発明の菌株は、特に、好ましくは、ＬＢ−Ｋｅｌｌｙ寒天平板上のウェル拡散拮抗アッセイにおいて、少なくとも１５ｍｍ、より好ましくは少なくとも２０ｍｍのウェルシュ菌基準株ＡＴＣＣ １３１２４の病原体クリアランス、及び／又は少なくとも２０ｍｍのウェルシュ菌株ＢＢ−０８１＿Ｃｐｅの病原体クリアランス、及び／又は少なくとも１５ｍｍ、好ましくは少なくとも１８ｍｍのウェルシュ菌株ＢＢ＿０３１＿Ｃｐｅの病原体クリアランスにより特徴付けられる。

本発明の菌株は、好ましくは、さらに、０．０５質量％の酢酸、０．０５質量％のプロピオン酸、及び／又は０．２質量％の乳酸の存在下で増殖することができることを特徴とする。

本発明の菌株は、好ましくは、さらに、以下の：セルラーゼ活性；キシラナーゼ活性；カタラーゼ活性；スーパーオキシドジスムターゼ活性の酵素活性の少なくとも１つ、好ましくは全てを呈することにより、特徴付けられる。

特に、本発明の菌株は、好ましくは、少なくとも８ｍＵ／ｍＬ、より好ましくは少なくとも１０ｍＵ／ｍＬ、特に約１２ｍＵ／ｍＬのキシラナーゼ活性を呈することを特徴とする。

本発明の菌株は、好ましくは、さらに、乳酸を産生し、好ましくは、さらにマイコトキシンを分解することができる。

本発明の枯草菌株はさらに、好ましくは、２ｍＭ胆汁の存在下、より好ましくは４ｍＭ胆汁の存在下で、増殖することができる点で、特徴付けられる。特に、本発明の枯草菌株は、好ましくは、このような高胆汁濃度下で、速やかに増殖しうることを特徴とする。

さらに、上記菌株は、好ましくは、高塩条件下、特に５質量％の塩化ナトリウムの存在下、より好ましくは１０質量％の塩化ナトリウムの存在下で、少なくとも１日間、増殖しうる。

さらに、本発明の菌株は、好ましくは、動物飼料のペレット化に必要な高温下で生存し、特に好ましくは、８０℃、より好ましくは９５℃又は９９℃の温度で、少なくとも２０分間生存する。

いかなる理論にも拘束されることを望まないが、本発明の枯草菌株は、選択的有効性を備えた抗菌性代謝産物を産生したり、利用可能な栄養素を多量に消費することで病原菌と競合したりする等の多面的な作用機序により、動物の健康、特に腸内の健康を増強し、それにより、腸内における病原菌の定着を効果的に抑制すると考えられる。これにより、枯草菌が産生する上記酵素は、前消化された栄養素を供給することにより、バランスのとれた腸内細菌叢を確立するのに役立つこともできる。

抗生物質と比較したプロバイオティクスの大きな利点としては、プロバイオティクスは、無差別に細菌を攻撃したり、病原菌の抗生物質耐性株を導出したりしないことがあげられる。通常、プロバイオティクスは、特定の効能を備える抗菌物質の産生により病原菌と選択的に競合することができ、かつ、理想的には、有益な腸内微生物叢の成長と生存率を同時に高めることができる。さらに、プロバイオティクスは、好ましくは、処置される動物の全身免疫応答を刺激することができる。

本発明のＤＳＭ ３２５４０の変異株は、好ましくは、自然突然変異体である。用語「自然突然変異体」は、変異原を意図的に用いず、ＤＳＭ ３２５４０から生じる突然変異体をいう。当該自然突然変異体は、古典的な方法、例えば、紫外線の存在下で枯草菌株を増殖させること、及び／又は高温又はプロトプラスト形成を適用すること、及び／又は親株が感受性である特定の抗生物質の存在下で、生物学的活性の改善若しくは動物、特に腸の健康の１又はそれ以上の指標を促進する機能を高めるための、いかなる耐性突然変異体をも試験すること、により得ることができる。自然突然変異体を同定する他の方法は、当業者に公知である。しかし、これらの好ましい自然発生的突然変異体に加えて、遺伝子工学により得られた変異体と同様に、ＤＳＭ ３２５４０の他の全ての種類の変異体もまた、本発明に包含される。

本発明の一の特定の実施形態は、天然非存在突然変異体、特に、上記特性で特徴付けた、株ＤＳＭ ３２５４０の、上記で特定した自然突然変異体である。

本発明の好ましい態様では、本発明の菌株及び調製物は、好ましくは、動物又はヒトに経口投与される。

したがって、本発明のさらなる態様は、本発明の枯草菌株、及び／又は調製物を含有する組成物、例えば、飼料、食品、飲料水及び飼育水並びに治療用組成物である。

本発明のさらなる態様はまた、飼料又は食品中のプロバイオティック成分としての枯草菌株、及び／又は本発明の調製物の使用である。

本発明による好ましい食品は、乳製品、特にヨーグルト、チーズ、ミルク、バター及びクォークである。

本発明の菌株の細胞は、特に、本発明の組成物中に、胞子（休眠状態）として、栄養細胞（増殖中）として、遷移状態細胞（増殖期から胞子形成期へ移行中）として、又はこれらの少なくとも２つ、特に、これら細胞の全て、の組み合わせとして、存在してもよい。好ましい実施形態では、本発明の組成物は、主として胞子を含むか、又は胞子しか含まない。

それに加えて、又はその代わりに、当該菌株の細胞は、非生物の不活化状態で用いられてよいが、それは、非生物細胞であってもプロバイオティクス効果は備えると予想されるためである。細胞を不活化する方法は、当業者に公知である。

本発明の枯草菌株及びそれらを含有する組成物を、動物に投与する場合、好ましくは、当該動物の健康を促進し、及び／又は当該動物の一般的な体調を改善し、及び／又は当該動物の飼料転換率を改善し、及び／又は当該動物の死亡率を低下させ、及び／又は当該動物の生存率を高め、及び／又は当該動物の体重を増加させ、及び／又は当該動物の生産性を高め、及び／又は当該動物の病気に対する抵抗力を高め、及び／又は当該動物の免疫応答を高め、及び／又は当該動物の健全な腸内細菌叢を確立又は維持し、及び／又は当該動物の糞便を介して排泄される病原体を低下させる。特に、本発明の菌株及び組成物は、治療目的で抗生物質を投与した後に、腸内微生物叢の健全なバランスを再構築するのを促進するために、用いられることができる。

したがって、本発明のさらなる態様は、動物の健康を促進する、及び／又は動物の一般的な体調を改善する、及び／又は動物の飼料転換率を改善する、及び／又は動物の死亡率を低下させる、及び／又は動物の生存率を高める、及び／又は動物の体重を増加させる、及び／又は動物の生産性を高める、及び／又は動物の病気に対する抵抗力を高める、及び／又は動物の免疫応答を高める、及び／又は動物の健全な腸内細菌叢を確立又は維持する、及び／又は動物の糞便を介して排泄される病原体を低下させる、方法であって、ここで、本発明の菌株及び／若しくは調製物、又は当該菌株を含む本発明の組成物が、動物に投与される。

したがって、本発明のさらなる態様は、動物の健康を促進する、及び／又は動物の一般的な体調を改善する、及び／又は動物の飼料転換率を改善する、及び／又は動物の死亡率を低下させる、及び／又は動物の生存率を高める、及び／又は動物の体重を増加させる、及び／又は動物の生産性を高める、及び／又は動物の病気に対する抵抗力を高める、及び／又は動物の免疫応答を高める、及び／又は動物の健全な腸内細菌叢を確立又は維持する、及び／又は動物の糞便を介して排泄される病原体を低下させる、ための、本発明の菌株、及び／又は調製物、及び／又は組成物の使用であって、ここで、当該本発明の菌株、及び／若しくは調製物、又は当該菌株を含む本発明の組成物が、動物に投与される。

したがって、本発明のさらなる態様は、動物の健康を促進する、及び／又は動物の一般的な体調を改善する、及び／又は動物の飼料転換率を改善する、及び／又は動物の死亡率を低下させる、及び／又は動物の生存率を高める、及び／又は動物の体重を増加させる、及び／又は動物の生産性を高める、及び／又は動物の病気に対する抵抗力を高める、及び／又は動物の免疫応答を高める、及び／又は動物の健全な腸内細菌叢を確立又は維持する、及び／又は動物の糞便を介して排泄される病原体を低下させる、上記の本発明の菌株及び調製物、並びに、上記菌株を含有する上記の本発明の組成物である。

用語「動物の生産性を高める」とは、特に以下の、より高品質な卵、乳若しくは肉を、より多量に生産すること、又は離乳後の子の生産量を高める、いかなる意味をも示す。

本発明の菌株、調製物及び組成物の方法及び使用は、治療的又は非治療的であってよい。本発明の特に好ましい実施形態では、当該方法及び使用は、非薬剤的であり、特に飼料用途である。

病原菌やその他の成分による動物の未処理の堆肥は、特に、動物それ自体、及び／又は当該堆肥に接触するヒトに有害な環境影響を及ぼしかねないが、これは、本発明の菌株、組成物又は調製物を動物に給餌するか、又は当該堆肥又は当該動物の床敷きを直接処理することにより、回避することができる。したがって、本発明のさらなる態様は、堆肥又は汚染液体の有害な環境影響を制御、及び／又は回避する方法であり、当該方法には、少なくとも、１つの菌株、１つの調製物、及び／又は１つの組成物を、糞尿、汚染液体、落葉落枝（litter）、ピット又は堆肥池に適用する工程を含む。好ましくは、当該組成物は、例えば噴霧等では液状で、又は例えば散布等では粉末として、適用される。

有害細菌は、落葉落枝の粘度（consistency）に悪影響を及ぼす場合があり、特に、流動性又は流動性の高い落葉落枝に影響を及ぼす場合があり、これにより、家禽の足パッド病変（foot pad lesions）の発症につながる可能性があるが、これは、本発明の菌株、組成物又は調製物を、当該動物に給餌することにより回避しうる。そこで、本発明のさらなる態様は、落葉落枝の粘度を制御、及び／又は改善する方法、特に、落葉落枝の固体粘度を確実にする方法、及び／又は足パッド病変を回避する方法であって、本発明の少なくとも、１つの菌株、１つの調製物、及び／又は１つの組成物を、動物、特に家禽に給餌する工程を含む。

本発明の菌株、及び調製物はまた、水質の改善に用いることができる。したがって、本発明のさらなる態様は、水又は水溶液、特に、飲料水、及び／又は飼育水の品質を制御、及び／又は改善する方法であり、少なくとも１つの菌株、及び／又は少なくとも１つの調製物、及び／又は少なくとも１つの組成物を、水又は水溶液に適用する工程を含む。

さらに、本発明の菌株、及び調製物はまた、植物の微生物病の処置に用いることができる。したがって、本発明のさらなる態様は、植物、特に栽培植物の微生物病を処置する、及び／又は予防する方法であって、本発明の少なくとも１つの菌株、及び／又は少なくとも１つの調製物、及び／又は少なくとも１つの組成物を、植物に適用する工程を含む。適用は、例えば噴霧等では液状で、又は例えば粉末として、好ましくは製剤化粉末で行われてよい。

本発明の菌株、調製物及び組成物を用いることで、好ましくは、前記特徴の少なくとも１つの改善が実現されるが、ここで、当該特徴の実現とは、好ましくは、適当な陰性対照と比較して、少なくとも１％、より好ましくは少なくとも３％、又は少なくとも５％の改善をいう。陰性対照としては、畜産分野で公知の平均値を用いてよいが、好ましくは、陰性対照動物は、試験した動物と同様の処理を受けるが、本発明の菌株、及び／又は調製物は投与されない。

特に、上記の本発明の菌株、調製物及び組成物は、動物の腸内における病原菌の増殖を、阻害、及び／又は低下させるのに有効な量で、動物に投与又は給餌することができる。このような病原菌としては、クロストリジウム菌、リステリア菌、サルモネラ菌、腸球菌、ブドウ球菌、アエロモナス菌、レンサ球菌、カンピロバクター、大腸菌、赤痢菌、ヘモフィルス菌、ブラキスピラ菌及びビブリオ菌があげられる。関連して、本発明の方法は、動物の糞便中に排泄される病原菌、ウイルス及び原虫の量を低下させるために、用いることができる。また、本発明の方法は、動物の腸内における有用細菌、例えば、乳酸菌、の増殖を維持又は高めるために用いることができる。本発明の組成物によれば、病原菌を低下させること、及び／又は有用細菌の増殖を高めるか、又は維持することにより、全体的に健康な腸内細菌叢を維持することができる。

したがって、本発明のさらなる態様はまた、病原菌の増殖を阻害するか、及び／又は低下させるため、及び／又は動物の腸内で有用細菌の増殖を維持するか、及び／又は高めるための、本発明の菌株、調製物及び組成物であり、ここで、病原菌としては、好ましくは、特に、ウェルシュ菌（Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、ディフィシル菌、ノービイ菌（Ｃ．ｎｏｖｙｉ）、セプチクム菌（Ｃ．ｓｅｐｔｉｃｕｍ）及びコリナム菌（Ｃ．ｃｏｌｉｎｕｍ）等のクロストリジウム菌、特に、リステリア・モノサイトゲネス菌（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、Ｌ．ｓｅｅｌｉｇｅｒｉ及びＬ．ｗｅｌｓｈｉｍｅｒｉ等のリステリア菌、特に亜種であるエンテリカ（ｅｎｔｅｒｉｃａ）、アリゾナエ（ａｒｉｚｏｎａｅ）、ボンゴリ（ｂｏｎｇｏｒｉ）を含むサルモネラ・エンテリカ菌（Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｃａ）、かつ、特に血清型、サルモネラ・ガリナルム菌（Ｓ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、ヒナ白痢菌（Ｓ．ｐｕｌｌｏｒｕｍ）、ネズミチフス菌（ティフィムリウム菌；Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、腸炎菌（Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）、サルモネラ・コレレスイス菌（Ｓ．ｃｈｏｌｅｒａｓｕｉｓ）、サルモネラ・ハイデルベルグ菌（Ｓ．ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）及びサルモネラ・インファンティス菌（Ｓ．ｉｎｆａｎｔｉｓ）を含むサルモネラ菌、エンテロコッカス・フェカーリス菌（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ），エンテロコッカス・フェシウム菌（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）及びエンテロコッカス・セコラム菌等の腸球菌、特に、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）等のブドウ球菌、アエロモナス菌由来の細菌、特に、豚レンサ球菌及びガリナセウス菌等のレンサ球菌、特に、カンピロバクター・ジェジュニ菌（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）及びカンピロバクター・コリ菌等のカンピロバクター、大腸菌由来の細菌、特に、ブタパラインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｓｕｉｓ）等のヘモフィルス菌、特に、豚赤痢菌（Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）等のブラキスピラ菌、及び、特に腸炎ビブリオ菌（Ｖ．ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）及びビブリオ・ハーベイ菌（Ｖ．ｈａｒｖｅｙｉ）等のビブリオ菌があげられ、かつ、有用細菌としては、好ましくは、乳酸菌（lactic acid bacteria）、特に乳酸桿菌（ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）及びビフィズス菌（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ）から選択される。

本発明の好ましい実施形態では、少なくとも１つの病原菌の量、特にウェルシュ菌の量を、少なくとも０．５ｌｏｇ、より好ましくは、少なくとも１ｌｏｇ、２ｌｏｇ、又は３ｌｏｇに低下させる。

したがって、本発明のさらなる態様はまた、動物の腸内における、病原菌の増殖を阻害するか、及び／若しくは低下させる、並びに／又は有用細菌の増殖を維持するか、及び／若しくは高める、本発明の上記菌株、調製物及び組成物であって、ここで、病原菌としては、好ましくは、特に、ウェルシュ菌、ディフィシル菌、ノービイ菌、セプチクム菌及びコリナム菌等のクロストリジウム菌、特に、リステリア・モノサイトゲネス、Ｌ．ｓｅｅｌｉｇｅｒｉ及びＬ．ｗｅｌｓｈｉｍｅｒｉ等のリステリア菌、特に亜種であるエンテリカ、アリゾナエ、ボンゴリを含むエンテリカ菌、かつ、特に血清型、ガリナルム菌、ヒナ白痢菌、ネズミチフス菌、腸炎菌、コレレスイス菌，ハイデルベルグ菌及びインファンティス菌を含むサルモネラ菌、フェカーリス菌，フェシウム菌及びエンテロコッカス・セコラム菌等の腸球菌、特に、黄色ブドウ球菌等のブドウ球菌、アエロモナス菌由来の細菌、特に、豚レンサ球菌及びガリナセウス菌等のレンサ球菌、特に、カンピロバクター・ジェジュニ菌及びカンピロバクター・コリ菌等のカンピロバクター、大腸菌由来の細菌、特に、ブタパラインフルエンザ菌等のヘモフィルス菌、特に豚赤痢菌等のブラキスピラ菌、及び、特に腸炎ビブリオ菌及びビブリオ・ハーベイ菌等のビブリオ菌があげられ、かつ、有用細菌としては、好ましくは、乳酸菌、特に乳酸桿菌及びビフィズス菌から選択される。

病原菌が発生するか、及び／又は、増殖すると、特定の疾患の発生の原因となるか、又は当該疾患の原因となりうる。例えば、ウェルシュ菌が発生するか、及び／又は当該菌が増殖すると、腸疾患の発生、特に、ブタ及び家禽の壊死性腸炎の発症の原因となりうる。ウェルシュ菌が発生するか、及び／又は当該菌が増殖すると、細菌性腸炎、壊疽性皮膚炎及び胆管肝炎等のさらなる疾患の原因となりうる。ウェルシュ菌の感染が軽度であっても、下痢を発症する場合があり、それにより、落葉落枝が湿り、足のパッド皮膚炎等の二次疾患の原因となりうる。ウェルシュ菌Ｃ型は、一般に、子ブタの壊死性腸炎及び壊死性出血性腸炎の主要原因と考えられており、ウェルシュ菌Ａ型は、軽度の壊死性腸炎及び絨毛萎縮を伴う、哺乳ブタ及び授乳ブタの腸疾患と関連する。

ディフィシル菌は、主として新生ブタの下痢の原因である、重要な新興病原体である。罹患した子ブタは、呼吸困難、腹部膨満、陰嚢浮腫を呈する場合がある。

黄色ブドウ球菌亜種アウレウス菌はニワトリの趾瘤、雌ブタの連鎖球菌性乳房炎の原因となる可能性があり、ヒトの食中毒の原因となる毒素を産生する可能性がある。

エンテロコッカス・セコラム菌は、通常、関節、及び／又は骨の組織の炎症により誘発されるブロイラーの跛行、関節炎及び骨髄炎の原因として知られる。さらにエンテロコッカス・セコラム菌は心膜炎の原因となりうる。

ガリナセウス菌は家禽の敗血症の原因となる場合がある。肉眼的病変としては、脾腫、肝腫、腎腫及びうっ血があげられる。弁膜性心内膜炎に関連した、肝臓及び脾臓の壊死、及び／又は複数部位における梗塞も観察されている。

カンピロバクター・コリ菌は食中毒菌で、ほとんどの場合、ヒトが当該細菌を含む豚肉を摂取することで、感染する。当該菌は、ヒトの胃腸炎、急性腸炎、急性下痢性疾患の原因である。ブタが主な宿主であるが、ヒト、家禽類、その他様々な動物にも感染しうる。

豚レンサ球菌はブタの重要な病原体であり、離乳後の子ブタの細菌性死亡の最も重要な原因の１つであり、敗血症、髄膜炎、その他多くの感染症の原因である。

病原体は、多発性関節炎、線維素性多漿膜炎、離乳後の下痢や浮腫、豚赤痢等の離乳後の腸疾患の原因となる可能性がある。

したがって、本発明のさらなる態様はまた、上記の本発明の菌株、及び／又は組成物を含む治療用組成物である。

したがって、この文脈における好ましい態様は、動物、好ましくはブタ又は家禽の、壊死性腸炎及び壊死性出血性腸炎、特に、無症候性壊死性腸炎及び壊死性出血性腸炎の治療、及び／又は予防のための、上記の本発明の菌株、及び／又は組成物を含む治療用組成物である。

したがって、この文脈における、さらに好ましい態様は、動物、好ましくは、ブタ又は家禽の、細菌性腸炎、壊疽性皮膚炎、コランジオ肝炎、クロストリジウム症、下痢、呼吸困難、腹部膨満、陰嚢浮腫、趾瘤、足パッド皮膚炎、レンサ球菌性乳房炎、跛行、関節炎、多発性関節炎、線維性多発性漿膜炎、離乳後の下痢及び浮腫疾患等の離乳後の腸疾患、赤痢、骨髄炎、関節、及び／又は骨の組織の炎症、心膜炎、脾腫、肝腫、腎腫大、うっ血、壊死、肝臓又は脾臓の梗塞、弁膜性心内膜炎、敗血症、及び／又は髄膜炎のための、上記の本発明の菌株、及び／又は組成物を含む、治療、及び／又は予防のための治療用組成物である。

したがって、本発明のさらなる態様はまた、ブタ又は家禽の疾患、特に、腸疾患、好ましくは、壊死性腸炎又は壊死性出血性腸炎、特に、無症候性壊死性腸炎又は無症候性壊死性出血性腸炎の治療、及び／又は予防であり、ここで、本発明の菌株、及び／又は組成物、及び／又は調製物が、それを必要とする動物に投与される。

したがって、本発明のさらなる態様はまた、疾患の治療、及び／又は予防、好ましくは、細菌性腸炎、壊疽性皮膚炎、コランジオ肝炎、クロストリジウム症、下痢、呼吸困難、腹部膨満、陰嚢浮腫、趾瘤、足パッド皮膚炎、レンサ球菌性乳房炎、跛行、関節炎、多発性関節炎、線維性多発性漿膜炎、離乳後の下痢及び浮腫疾患等の離乳後の腸疾患、赤痢、骨髄炎、関節、及び／又は骨の組織の炎症、心膜炎、脾腫、肝腫、腎腫大、うっ血、壊死、肝臓又は脾臓の梗塞、弁膜性心内膜炎、敗血症、及び／又は髄膜炎から選択されるブタ又は家禽の疾患の治療、及び／又は予防であり、ここで、本発明の菌株、及び／又は組成物、及び／又は製剤が、それを必要とする動物に投与される。

本発明の菌株、及び／又は調製物、及び／又は組成物は、当該動物に、飼料、及び／又は飲料水により、動物の生存中、又は動物の生存中の特定の段階若しくは期間、数日間投与することができる。例えば、当該菌株、及び／又は組成物は、家畜の、初期飼料にのみ、又は最終飼料にのみ、投与されてよい。

また、本発明の特定の態様は、ヒトの健康を促進する、及び／又はヒトの一般的な体調を改善する、及び／又はヒトの病気に対する抵抗力を高める、及び／又はヒトの免疫応答を高める、及び／又はヒトの健全な腸内細菌叢を確立又は維持する、方法であって、ここで、本発明の菌株、及び／又は調製物、又は、当該菌株を含む本発明の組成物が、ヒトに投与される。

したがって、本発明のさらなる態様は、ヒトの健康を促進する、及び／又はヒトの一般的な体調を改善する、及び／又はヒトの病気に対する抵抗力を高める、及び／又はヒトの免疫応答を高める、及び／又はヒトの健全な腸内細菌叢を確立又は維持するための、本発明の菌株、及び／又は、調製物、及び／又は、組成物の使用であって、ここで、当該本発明の菌株、及び／又は、調製物、及び／又は、組成物が、ヒトに投与される。

本発明の組成物、特に、飼料、食品、医薬組成物、飲料水又は飼育水は、好ましくは本発明の菌株を、約１×１０^３〜約２×１０^１２ＣＦＵ／（ｇの飼料、又はｍｌの水）の比率で、特に、約１×１０^３、約１×１０^４、約１×１０^５、約１×１０^６、約１×１０^７、約１×１０^８、約１×１０^９、約１×１０^１０、約１×１０^１１、約１×１０^１２ＣＦＵ／（ｇの飼料、又はｍｌの水）の比率で、好ましくは、約１×１０^４〜約１×１０^１０ＣＦＵ／（ｇの飼料、又はｍｌの水）の比率で含み、より好ましくは、１×１０^４〜１×１０^７ＣＦＵ／（ｇの飼料、又はｍｌの水）で、動物に投与される。

それに対応して、本発明の飼料、食品及び水組成物中の、本発明の当該菌株、及び／又は調製物の好ましい量は、好ましくは０．１質量％〜１０質量％、より好ましくは０．２質量％〜５質量％、特に０．３質量％〜３質量％の範囲である。

本発明の方法は、全ての種類の動物、特に、全ての種類の非ヒト動物及び非昆虫動物、より好ましくは、全ての種類の脊椎動物、例えば哺乳動物、水生動物及び鳥類に適用することができる。

本発明が貢献することができる動物としては、家畜、ペット、外来動物、動物園動物、水生動物、スポーツ用、娯楽用又は労務用の動物があげられるが、これらに限定されない。

ペットは、好ましくは、イヌ、ネコ、家禽、家畜及び外来動物から選択される。

水生動物は、好ましくはヒトの栄養を目的とする、フィンフィッシュ（finfish）及び甲殻類から選択される。特に、コイ、ティラピア、ナマズ、マグロ、サケ、マス、バラムンディ、鯛、スズキ、タラ、エビ、ロブスター、カニ、エビ及びザリガニがあげられる。この文脈での好ましいサケは、大西洋サーモン、レッドサーモン、マスサーモン、キングサーモン、ケタサーモン、ギンザケ、ドナウサーモン、太平洋サーモン及びピンクサーモンである。

さらに好ましい水生動物は、養殖魚であり、その後、魚粉又は魚油に加工される。これに関連して、そのような魚は、好ましくはニシン、スケトウダラ、メンへーデン（menhaden）、イワシ、シシャモ（capelin）又はタラである。

さらなる好ましい実施形態では、動物は、消費用に飼育される家畜、又は食料生産物として飼育される、家禽、ブタ及び反芻動物等である。

家禽は、生産的家禽（productive poultry）、家畜家禽、高級家禽（fancy poultry）又は野鳥から選択することができる。

この文脈で好ましい生産的家禽は、ニワトリ、七面鳥、アヒル及びガチョウである。この文脈における生産的家畜は、好ましくは、若齢家畜の生産用に最適化された家禽、又は肉を担持するために最適化された家禽である。

好ましい高級家禽又は野鳥は、クジャク、キジ、ヤマウズラ、シャコ（chukkars）、ホロホロチョウ、ウズラ、オオライチョウ（capercaillies）、ライチョウ（grouse）、ハトおよび白鳥であり、ウズラが特に好ましい。

さらに好ましい家禽は、走鳥類、特にダチョウ及びエミュー（emus）、並びにオウムである。

本発明の反芻動物は、好ましくは、ウシ、ヤギ及びヒツジから選択される。一の実施形態では、本発明の組成物を、前反芻動物の健康促進のため、特に、当該動物の下痢の発生率を低下させるため、当該動物に給餌することができる。前反芻動物は、生後約１２週齢までの週齢である、仔牛を含む反芻動物である。

本発明の組成物は、少なくとも１つの担体、通常の飼料成分、又はそれらの組み合わせを含んでもよい。

適当な担体としては、回復、効能、又は物理的特性を改善する、及び／又は包装及び投与を促進するために添加される、不活性製剤成分である。このような担体を、個別に、又は組み合わせて、添加することができる。これらの担体は、粘結防止剤、酸化防止剤、膨張剤、及び／又は保護剤から選択することができる。有用な担体の例としては、多糖類（特にデンプン、マルトデキストリン、メチルセルロース、ガム、キトサン、及び／又はイヌリン）、タンパク質源（特にスキムミルク粉末、及び／又は甘乳粉末）、ペプチド、糖類（特にラクトース、トレハロース、スクロース、及び／又はデキストロース）、脂質（特にレシチン、植物油、及び／又は鉱物油）、塩類（特に塩化ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カルシウム、チョーク、石灰石、炭酸マグネシウム、リン酸ナトリウム、リン酸カルシウム、リン酸マグネシウム、及び／又はクエン酸ナトリウム）、及びケイ酸塩（特に粘土、特にベオライト粘土、非晶質シリカ、ヒュームド/沈降シリカ、ゼオライト、フラー土、ベイリス、クリントポライト、モンモリロナイト、珪藻土、タルク、ベントナイト、および/またはケイ酸アルミニウム、マグネシウムおよび/またはケイ酸カルシウム等のケイ酸塩）があげられる。動物飼料添加物に適する担体は、毎年発行されるAmerican Feed Control Officials Official Publicationに記載されている。例えば、Official Publication of American Feed Control Officials, Sharon Krebs, editor, 2006 edition, ISBN 1-878341-18-9を参照のこと。担体は、発酵培養液（broth）の濃縮後、及び／又は乾燥中、及び／又は乾燥後に、添加することができる。本発明の好ましい担体は、炭酸カルシウム、珪藻土及び植物油から選択される。

本発明の好ましい実施形態は、濃縮組成物、特に、本発明の菌株の少なくとも１種と上記の少なくとも１つの担体とを含む、飼料組成物を調製するのに適する組成物であり、本発明の菌株を少なくとも１種、好ましくは０．１〜１０質量％、より好ましくは０．２〜５質量％、特に、０．３〜３質量％、とりわけ、０．４〜２．２質量％、及び、少なくとも１つの担体を、好ましくは、少なくとも９０質量％、好ましくは、９０〜９９．９質量％、より好ましくは、９５〜９９．８質量％、特に、９７〜９９．７質量％、とりわけ、９７．８〜９９．７質量％、含み、当該担体は、好ましくは、実質的に石灰石、特に、わずかな珪藻土、及び／又は植物油を含む石灰石、からなる。

安定化された菌株を含む、本発明のこれらの好ましい組成物は、本発明の菌株を上記の量で含むことが、好ましい、飼料、医薬組成物、飲料水及び飼育水の調製物に用いることができる。好ましい実施形態では、飼料、飲料水又は飼育水１トン当たり、当該濃縮組成物の５０〜１０００グラム、特に５０、１００、２５０、５００又は１０００グラムを用いて、動物の給餌することができる組成物を提供する。これらの濃縮組成物は、好ましくは、濃縮組成物１ｇ当たり、本発明の少なくとも１つの菌株を１×１０^９〜２×１０^１１ＣＦＵ、特に２×１０^９〜１×１０^１１ＣＦＵの量で、含む。

当該濃縮組成物から出発して、当該濃縮組成物を、通常の飼料又は食品成分と混合することにより、飼料及び食品組成物を各々調製することができる。

本発明の組成物中に含有されてもよい、及び／又は本発明の濃縮組成物を出発物質とする飼料組成物の調製に用いてもよい、適当な通常の動物飼料成分としては、１又はそれ以上の：タンパク質、炭水化物、脂肪、他のプロバイオティクス、プレバイオティクス、酵素、ビタミン、免疫調節剤、乳代用剤、ミネラル、アミノ酸、抗コクシジウム剤、酸ベースの製品、及び／又は抗生物質等の医薬品、があげられる。

本発明で用いられてもよい成分を含有する炭水化物は、例えば、飼料（forage）、粗飼料、小麦粉、ひまわり粉又は大豆粉、及びそれらの混合物である。

本発明で用いられてもよい成分を含有するタンパク質は、例えば、大豆タンパク質、エンドウ豆タンパク質、小麦グルテン又はコーングルテン、及びそれらの混合物である。

本発明で用いられてもよい成分を含有する脂肪は、特に、動物及び植物由来の油であって、例えば、大豆油、菜種油、ひまわり油、亜麻仁油又はパーム油等の植物油、魚油、及びそれらの混合物である。

本発明でさらに用いられてもよい脂肪を含有する成分を含有するタンパク質は、例えば、魚粉、オキアミ粉、二枚貝粉、イカ粉又はエビ殻、並びにそれらの組み合わせである。

本発明の菌株及び調製物と組み合わせて、本発明で用いられてよい、さらなるプロバイオティクス（ＤＦＭ）は、好ましくは、枯草菌, バチルス・リヒェニホルミス菌（Bacillus licheniformis）、バチルス・レンタス菌（Bacillus lentus）、バチルス・プミルス菌（Bacillus pumilus）、バシラス・ラテロスポーラス菌（Bacillus laterosporus）、バチルス・コアギュランス菌（Bacillus coagulans）、バチルス・アレヴィ菌（Bacillus alevi）、セレウス菌（Bacillus cereus）、バチルス・バディウス菌（Bacillus badius）、バチルス・チューリギエンシス菌（Bacillus thurigiensis）、エンテロコッカス・フェシウム菌、及びペディオコッカス・アシディラクティシィ菌（Pediococcus acidilactici）から選択される細菌である。好ましい例としては、枯草菌ＤＳＭ ３２５３９株（特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の規定に基づき、２０１７年６月１４日にＤＳＭＺに寄託された）及びその誘導体、バチルス・リヒェニホルミス菌DSM 32314株及び枯草菌DSM 32315株（ともに、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の規定に基づき、2016年5月12日にDSMZに寄託された）及びその誘導体、ケミン（Kemin）がCLOSTAT（登録商標）の商標で販売する枯草菌PB6株（米国特許第７，２４７，２９９号に記載され、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−６７３７として寄託）、カルピスがCALSPORTN（登録商標）として販売する枯草菌Ｃ−３１０２株（米国特許第４，９１９，９３６号に記載され、FERM BP-1096として、日本の産業科学技術庁の発酵研究所に寄託）、クリスチャン・ハンセン（Chr. Hansen）がＧａｌｌｉＰｒｏ（登録商標）の商標で販売する枯草菌ＤＳＭ１７２９９株、クリスチャン・ハンセンがＧａｌｌｉＰｒｏＴｅｃｔ（登録商標）の商標で販売するバチルス・リヒェニホルミス菌ＤＳＭ １７２３６株、クリスチャン・ハンセンがＢｉｏＰｌｕｓ（登録商標）ＹＣとして販売するバチルス・リヒェニホルミス菌ＤＳＭＺ ５７４９株と枯草菌ＤＳＭＺ ５７５０胞子株の混合物、Ａｄｉｓｅｏ／ＮｏｖｏｚｙｍｅｓがＡｌｔｅｒｉｏｎ（登録商標）の商標で販売する枯草菌ＤＳＭ ２９７８４株、クリスチャン・ハンセンがＰＯＲＣＢＯＯＳＴ（登録商標）として販売する枯草菌、又は、米国特許第６，８４９，２５６号に記載されるバチルス・コアギュランス菌株があげられる。他の非バチルス菌プロバイオティクス、例えば、出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）、メタノール資化酵母（Pichia pastoris）、クロコウジカビ（Aspergillus niger）、コウジカビ（Aspergillus oryzae）、またはハンゼヌラ（Hansenula）等もまた、本発明の組成物に用いてよい。特に、ヒトの健康に有用であることが知られているさらなるプロバイオティクス、例えば、乳酸菌産生細菌、特に乳酸桿菌、又はビフィズス菌を食品組成物に用いてよい。これらのさらなるプロバイオティクスが、本発明の組成物の一部として処方されない場合は、それらを、本発明の組成物とともに（同時に、又は異なる時間に）投与してよい。

本発明に用いることができるプレバイオティクスは、好ましくは、オリゴ糖、特に、ガラクトオリゴ糖、シライルオリゴ糖（silayloligosaccharides）、ラクツロース、ラクトスクロース、フルクトオリゴ糖、パラチノース又はイソマルトースオリゴ糖、グリコシルスクロース、マルトオリゴ糖、イソマルトオリゴ糖、シクロデキストリン、ゲンチオオリゴ糖、ダイズオリゴ糖、キシロオリゴ糖、デキストラン、ペクチン、ポリガラクツロナン、ラムノガラクツロナン、マンナン、ヘミセルロース、アラビノガラクタン、アラビナン、アラビノキシラン、耐性デンプン、メビオース（mehbiose）キトサン、アガロース、イヌリン、タガトース、ポリデキストロース、及びアルギン酸塩から選択されるオリゴ糖である。

本発明の飼料組成物に用いることができ、かつ、飼料の消化を促進しうる酵素は、フィターゼ（EC 3.1 .3.8又は3.1.3.26）、キシラナーゼ（EC 3.2.1.8）、ガラクタナーゼ（EC 3.2.1.89）、ガラクトシダーゼ、特にα−ガラクトシダーゼ（EC 3.2.1.2２）、プロテアーゼ（EC 3.4）、ホスホリパーゼ、特にホスホリパーゼＡ１（EC 3.1.1.32）、ホスホリパーゼＡ２（EC 3.1.1.4）、ホスホリパーゼＣ（EC 3.1.4.3）及びホスホリパーゼＤ（EC 3.1.4.4）、リゾホスホリパーゼ（EC 3.1.5）、アミラーゼ、特にα−アミラーゼ（EC 3.2.1.1）；リゾチーム（EC 3.2.1.17）、グルカナーゼ、特にβ−グルカナーゼ（EC 3.2.1.4又はEC 3.2.1.6）、グルコアミラーゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼ、又はそれらの混合物から選択されるのが好ましい。

市販のフィターゼの例としては、Ｂｉｏ−Ｆｅｅｄ（商標）フィターゼ（ノボザイム）、Ｒｏｎｏｚｙｍｅ（登録商標）Ｐ及びＨｉＰｈｏｓ（商標）（DSMニュートリショナル・プロダクツ）、Ｎａｔｕｐｈｏｓ（商標）（ＢＡＳＦ）、Ｆｉｎａｓｅ（登録商標）及びＱｕａｎｔｕｍ（登録商標）Ｂｌｕｅ（ＡＢエンザイム）、Ｐｈｙｚｙｍｅ（登録商標）ＸＰ（ベレニウム／デュポン）及びＡｘｔｒａ（登録商標）ＰＨＹ（デュポン）があげられる。他の好ましいフィターゼとしては、例えば、国際公開第９８／２８４０８号、国際公開第００／４３５０３号、及び国際公開第０３／０６６８４７号に記載されたものがあげられる。

市販のキシラナーゼの例としては、Ｒｏｎｏｚｙｍｅ（登録商標）ＷＸ及びＧ２（DSMニュートリショナル・プロダクツ）、Ｅｃｏｎａｓｅ（登録商標）ＸＴ及びＢａｒｌｅｙ（ＡＢビスタ）、Ｘｙｌａｈｉｎ（登録商標）（Ｖｅｒｅｎｉｕｍ）及びＡｘｔｒａ（登録商標）ＸＢ（キシラナーゼ／β−グルカナーゼ、デュポンＤ）が挙げられる。市販のプロテアーゼの例としては、Ｒｏｎｏｚｙｍｅ（登録商標）ＰｒｏＡｃｔ（DSMニュートリショナル・プロダクツ）があげられる。

本発明で用いることができるビタミンは、例えば、ビタミンＡ、ビタミンＤ３、ビタミンＥ、ビタミンＫ３等のビタミンＫ、ビタミンＢ１２、ビオチン、コリン、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ６、ナイアシン、葉酸及びＣａ−Ｄ−パントテン酸塩等のパントテン酸塩、又はそれらの組み合わせである。

用いることができる免疫調節因子は、例えば、抗体、サイトカイン、噴霧乾燥血漿、インターロイキン、又はインターフェロン、又はそれらの組み合わせである。

本発明で用いることができる鉱物は、例えば、ホウ素、コバルト、塩化物、クロム、銅、フッ化物、ヨウ素、鉄、マンガン、モリブデン、セレン、亜鉛、カルシウム、マグネシウム、カリウム、又はナトリウム、又はそれらの組み合わせである。

本発明で用いることができるアミノ酸は、例えば、リジン、アラニン、トレオニン、メチオニン又はトリプトファン、又はそれらの組み合わせである。

したがって、本発明のさらなる実施形態は、動物用飼料組成物を調製する方法であって、特に、動物の健康、特に腸の健康を高めるのに有効な量の、本発明の、少なくとも１つの菌株、及び／又は少なくとも１つの調製物、及び／又は少なくとも１つの濃縮組成物を、飼料成分、例えば、タンパク質、脂質、及び／又は炭水化物、並びに、場合によっては、さらに有益な物質、好ましくは、上記物質、と混合して、飼料製品を提供することを含む、方法である。この方法には、例えば、ペレット化工程も含むことができる。

乾燥又は半湿潤飼料の押出加工を含む、当業者に公知の標準的なペレット加工プロセスを用いてよい。好ましいペレット化温度は、約６５℃〜約１２０℃である。

本発明の菌株及び組成物としては、例えば米国特許第６，０６０，０５１号、欧州特許第０２８７６９９号又は米国特許出願公開第２０１４／００１０７９２号に記載された培地及び他の方法を用いることがあげられ、当該分野で周知の方法で、本発明の菌株及び組成物を培養して獲得しうる。従来の大規模微生物培養プロセスとしては、液中発酵、固体発酵、又は液体表面培養があげられる。発酵終了が近づいて栄養が枯渇すると、菌株の細胞は、成長期から胞子形成期へ移行を開始し、その結果、発酵の最終産物は、主として、胞子、代謝産物及び残留発酵培地となる。胞子形成は、これらの株の自然な生活環の一部であり、一般に、栄養制限に応じて、細胞により開始される。発酵により、枯草菌の細胞コロニー形成単位のレベルが高くなり、胞子形成が促進される。発酵により生じる培地中の細菌細胞、胞子及び代謝物を、直接用いることもできるし、遠心分離、接線流ろ過、深層ろ過、及び蒸発等の従来の工業的方法で濃縮することもできる。濃縮発酵培養液は、例えば、ダイアフィルトレーション法により洗浄して、残留発酵培地及び代謝物を除去することができる。

発酵培養液又は培養液濃縮物は、担体の添加の有無にかかわらず、噴霧乾燥、凍結乾燥、トレー乾燥、流動床乾燥、ドラム乾燥、又は蒸発等の従来の乾燥プロセス又は方法を用いて乾燥させることができる。得られた乾燥生成物は、特定の粒子サイズ又は物理的フォーマットを達成するために、粉砕又は顆粒化等によりさらに処理されてもよい。また、上記のように、担体は、乾燥後に添加されてもよい。

本発明の菌株の調製物は、細胞残屑を含有する無細胞調製物又は調製物、又は無傷細胞及び細胞残屑の混合物を含有する調製物であってもよい。本発明の菌株の無細胞調製物は、例えば、発酵培養液の遠心分離、及び／又は濾過により得ることができる。用いる技術によっては、これらの無細胞調製物は細胞が完全に存在しないわけではなく、僅かに少量の細胞を含む場合がある。細胞は代謝産物、酵素、及び／又はペプチド等の化合物を周囲の培地中に分泌するため、細胞上清は、細胞により分泌されるような、上記化合物、特に代謝産物、酵素、及び／又はペプチドの混合物を含む。したがって、本発明の好ましい実施形態では、当該菌株の調製物は、発酵培養液の上清である。

菌株の細胞片を含む組成物は、当業者に公知の技術、例えば機械的手段により、又は高圧を適用して、細胞を破砕することにより、得ることができる。適用される力の程度に応じて、破壊細胞のみを含む組成物、又は細胞片と無傷の細胞との混合物を含む組成物が得られる。細胞の均質化は、例えば、フレンチセルプレス、ソニケーター、ホモジナイザー、マイクロフルイダイザー、ボールミル、ロッドミル、ペブルミル、ビーズミル、高圧研削ロール、垂直シャフトインパクター、工業用ブレンダー、高剪断ミキサー、パドルミキサー、及び／又はポリトロンホモジナイザーを用いて実現することができる。適切な代替手段としては、細胞の酵素的、及び／又は化学的な処理である。

本発明の無細胞調製物はまた、上記技術を適用することにより、最初に細胞を破砕した後、細胞片及び残りの無傷細胞を除去して得られる調製物を、含む。細胞片及び残存する無傷細胞は、特に、遠心分離、及び／又は濾過により除去することができる。

本発明の菌株の調製物は、活性化合物として、少なくとも１つの代謝産物、好ましくは、以下に記載される代謝産物の混合物、及び／又はプロテアーゼ、特にスブチリシン、キシラナーゼ、及び／又はセルラーゼ、及び／又は少なくとも１つのペプチド、及び／又はそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つの酵素を含んでよい。

本発明の菌株に含まれる、及び／又は上記の細胞調製物に含まれる、代謝産物の有効な混合物を含む調製物は、例えば、米国特許第６，０６０，０５１号に記載の方法により得ることができる。特に、当該調製物は、上記調製物に含まれるような、酢酸エチル等の有機溶媒を用いて代謝物を沈殿させた後、沈殿した代謝物を適当な溶媒中に再溶解することにより得ることができる。その後、分子量カットオフに基づいて代謝産物を様々な画分に分類する、サイズ排除濾過により代謝産物を精製することができる。

本発明の代謝物の有効な混合物を含有する当該調製物は、好ましくは、本発明の菌株の、少なくとも５つ、より好ましくは少なくとも６、７、８、９、１０又は１２、特に、全ての代謝物を含む。ＤＳＭ ３２５４０株の代謝物の含有量を表５．１に示す。代謝産物の分子量は、好ましくは４００〜４０００ダルトン、より好ましくは５００〜３５００ダルトンである。

好ましくは、本発明によれば、本発明の実施形態では、本発明の菌株、及び／又は調製物、及び／又は組成物の有効量が、用いられる。用語「有効量」とは、本発明の菌株及び／又は製剤、及び／又は組成物は投与されないが、（飼料及び他の化合物を含む）同じ食餌を投与される動物と比較して、動物、及び／又は環境に対して、特に上記特徴に関して、少なくとも１つの有益な効果を及ぼす量をいう。

治療用途の場合、本発明の菌株、及び／又は製剤、及び／又は組成物の処置量が用いられるのが好ましい。用語「処置量」とは、動物の病的状態を改善、好転、又は予防するのに十分な量をいう。当業者であれば、種々の動物に対する最適投与量レベルを、とりわけ、（ｉ）種々の用量で腸内における病原菌を阻害又は低下させる、（ｉｉ）有用細菌のレベルを高める又は維持する、及び／又は（ｉｉｉ）種々の用量で、動物の健康、特に腸の健康を高める、組成物の効能を評価することにより、容易に決定することができる。

消化管における生存に関連する菌株の特徴
種々の環境試料から枯草菌株をスクリーニングし、動物への直接給餌微生物／プロバイオティクスとして優れた菌株を獲得した。この菌株は、標的動物の腸内でその潜在能力を最大限に発揮することを目的とするため、種々の環境条件及び消化管関連条件に耐性である菌株を予めスクリーニングした。菌株胞子を生成させて（Nicholson及びSetlow 1990）、洗浄し、８０℃で２０分間インキュベート（低温殺菌）した後、仔牛浸出ブロス寒天培地（veal infusion; VI, Difco（商標）, no. 234420, Becton Dickinson GmbH, Heidelberg, Germany)を用いて、10倍希釈液中対数/１で滴定した。非増殖前で希釈度が2番目に高い液を-80℃で保存し、胞子状態以降の全ての評価で標準出発点として用いた。Larsen et al.(2014)に基づき、酸暴露の生存率を評価して、胃の通過をシミュレートした(Argenzio 2004a; Trampel and Duke 2004)。栄養細胞の増殖を、胃／前胃及び砂嚢の条件下での増殖を示す低ｐＨ、及び４ｍＭまでの胆汁（B8631、CAS 8008-63-8、Sigma-Aldrich）の存在下で、ｐＨ７で評価して、胃又は砂嚢のクリアランス直後の小腸近位部における菌株の増殖を確認した（Argenzio 2004b; Trampel and Duke 2004）。嫌気性の腸における菌株の適応度（Argenzio 2004b; Trampel and Duke 2004）を、嫌気性条件下、２．５ｍＭ ＫＮＯ_３添加ＶＩ培地（Glaser et al, 1995）に標準化胞子溶液（AnaeroPakTM, Thermo Fisher Scientific）を接種して、評価した。さらに、菌株の嫌気性タンパク質分解活性及び細胞分解活性を、１％スキムミルク粉末（70166、Sigma-Aldrich）又は０．１％水不溶性ＡＺＣＬ−ＨＥセルロース（I-AZCEL, Megazyme International, Bray, Ireland）を添加したＶＩ寒天平板培地で、評価した。

さらに、菌株の好気性細胞溶解活性を、０．１％水不溶性ＡＺＣＬ−ＨＥセルロース（I-AZCEL, Megazyme International, Bray, Ireland）添加ＶＩ寒天培地を用いて、評価した。好気性条件下で２４時間後、寒天の青色コロニー化はセルラーゼ活性を示した。

浸透圧ストレスは、消化管でもみられるが（Argenzio 2004b; Trampel and Duke 2004）、これを、１０質量％ＮａＣｌ添加ＶＩ寒天上における増殖を測定して、評価した（den Besten et al. 2009）。最後に、胞子を９９℃で２０分間曝露（Palop et al. 1996）した後、ＶＩ寒天培地に接種して、ペレット化安定性を測定することにより、胞子の熱安定性を評価した。

枯草菌株ＤＳＭ ３２５４０は模擬胃通過後も生存し、ｐＨ６から菌株の増殖が観察された。ＤＳＭ ３２５４０株は嫌気的に培養することができ、嫌気性条件下で水不溶性セルロース及びタンパク質を分解することができた。さらに、好気性条件下で、水不溶性セルロースを分解することができた。ＤＳＭ ３２５４０株は、２ｍＭ及び４ｍＭの胆汁存在下、０．３質量％のブタ胆汁の存在下、０．３質量％のニワトリ胆汁の存在下、及び１０質量％のＮａＣｌの存在下で増殖することができた。ＤＳＭ ３２５４０株の平均胞子数は９．１×１０^８ＣＦＵ／ｍＬであり、ＤＳＭ ３２５４０株の胞子は、９９℃で２０分間曝露した後も生存することができた。

参考文献

動物栄養用の直接給餌微生物（ＤＦＭ）／プロバイオティクスの技術水準に関連する菌株の機能の比較−胆汁耐性の定量的評価
実施例１で選択した枯草菌株ＤＳＭ ３２５４０の競合能を評価するために、市販の枯草菌株ＤＳＭ １７２９９、及び／又はバチルス・リヒェニホルミス菌株ＤＳＭ １７２３６を用いて、ベンチマーク分析を行った。近位小腸で行う菌株の準備（Argenzio 2004b; Trampel and Duke 2004）として、胃通過直後の中性ｐＨの胆汁の存在下、０．３質量％ブタ胆汁（Sigma-Aldrich）添加ＶＩＢ培地での菌株培養により、測定した。候補菌株の細胞懸濁液５０ｕＬ、及び１０ｍＬのＶＩＢ、を含む１００ｍＬの三角フラスコ中で３７℃、２００ｒｐｍ、インキュベートした後、一晩培養物約５０ｕＬと、ｐＨ７の０．３質量％のブタ胆汁を含むＶＩＢの１ｍＬとを、１００ウェルハニカムプレート（Oy Growth Curves Ab Ltd, former Thermo Labsystems, Helsinki, Finland）に移して、ＯＤ０．２／ｍＬを得た。ＢｉｏＬｉｎｋソフトウェアパッケージ（Oy Growth Curves Ab Ltd）を用いたＢｉｏｓｃｒｉｅｎ Ｃ ＭＢＲを用いて、１５分毎にＯＤを測定し、３７℃、２００ｒｐｍで４８時間、菌株特異的増殖を観察した。各菌株の定量的評価は、０〜５時間の曲線下面積（ＡＵＣ５、ＯＤ×時間（ｈ））、０〜１０時間の曲線下面積（ＯＤ×時間（ｈ）のＡＵＣ１０）、及び菌株が最大光学濃度（Ｔｍａｘ（ｈ））に達するまでの時間として、比較した。結果を表２．１に示す。
表２．１．枯草菌株ＤＳＭ ３２５４０及び基準株ＤＳＭ １７２９９及びＤＳＭ １７２３６株、０．３質量％のブタ胆汁の存在下での増殖

ＡＵＣ５：光学濃度０〜５ｈの曲線下面積×ｈ、ＡＵＣ１０：光学濃度０〜１０ｈの曲線下面積×ｈ、Ｔｍａｘ：最大光学濃度到達時間（ｈ）
直接比較すると、ＤＳＭ ３２５４０株は、０．３質量％のブタ胆汁存在下で、基準株ＤＳＭ １７２９９よりも１６．７５時間早く、基準株ＤＳＭ １７２３６よりも２７．５時間早く、最大ＯＤに達した。さらに、ＤＳＭ ３２５４０株は、ＤＳＭ １７２３６株の増殖と比較して、最初の５時間で２．７倍、最初の１０時間で３．２倍、最初の３０時間で２．１倍速く、増殖した。さらに、ＤＳＭ ３２５４０株は、０．３％のニワトリ胆汁の存在下で増殖することができる。

参考文献

動物栄養用の直接給餌微生物（ＤＦＭ）／プロバイオティクスの技術水準に関連する菌株の性能の比較−短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）存在下での増殖
ＤＳＭ ３２５４０株とＤＳＭ １７２９９株の増殖を、短鎖脂肪酸の存在下で、大腸についてより重要となる消化管で観察して比較し、評価した（Argenzio 2004b; Trampel and Duke 2004）。試験は、実施例１に記載の標準化された胞子溶液を用いて開始し、３７℃、ｐＨ６のＶＩ培地で、好気性菌培養して試験した。増殖対非増殖をパラメータとして読み取った。この試験では、Ｍｃｌｌｖａｉｎｅ緩衝液（Palop et al. 1996）を用いてＶＩ培地をｐＨ６に調製後、０，０５％酢酸（HA, 537020, CAS 64-19-7, Sigma-Aldrich）、０，０５％プロピオン酸（HP, P1386, CAS 79-09-4, Sigma-Aldrich）又は０，２％乳酸（HL, W261106, CAS 50-21-5, Sigma-Aldrich）を添加した。結果を表３．１に示す。
表３．１．枯草菌株ＤＳＭ ３２５４０及び基準株ＤＳＭ １７２９９のｐＨ６における、短鎖脂肪酸存在下での増殖評価

枯草菌株ＤＳＭ ３２５４０は酢酸、プロピオン酸及び乳酸の存在下、ｐＨ６で増殖できたが、ＤＳＭ １７２９９株は上記条件下では、胞子段階で増殖しなかった。

参考文献

動物栄養用の直接給餌微生物（ＤＦＭ）／プロバイオティクスの技術水準に関連する菌株の性能の比較−酵素活性の定量的評価
実施例２で行った試験と同様に、ＤＳＭ ３２５４０株、ＤＳＭ １７２９９株及びＤＳＭ １７２３６株の好気性キシラン分解活性を評価して、比較した。キシラナーゼ活性はLarsen et al. (2014)に記載されているように測定した。分析は、３回の独立実験系で行い、その後、ミリ単位／マイクロリットル溶液として平均化した。

表４．１．ＤＳＭ ３２５４０株、ＤＳＭ １７２９９株及びＤＳＭ １７２３６株のキシラナーゼ活性

直接比較では、ＤＳＭ ３２５４０株は、基準株ＤＳＭ １７２３６と比較すると、キシラナーゼ活性が１．５倍高く、基準株ＤＳＭ １７２９９と比較しても、同様のキシラナーゼ活性を呈した。

参考文献

動物栄養用の直接給餌微生物（ＤＦＭ）／プロバイオティクスの技術水準に関連する菌株の性能の比較−代謝産物の発現及び病原体阻害
実施例２で行った試験と同様、ＤＳＭ ３２５４０株及び野生型株ＤＳＭ １０株を比較し、各培地で発現した代謝産物及び増殖阻害された病原体の数を、各々評価した。代謝産物発現分析については、出発培養物を培養して、Scholz et al. (2011)に記載されているように試験を行った。１００ｍＬフラスコで、１０ｍＬのＬｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｍｉブロス（LB, Thermo Fisher Scientific）を３７℃、１６０ｒｐｍで２４時間培養した培養液１００ ｕＬを、主培養物に用いた。主培養物を、０．２ｍＬ／ＬのＫｅｌｌｙＴ微量金属溶液（LBKelly, Scholz et al. 2011）を含む１０ｍＬのＬＢ、又は０．６％酵母抽出物を含む１０ｍＬのトリプチケーゼソイブロス（(Oxoid, Thermo Fisher Scientific）（Y1625, CAS 8013-1-2, Sigma-Aldrich; 得られる培養液は「TSBYE」と略す）のいずれかを用いて、ともに１００ｍＬフラスコ内で３７℃、２４時間、１６０ｒｐｍで培養した。主培養物の４ｍＬを、１５ｍＬ試験管で、２ｍＬのｎ−ブタノールと混合し、３分間ボルテックスした後、１５分間超音波処理した。５０００ｒｐｍ、１分間遠心後、有機相を取り出して、真空乾燥し、高速液体クロマトグラフィー−エレクトロスプレーイオン化質量分析（HPLC-ESI-MS; Chen et al. 2006）を用いて、分析した。全ての試料を、負及び正の２つの異なるモードで測定し、質量スペクトルを得た。Teo and Tan (2005)で同様に報告されたピークの結果を、Ｄａ（ダルトン）の分子量に換算し、その結果を表５．１に示す。

表５．１．（ａ） ＬＢ−Ｋｅｌｌｙ及びＴＳＢＹＥにおける、ＤＳＭ ３２５４０株及び野生型ＤＳＭ １０株で各々発現した代謝産物の比較
（ｎ／ｄは検出されなかったことを意味する）

表５．１．（ｂ） ＬＢ−Ｋｅｌｌｙ及びＴＳＢＹＥにおける、ＤＳＭ ３２５４０株及び野生型ＤＳＭ １０株で各々発現した代謝産物の比較
（ｎ／ｄは検出されなかったことを意味する）

さらに、表５．１の代謝産物の一部として、詳細は検討されていないが、枯草菌の二次代謝産物産生を介した病原体阻害を、ウェル拡散拮抗試験（Parente et al. 1995）を用いて評価した。

７種類の異なる病原体、ウェルシュ菌、ディフィシル菌ＤＳＭ １２９６株、エンテロコッカス・セコラム菌ＤＳＭ ２０６８３株、黄色ブドウ球菌亜種アウレウス菌ＤＳＭ ２０２３１株、ガリナセウス菌ＤＳＭ １５３４９株、豚レンサ球菌ＡＴＣＣ ４３７６５株及びカンピロバクター・コリ菌ＡＴＣＣ ３３５５９株を用いたウェル拡散拮抗試験を行った。

３種類の病原性ウェルシュ菌の候補を、Teo and Tan (2005)由来のウェルシュ菌基準株ＡＴＣＣ １３１２４株及び、RIPAC-LABOR GmbH, Potsdam-Golm, Germany由来のブタ由来の２種類の病原性ウェルシュ菌野外分離株を用いて試験した。Ripac由来のウェルシュ菌Ｃ型株について、壊死性腸炎陽性ブタ消化管からＢＢ−０８１＿Ｃｐｅ株及びＢＢ−０３１＿Ｃｐｅ株が分離されたことを報告する。ＢＢ−０８１＿Ｃｐｅ株はｃｐｂ２陽性（Songer et al. 2005）、ｎｅｔＢ陰性であり、試験したＢＢ−０３１＿Ｃｐｅ株はβ２−トキシン陽性（(Allaart et al. 2012）であった。ＡＴＣＣ １３１２４株は、クロストリジウム菌の基準株として機能するＡ型α毒素産生株であることが知られている。

ディフィシル菌は、主として新生ブタの下痢の原因である重要な新興病原体である（Songer et al. 200）。罹患した子ブタは呼吸困難、腹部膨満、陰嚢浮腫を呈することがある。下痢は、全ての罹患ブタで発症するわけではない。ＤＳＭ １２９６株は、ディフィシル菌の公知の基準株であり、細胞毒素を産生する。

黄色ブドウ球菌亜種アウレウス菌は、ニワトリの趾瘤（McMullin 2004）、雌ブタの連鎖球菌性乳房炎（Contreras et al. 2011）の原因となり、ヒトの食中毒の原因となる毒素を産生する（2016 Centers for Disease Control and Prevention）。ＤＳＭ ２０２３１株は、血清型３基準株である。

エンテロコッカス・セコラム菌は、通常、関節、及び／又は骨の組織の炎症により誘発されるブロイラーの跛行、関節炎及び骨髄炎の原因として知られている。さらに、エンテロコッカス・セコラム菌は、心膜炎の原因となりうる[Kense et al. 2011]。ＤＳＭ ２０６８３株は、ニワトリの盲腸から単離した。

ガリナセウス菌は家禽の敗血症の原因となる場合がある。肉眼的病変としては、脾腫、肝腫、腎腫及びうっ血があげられる。弁膜性心内膜炎に関連した、肝臓及び脾臓の壊死、及び／又は複数部位における梗塞も観察されている[Collins et al. 2002]。

豚レンサ球菌はブタの重要な病原体であり、離乳後の子ブタの細菌性死亡の最も重要な原因の１つであり、敗血症、髄膜炎、その他多くの感染症の原因である[Goyette-Desjardins et al. 2014]。ＡＴＣＣ ４３７６５株は血清群Ｒ；血清型２に属し、ブタから分離された。

カンピロバクター・コリ菌は食中毒菌で、ほとんどの場合、ヒトが当該細菌を含む豚肉を摂取することで、感染する。ヒトの胃腸炎、急性腸炎、急性下痢性疾患の原因である[Fitzgerald et al. 2007]。ブタが主な宿主であるが、ヒト、家禽類、その他様々な動物にも感染しうる。ブタの糞便からＡＴＣＣ ３３５５９株を分離した。

バチルス菌株を、１００ｍＬの振盪フラスコ中の、１０ｍＬのＴＳＢＹＥ（３０ｇ／ＬのＴＳＢ＋６ｇ／Ｌの酵母抽出物）、又は、ＬＢ−Ｋｅｌｌｙ（ＤＳＭＺ培地１０３２の微量元素溶液を添加したＬＢ−培地）で、３７℃、２００ｒｐｍ、１６時間培養した。病原菌株を、適当な条件下で、５９５ｎｍの光学濃度が少なくとも１になるまで、液体培養して増殖させた後、１００μｌを寒天プレートの表面に、滅菌スパチュラに播種した。ガリナセウス菌にはＢＨＩ寒天平板培地を、その他の病原菌株にはすべてＴＳＢＹＥ寒天平板培地を用いる。直径９ｍｍのウェル３個を乾燥プレートに切断した。第１のウェルを非接種培地対照として培養せずに使用し、第２のウェルには、１００ｕＬの非阻害性バチルス菌株（バチルス・セレウス菌変種トヨイ菌（Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ ｖａｒ．ｔｏｙｏｉ、ＮＣＩＭＢ ４０１１２株）を接種し、第３のウェルには１００ｕＬの枯草菌ＤＳＭ ３２５４０株又はＤＳＭ １７２９９株の培養液を接種した。適切な条件下で、３７℃、２４時間インキュベートした後、切断したウェルの縁からクリアランスしたローン（lawn）の境界までを測定して、mm単位のクリアランスゾーンを決定した。各コロニーを２回（水平、垂直）測定した後、平均化した。その結果を以下の表に示す。

表５．２：ＬＢ−Ｋｅｌｌｙ培地での、ウェル拡散拮抗アッセイにおける、枯草菌ＤＳＭ ３２５４０株、ＤＳＭ １７２３６株及びＤＳＭ １７２９９株の病原性クロストリジウム菌阻害能の比較、病原菌のクリアランスｍｍ値

上記データから、ＤＳＭ ３２５４０株は、特にＤＳＭ １７２９９と比較して、ウェルシュ菌及びディフィシル菌の増殖を極めて効果的に阻害できることが示される。

表５．３：ＬＢ−Ｋｅｌｌｙ培地でのウェル拡散拮抗アッセイにおける、枯草菌ＤＳＭ ３２５４０株、ＤＳＭ １７２３６株及びＤＳＭ １７２９９株の、病原性のブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）及びカンピロバクターに対する阻害能の比較、病原菌のクリアランスｍｍ値

上記データから、ＤＳＭ ３２５４０株は、特にＤＳＭ １７２９９株と比較して、黄色ブドウ球菌亜種アウレウス菌、ガリナセウス菌、豚レンサ球菌及びカンピロバクター・コリ菌の増殖を、極めて効果的に阻害できることが示される。

表５．４：ＴＳＢＹＥ培地でのウェル拡散拮抗アッセイにおける、枯草菌ＤＳＭ ３２５４０株、ＤＳＭ １７２３６株及びＤＳＭ １７２９９株の、病原性エンテロコッカス・セコラム菌に対する阻害能の比較、病原菌のクリアランスｍｍ値

上記データから、ＤＳＭ ３２５４０株は、特にＤＳＭ １７２９９株と比較して、エンテロコッカス・セコラム菌の増殖を、極めて効果的に阻害できることが示される。

参考文献

抗酸化酵素活性の定性的評価
熱ストレス等のストレス過多条件が原因となる酸化ストレス(Lin et al., 2006)では、活性酸素種が存在すると、ＤＮＡ、タンパク質又は脂質の損傷の原因となる。プロバイオティクスは、抗酸化酵素活性を高めて、宿主の酸化的防御システムを増強しうる(Aluwong et al., 2013, Mishra et al., 2015)。そこで、抗酸化酵素活性、特にスーパーオキシドジスムターゼ及びカタラーゼ活性について、ＤＳＭ ３２５４０株をスクリーニングした。

当該菌株の培養バイオフィルムのカタラーゼ活性を評価するため、当該菌株を、振盪フラスコ中のグルコース添加ＬＢ培地で、３７℃、２００ｒｐｍで１５時間培養した。培養物を光学濃度ＯＤ_６００で１．０に調整して、１０μｌの培養物をＴＳＢＹＥ（３０ｇ／ｌのＴＳＢ＋６ｇ／ｌの酵母抽出物）又はＬＢ−Ｋｅｌｌｙ（ＤＳＭＺ培地１０３２の微量元素溶液を添加したＬＢ−培地）寒天プレート上に播種して、３７℃で好気性条件下、及び３７℃で０．２％酸素下、で１５時間インキュベートし、３％Ｈ_２Ｏ_２（過酸化水素溶液３％、Sigma-Aldrich（登録商標））をコロニー上に滴下して、カタラーゼ活性を分析した。Ｈ_２Ｏ_２からのＯ_２及びＨ_２Ｏの生成であり、コロニーに泡が形成されることを、パラメータとして読み取った。

表６．１． 好気性条件下での、ＬＢ−Ｋｅｌｌｙ培地又はＴＳＢＹＥ培地における枯草菌株ＤＳＭ ３２５４０のバイオフィルムのコロニーのカタラーゼ活性の評価

枯草菌株ＤＳＭ ３２５４０を、好気性条件下で増殖すると、カタラーゼ活性を示した。

表６．２． ０．２％酸素下、ＬＢ−Ｋｅｌｌｙ培地又はＴＳＢＹＥ培地における枯草菌株ＤＳＭ ３２５４０のバイオフィルムのコロニーのカタラーゼ活性の評価

枯草菌株ＤＳＭ ３２５４０は、０．２％酸素下で増殖させた場合にも、カタラーゼ活性を示した。

好気性条件下で培養した浮遊細胞から得たタンパク質抽出物についても、カタラーゼ活性を分析した。ＤＳＭ ３２５４０株を、振盪フラスコ中のグルコース添加ＬＢ培地で、３７℃、２００ｒｐｍで、１５時間培養した。８ｍｌの細胞培養物を、４℃、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離したものを回収し、ペレットをｐＨ７．３のＰＢＳに再懸濁した。リボライザーを用いて、可溶性細胞抽出物を得た。破壊細胞を４℃、１３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、得られた上清を次の工程に用いた。タンパク質抽出物のタンパク質濃度は、牛血清アルブミンを標準としたブラッドフォード法(Bradford, 1976)で測定した。タンパク質抽出物の濃度をｐＨ７．３のＰＢＳで調製し、タンパク質抽出物を天然試料ローディングバッファー（２ｘ、ＶＷＲ）と混合して、ネイティブゲル電気泳動（１０％非変性ポリアクリルアミドゲル、Biorad）を適用し、タンパク質を４℃で分離した。次に、浮遊細胞由来の細胞抽出物のカタラーゼ活性を、１％ＦｅＣｌ_３及び１％Ｋ_３Ｆｅ（ＣＮ）_６の染色溶液中で、ゲルを染色して、検出した（Woodbury et al., 1971）。カタラーゼ活性は明るいバンドとして観察しうる。

枯草菌株ＤＳＭ ３２５４０は、試験したこれらの特異的条件下でも、カタラーゼ活性を示した。

同様に好気性条件下で培養した細胞由来のタンパク質抽出物のスーパーオキシドジスムターゼ活性もまた、分析した。上記の方法により細胞抽出物を獲得して、４℃でネイティブゲル電気泳動を行い、タンパク質を分離した。スーパーオキシドジスムターゼ活性は、Beauchamp and Fridovich (1971)出典のニトロブルーテトラゾリウム染色法で、ゲルを染色して、検出した。

枯草菌株ＤＳＭ ３２５４０は試験した条件下で、スーパーオキシドジスムターゼ活性を示した。

参考文献

乳酸産生の検出
ｉｎ ｖｉｔｒｏの研究によれば、病原体複製は、低分子量物質が介在すると阻害されることが示されている(Oelschlager 2010)。このリストの上位には、乳酸等の短鎖脂肪酸があげられる(Oelschlager 2010)。病原体が阻害される理由として考えられるのは、乳酸産生によるｐＨの低下である(Fuller 1992)。乳酸菌は、動物飼料のプロバイオティクスとしても用いられており、炭水化物の発酵では、乳酸は主要最終産物として生成されることが知られている(Halasz 2009)。枯草菌株ＤＳＭ ３２５４０は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで乳酸を産生しうることが示されている。

枯草菌株ＤＳＭ ３２５４０、及び、乳酸を産生することが知られているプロバイオティック桿菌であるバチルス・トヨネンシス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｏｙｏｎｅｎｓｉｓ）を比較して、嫌気性乳酸産生を評価した。乳酸産生の測定は、以下のように行った：菌株の前培養物を、１０ｍＬのＴＳＢＹＥ（３０ｇ／ｌのＴＳＢ＋６ｇ／ｌの酵母抽出物）で、３７℃、一晩培養した。主培養物を、１５ｍｌのファルコンチューブにて、ＯＤ_６００が０．２である、１０ｍｌの２５ｇ／ｌショ糖及び５ｍＭＫＮＯ_３添加ＴＳＢＹＥに接種し、３７℃で４８時間、無振盪で培養した。上清中の乳酸を、ＨＰＬＣ−ＵＶで測定した。

枯草菌株ＤＳＭ ３２５４０の乳酸産生は、バチルス・トヨネンシス菌のプロバイオティック株と比較して、概ね５０％高い。

参考文献

新規枯草菌株ＤＳＭ ３２５４０を給餌した中国で飼育したブタの成績の比較
実験は、１６８頭の２５日間離乳した子ブタ（ランドレース（Ｌａｎｄｒａｃｅ）×ヨークシャ（Ｙｏｒｋｓｈｉｒｅ））を対象とし、無作為に３つの処理群に割り付け（表８．１）、これを８区（反復）にし、各区に平均６．５±０．５ｋｇの７頭をあてがった。３種類の処置は、主にトウモロコシ−大豆粕に基づき（表８．２）：１．基本制御（対照）；２．対照＋３０ｇのバージニアマイシン／飼料ＭＴ（ＡＧＰ）；３．対照＋２．０×１０^９ｃｆｕ／ｇ（ＤＳＭ ３２５４０株）含有２５０ｇ／ＭＴの枯草菌株ＤＳＭ ３２５４０株である。実験的処置として、１〜４２日齢から、マッシュ型で自由摂取させた。
表８．１：実験的処置

表８．２． 基本食餌の成分及び栄養組成

上記子ブタの体重増加、飼料転換率、飼料摂取量、及び下痢に対する処置の結果を表８．３及び８．４に示す。

表８．３．離乳後１〜４２日の成績データ

表８．４．下痢に罹患した子ブタの下痢スコア

枯草菌株ＤＳＭ ３２５４０の添加により、陰性対照と比較して、１日平均体重増加量、飼料要求率、飼料摂取量及び下痢スコアが有意に改善されたが、ＡＧＰを含む陽性対照とは同程度であった。

新規枯草菌株ＤＳＭ ３２５４０を給餌したスペインで飼育されたブタの成績の比較
試験では、離乳後２１日目の子ブタ６４頭（平均体重７．３＋０．３５ｋｇ）を２つの投与群に無作為に割り付け（表９．１）、各４匹の６区（反復）に分けた。３種類の処置は、主にトウモロコシ−大豆粕に基づき（表９．２）、１．基本制御（対照）；２．対照＋２．０×１０^９ｃｆｕ／ｇ（ＤＳＭ ３２５４０株）含有２５０ｇ／ＭＴの枯草菌株ＤＳＭ ３２５４０株である。実験的処置として、１〜４２日齢から、マッシュ型で自由摂取させた。

表９．１． 基本食餌の成分及び栄養組成物

表９．２． 枯草菌 ＤＳＭ ３２５４０株ベースの飼料添加物又は抗生物質成長促進剤を添加する飼料、及び添加しない飼料を用いた、０〜４２日齢の動物の成績。

枯草菌株ＤＳＭ ３２５４０は、陰性対照と比較して、試験したすべてのパラメータを有意に改善した。

Claims (19)

1. 以下の群：
   ａ）ＤＳＭＺに寄託番号ＤＳＭ ３２５４０として寄託された枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株；
   ｂ）前記ＤＳＭ ３２５４０株の全ての同定特性を有する、前記ＤＳＭ ３２５４０として寄託された枯草菌株の変異体；
   ｃ）前記ａ）又はｂ）の調製物；
   ｄ）前記ａ）、ｂ）又はｃ）に含まれる化合物の有効な混合物を含有する調製物；
   から選択される、枯草菌株又はその調製物。
2. 請求項１のｂ）前記ＤＳＭ ３２５４０として寄託された枯草菌株の変異体であって、前記変異体のＤＮＡ配列は、ＤＳＭ ３２５４０株のＤＮＡ配列と少なくとも９５％同一である、ＤＳＭ ３２５４０として寄託された枯草菌株の変異体。
3. 枯草菌株又はその調製物であって、前記枯草菌株が以下の：
   ａ）配列番号２で表されるポリヌクレオチド配列と、少なくとも９９．５％、好ましくは少なくとも９９．８％、とりわけ１００％の配列同一性を有する、ｙｑｆＤ配列；
   ｂ）配列番号３で表されるポリヌクレオチド配列と、少なくとも９９．５％、好ましくは少なくとも９９．８％、とりわけ１００％の配列同一性を有する、ｇｙｒＢ配列；
   ｃ）配列番号４で表されるポリヌクレオチド配列と、少なくとも９９．５％、好ましくは少なくとも９９．８％、とりわけ１００％の配列同一性を有する、ｒｐｏＢ配列；
   ｄ）配列番号５で表されるポリヌクレオチド配列と、少なくとも９９．５％、好ましくは少なくとも９９．８％、とりわけ１００％の配列同一性を有する、ｇｒｏＥＬ配列；
   の少なくとも１つ、好ましくは全てを示す、枯草菌株又はその調製物。
4. 枯草菌株が配列番号１で表されるポリヌクレオチド配列と、少なくとも９９．５％、好ましくは少なくとも９９．８％、とりわけ１００％の配列同一性を有する、１６Ｓ ｒＤＮＡ配列を表す、請求項１〜４のいずれか一項に記載の枯草菌株又はその調製物。
5. 嫌気的に増殖ができ、特に、嫌気性条件下で、水不溶性のセルロース及びタンパク質を分解することができる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の枯草菌株。
6. ウェルシュ菌（Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）ＡＴＣＣ １３１２４株；ウェルシュ菌ＢＢ−０８１＿Ｃｐｅ株；ウェルシュ菌ＢＢ＿０３１＿Ｃｐｅ株；ディフィシル菌（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＤＳＭ １２９６株；黄色ブドウ球菌亜種アウレウス菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ｓｕｂｓｐ．ａｕｒｅｕｓ）ＤＳＭ ２０２３１株；ガリナセウス菌（Ｓ．ｇａｌｌｉｎａｃｅｕｓ）ＤＳＭ １５３４９株；豚レンサ球菌（Ｓ．ｓｕｉｓ）ＤＳＭ ９６８２株；カンピロバクター・コリ菌（Ｃ．ｃｏｌｉ）ＤＳＭ ４６８９株；及びエンテロコッカス・セコラム菌（Ｅ．ｃｅｃｏｒｕｍ）ＤＳＭ ２０６８３株から選択される菌株の少なくとも１つ、好ましくは、全て菌株の増殖を阻害することができる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の枯草菌株。
7. ０．０５質量％の酢酸、０．０５質量％のプロピオン酸、及び／又は０．２質量％の乳酸の存在下で増殖することができる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の枯草菌株。
8. セルラーゼ活性、キシラナーゼ活性、カタラーゼ活性、スーパーオキシドジスムターゼ活性の少なくとも１つ、好ましくは、全ての酵素活性を呈する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の枯草菌株。
9. ２ｍＭ、好ましくは、４ｍＭの胆汁の存在下で増殖することができる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の枯草菌株。
10. 飼料又は食品中のプロバイオティック成分（ＤＦＭ）としての、請求項１〜９のいずれか一項に記載の枯草菌株又はその調製物の使用。
11. 請求項１〜９のいずれか一項に記載の枯草菌株又はその調製物と、及び好ましくは、タンパク質、炭水化物、脂肪、さらなるプロバイオティクス、プレバイオティクス、酵素、ビタミン、免疫調節剤、代用乳、ミネラル、アミノ酸、抗コクシジウム剤、酸性製品、医薬品、及びそれらの組み合わせから選択される、少なくとも１つのさらなる飼料又は食品成分と、を含む、飼料又は食品の組成物。
12. 請求項１〜９のいずれか一項に記載の枯草菌株又はその調製物、及び薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
13. 動物又はヒトの健康状態、特に腸の健康状態を改善する、請求項１１又は１２に記載の組成物。
14. 動物、特にブタ又は鳥類に、請求項１〜９のいずれか一項に記載の枯草菌株又はその調製物、及び／又は請求項１１に記載の飼料組成物、及び／又は請求項１２に記載の医薬組成物を、給餌する方法。
15. 請求項１〜９のいずれか一項に記載の枯草菌又はその調製物、又は請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の組成物を、動物又はヒトに投与して、前記動物又はヒトの健康状態、特に腸の健康状態を改善する方法。
16. 請求項１〜９のいずれか一項に記載の少なくとも１の枯草菌及び／若しくは少なくとも１のその調製物、又は請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の少なくとも１の組成物を動物に投与することにより、前記動物の健康を改善する、及び／又は、前記動物の一般的な体調を改善する、及び／又は、飼料転換率を改善する、及び／又は、前記動物の死亡率を低下させる、及び／又は、動物の生存率を高める、及び／又は、動物の体重を増加させる方法、及び／又は、動物の病気に対する抵抗力を高める、及び／又は、動物の免疫応答を高める、及び／又は、動物の健全な腸内微生物叢を確立又は維持する、及び／又は、動物の糞便を介して排泄される病原体を低下させる、方法。
17. 堆肥又は汚染された液体の有害な環境影響を制御、及び／又は回避する方法であって、堆肥、汚染された液体、落葉落枝、ピット、又は堆肥池に、請求項１〜９のいずれか一項に記載の少なくとも１の枯草菌、及び／又は少なくとも１のその調製物、及び／又は請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の少なくとも１の組成物、を適用する工程を含む、方法。
18. 水又は水溶液、特に飲料水又は飼育水、の水質を制御、及び／又は改善する方法であって、請求項１〜９のいずれか一項に記載の少なくとも１の枯草菌、及び／又は少なくとも１のその調製物、及び／又は請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の少なくとも１の組成物、を、水又は水溶液に適用する工程を含む、方法。
19. 栽培植物の微生物病を処置、及び／又は予防する方法であって、請求項１〜９のいずれか一項に記載の少なくとも１の枯草菌、及び／又は少なくとも１のその調製物、及び／又は請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の少なくとも１の組成物、を、栽培植物に適用する工程を含む、方法。