PT948606E - Fitasse de peniophora - Google Patents

Description

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MEMÓRIA DESCRITIVA FITASSE DE PENIOPHORA

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção se refere a um polipeptídio isolado que mostra actividade fitasse, as correspondentes sequências de ADN clonado, um processo para preparar o polipeptídio e o emprego do mesmo para diversas aplicações industriais, concretamente em comida para animais.

ESTADO DA TÉCNICA O ácido fítico ou fosfato desidrogena 1,2,3,4,5,6-hexakis de mio-inositol (ou para abreviar hexakisfosfato de mio-inositol) é a fonte primária do inositol e a primeira forma de armazenamento de fosfato em sementes de plantas. De facto, forma-se de maneira natural durante a maduração das sementes e grãos de cereal. Nas sementes de legumes representa perto dos 70% do conteúdo de fosfato e se encontra integrado estruturalmente com os corpos de proteína como fitina, um potássio misto, magnésio e sal calcita de inositol. As sementes, os grãos de cereal e os legumes são componentes importantes das preparações de alimentos e das preparações de comidas, concretamente das preparações de comida para animais. Os cereais e os legumes estão adquirindo cada vez mais importância na alimentação humana.

As regiões de fosfato de ácido fítico qualquer cátion divalentes e trivalentes como iões de metal, ou seja, os iões de cálcio, ferro, zinco e magnésio que são essenciais desde o ponto de vista nutricional assim como os minerais traças mangano, cobre e molibdénio. 1

Ademais, o ácido fítico também liga mesmo certo ponto proteínas por interacção electrostática. Com um pH por debaixo do ponto isoeléctrico, pi, da proteína, a proteína carregada positivamente liga direitamente com o fitato. Com um pH por cima do pi, a proteína carregada negativamente liga com o fitato por meio de iões de metal.

As vezes o ácido fítico e seus sais, fitatos, não são metabolizados, dado que não podem ser absorvidos pelo sistema gastrintestinal, ou seja que nem seus derivados fosforosos, nem os iões de metal quelados, nem as proteínas ligadas estão disponíveis desde o ponto de vista nutricional.

Assim, dado que o fósforo é um elemento essencial para o crescimento de todos os organismos, as preparações de alimentos e as preparações de comida para animais têm que ser completada com fosfato inorgânico. Com bastante frequência também deve ser completada os iões que são essenciais desde o ponto de vista nutricional como o ferro e o cálcio. E, além disso, o valor nutritivo de uma determinada dieta diminui a causa da união de proteínas mediante o ácido fítico. Como consequência disso, normalmente se considera o ácido fítico como um factor antinutricional.

Além disso, dado que o ácido fítico não se metaboliza, o fósforo fitato atravessa o tracto gastrintestinal destes animais e é excretado com o abono, o que produz uma contaminação do ambiente pelo fosfato que não é desejado, o que por sua vez conduz, por exemplo, a eutroficação da água e a um crescimento elevado de algas. O ácido fítico ou os fitatos, términos que são considerados sinónimos e que são empregados indistintamente no presente contexto a menos que se indique o contrário, se degradam mediante fitasses. 2

Na maior parte destas sementes de plantas que contém ácido fítico, também se encontra enzimas de fitasse endógenas. Estas enzimas são formadas durante a germinação da semente e servem para liberar o fosfato e, ao igual que o produto final, liberam mio-inositol para usar durante o crescimento da planta.

Quando se ingere, os fitatos que compõe os alimentos ou as comidas que podem ser hidrolisado mediante as fitasses endógenas vegetal, da semente em questão, mediante fitasses que provem da flora micro do intestino e mediante as fitasses da mucosa intestinal. Mas, na prática, a capacidade de hidrolização das fitasses endógenas vegetais, e das fitasses da mucosa intestinal, no caso de que exista, é muito insuficiente para aumentar de forma significativa a bio-disposição dos componentes ligados ou constitutivos dos fitatos. Mas, quando o processo de preparação dos alimentos ou das comidas implica germinação, fermentação ou remolho, a fitasse endógena pode contribuir em certa medida a degradação do fitato.

Nos ruminantes ou nos animais poligástricos como os cavalos e as vacas o sistema gastrintestinal aloja microrganismos capazes de degradar o ácido fítico. Mas, isto não ocorre nos animais monogástricos como os seres humanos, as aves e os porcos. Como consequência disso, os problemas que foram mencionados anteriormente têm uma importância primária no que respeita a esses animais monogástricos.

Existem publicações sobre a produção de fitasses por plantas assim como por microrganismos. Entre os microrganismos são conhecidas como bactérias que produzem fitasse assim como fungos que produzem fitasse.

Do reino vegetal se conhece, por exemplo, uma fitasse de farelo de trigo (Thomlinson et al, Bi, 1 (1962), 166-171). Barrientos et al, Planta. Physiol., 106 (1994), 1489-1495 foi descrito uma fitasse alcalina de pólen de lilácea. 3

Entre as bactérias, se descreveram fitasse derivadas de Bacillus subtilis (Paver and Jagannathan, 1982, Journal of Bacteriology 151:1102-1108) e Pseudomonas (Cosgrove, 1970, Australian Journal of Biological Sciences 23:1207-1220). Ademais uma fitasse de E. coli foi purificada e caracterizada por Greiner et al, Arch. Bi. Bi., 303, 107-113, 1993). Mas, esta enzima é provavelmente uma fosfatasa ácida.

Também se descreve leveduras que produzem fitasse, como Saccharomyces cerevisiae (Nayini et al, 1984, Lebensmittel Wissenschaft und Technologie 17:24-26). Mas, esta enzima é provavelmente uma mio-inositol monofosfatasa (Wodzinski et al, Adv. Appl. Microbiol., 42, 263-303). Em AU-A-24840/95 se descreve a clonação e expressão de uma fitasse da levedura Schwanniomyces occidentalis.

Foram dadas diversas descrições de fungos filamentosos que produzem fitasse, ainda que estes só pertencem a phyllum micótico de Ascomycota {ascomicetes). Concretamente, se encontram diversas referências a ascomicetes do género Aspergillus que produz fitasse como Aspergillus terreus (Yamada et al., 1986, Agric. Biol. Chem. 322:1275-1282). Deste modo, foi descrito a clonação e expressão do gene de fitasse a partir de Aspergillus niger var. awamori (Piddington et al., 1993, Gem 133:55-62). EP 0 420 358 descreve a clonação e expressão de uma fitasse de Aspergillus ficuum (niger). EP 0 684 313 descreve a clonação e expressão de fitasses de ascomicetes Myceliophthora thermophila e de Aspergillus terreus.

NOMENCLATURA E ESPECIFICIDADE DA POSIÇÃO DAS FITASSES

No presente contexto uma fitasse é uma enzima que catalisa a hidrólise de fítato (hexakisfosfato de mio-inositol) a (1) mio-inositol e/ou (2) mono, di, tri, tetra e/ou penta-fosfatos derivados e (3) fosfato inorgânico. De agora em diante, para abreviar, se fará referência aos compostos mencionados anteriormente com a seguinte nomenclatura: IP6, I, IP1, IP2, IP3, IP4, IP5 e P, respectivamente. Isto 4 significa que mediante a acção de uma fitasse, se degrada IP6 em P + um ou mais dos componentes IP5, IP4, IP3, IP2, IP1 e I. Altemativamente, o mio-inositol que leva em total n grupos de fosfato adstritos às posições p, q, r,.. indica-se como Ins(p,q,r,..) Pn. Por conveniência Ins(l,2,3,4,5,6) P6 (ácido fítico) se indica com a abreviatura PA.

Segundo a base de dados sobre a nomenclatura da enzima ExPASy (um depósito de informação relativa a nomenclatura de enzimas que se baseia principalmente nas recomendações do Comité de nomenclatura da União Internacional de Bioquímica e Biologia Molecular (UIBBM) que descreve cada tipo de enzima caracterizada a que uma EC (Comissão de enzima) se destinou um número, conhecem-se dois tipos diferentes de fitasses: a chamada 3-fitasse (3-fosfohidrolasa de hexafosfato de mio-inositol, EC 3.1.3.8) e a chamada 6-fitasse (6-fosfohidrolasa de hexafosfato de mio-inositol, EC 3.1.3.26). A 3-fitasse hidrolisa primeiro o enlace de éster na posição 3, enquanto que a 6-fitasse hidrolisa primeiro o enlace de éster na posição 6.

Nomenclatura do inositolfosfato

Se considerarmos os produtos de hidrólise primários de uma fitasse que atua sobre ácido fítico, alguns dos ésteres resultantes são diastereómeros e outros são enantiómeros. Geralmente, é mais fácil realizar distinções entre os diastereómeros, dado que estes possuem propriedades físicas diferentes, enquanto que é muito mais difícil realizar distinções entre os enantiómeros que são imagens especulares os uns dos outros.

Assim, Ins(l,2,4,5,6) P5 (extraído o 3-fosfato) e Ins(l,2,3,4,5) P5 (extraído o 6-fosfato) são diastereómeros e fáceis de distinguir, enquanto que Ins(l,2,4,5,6)P5 (extraído o 3-fosfato) e Ins(2,3,4,5,6)P5 (extraído o 1-fosfato) são enantiómeros. Isto mesmo é aplicado no par Ins(l,2,3,4,5)P5 (extraído o 6-fosfato) e Ins(l,2,3,5,6)P5 (extraído o 4-fosfato). Como consequência disto, dos 6 ésteres do penta-fosfato que resultam do primeiro passo da hidrólise de fitasse catalisada do 5

ácido fítico, só podem ser distinguida facilmente os ésteres nos que se extraiu o 2-, 3-, 5- e 6-fosfato, ou seja aqueles que só têm quatro diastereómeros, cada um dos dois ésteres restantes é um enantiómero de cada um destes compostos (4- e 6- são enantiómeros, ao igual que 1- e 3-).

Emprego da regra do localizador mais baixo

Deve-se comentar neste caso, que quando empregamos as denominações Ins(2,3,4,5,6)P5 e Ins(l,2,3,5,6)P5, se aplica uma relaxação das recomendações anteriores no que respeita a numeração dos átomos de mio-inositol. Está relaxação da regra do localizador mais baixo é recomendada pelo Comité de nomenclatura da União Internacional de Bioquímica (Biochem J. (1989) 258, 1-2) sempre que os autores queiram publicar relações estruturais.

Em esta regra do localizador mais baixo se recomenda a nomenclatura L e D: Inositolfosfato e os ésteres de fosfato de mio-inositol devem ser designados como 1D- (ou 1L-) -Ins(r,s,t,u,w,x)Pn, onde n indica o número de grupos de fosfato e os localizadores r,s,t,u,w assim como x indicam suas posições. As posições são numeradas segundo o Comité de nomenclatura da União Internacional de Bioquímica (NC-UIB) mencionado anteriormente (e as referências que são feitas aqui), e 1D ou 1L são empregadas para fazer que um substituto tenha o localizador ou número mais baixo possível (“regra do localizador mais baixo”).

Especificidade da fitasse

Como foi dito anteriormente, as fitasses se dividem segundo sua especificidade na fase inicial de hidrólise, ou seja, segundo o grupo de fosfato-éster que se hidrolisa primeiro. 6

No que respeita a especificidade das fitasses conhecidas, se diz que as fitasses vegetal, são 6-fitasses. Mas, se diz que a fitasse de pólen de lilácea é uma 5-fitasse. Das fitasses derivadas de microrganismos se diz principalmente que são 3-fitasse, por exemplo ExPASy, a base de dados mencionada anteriormente com 3-fitasse se refere a quatro fitasses de Aspergillus awamori (cepa ALK0243) e Aspergillus niger (cepa NRRL 3135) (Gem 133:55-62 (1993) e Gem 127:87-94(1993)).

Empregando agora a nomenclatura D/L (na que a configuração D e L referida a posição 1), a fitasse de farelo de trigo hidrolisa primeiro o grupo de éster de fosfato na posição L-6 (= D-4), enquanto que as 3-fitasses hidrolisam primeiro o grupo de éster de fosfato na posição D-3 (= L-l). A especificidade si pode examinar de diferentes maneiras, por exemplo, através de CLARC ou através de espectroscopia NMR. Mas, estes métodos não permitem de forma imediata a distinção entre hidrólise, por exemplo, dos grupos de fosfato -éster nas posições D-6 e a hidrólise L-6, posto que os produtos da hidrólise, D-Ins(l,2,3,4,5)P5 e L-Ins(l,2,3,4,5)P5, são enantiómeros (imagem especular), e pelo tanto seus espectros NMR são idênticos.

Em outras palavras, no presente contexto uma 6-fitasse significa ou uma fitasse L-6 ou uma fitasse D-6 ou ambas, ou seja, uma fitasse que é uma fitasse L-6, uma fitasse D-6 ou uma fitasse ((D-6-)+(L-6-)) (que apresenta ambas actividades). Esta última também se pode designar fitasse D/L-6.

RESUMO DA INVENÇÃO A presente invenção tem por objecto proporcionar fitasses alternativas, concretamente fitasses com propriedades superiores tais como uma maior estabilidade ao calor ou liberação mais rápida do fítato do fosfato, e que ademais que possam ser produzidas em quantidades comercialmente úteis. 7 7’

Os inventores da presente invenção descobriram de forma surpreendente que se pode obter uma enzima que mostra actividade fitasse a partir de uma cepa micótica da ordem Stereales concretamente da família Peniophoraceae, especialmente do género Peniophora, mais concretamente da cepa Peniophora lycii, e conseguiu clonar uma sequência de ADN que codifica essa enzima. A sequência de ADN e a sequência de aminoácidos de se encontram registradas no catálogo de sequências como SEQID No. 1 e 2, respectivamente.

Como é explicada mais detalhadamente na secção experimental que aparece a continuação, se descobriu que esta nova fitasse é capaz de liberar o ácido fítico do fósforo com maior rapidez que uma fitasse conhecida (fitasse de Aspergillus niger, Phytase Novo®). Este achado mostrou-se numa prova de milho relevante para a solicitude com um pH 3.5 e pH 5.5 assim como em estudos NMR.

Ademais, descobriu-se que a fitasse da invenção apresenta um perfil de degradação diferente que é muito interessante. Com pH 3.5 esta fitasse pertence a uma classe nova de fitasses que mostram uma afinidade inicial elevada com a posição 6 assim como com a posição 3 do ácido fítico, ou seja que não é nem uma 3-fitasse nem uma 6-fitasse, porém com menor especificidade de posição que tudo o que se descobriu até agora em relação com as fitasses conhecidas. Mas, com pH 5.5, deve ser classificado como uma 6-fitasse.

Além disso a actividade específica da fitasse de Peniophora lycii encontra-se a um nível muito elevado, ou seja, por cima de 200, preferentemente superior a 400, especialmente maior que 600, concretamente, mais de 800, com preferência aproximadamente 1000 FYT/mg, a que se existe de facto referência no exemplo 4a. Este resultado mais bem inesperado, ao menos no caso das fitasses micóticas (a fitasse de Aspergillus que é conhecida, tem uma actividade específica de só aproximadamente 180 FYT/mg). 8 A ordem de Stereales pertence a classe micótica de Hymenomycetes e o phylum micótico pertence a de Basidiomycota. Os fungos que produzem a fitasse conhecida pertencem ao phylum de Ascomycota. .

Em um primeiro aspecto, a invenção se refere a um polipeptídio isolado que tem actividade fitasse e que tem a sequência de aminoácidos SEQ ID No. 2 ou a sequência de aminoácidos n°. 31 a 439 derivada, ou uma sequência de aminoácidos que é ao menos um 70% homóloga a qualquer destas sequências.

Em outros aspectos, a invenção fornece sequências de ADN clonado que codificam os polipeptídio mencionados anteriormente, assim como vectores e células hóspedes que incluem estas sequências de ADN clonado.

Dentro do campo da invenção, constitui outro aspecto da invenção o uso da fitasse da invenção para liberar ao ácido fítico de fosfato inorgânico, assim como outros usos mais específicos, e composições, concretamente preparações alimentícias e comidas assim como aditivos que incluem a fitasse da invenção.

Geralmente, os términos e expressões tal e como são empregadas aqui se devem interpretar como normalmente é feita na técnica. Mas, em caso de duvida podem ser úteis as definições da presente descrição.

DEFINIÇÕES GENERALES

Pela expressão “um polipeptídio/enzima isolado que tem/apresenta actividade fitasse” ou “uma fitasse isolada” se entende qualquer péptido ou proteína que tem actividade fitasse (veja abaixo) e que é essencialmente livre de outro polipeptídio que não seja de fitasse, por exemplo, ao menos perto de um 20% puro, preferentemente ao menos aproximadamente um 40% puro, mais preferentemente perto de um 60% puro, inclusive mais preferentemente um 80% puro, muito mais preferentemente perto de um 90% puro e inclusive mais preferentemente perto de um 95% puro, como foi determinado mediante o sistema de diluição simples por 9 electroforese em gel de polipeptídio SDS-PAGE. Às vezes um polipeptídio deste tipo é denominado altemativamente fitasse “purificada”. A definição de “um polipeptídio isolado” também inclui polipeptídio fusionado ou polipeptídio de fusão que se pode dissociar e aos que se pode unir outro polipeptídio no N-terminus ou o C-terminus do polipeptídio ou de um fragmento derivado. Um polipeptídio fusionado se produz fusionando uma sequência de ácido nucléico (ou uma porção derivada) que codifica outro polipeptídio a uma sequência de ácido nucléico (ou uma porção derivada) da presente invenção. Na técnica se conhecem métodos para produzir polipeptídio de fusão e entre estes métodos se inclui, a união das sequências de codificação que codificam os polipeptídio de modo que este se encontra dentro do âmbito e de modo que o mesmo promotor(es) e terminador controlam a expressão do polipeptídio fusionado. A expressão “polipeptídio ou enzima que apresenta actividade fitasse” ou “fitasse” se refere a qualquer enzima capaz de efectuar a liberação de fosfato inorgânico ou fosforoso a partir de diversos fosfatos de mio-inositol. Alguns exemplos deste tipo de fosfatos de mio-inositol (substratos de fitasse) são o ácido fítico e qualquer sal derivado, por exemplo fitato de sódio ou fitato de potássio ou sais mistas. Deste modo, qualquer estereoisómero do mono, di, tri, tetra ou penta-fosfatos de mio-inositol pode servir como um substrato de fitasse.

Segundo a definição anterior, a actividade fitasse pode ser determinada empregando qualquer ensaio no que se empregue um destes substratos. No presente contexto (a menos que se especifique o contrário) a actividade fitasse se determina na unidade FYT, um FYT é a quantidade de enzima que libera 1 mmol inorgânico orto-fosfato por minuto baixo as seguintes condições: pH 5.5; temperatura 37°C; substrato: fitato de sódio (C6H6024P6Na]2) numa concentração de 0,0050 mol/1. Na parte experimental se descrevem ensaios de fitasse adequados. 10

Por “homología de polipeptídio” a “homología de aminoácido” entende-se o grau de identidade entre duas sequências. A homología pode-se determinar de forma adequada utilizando programas de computador conhecidas na técnica como GAP disponível no pacote de programa de GCG, versão 8 (Program Manual for the Wisconsin Package, Versão 8, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, Usa 53711) (Needleman, S.B. e Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48, 443-453). Usando o GAP com as seguintes configurações para a comparação de sequências de polipeptídio: penalização de criação GAP de 5,0 e penalização de extensão GAP de 0,3.

No presente contexto uma “6-fítasse” significa uma fitasse que hidrolisa primeiro a posição 6 em ácido fítico ou tem preferência por estas posições (se emprega o plural posto que este término cobre duas posições). Concretamente, mais de um 50% do produto de hidrólise da primeira fase é Ins(l,2,3,4,5)P5 e/ou Ins(l,2,3,5,6)Ps. Preferentemente estes dois compostos constam de ao menos um 60%, mais preferentemente de ao menos um 70%, mais preferentemente ainda de ao menos um 80%, especialmente de ao menos um 90% e ainda com preferência mais de um 95% do produto da fase inicial de hidrólise de PA.

Da mesma maneira deve interpretar-se que os outros términos de especificidade como por exemplo “3-fítasse,” “(3+6)-fitasse,” “6D-fitasse” e “6L-fitasse”, incluem as mesmas formas de realização preferidas.

Pensamos que os términos "uma parte da fitasse que codifica a sequência de ADN clonada em um plasmídeo presente em uma cepa de E. coli depositada" e "uma fitasse que codifica parte da correspondente sequência de ADN que se mostra no catálogo de sequências" são idênticos, e por tanto ditos términos também podem ser empregados de forma intercambiável. 11

Em princípio, o término “uma parte da fitasse que codifica” que é empregado em relação com uma sequência de ADN significa a zona da sequência de ADN que se traduz numa sequência de polipeptídio que tem actividade fitasse. Normalmente esta é a zona que deve ser seguida em primeiro lugar entre um primeiro códon inicial “ATG” (códon “AUG” em ARNm) e um códon final (“TAA”, “TAG” ou “TGA”).

Mas, o polipeptídio traduzido como é descrito acima inclui normalmente além de uma sequência madura que apresente actividade fitasse, uma sequência de sinal N-terminal e/ou uma sequência pro-péptida. Geralmente, a sequência de sinal dirige a secreção do polipeptídio e o pro-péptido dirige o dobramento do polipeptídio. Para mais informação veja Egnell, P. et al. Molecular Micro. 6(9):1115-19 (1992) ou Stryer, L., “Biochemistry” W.H., Freeman and Company/New York, ISBN ΟΤΙ 67-1920-7. Assim, o término “parte de fitasse que codifica” também se refere a sequência de ADN correspondente à parte madura do polipeptídio traduzindo ou a cada uma de essas partes maduras, se existem várias.

Ademais, se deve incluir nesta definição qualquer fragmento de uma sequência deste tipo que codifica um fragmento de polipeptídio e que ainda retém alguma actividade fitasse.

Uma Sequência clonada de ADN ou, altemativamente, “uma formação de ADN,” “um segmento de ADN” ou “uma sequência de ADN isolada” se refere a uma sequência de ADN que pode ser clonada segundo os procedimentos de clonação Standard que se empregam habitualmente em engenharia genética para recolocar o segmento de ADN da sua ubiquação natural a um lugar diferente onde será replicado. O término se refere geralmente a uma sequência de ácido nucleico que está essencialmente livre de outras sequências de ácido nucleico, por exemplo, ao menos perto de um 20% pura, preferentemente ao menos perto de um 40% pura, mais preferentemente perto de um 60% pura, inclusive mais preferentemente perto de um 80% pura, muito mais preferentemente perto de um 90% pura, e inclusive 12 mais preferentemente perto de um 95% pura, como foi determinado por electroforese em gel de agarosa. Os procedimentos de clonação podem implicar a excisão e isolamento de um fragmento de ácido nucléico desejado que inclui a sequência de ácido nucléico que codifica o polipeptídio, a inserção do fragmento numa molécula vector, e a incorporação do vector recombinante numa célula hóspede onde será replicada copiam múltiplas ou clones da sequência de ácido nucléico. A sequência de ácido nucléico pode ser genómico, ADNc, ARN, semi-sintético, de origem sintético, ou qualquer combinação derivada. 0 grau de identidade ou “homología” entre duas sequências de ácido nucléico pode ser determinado mediante um programa de computador conhecido na técnica como GAP fornecido no pacote de programa GCG (Program Manual for the Wisconsin Package, Versão 8, Agosto 1996, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, Usa 53711) (Needleman, S.B. e Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular Bi, 48, 443-453). Usando GAP com a seguinte configuração para comparar sequências de ADN: penalização de criação GAP de 5,0 e penalização de extensão GAP de 0,3.

As condições experimentais adequadas para determinar se uma sequência de ADN ou ARN determinada “híbrida” a uma sonda de nucleotídeo ou oligonucleótido específico implica o molhar previamente o filtro que contém os fragmentos de ADN ou ARN para examinar a hibridação em 5 x SSC (cloruro de sódio/citrato de sódio), (J. Sambrook, E.F. Fritsch, e T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d edition, Cold Spring Harbor, New York) durante 10 minutos, e pré-hibridação do filtro numa solução de 5 x SSC, 5 x de solução De (Sambrook et al. 1989), 0,5 % de SDS e 100 pg/ml de ADN de esperma de salmão desnaturalizado e submetido a um banho de ultra-som (Sambrook et al. 1989), contínuo de hibridação na mesma solução que contém uma concentração de 10 ng/ml de uma sonda cevada de forma aleatória (Feinberg, A. P. e Vogelstein, B. (1983) Anal. Biochem. 132:6-13), marcada, com 32P-dCTP (actividade específica > 1 x 109 cpm/pg) durante 12 horas a aproximadamente 45°C. 13 A continuação se lava o filtro duas vezes durante 30 minutos em 2 x SSC, 0,5 % de SDS ao menos a 55°C (rigor baixo), ao menos a 60°C (rigor meio), ao menos a 65°C (rigor médio/alto), ao menos a 70°C (rigor alto), ou ao menos a 75°C (rigor muito alto).

As moléculas que hibridam a sonda de oligonucleótido baixo estas condições se detectam empregando um filme de raio X.

Descobriu-se que é possível pré-dizer teoricamente se duas sequências de ADN dadas podem hibridar baixo determinadas condições específicas ou não.

Assim, como uma alternativa ao método experimental descrito anteriormente a determinação de se uma sequência de ADN análoga hibridará ou não a sonda de nucleotídeo de anteriormente, pode-se embasar em um cálculo teórico da Tm (temperatura de fusão) na que duas sequências heterólogas de ADN com sequências conhecidas hibridarão baixo condições específicas (por exemplo, com respeito à concentração de cátion e a temperatura).

Para determinar a temperatura de fusão das sequências heterólogas de ADN (Tm(hetero)) é preciso determinar em primeiro lugar a temperatura de fusão (Tm(homo)) de sequências homólogas de ADN. A temperatura de fusão (Tm(homo)) entre duas cadeias de ADN completamente complementarias (formação homoduplex) pode-se determinar empregando a seguinte fórmula,

Tm(homo) = 81,5°C + 16,6(log M) + 0,41(%GC) - 0,61 (% form) 500/L ("Current protocols in Molecular Biology". John Wiley and Sons, 1995), onde 14 “Μ” “%GC” “% form”

representa a concentração de cátion molar em tampão de lavado, % de Guanina (G) e Citosina (C) do número total de bases da sequência de ADN, % de formamida no tampão de lavado, e a longitude da sequência de ADN. A Tm determinada através da fórmula anterior é a Tm de uma formação homoduplex (Tm(homo)) entre duas sequências de ADN completamente complementarias. Para adaptar o valor de Tm ao de duas sequências de ADN heterólogas, se assume que uma diferencia do 1% em sequência de nucleotídeos entre as duas sequências heterólogas iguala uma diminuição de 1°C em Tm ("Current protocols in Molecular Biology". John Wiley and Sons, 1995). Por tanto, se determina a Tm(hetero) para a formação heteroduplex subtraindo o % de diferencia de homología entre a sequência análoga em questão e a sonda de nucleotídeo de anteriormente a partir de uma Tm(homo). A porcentagem de homología de ADN se calcula como se descreve aqui (veja encima). O término “vector” inclui términos/objectos como “construções de ácido nucléico,” “construções de ADN ,” vectores de expressão” ou “ vectores recombinantes.” A construção de ácido nucléico compreende uma sequência de ácido nucléico da presente invenção ligada operavelmente a uma ou mais sequências de controle capazes de desenvolver a expressão da sequência de codificação numa célula hóspede adequada baixo condições compatíveis com as sequências de controle. A "construção de ácido nucléico" se define como uma molécula de ácido nucléico, monocatenaria ou bi, que se isola de um gen que se produz de forma natural ou que foi modificado para conter segmentos de ácido nucléico que se combinam e superpõe de maneira que do contrário não existiria na natureza. 15 O término construção de ácido nucléico pode ser sinónimo do término portaisótopos de expressão quando a construção de ácido nucléico contém todas as sequências de controle necessárias para a expressão de uma sequência de codificação da presente invenção. O término “sequência de codificação” como se define aqui compreende principalmente uma sequência que se transcreve em ARNm e se traduz em um polipeptídio da presente invenção quando se submete ao controle das sequências de controle mencionadas anteriormente. As fronteiras da sequência de codificação se determinam geralmente através de um códon de início da tradução ATG em 5’-terminus e um códon de detenção da tradução em 3’-terminus. Uma sequência de codificação pode incluir, porém não se limita a, ADN, ADNc, e sequências de ácido nucléico recombinante. O término “sequências de controle” inclui neste caso todos os componentes que são necessários ou vantajosos para a expressão da sequência de codificação da sequência de ácido nucléico. Cada sequência de controle pode ser nativa ou estranha com respeito a sequência de ácido nucléico que codifica o polipéptido. Tais sequências de controle incluem, porém não se limitam a, uma guia, uma sequência de poliadenilação, uma sequência de propéptido, um acelerador, uma sequência de sinal, e um terminador de transcrição. Como mínimo, as sequências de controle incluem um acelerador, e sinais de detenção transcripcional e de detenção da tradução. As sequências de controle podem estar fornecidas de enlaces para introduzir lugares de restrição específicos que facilitam o enlace das sequências de controle com a zona de codificação da sequência de ácido nucléico que codifica um polipéptido.

No vector de expressão, a sequência de ADN que codifica a fitasse se conectar operavelmente a uma sequência de acelerador e de terminador adequada. O acelerador pode ser qualquer sequência de ADN que mostra actividade transcripcional na célula hóspede elegida e se pode derivar a partir de genes que 16 codificam proteínas que são homólogas ou heterólogas a célula hóspede. Os expertos na técnica conhecem bem os procedimentos que são empregados para enlaçar as sequências de ADN que codificam a fitasse, o acelerador e o terminador e para agrega-las em vectores adequados (cf. por exemplo Sambrook et al., (1989), Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY). O vector de expressão recombinante pode ser qualquer vector (por exemplo, um plasmídeo ou um vírus) que pode ser convenientemente submetido a procedimentos de ADN recombinante e pode efectuar a expressão da sequência de ácido nucléico.

Pode-se inserir mais de uma cópia de uma sequência de ácido nucléico que codifica um polipeptídio da presente invenção na célula hóspede para amplificar a expressão da sequência de ácido nucléico. A amplificação estável da sequência de ácido nucléico pode ser obtida mediante a integração de ao menos uma cópia adicional da sequência no genoma da célula hóspede empregando métodos que são bem conhecidas na técnica e seleccionando transformantes.

Os expertos na técnica conhecem bem os procedimentos que são empregados para enlaçar os elementos de anteriormente e poder construir assim os vectores de expressão recombinante da presente invenção (veja, por exemplo, Sambrook et al., 1989, supra).

Uma “célula hóspede” ou “una célula hóspede recombinante” compreende qualquer derivado de uma célula mãe que não é idêntica a célula mãe devida às mutilações que se produzem durante a réplica. A célula é preferentemente transformada com um vector que inclui uma sequência de ácido nucléico da invenção contínua da integração do vector no cromossomo hóspede. 17 “Transformação” significa a introdução de um vector que inclui uma sequência de ácido nucléico da presente invenção numa célula hóspede de modo que o vector se mantém como um integrante cromossómico ou como um vector extra-cromosómico que se auto-replica. Geralmente se considera que a integração supõe uma vantagem já que é mais provável que a sequência de ácido nucléico se mantém mais estável na célula. A integração do vector no cromossomo hóspede pode ser realizada através de recombinação homóloga ou não homóloga como se descreve encima. A célula hóspede pode ser um microrganismo unicelular, por exemplo, um microrganismo procariótico, ou não unicelular, por exemplo, um eucariótica. Exemplos de uma célula eucariótica são uma célula mamífera, uma célula de insecto, uma célula vegetal ou uma célula micótica. Entre as células mamíferas úteis se encontram células de ovário de hámster chinês (OHC), células HeLa, células de rim de cria de hámster (RCH), células COS, ou qualquer número de outras cadeias de células imortalizadas e disponíveis, por exemplo em American Type Culture Collection.

Numa forma de realização preferida, a célula hóspede é uma célula micótica. O término “fungos” como é empregado na presente descrição inclui os phylla Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota, e Zygomycota (como os define Hawksworth et al., em, Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi, 8th edition, 1995, CAB International, University Pre, Cambridge, UK) assim como Oomycota (como citado em Hawksworth et al., 1995, supra, página 171) e todos os fungos motospóricos (Hawksworth et al., 1995, supra). Também se faz referência a Jiilich, 1981, Higher Taxa de Basídiomycetes e Hansen & Knudsen (Eds..), Nordic Macro, Vol. 2 (1992) e 3 (1997).

As células micóticas podem ser transformadas através de um processo que implica a formação de protoplastos, a transformação dos protoplastos, e a regeneração da membrana celular de uma maneira conhecida per se. 18

As células hóspedes preferidas são uma cepa de Fusarium, Trichoderma ou Aspergillus, concretamente uma cepa de Fusarium graminearum, Fusarium venenatum, Fusarium cerealis, Fusarium sp., que têm a característica de identificação de Fusarium ATCC 20334, como se descreve mais detalhadamente em PCT/US/95/07743, Trichoderma harzianum o Trichoderma reesei, Aspergillus niger o Aspergillus oryzae.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Na descrição detalhada da invenção que aparece a continuação, se faz referência aos desenhos, nos quais: A figura 1 A figura 2 A figura 3 A figura 4 A figura 5 As figuras 6-7 As figuras 8-9 A figura lOa-c é uma curva de actividade de pH da fitasse Peniophora (5mM de fitato, 30 minutos, a 37°C) é uma curva derivada da estabilidade do pH (pré-incubação de 1 h 40°C), é uma curva derivada da temperatura-actividade (0,1M de Na-acetato, 5mM de fitato, pH 5.5, 30 minutos), é uma curva derivada da temperatura-estabilidade (pré-incubação de 60 minutos em 0,1M de Na-acetato pH 5.5), é uma curva derivada da calorimetria por analise diferencial (DSC) (0,1M de Na-acetato, pH 5.5; Td = 59,6°C), são espectros NMR, linhas superpostas (até 24h), que mostram o perfil de um produto de um Aspergillus niger e a fitasse Peniophora, respectivamente, são espectros NMR como os anteriores, porém as linhas se superpõe até 4,5h, representa perfis NMR observados depois de 20 minutos (a pH 5.5), 24 horas (a pH 5.5) e 20 minutos (a pH 3.5), respectivamente, 19 A figura 11 As figuras 12-13 representa curvas que mostram a concentração com respeito ao tempo de Ins(l,2)P2 e Ins(2)P, respectivamente, e representam curvas que mostram a liberação de fosfato inorgânico de milho com respeito ao tempo com pH 5.5 e pH 3.5, respectivamente.

DEPÓSITOS A cepa isolada de Peniophora lycii, a partir da qual se obteve a fitasse da invenção foi depositada no Centraalbureau voor Schimmel-cultures, P.O. Box 273,3740 AG Baam, The Netherlands, (CBS), segundo o que estipula o Tratado de Budapeste no qual concerne o Reconhecimento Internacional do Depósito de Microrganismos para Procedimentos de patentes, da seguinte maneira:

Data de depósito: 4 de Dezembro de 1996

Ref do depositante: NN006113 N° CBS: Peniophora lycii N° CBS 686.96

Além disso, o plasmídeo de expressão (vector transportador) pYES 2.0 que contém a longitude completa das sequências de ADNc que codificam esta fitasse da invenção foi transformada numa cepa de Escherichia coli que foi depositada no De Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH., Mascheroder Weg lb, D-38124 Braunschweig, Alemania, (DSM), segundo o que estipula o Tratado de Budapeste no qual concerne ao Reconhecimento Internacional do Depósito de Microrganismos para Procedimentos de patentes, da seguinte maneira:

Data de depósito: 2 de dezembro de 1996

Referencia do depositante: NN 049282 N° DSM: Escherichia coli N° DSM. 11312 20 /

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A homología das fitasses conhecidas como a fitasse da sequência de aminoácidos ir Número. 2 e a sequência de ADN da SEQID No. 1 é a seguinte:

Homología (com nível de aminoácido fitasses de: Aspergillus Niger (NRRL 3135): Aspergillus terreus (cepa 9A-1): Myceliophthora thermophila (ATCC 48102): Schwanniomyces occidentalis: Escherichia coli Kl2 (ATCC 33965): nível de ADN, respectivamente) com as aminoácido ADN 41% 51% 41% 53% 45% 54% 26% 38% 39% indica um reconhecimento não real entre as fitasses de P. lycii e. coli.

Por tanto, a fitasse Peniophora é mais bem diferente das fitasses conhecidas, a fitasse mais unida com esta é a fitasse de Myceliophthora thermophila (EP 0684313).

Como descreve mais detalhadamente na parte experimental que aparece mais adiante, quando a fitasse Peniophora se expressa em Aspergillus, essa fitasse tem uma sequência de aminoácidos N-terminal de Leu-Pro-Ile-Pro-Ala-Gln-Asn (aminoácidos número 31-37 em SEQ ID No. 2). Como consequência disto, actualmente se crê que a sequência de aminoácidos número. 31-439 da SEQ ID No. 2 é uma sequência de fitasse madura.

Todas as homologías de aminoácidos da presente solicitude são ao menos do 70%. Preferentemente, o grau de homología é como mínimo do 80%, mais preferentemente ao menos do 90%, e ainda mais preferentemente ao menos do 95%, especialmente ao menos do 97%. 21 O polipeptídio de fitasse pode ser obtido a partir de Peniophora lycii CBS 686.96 e tem uma ou várias das seguintes características: (i) um pH óptimo de 3-6

(ii) uma temperatura óptima de 30-65°C

(iii) é estável durante ao menos uma hora com pH 3-9 e 40°C

(iv) mais de um 75% de actividade residual depois de uma hora de pré-incubação com temperaturas de 0-50°C (v) um peso molecular da forma de 43-53 kDa

(vi) ao menos um 20% de actividade residual depois de 60 minutos de pré-incubação a 70°C (vii) uma temperatura de desdobramento determinada através calorimetria por análise diferencial de 50-65°C. A continuação relacionam-se outros espaços alternativos ou espaços mais preferentes: (i) um pH óptimo preferentemente de 3.5-5.5, mais preferentemente de 3.7-5.2, e muito mais preferentemente de 3.8-5.0

(ii) uma temperatura óptimo preferentemente de 35-62°C, mais preferentemente de uns 37-58°C, a ser possível ao redor dos 50°C (iii) preferentemente estável durante ao menos uma ora a 40°C com pH 3-6, mais preferentemente com pH 3-5. (iv) preferentemente ao menos um 80% de actividade residual depois de incubação durante uma hora a temperaturas de 0-50°C com pH 5.5, mais preferentemente ao menos um 90% de actividade residual depois de incubação durante uma hora a temperaturas de 0-50°C com pH 5.5; (v) O peso molecular da forma deglicosilada do polipeptídio segundo a SEQ ID No. 2 se calcula a 48 kDa. Um polipeptídio pode ser de enzímica ou quimicamente e o peso molecular pode ser calculado por exemplo através de espectroscopia de massa ou sobre um gel SDS-PAGE. A de química está de 22 em "Carbohydrate analysis - a practical approach" por M.F. Chaplin & J.F. Kennedy (Eds..), IRL Pre, Oxford, 1986, veja concretamente o capítulo V. Para uma de enzimática se segue o procedimento indicado pelo fornecedor da enzima. Altemativamente se determina um peso molecular claro Mr de aproximadamente 67 kDa relativo a emigração de marcadores de pesos moleculares em SDS-PAGE. Este valor de aproximadamente 67 kDa se obtém quando a enzima é expressada em Aspergillus (veja os exemplos que aparecem a continuação). (vi) preferentemente ao menos um 30%, mais preferentemente ao menos um 40%, muito mais preferentemente ao menos um 50% de actividade residual depois de 60 minutos de pré incubação a 70°C, pH 5.5; ou preferentemente ao menos um 30%, mais preferentemente ao menos um 40%, muito mais preferentemente ao menos um 50% de actividade residual depois de pré incubação durante uma hora a temperaturas de 60-80°C com pH 5.5 (vii) preferentemente uma temperatura de desdobramento como se determina através de calorimetria por análise diferencial de 55-62°C, mais preferentemente de 58-62°C, ainda mais preferentemente de aproximadamente 60°C.

Altemativamente, as características a seguir são as características do polipéptido: Um pH óptimo no intervalo de 3-7, calculado a 37°C; mais preferentemente um pH óptimo no intervalo de 4-6, calculado a 37°C; e inclusive mais preferentemente um pH óptimo no intervalo de 4.5-5.5, calculado a 37°C; e ou ao menos um 65% de actividade fitasse residual depois de 20 minutos de incubação a 70°C, calculada de forma relativa com respeito a actividade a 26°C; mais preferentemente ao menos um 75% de actividade fitasse residual depois de 20 minutos de incubação a 70°C, calculada de forma relativa com respeito a actividade a 26°C; é inclusive mais preferentemente ao menos um 80% de actividade fitasse residual depois de 20 minutos de incubação a 70°C, calculada de forma relativa com respeito a actividade a 26°C. 23

Actualmente se observa que os polipeptídios da invenção também se podem obter de qualquer cepa da classe Hymenomycetes, preferentemente da ordem Stereales, mais preferentemente das cepas do género Peniophora, e ademais mais preferentemente de qualquer cepa de Peniophora lycii.

Preferentemente, o polipeptídio da invenção é capaz de voltar a dobrar-se para recuperar ao menos um 10%, preferentemente ao menos um 20%, mais preferentemente ao menos um 30%, ainda mais preferentemente ao menos um 40% e mais preferentemente ao menos um 50% da sua actividade fitasse depois de haver sido desnaturalizado.

Um método de provação para este tipo de polipeptídio micóticos é o seguinte: se deposita o microrganismo em questão em placas de replicação de fitato (veja exemplo 1, “Identificação de colónias positivas”) e se incuba por exemplo a 30 ou 37°C. Se isolam as colónias positivas de fitasse, se cultivam em frascos de agitação e se extrai o restante. Verifíca-se a actividade fitasse do sobrenadante antes e depois de um tratamento térmico de por exemplo 20 minutos a 70°C, através do método do exemplo 1 (“Prova de transformantes de A. oryzae”). Estas mostras que ainda são fitassepositivas depois da incubação por exemplo durante 20 minutos a 70°C são termoestáveis ou capazes de voltar a dobrar-se para recuperar uma parte importante da sua actividade fitasse. As que são verdadeiramente termoestáveis se podem excluir seguindo os seguintes métodos dos exemplo 5 ou 6, ou seja avaliando a actividade residual depois da incubação com diversas temperaturas no intervalo que seja relevante para determinar se descende a actividade residual e se retoma a aumentar com uma maior temperatura.

Este método se pode aplicar por analogia a outros microrganismos como as bactérias usando médios basais e temperaturas que se correspondam com as demandas dos organismos em questão. 24 A invenção também se refere a um polipeptídio isolado que apresenta actividade fitasse que faz que desapareça rapidamente o substrato PA (o fosforilado completo), concretamente ao cabo de 5 horas, preferentemente ao cabo de 4 horas, mais preferentemente ao cabo de 3 horas, concretamente ao cabo de 2 horas, especialmente ao cabo de uma hora e muito especialmente ao cabo de meia hora (faz-se referência ao exemplo 5). A invenção também se refere a um polipeptídio isolado que mostra actividade fitasse e que libera do fosfato inorgânico mais rápido do ácido fítico, concretamente com pH 3.5 (faz-se referência ao exemplo 6); e deste modo se refere ao uso de qualquer destes quatro tipos de fitasses, concretamente na indústria da padaria, na elaboração de massas, ao preparar inositol ou derivados deste, em comidas ou alimentos, especialmente em comida para animais ou em aditivos de comida para animais. A reivindicação 2 se refere a sequências de nucleotídeo das fitasses da invenção, concretamente a sequências de ADN.

Para uma definição de “hibridação,” consulta na secção titulada “definições gerais,” que também inclui algumas condições de hibridação preferidas. O grau de identidade ou homología entre duas sequências de ácido nucléico pode ser determinado como se descreve na secção de definições gerais. Com respeito a parte de homología na característica (d) da reivindicação 2, o grau de homología é ao menos do 70%, preferentemente ao menos do 80%, mais preferentemente ao menos de aproximadamente o 90%, inclusive mais preferentemente ao menos de aproximadamente o 95%, e mais preferentemente ao menos de aproximadamente o 97%. Concretamente, o grau de homología basea-se numa comparação com as sequências inteiras catalogadas ou sua cadeia complementaria ou qualquer das subsequências derivadas que correspondem a uma fitasse “madura”.

As condições de hibridação são de rigor médio/alto. 25 A sequência de ADN da invenção também pode ser clonada através de qualquer método general que compreenda - a clonação, em vectores adequados, de uma biblioteca de ADNc de qualquer organismo que se espera que produza a fitasse que interessa, - a transformação de células hóspedes de levedura adequadas com ditos vectores, - o cultivo das células hóspedes sobre condições adequadas para expressar qualquer enzima de interesse que esteja codificada por um clone na biblioteca de ADNc, - a crivação para obter clones positivos determinando qualquer actividade fitasse da enzima produzida por ditos clones, e - o isolamento da enzima que codifica o ADN de ditos clones.

Em WO 93/11249 e WO 94/14953 se descreve um método de isolamento geral. Na parte experimental damos uma descrição detalhada dos métodos de crivação. A invenção também se refere em general ao uso do polipeptídio segundo qualquer das reivindicações 1-3 para liberar (ou catalisar a liberação de) fosfato inorgânico de fitato ou ácido fítico. Outra maneira seria: para converter fítato em fosfato inorgânico e (mio-inositol e/ou os ésteres derivados de mono, di, tri, tetra, penta-fosfato). Dentro do campo desta reivindicação se inclui qualquer processo onde a fitasse da invenção exerce sua actividade fitasse como se descreveu previamente.

Outros usos mais específicos segundo a invenção se encontram em alimentos para humanos ou preparações de comida para animais ou em aditivos para tais preparações, onde a fitasse serve entre outras coisas para (i) reduzir o nível de fitato no abono, 26 (ii) melhorar a digestão, induzir o crescimento, ou melhorar a utilização da comida e os alimentos ou sua eficiência de conversão, fazendo que se encontrem disponíveis as proteínas, que do contrário tinham sido ligadas pelo fitato, (iii) prevenir a desnutrição ou as doenças como a anemia causada por a falta de íons essenciais e de fosfato, ou seja melhorando a biodisponibilidade de minerais ou aumentando a absorção derivada, eliminando a necessidade de agregar fosfato adicional e íons, etc..

Concretamente, as fitasses da invenção também podem ser empregadas na alimentação dos frangos para melhorar a qualidade da casca do ovo (com o que se reduz as perdas devido a ruptura), cf. por exemplo The Merck Veterinary Manual, (Edição sétima, Merck & CO., Inc., Rahway, N.J., U.S.A., 1991; p.1268); Jeroch et al; Bodenkultur Vol. 45, No. 4 pp. 361-368 (1994); Poultry Science Vol. 75, No. 1 pp. 62-68 (1996); Canadian Journal of Animal Science Vol. 75, No. 3 pp. 439-444 (1995); Poultry Science Vol. 74, No. 5 pp. 784-787 (1995) e Poultry Science Vol. 73, No. 10 pp. 1590-1596(1994).

Uma “comida” e um “alimento” significa respectivamente qualquer dieta natural ou artificial, comida ou similar ou componentes de tais comidas destinadas ou adequadas para que possam ser comidas, tomadas, digeridas um animal e um ser humano respectivamente. A fitasse pode exercer seu efeito in vitro ou in vivo, ou seja, antes de ser tomada ou no estômago do indivíduo, respectivamente. Também sendo possível uma acção combinada.

Uma composição de fitasse segundo a invenção sempre compreende ao menos uma fitasse da invenção.

Geralmente, as composições de fitasse são líquidas ou secas. 27

As composições líquidas necessitam conter somente a enzima fitasse, preferentemente numa forma altamente purificada. Mas, normalmente, também se agrega um estabilizador como glicerol, sorbitol ou monopropilenoglicol. A composição líquida também pode constar de outros aditivos, como sais, açúcares, conservantes, agentes de ajuste do pH, proteínas, fitato (um substrato de fitasse). As composições líquidas habituais são aquosas ou misturas a base de azeite. As composições líquidas podem ser agregadas a uma comida ou alimento trás sua granulação opcional.

As composições secas podem ser composições secadas por pulverização, em cujo caso a composição necessita conter somente a enzima numa forma seca. Mas, normalmente, as composições secas devem-se chamar granulados quando se podem misturar rapidamente por exemplo com componentes de comida ou alimentos, ou mais preferentemente, podem formar um componente de uma mistura previa. O tamanho de partícula dos granulados de enzima é preferentemente compatível com o tamanho dos outros componentes da mistura. Desta maneira se consegue um meio seguro e conveniente de incorporar as enzimas a, por exemplo, comida para animais.

Os granulados de aglomeração são preparados empregando a técnica de aglomeração numa misturadora de corte elevado (por exemplo Lõdige) durante o qual se unem a um material de recheio e a enzimas para formar grânulos.

Os grânulos de absorção são preparados dispondo de núcleos de um material de suporte para absorver ou ser revestindo pela enzima.

Os materiais de recheio típicos são sais como o sulfato de disodio. Outros produtos de recheio são caulino, talco, silicato de magnésio alumínio e fibras de celulose. Opcionalmente, dentro dos granulados de aglomeração se incluem aglutinantes como as dextrinas. 28

Entre os materiais de suporte habituais se encontram os amidos, por exemplo em forma de mandioca, milho, batata, arroz e trigo. Também se podem empregar sais.

Opcionalmente, os granulados são revestidos com uma mistura de revestimento. Essa mistura compreende agentes de revestimento, preferentemente agentes de revestimento hidrofóbicos, como azeite de palma hidrogenado e sebo bovino, e se se deseja outros aditivos, como carbonato de cálcio ou caulino.

Adicionalmente, as composições de fitasse podem conter outros substituintes como agentes corantes, compostos aromatizantes, estabilizadores, vitaminas, minerais, outras enzimas que melhorem a comida ou o alimento, etc.. Isso se dá particularmente nas chamadas misturas previas.

Um “aditivo de comida ou alimento” é um composto essencialmente puro ou uma multi-composição de componentes destinada a que o resultado adequado seja agregado à comida ou ao alimento. Concretamente, trata-se de uma substância que pelo uso ao que está destinada se está convertendo em um componente de um produto alimentício ou para alimentos ou afecta algumas características de um produto alimentício ou para alimentos. Como foi indicado anteriormente se compõe de composições de fitasse. Um aditivo habitual inclui normalmente um ou mais compostos como vitaminas, minerais ou enzimas que melhoram o alimento assim como excipientes e/o suportes adequados.

Em uma forma de realização preferida, as composições de fitasse da invenção incluem adicionalmente uma quantidade eficaz de uma ou mais enzimas que melhoram o alimento, concretamente enzimas que melhoram o alimento e que foram seleccionadas do grupo composto por a-galactosidase, β-galactosidase, concretamente lactase, outras fitasses, β-glucanase, concretamente endo^-l,4-glucanase e endo-β—l,3(4)-glucanase, celulase, xilosidase, galactanase, concretamente arabinogalactano endo-l,4^--galactosidase e arabinogalactano 29 endo-l,3-p--galactosidase, endoglucanase, concretamente endo-l,2-p--glucanase, endo-l,3-a-glucanasa, e endo-1,3-P-glucanase, enzimas que degradam a petina, concretamente pectinase, pectinesterase, pectinliase, poli, arabinanase, rhamnogalacturonase, rhamnogalacturonanoacetilesterase, ramnogalacturonan-a-ramnosidase, pectatoliase, e α-galacturonisidase, mananase, β-manosidase, mananoacetilesterase, xilano acetilesterase, protease, xilanase, arabinoxilanase e enzimas lipolíticas como lipase, fosfolipase e cutinase. O aditivo alimentício para animais da invenção se complementa no animal monogástrico antes ou ao mesmo tempo em que a dieta. Preferentemente, o aditivo alimentício para animais da invenção se complementa no animal monogástrico ao mesmo tempo em que a dieta. Em uma forma de realização preferente da invenção, o aditivo para alimentos para animais se agrega a dieta em forma de um granulado ou um líquido estabilizado.

Uma quantidade eficaz de fitasse numa comida ou alimento é de aproximadamente 10-20.000; preferentemente de aproximadamente 10 a 15.000, mais preferentemente de aproximadamente 10 a 10.000, concretamente de aproximadamente 100 a 5.000, especialmente de aproximadamente 100 a aproximadamente 2.000 FYT/kg de comida ou alimento.

Exemplos de outros usos específicos da fitasse da invenção são encontrados no processo da soja e na produção de inositol ou derivados. A invenção também se refere a um método para reduzir os níveis de fitatos em abonos animais, onde se dá uma comida ao animal que inclui uma quantidade eficaz da fitasse da invenção. Como foi estabelecido no começo desta solicitude, um dos principais efeitos derivados é a redução da contaminação do meio por fosfato. 30

Também dentro do campo da invenção se inclui o uso de uma fitasse da invenção durante a preparação de alimentações ou alimentos ou aditivos, ou seja a fitasse exerce sua actividade fitasse somente durante a produção e não se encontra activa nos alimentos ou produto de alimentação final. Este aspecto é relevante por exemplo para a preparação de massas e no sector da padaria. A invenção também se refere substancialmente a cultivos biológicos puros dos microrganismos depositados e a cepas que incluem, como uma parte do seu equipamento genético, uma sequência de ADN que codifica uma fitasse da invenção. Dentro da definição de um cultivo biológico substancialmente puro encontramos qualquer mutação de ditas cepas que reteve a capacidade de codificação da fitasse. A invenção é descrita com maior detalhe nos seguintes exemplos que em modo algum pretendem limitar o objectivo da invenção.

EXEMPLO

Materiais e Métodos Meios:

Placas de replicação de fitasse:

Agregar a 200ml de agar SC derretido 20ml de 20% de galactose 800μ1 de 5% de treonina

25ml de solução A

25ml de solução B 200μ1 de solução de elemento traça (Catálogo DSM 141)

Solução A: 6g CaCl2,2H20 8g MgCl2, 6H20 agregar ddH20 a 11 31 ρΗ = 6.5

Solução Β: 35,12g de Na-fitato agregar H2O a 11 pH = 6.5

Meio A:

Base de nitrogénio de levedura w/o Aminoácidos 7,5 g/1 (Difco0919) Ácido succínico (Merck 822260) 11,3 g/1

NaOH (Merck 6498) 6,8 g/1 r

Acido de casamino w/o vitamina (Difco 0288) 5,6 g/1

Triptófano (Merck 8374) 0,1 g/1

Treonina 1,0 g/1

Na-fitato (35,12 g/1 pH 6.5) 125 ml/L

Galactosa 20,0 g/1

Metal traça (DSM 141) 1,0 ml/1

agregar 11 com H2O

Solução de metal traça: r

Acido nitrilotriacético 1,50 g 3.00 g 0,50 g 1.00 g 0,10 g 0,18 g 0,10 g 0,18 g 0,01 g

MgS04,7 Η 2O

MnS04.2H20

NaCl

FeSC>4, 7H2O

C0SO4.7H2O

CaCl2,2H20

ZnS04,7H20

CuS04,5H20 32 0,02 g 0,01 g 0,01 g 0,025 g 0,30 g 11 KA1(S04)2,12H20 H3BO3

Na2Mo04,2H20 NiCl2,6H20 Na2Se30,5H20 Agua destilada pH 7.0

Em primeiro lugar se dissolve ácido nitrilotriacético e se ajusta o pH a 6.5 com hidróxido de potássio, a continuação se agregam os minerais. O pH final é de 7.0 (com KOH).

Meio B:

Similar ao meio A excepto que se agrega glicose como uma fonte de C em lugar de galactose. YPD: 10 g de extracto de levedura, 20 g de peptona, H20 a 900 ml. Agregam-se 100 ml de 20% de glicose (filtrado estéril) submetidos ao autochave. YPM: 10 g de extracto de levedura, 20 g de peptona, H20 a 900 ml. Agregam-se, 100 ml de 20% de maltodextrina (filtrado estéril) submetidos ao autochave. 10 x de sal basal: 75 g de base de nitrogénio de levedura, 113 g de ácido succínico, 68 g de NaOH, H20 até 1000 ml, filtrado estéril. 33 SC-URA:

Agregam-se 100 ml 10 x de sal basal, 28 ml de 20% de ácidos de casamino sem vitaminas, 10 ml de 1% de triptófano, H20 a 900 ml, em autochave, 3,6 ml de 5% de treonina e 100 ml de 20% de glicose ou 20% de galactosa. SC-agar:

Agregam-se SC-URA, 20 g/l de agar. SC-variante de agar: 20 g de agar, 20 ml de 10 x de sal basal, H20 a 900 ml, submetidos ao autochave. Métodos gerais de biologia molecular A menos que se especifique o contrário as manipulações e transformações do ADN se levaram a cabo empregando métodos Standard de biologia molecular (Sambrook et al. (1989) Molecular cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor lab., Cold Spring Harbor, NY; Ausubel, F. M. et al. (eds.) "Current protocols in Molecular Biology". Juan Wiley and Sons, 1995; Harwood, C. R., y Cutting, Seg. M. (eds.) "Molecular Biological Methods for Bacillus". Juan Wiley and Sons, 1990). A menos que se especifique o contrário todas as enzimas para as manipulações do ADN, como por exemplo endonuclease de restrição, ligase etc.., foram obtidas de New England Biolabs, Inc. As enzimas foram empregadas segundo as especificações dos provedores. EXEMPLO 1

Clonação e expressão de uma fitasse a partir de Peniophora lycii CBS No. 686.96

Organismos depositados:

Peniophora lycii CBS No 686.96 compreende a fitasse que codifica a sequência de ADN da invenção. 34

Escherichia coli DSM N° 11312 que contém o plasmídeo que inclui toda a sequência completa do ADNc, que codifica para a obtenção da fitasse da invenção no vector transportador pYES 2.0.

Outras cepas:

Cepa de levedura: a cepa de Sacaromices cerevisiae empregada foi W3124 (van den Hazel, H.B; Kielland-Brandt, M.C.; Winther, J.R. en Eur. J. Biochem., 207, 277-283, 1992; (MATa; ura 3-52; leu 2-3, 112; his 3-D200; pep 4-1137; prcl::HIS3; prb 1:: LEU2; ciri-).

Cepa de E. coli: DH10B (Life Technologies)

Plasmídeos: O vector de expressão de Aspergillus pHD414 é um derivado do plasmídeo p775 (descrito em EP 238 023). A construção de pHD414 se descreve mais detalhadamente em WO 93/11249. pYES 2.0 (Invitrogen) pA2phy2 (Ver exemplo 1)

Clonação de expressão em levedura A clonação de expressão se levou a cabo em levedura da maneira de por H. Dalboege et al. (H. Dalboege et al Mol. Gen. Genet (1994) 243:253-260.; WO 93/11249; WO 94/14953), incluído aqui como referência. Cada um dos passos individuais da extracção do ARN total, síntese do ADNc, tratamento de nuclease de vagem mung, finalização directa do ADN de polipeptídio com T4 e construção de bibliotecas se levaram a cabo segundo as referências que foram mencionadas anteriormente. 35

Procedimento de fermentação de Peniophora lycii CBS No 686.96 para o isolamento do ARNm:

Inoculou-se Peniophora lycii CBS 686.96 de uma placa com micelio cultivado em um frasco de agitação com 100 ml de meio B (soja 30 g/1, maltodextrina 15 g/1, bactopeptona 5 g/1, pluronic 0,2 g/1). O cultivo foi incubado de forma estacionaria a 26°C durante 15 dias. Filtrou-se o caldo de cultivo resultante através de miracloth e se congelou o micelio em nitrogénio líquido.

Isolou-se o ARNm do micelio deste cultivo como se descreve em (H. Dalboege et al Mol. Gen. Genet (1994) 243:253-260.; WO 93/11249; WO 94/14953). A extracção de ARN total se levou a cabo com tiocianato de guanidinio contínuo de ultracentrifugado através de um leito de 5.7 M de CsCl e o isolamento de ARN poli(A)+ si realizou por cromatografía de afinidade de oligo(dT)celulose mediante os procedimentos de em WO 94/14953. Síntese do ADNc:

Sintetizou-se o ADNc bicatenario a partir de 5 mg de ARN poli(A)+ através do método RNasa H (Gubler and Hoffman (1983) Gen 25:263-269, Sambrook et al. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor lab., Cold Spring Harbor, NY). O ARN poli(A)+ (5 pg em 5 μΐ de água tratada com DE) foi aquecido a 70°C durante 8 minutos em um tubo de Eppendorph sem RNasa pre-siliconado, esfriado sobre gelo e combinado em um volume final de 50 μΐ com tampão de transcriptasa invertida (50 mM de Tris-Cl, pH 8.3, 75 mM KC1, 3 mM de MgC12, 10 mM de DTT, Bethesda Research Laboratories) que continha 1 mM de DATP, DGTP e dTTP e 0,5 mM de 5-metil-dCTP (Pharmacia), 40 unidades de inhibidor de ribonuclease de placenta humana (RNasin, Promega), 1,45 pg de cebador oligo(dT)18-Not I (Pharmacia) e 1000 unidades de transcriptase invertida Super II RNasa H (Bethesda Research Laboratories). Sintetizou-se o ADNc monocatenario incubando a mistura de reacção a 45°C durante 1 hora. Trás a síntese, a mistura híbrida de ARNm: ADNc foi filtrada em gel através de uma 36 coluna de rotação Micro S-400 HR (Pharmacia) segundo as instruções do fabricante.

Depois da filtração em gel, se diluiu os híbridos em um tampão de cadeia secundaria de 250 μΐ (20 mM de Tris-Cl, pH 7.4, 90 mM de KC1, 4,6 mM de MgC12, 10 mM (NH4)2S04, 0,16 mM de bNAD+) que continha 200 μΐ de cada dNTP, 60 unidades de polipeptídio I de ADN de E. coli (Pharmacia), 5,25 unidades de RNasa H (Promega) e 15 unidades de ligase de ADN de E. coli (Boehringer Mannheim). A síntese do ADNc de cadeia secundaria se levou a cabo incubando o tubo de reacção a 16°C durante 2 horas e outros 15 minutos adicionais a 25°C. Deteve-se a reacção mediante adição de EDTA a uma concentração final de 20 mM em seguida de fenol e extracções de clorofórmio.

Tratamento de nuclease de vagem mung:

Precipitou-se o ADNc bi a -20°C durante 12 horas mediante a adição de 2 vol. de 96% de EtOH, 0,2 Vol 10 M de NH4Ac, recuperou-se mediante centrifugado, lavou-se em 70% de EtOH, secou-se e se voltou a suspender em 30 μΐ de tampão de nuclease de vagem mung (30 mM de NaAc, pH 4.6, 300 mM de NaCl, 1 mM de ZnS04, 0,35 mM de DTT, 2% de glicerol) que continha 25 unidades de nucleasa de vagem mung (Pharmacia). Recortou-se a curva de ADN monocatenario incubando a reacção a 30°C durante 30 minutos, contínuo da adição de 70 μΐ 10 mM de Tris-Cl, pH 7.5, 1 mM de EDTA, extracção de fenol e precipitação com 2 vol. de 96% de EtOH e 0,1 Vol 3 M de NaAc, pH 5.2 em gelo durante 30 minutos.

Finalização directa do ADN de polipeptídio com T4:

Recuperaram-se os ADNc bicatenarios mediante centrifugado e se finalizaram directamente em 30 ml de tampão de ADN de polipeptídio T4 (20 mM de Tris-acetato, pH 7.9, 10 mM de MgAc, 50 mM de KAc, 1 mM de DTT) contendo 0,5 mM de cada dNTP e 5 unidades de ADN de polipeptídio T4 (New England Biolabs) incubando a mistura de reacção a 16°C durante 1 hora. A reacção se deteve mediante a adição de EDTA a uma concentração final de 20 mM, contínuo 37 de fenol e extracções de clorofórmio, e precipitação durante 12 horas a -20°C agregando 2 vol. de 96% de EtOH e 0,1 vol. de 3 M de NaAc, pH 5.2.

Enlace do adaptador, digestão com Not I e selecção de tamanho:

Uma vez completada a reacção foi recuperada os ADNc mediante centrifugado, foram lavados em 70% de EtOH e se secaram. O granulado de ADNc foi novamente suspendido em 25 μΐ de tampão de enlace (30 mM de Tris-Cl, pH 7.8, 10 mM de MgCl2, 10 mM de DTT, 0,5 mM de ATP) contendo 2,5 pg de adaptadores BstXI (Invitrogen) não palindrómicos e 30 unidades de ligase T4 (Promega) e incubado a 16°C durante 12 horas. A reacção se deteve mediante aquecimento a 65°C durante 20 minutos e a continuação se esfriou em gelo durante 5 minutos. O ADNc adaptado foi digerindo com enzima de restrição Not I mediante a adição de 20 μΐ de água, 5 μΐ de tampão de enzima de restrição lOx Not I (New England Biolabs) e 50 unidades de Not I (New England Biolabs), contínuo de incubação durante 2,5 horas a 37°C. A reacção se deteve esquentando a 65°C durante 10 minutos. Os ADNc foram divididos por tamanho através de electroforese de gel sobre uma SeaPlaque GTG de 0,8% de gel de agarosa com uma temperatura de fusão baixa (FMC) em lx TBE para separar os adaptadores não enlaçados e os ADNc pequenos. O ADNc foi seleccionado segundo o tamanho com um limite de 0,7 kb e recuperado do gel empregando b-Agarasa (New England Biolabs) segundo as instruções do fabricante e precipitado durante 12 horas a -20°C agregando 2 vol. de 96% de EtOH e 0,1 vol. 3M de NaAc com pH 5.2.

Construção de bibliotecas: O ADNc direccional, seleccionado por tamanho foi recuperado mediante centrifugado, lavado em 70% de EtOH, secado e novamente suspendido em 30 μΐ 10 mM de Tris-Cl, pH 7.5, 1 mM de EDTA. Si de os ADNc por filtração em gel através de uma coluna de rotação Micro S-300 HR (Pharmacia) segundo as instruções do fabricante. Levou-se a cabo três provas de ligação em 10 μΐ de tampão de ligação (30 mM de Tris-Cl, pH 7.8, 10 mM de MgCl2, 10 mM de DTT, 38 0,5 mM de ATP) contendo 5 μΐ de ADNc bicatenario (tubos de reacção #1 e #2), 15 unidades de ligase T4 (Promega) e 30 ng (tubo #1), 40 ng (tubo #2) e 40 ng (tubo #3, o controle residual do vector) do vector pYES 2.0 divido com BstXI-Notl. As reacções de ligação se levaram a cabo mediante incubação a 16°C durante 12 horas, aquecimento a 70°C durante 20 minutos e adição de 10 μΐ de água a cada tubo. Submeteu-se 1 μΐ de cada mistura de ligação a electroforese para obter 40 μΐ de células DH10B de e. coli electrocompetente (Bethesda research Laboratories) como se descreveu (Sambrook et al. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor lab., Cold Spring Harbor, NY). Empregando as condições óptimas estabeleceu-se uma biblioteca em E. coli consistente em reservas. Cada reserva se realizou espalhando E. coli transformado sobre placas de agar de LB+ampicilina dando 15.000-30.000 colónias/placa depois da incubação a 37°C durante 24 horas. Agregaram-se 20 ml de LB+ampicilina a placa e se suspendeu as células em dita placa. Agitou-se a suspensão da célula em um tubo de 50 ml durante 1 hora a 37°C. Isolou-se o ADN do plasmídeo das células segundo as instruções do fabricante empregando o equipe para plasmídeos QIAGEN e se armazenou a -20°C.

Transformaram-se partes alíquotas de 1 μΐ de plasmídeos do ADN purificado (100 ng/ml) de reservas individuais em S. cerevisiae W3124 por electroporação (Becker e Guarante (1991) Methods Enzymol. 194:182-187) e os transformantes foram depositados em placas sobre agar SC contendo 2% de glicose e incubados a 30°C.

Identificação de colónias positivas:

Depois de 3-5 dias de crescimento, as placas de agar foram depositadas para sua replica sobre um jogo de placas de replicas de fitato e incubadas durante 3-5 dias a 30°C. Verteu-se um 1% de LSB-agarosa contendo 0,2M de CaC12 sobre as placas e depois de 1-4 dias identificaram-se as colónias positivas de fitasse como colónias rodeadas por uma zona de compensação.

39

Espalharam-se células das colónias de enzima positivas para o isolamento de uma só colónia sobre agar e seleccionou-se uma única colónia de produção de enzimas por cada colónia identificada de produção de fitasse.

Isolamento de um gen do ADNc para a expressão em Aspergillus:

Inoculou-se uma colónia de levedura que produzia fitasse em 20 ml de caldo YPD em um tubo de ensaio de vidro de 50 ml. O tubo foi agitado durante 2 dias a 30°C. Recolheram-se as células mediante centrifugado durante 10 minutos a 3000 rpm.

Isolou-se o ADN segundo WO 94/14953 e se dissolveu em 50 ml de água. O ADN foi transformado em E. coli através de procedimentos Standard. Isolou-se plasmídeo de ADN de E. coli empregando os procedimentos Standard e se analisou por análise de enzima de restrição.

Eliminou-se o inserto de ADNc empregando as enzimas de restrição Hind III e Xba I e ligou no vector de expressão pHD414 de Aspergillus dando como resultado o plasmídeo pA2phy2. O inserto de ADNc do plasmídeo purificado de ADN Qiagen de pA2phy2 (Qiagen, Usa) foi sequenciado com o equipe de sequenciação de ciclo terminal de Taq (Perkin Elmer, Usa) e os cebadores de oligonucleótidos sintéticos empregando um sequenciador de ADN de Applied Biosystems ABI PRISM™ 377 segundo as instruções dos fabricantes.

Transformação de Aspergillus oryzae ou Aspergillus Niger.

Preparam-se os protoplastos como si descreve em WO 95/02043, pág. 16, linha 21 - pág. 17, linha 12, documento que se incorpora aqui como referência.

Misturam-se 100 μΐ de suspensão de protoplastos com 5-25 pg do ADN apropriado em 10 μΐ de STC (1,2 M de sorbitol, 10 mM de Tris-Cl, pH = 7.5, 10 mM de CaCl2) Misturam-se os protoplastos com p3SR2 (um gen amdS de a. 40

nidulans que leva plasmídeo) (Tove Christensen et al. Bi, pág. 1419-1422 vol.6, Decegas. 1988). A mistura é deixada a temperatura ambiente durante 25 minutos, se agregam 0,2 ml de 60% de PEG 4000 (BDH 29576), 10 mM de CaCl2 e jq mM de Tris-Cl, pH 7.5 e se misturam com cuidado (duas vezes) e finalmente se agregam 0,85 ml da mesma solução e se mistura com cuidado. A mistura é deixada a temperatura ambiente durante 25 minutos, centrifugada a 2500 g durante 15 minutos e o granulado novamente suspendido em 2 ml de 1,2 M de sorbitol. Depois de outra sedimentação mais se espalham os protoplastos sobre placas mínimas (Cove, Biochem. Biophys. Ata 113 (1966) 51-56) contendo 1,0 M de sucrosa, pH 7.0, 10 mM de acetamida como fonte de nitrogénio e 20 mM de CsCl para inibir o crescimento residual. Trás a incubação durante 4-7 dias a 37°C si recolhem as esporas e si espalham por colónias únicas. Este procedimento se repete e as esporas de uma única colónia se armazenam depois do segundo re-isolamento como uma transformação definida.

Prova de transformantes deA.oryzae

Inoculam-se cada um dos transformantes de A.oryzae em 10 ml de YPM (compare abaixo) e se propaga. Depois de 2-5 dias de incubação a 30°C, se extrai o sobrenadante. A actividade fitasse se identifica aplicando 20 μΐ de sobrenadante em orifícios de 4 mm de diâmetro perfurados em placas de um 1% de LSB-agarosa contendo 0,1M de sódio acetato pH 4.5 e 0,1% de ácido Inositol hexafosfórico. Deixam as placas durante a noite a 37°C. Verte-se um tampão contendo 0,1M de CaCl2 e 0,2M de acetato de sódio pH 4.5 sobre as placas e se deixam as placas a temperatura ambiente durante lh. A continuação se identifica a actividade fitasse como uma zona clara. 41

Fermentação por lotes alimentados: A fermentação por lotes alimentados se levou a cabo em um meio que continha maltodextrina como fonte de carbono, ureia como fonte de nitrogénio assim como extracto de levedura. A fermentação por lotes alimentados se realizou inoculando um cultivo de um frasco de agitação de células hóspedes de A. oryzae em um meio que incluía 3,5% da fonte de carbono e 0,5% da fonte de nitrogénio. Depois de 24 horas de cultivo a pH 7.0 e 34°C se iniciou a provisão continuo de fontes de carbono e nitrogénio adicionais. Manteve-se a fonte de carbono como o factor de limitação e se estabeleceu que se dava um excesso de presença de oxigénio. O cultivo por lotes alimentados continuou durante 4 dias.

Isolamento da sequência de ADN mostrado em SEQID No. 1: A fitasse que codifica parte da sequência de ADN mostrada na sequência ir No. 1 que codifica a fitasse da invenção se pode obter a partir do organismo depositado Escherichia coli DSM 11312 mediante extracção de plasmídeo de ADN através dos métodos conhecidos na técnica (Sambrook et al. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor lab., Cold Spring Harbor, NY). A clonação e a expressão se levaram a cabo empregando a técnica de clonação de expressão em levedura como si há descrito encima.

Isolou-se ARNm de Peniophora lycii, CBS No. 686.96, cultivado como foi descrito encima.

Foram recolhidos os micélios depois de 15 dias de crescimento, foram congelados imediatamente em nitrogénio líquido e se armazenaram a -80°C. Construiu-se em E. coli uma biblioteca de Peniophora lycii, CBS No. 686.96, que se compunham aproximadamente de 9x105 clones individuais como se descreveu com um vector residual de um 1%. Transformou-se em levedura o plasmídeo de ADN de alguma das reservas e de cada reserva se obteve 50-100 placas contendo 250-400 colónias de levedura. 42

Identificaram-se e isolaram colónias positivas de fitasse como foi descrito encima e inocularam-se em 20 ml de caldo YPD em um tubo de ensaio de vidro de 50 ml. 0 tubo foi agitado durante 2 dias a 30°C. Recolheram-se as células mediante centrifugado durante 10 minutos a 3000 rpm. Isolou-se o ADN segundo WO 94/14953 e se dissolveu em 50 μΐ de água. Transformou-se o ADN em E. coli através dos procedimentos Standard. Isolou-se o plasmídeo de ADN de E. coli empregando os procedimentos Standard e a sequência de ADN do ADNc que codifica a fitasse com o equipe de sequência de ciclo terminal de Taq (Perkin Elmer, Usa) assim como cebadores de oligonucleótidos sintéticos empregando o seqiienciador de ADN de Applied Biosystems ABI PRISM™ 377 segundo as instruções dos fabricantes. A Sequência de ADN do ADNc que codifica a fitasse é mostrada na SEQ ID No. 1 e a correspondente sequência de aminoácidos é mostrada na SEQ ID No. 2. Na sequência ir No. 1 os nucleotídeos de ADN do No. 1 ao No. 1320 definem região que codifica a fitasse. A parte da sequência de ADN na SEQ ID No. 1, que codifica a parte madura da fitasse é a posição 91 a 1320, que corresponde a posição de aminoácido 31-439 na SEQ ID No 2. O ADNc se obtém do plasmídeo que se encontra em DSM 11312.

Isolou-se o ADN total de uma colónia de levedura e se recuperou o plasmídeo de ADN mediante a transformação de E. coli como se há descrito encima. Para expressar a fitasse em Aspergillus, o ADN foi digerindo com enzimas de restrição apropriadas, divido por tamanho sobre gel e um fragmento correspondente ao gen de fitasse foi purificado. O gen foi ligado posteriormente a pHD414, digerindo com enzimas de restrição apropriadas e deu como resultado o plasmídeo pA2phy2.

Depois de amplificar o ADN em E. coli si transformou o plasmídeo em Aspergillus oryzae como si há descrito encima. 43

Ensaio de transformantes de A. oryzae

Si ensaio a actividade enzimática de cada um dos transformantes como si há descrito encima. Alguns dos transformantes tinham actividade fitasse que foi significativamente maior que o resíduo de Aspergillus oryzae. Isto demonstra a expressão eficiente da fitasse em Aspergillus oryzae. EXEMPLO 2

Purificação e caracterização da fitasse de Peniophora lycii expressada em Aspergillus oryzae. A fitasse Peniophora lycii foi expressa e excretada do Aspergillus oryzae IFO 4177.

Agregou-se adjunto de filtragem ao caldo de cultivo que foi filtrado através de um tecido que filtra. Está solução foi novamente filtrada através de uma placa filtrante profunda Seitz dando como resultado uma solução clara. Concentrou-se o filtrado mediante ultrafiltração sobre membranas de polipeptídio 3kDa isolado, contínuo de diafiltração com água destilada para reduzir a condutibilidade. O pH da enzima concentrada foi ajustado a pH 7.5. A condutibilidade da enzima concentrada foi de 1,2 mS/cm.

Aplicou-se a fitasse a uma coluna de Q-sefarosa FF equilibrada em 20mM de Tris/CH3COOH, pH 7.5 e se diluiu a enzima com um gradiente de NaCl lineal crescente (0 -» 0,5M). A actividade fitasse diluiu como um único valor máximo. Este valor máximo foi agrupado e se agregou (NH4)2S04 a 1,5M da concentração final. Uma coluna de fenilo Toyopearl 650S foi equilibrada em 1,5M de (NH4)2S04, lOmM de ácido succínico/NaOH, pH 6.0 e a fitasse foi aplicada, a esta coluna e diluída com um gradiente (1,5 —> 0M) lineal decrescente (NH4)2S04. Agruparam-se fracções que continhas fitasse e se substituiu o tampão por 20mM de Tris/CH3COOH, pH 7.5 sobre uma coluna Sephadex G25. O filtrado G25 foi aplicado a uma coluna de Q-sefarosa FF equilibrada em 20mM de 44

Tris/CH3C00H, pH 7.5. Depois de haveres lavado a coluna amplamente com o tampão de equilíbrio, se diluiu a fitasse com um gradiente NaCl lineal aumentando (0 —> 0,5M). A actividade fitasse foi agrupada e se substituiu o tampão por 20mM de Tris/CH3COOH, pH 7.5 através de diálise. A fitasse dializada foi aplicada, a uma coluna SOURCE 30Q equilibrada em 20mM de Tris/CH3COOH, pH 7.5. Depois de haveres lavado a coluna integralmente com o tampão de equilíbrio se diluiu uma fitasse com um gradiente NaCl lineal aumentado (0 -> 0,3M). Analisaram-se as fracções da coluna SOURCE 30Q através do sistema de diluição simples por electroforese em gel de polipeptídio e se agruparam as fracções de fitasse puras. A fitasse de Peniophora migra no gel como uma banda com Mr = 67 kDa. A seqúenciador do aminoácido N-terminal do componente 67 kDa se levou a cabo seguindo o sistema de diluição simples por electroforese em gel de polipeptídio SDS-PAGE e através de electro-transferência numa membrana PVDF. Poderia se deduzir a seguinte sequência de aminoácidos N-terminal:

Leu-Pro-Ile-Pro-Ala-Gln-Asn A sequência corresponde aos resíduo de aminoácido 31-37 na sequência de aminoácidos derivada de ADNc.

Em consequência se supõe que uma sequência de aminoácidos madura da fitasse quando esta é expressada em Aspergillus é o No. 31-439 da SEQ ID No. 2. EXEMPLO 3

Caracterização da fitasse de Peniophora lycii, presente no sobrenadante do caldo de fermentação cru. A caracterização que se mostra a continuação si levou a capo no sobrenadante do caldo de cultivo cru. 45

Ensaio da actividade fitasse:

Por cada mostra de fitasse se agregam duas mostras de 20 μΐ a 100 μΐ de ácido fítico (5 mM de sódio fitato em 0,1 M de tampão de acetato de sódio pH 5.5).

Com um tempo T= 0 minuto agrega-se à mostra de referência 100 μΐ de reactivo Fe (1,1 g de FeS04, 7 H20 em 15 ml de solução de amónio molibdato (2,5 g (NH4)6Mo7024 ,4 H20 y 8 ml de H2S04 diluído a 250 ml com água)). A mistura de referência é incubada durante 5 minutos a 37°C. A intensidade da cor azul se mede espectrofotométricamente a 750 nm.

Incuba-se a mostra de enzima durante 30 minutos a 37°C. Com um tempo T=30 minutos agregam-se 100 ml de reactivo Fe. As mostras são incubadas durante 5 minutos a 37°C e medidas espectrofotométricamente a 750 nm. A diferencia entre a mostra de enzima e a mostra de referência indicam a quantidade de fosfato liberado em relação com uma curva de calibração de fosfato.

Estabilidade térmica A estabilidade da fitasse foi calculada pré-incubando as mostras de enzima durante 20 minutos nas temperaturas indicadas na tábua que são mostrada a continuação, as mostras foram esfriadas a temperatura ambiente antes de calcular a actividade residual.

Os resultados obtidos também são mostrados na tábua que aparece a continuação, ou seja, com relação à actividade residual depois da incubação durante 20 minutos a 26°C.

Actividade residual Cepa 26 C 60 C 7TrC Peniopora lycii RJ0 82 82 46 pH óptimo Ο perfil de pH também foi calculado sobre o sobrenadante do caldo de cultivo cru empregando o ensaio da actividade fitasse descrita anteriormente. A solução de 5 mM de ácido fítico foi realizada nos seguintes tampões: pH 3.0 (0,1 M de glicínia/HCl), pH 4.0 (0,1 M de acetato de sódio), pH 5.0 (acetato de sódio), pH 5.5 (acetato de sódio), pH 6.0 (50 mM de mês), pH 7.0 (0,1 M de Tris-Cl), pH 8.0 (0,1 M de Tris-Cl), pH 9.0 (0,1 M de glicínia/NaOH).

Os resultados mostram-se na tábua que aparece a continuação, em valores relativos, onde o índice 100 indica a actividade com pH 5.0.

Cepa PH 3.0 “PH- 4.0 PH 5.0 ~ΉΓ~ 5.5 6.0 PH 7.0 8.0 PH 9.0 F. lycii 31 68 100 68 25 20 11 2 EXEMPLO 4

Caracterização da fitasse purificada de Peniophora lycii A fitasse de Peniophora lycii foi expressa em Aspergillus e purificada como é descrita no exemplo 2. A actividade fitasse si calcula empregando o seguinte ensaio:

10 μΐ de mostras de enzima (diluídas em 0,1 M de acetato de sódio, 0,01 % de Tween 20, pH 5.5) foram agregadas a 250 μΐ de 5 mM de sódio fitato (Sigma) em 0,1 M de acetato de sódio, 0,01 % de Tween 20, pH 5.5 (pH ajustado depois de dissolver o sódio fitato; o substrato foi pré-esquentado) e se incubou durante 30 minutos a 37°C. A reacção foi detida agregando 250 μΐ de 10% de ATC e o fosfato livre foi calculado agregando 500 μΐ de 7,3 g de FeS04 em 100 ml de reactivo de molibdato (2,5 g (NH4)6Mo7024.4H2O em 8 ml de H2S04 diluído a 250 ml). A 47 absorbância a 750 nm foi calculada sobre mostras de 200 μΐ em placas micro de 96 chávenas. Incluíram os valores em branco do substrato e da enzima. Também incluíram uma curva de fosfato Standard, (0-2 mM de fosfato). 1 FYT é a quantidade de enzima que libera 1 pmol de fosfato/min com as condições dadas.

Os perfis de temperatura se obtiveram realizando a prova em várias temperaturas (pré-aquecendo o substrato).

Investigou-se a estabilidade térmica pré-incubando as fitasses em 0,1 Mm de fosfato de sódio, pH 5.5 a várias temperaturas antes de calcular a actividade residual. A estabilidade do pH foi calculada incubando a enzima com pH 3 (25 mM de glicina-Cl), pH 4-5 (25 mM de acetato de sódio), pH 6 (25 mM de mês), pH 7-9 (25 mM de Tris-Cl) durante 1 hora a 40 °C, antes de calcular a actividade residual.

Os perfis de pH foram obtidos levando a cabo a prova com vários pH e empregando os mesmo sistemas de tampão (50 mM, se reajustou o pH ao dissolver o substrato).

Os resultados dos estudos sobre o perfil de pH que são indicados acima, sobre a estabilidade de pH, sobre o perfil de temperatura e sobre a estabilidade térmica se mostram nas figuras 1,2,3 e 4 respectivamente.

Na figura 1 se observa que a fitasse de Peniophora lycii tem uma actividade razoável a um pH 3-6 (ou seja mais de um 40% da actividade máxima). A um pH 3.5-5.5 se observa mais de um 60% da actividade máxima, a um pH 3.8-5.0 mais de um 90%. O pH óptimo parece encontrar-se na área de pH 4-5. 48 É evidente, na figura 2, que a fitasse de Peniophora lycii é muito estável (ou seja retém mais do 80% da actividade máxima) durante 1 hora a 40°C no intervalo completo de pH 3-9.

No que respeita ao perfil térmico, resultando evidente na figura 3, que a fitasse de Peniophora lycii tem uma actividade razoável a temperaturas de 30-65°C (ou seja, mais do 60% da actividade máxima), enquanto que a temperaturas de 35-62°C a actividade é de mais do 70% da actividade máxima e a temperatura óptima poderia ser de perto de 50°C. E, finalmente, no que respeita os resultados sobre a estabilidade térmica que se mostram na figura 4, a fitasse da invenção é muito estável a temperaturas de 0 a perto de 50°C (ou seja, mais de um 90% de actividade residual). Observa-se uma certa diminuição na actividade residual depois da pré-incubação a temperaturas superiores a 50°C. De qualquer forma, a 60-80°C ainda permanece um 50-60% da actividade residual.

Este facto se deve a que a enzima é capaz surpreendentemente de voltar a dobrar-se depois de sua desnaturalização térmico. O grau de dobramento depende das condições exactas (pH, concentração enzimática). A figura 5 mostra o resultado de medidas de calorimetria por análise diferencial (DSC) sobre a fitasse Peniophora.

Na DSC, o calor consumido para manter um aumento constante da temperatura da célula de mostra se mede com respeito a uma célula de referência. Mantém-se um nível de aquecimento constante (por exemplo, 90°C/hora). Um processo endotérmico (processo que consume calor - por exemplo, o desdobramento de uma enzima/proteína) observa-se como um aumento do calor transferido a célula com o objectivo de manter constante o aumento de temperatura. 49 A DSC levou-se a cabo empregando o aparelho MC2 de MicroCal. Equilibraram-se as células 20 minutos a 20°C antes da análise a 90°C com uma frequência de exploração de 907h. Carregaram-se mostras por volta de 2,5 mg/ml de fitasse de Peniophora em 0,1 M de acetato de sódio, pH 5.5.

Os estudos sobre a estabilidade térmica foram comprovados através de DSC, posto que resultado evidente na figura 5 que a fitasse de Peniophora tem uma desnaturalização ou temperatura de “fusão” de perto de 60°C com pH 5.5.

EXEMPLO 4A

Determinação da actividade específica da fitasse de Peniophora.

Actividade específica se determina sobre uma mostra altamente purificada da fitasse (a pureza se controlou previamente sobre um gel SDS de poliacrilamida que mostra a presencia de só um componente). A concentração de proteína na parte alíquota de fitasse foi calculada por análise de aminoácidos da seguinte maneira: uma parte alíquota da fitasse foi hidrolisada em 6N de HC1, 0,1% de fenol durante 16h a 110°C em um tubo de vidro evacuado. Contaram-se os aminoácidos resultantes usando um sistema de análise de aminoácidos de Applied Bi 420A accionado segundo as instruções dos fabricantes. A partir das quantidades de aminoácidos pode-se calcular a massa total - e por tanto também a concentração - da proteína na parte alíquota hidrolisada. A actividade se determina nas unidades de FYT. Um FYT é a quantidade de enzima que libera 1 micro de fosfato inorgânico do fitato (5 mM de fitato) por minuto a pH 5.5, 37° C; a prova aparece no exemplo 4. A actividade específica se calcula a 987 FYT/mg de proteína de enzima. 50 EXEMPLO 5

Perfilação do produto em função do tempo da hidrólise catalisada com fitasse do ácido fítico através de espectroscopia lH NMR

Investigou-se a hidrólise do ácido fítico (PA) catalisada pela fitasse de Peniophora e por uma fitasse comercializada de Aspergillus Niger (Fitasse Novo®) (27 mM fítato, 1 FYT/ml, pH 5.5 e 3.5, e 27°C) através de Ή NMR perfilando a mistura de produto ao longo de 24 horas. A partir de agora (Ins (p,q,r,..)Pn denota mio-inositol levando em total n grupos de fosfato ligados nas posições p, q, r,... Por conveniência para designar Ins(l,2,3,4,5,6)P6 (ácido fítico) emprega-se a abreviatura PA. A pesar de tudo, consulte a secção “Nomenclatura e especificidade de posição de fitasse” na parte geral desta solicitude. A técnica proporciona informação específica sobre de pontos iniciais de incursão da enzima na molécula PA, assim como informação sobre da identidade do produto final. Por outro lado, os modelos de evolução de valores máximos que reflectem a composição das misturas de produto intermédio proporcionam uma medida qualitativa, uma impressão digital, adequada para identificar as similitudes e as diferencias entre as enzimas individuais. A NMR, ao igual que outros métodos analíticos, pode distinguir entre estereoisómeros que não são imagens especulares (diastereómeros), porém não entram em um jogo de isómeros, que são imagens especulares (enantiómeros), posto que estes mostram espectros NMR idênticos.

Assim, Ins( 1,2,4,5,6)P5 (3-fosfato extraído) amostra um espectro de NMR diferente de Ins(l,2,3,4,5)P5 (6-fosfato extraído) porque os isómeros são diastereómeros. 51

Mas, os espectros da NMR de Ins(l,2,4,5,6)P5 e Ins(2,3,4,5,6)P5 (extraído o 1-fosfato) são idênticos porque os isómeros são enantiómeros. Isso mesmo acontece com o par Ins(l,2,3,4,5)P5 e Ins(l,2,3,5,6)P5 (extraído o 4-fosfato).

Assim, através da NMR não resultado possível distinguir entre uma 3-fitasse e uma 1-fitasse, e não é possível diferenciar entre uma 6-fítasse e uma 4-fitasse (ou uma L-6 - e uma D-6-fitasse empregando a regra do localizador mais baixo). A partir da descrição da 3-fitasse e 6-fitasse da bibliografia, na presente solicitude foi empregados os términos 3-fttasse e 6-fitasse para nossas enzimas, não obstante, ainda que é pouco provável, em realidade não se sabe, ainda se dispomos de uma 1-fitasse e uma 4-fitasse em seu lugar.

Experimentação.

Foram registrados os espectros de NMR a 300 K (27°C) sobre um instrumento Bruker DRX400 equipado com uma cabeça sonda invertida selectiva de 5 mm. Foram acumulados 16 explorações precedidas por 4 explorações simuladas empregando exploração de 2003 Hz (5 ppm) coberto por pontos de dados de 8 K. Consegui-se uma atenuação da ressonância residual HOD através de um período de pré-saturação de 3 segundos. Os espectros foram referenciados a sinal HOD (d 4.70).

As mostras PA para a análise de NMR foram preparadas da seguinte maneira: dissolveu-se PA (100 mg, sal dipotásica de ácido fítico, Sigma P-5681) em água desionizada (4,0 ml) e se ajustou o pH a 5.5 ou 3.5 mediante adição de NaOH (4 N) aquoso. Agregou-se água desionizada (até 5 ml) e transferiu-se porções de 1 ml, que correspondiam cada uma a 20 mg de ácido fítico, a frascos de tampa de rosca e se evaporou o solvente (centrífuga ao vazio). As mostras secas foram dissolvidas em óxido de deutério (2 ml, Merck 99,5% D) e novamente vaporizadas até secar-se (armazenado a -18°C até seu uso). 52

Para a análise de NMR se dissolveu uma mostra de 20 mg de ácido fítico em óxido de deutério (1,0 ml, Merck 99,95% D). A solução foi transferida a um tubo para a NMR e o espectro da 1H NMR foi registrado. Agregou-se a solução enzimática (1 FTU, dissolvida en/diluída, de forma apropriada, com óxido de deutério) contínua de uma mistura continua (1 minuto). Registraram-se os espectros da 1H NMR imediatamente depois de agregar a enzima (t=0), e depois uma vez transcorridos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 45, 60, 75, 90, 105, 120, 135 150, 165, 180, 195, 210 minutos (= 3,5 horas), 4,5, 5,5 6,5, 7,5, 8,5, 9,5, 11,5, 13,5, 15,5, 17,5, 19,5, 21,5, e 23,5 horas. Si calculou o pH no tubo para a NMR. Si obteve espectros adicionais depois de 48 e 120 horas (5 dias), ali onde se agregou uma porção de substrato (PA, 6 mg) para saber se a enzima mantinha sua actividade catalítica.

Mediante análise 2D NMR de misturas de inositol fosfato obtidas através da digestão parcial de PA, em conjunção com os dados sobre a NMR publicados (Scholz, P.; Bergmann, G., e Mayr, G.W.: Methods in Inositide Research (Ed. Irvine, R.F..), págs. 65-82, Raven Pre, Ltd., New York (1990)), identificou-se sinais característicos 1H NMR atribuídos a Ins(l,2,3,4,5,6)P6 (PA),

Ins(l,2,4,5,6)P5, Ins(l,2,3,4,5)P5, Ins(l,2,5,6)P4, Ins(l,2,6)P3, Ins(l,2)P2 e Ins(2)P e foi possível uma quantificação relativa de estas espécies durante o transcurso da reacção.

Nas figuras 6 e 7 respectivamente si mostram as linhas superpostas de perfis do produto para a fitasse de Aspergillus e a fitasse de Peniophora que cobre 24 horas de tempo de reacção a pH 5.5. A sinal a 53,25(t) representa H-5 em Ins(l,2)P2 enquanto que a sinal a δ3,18(t) representa H-5 em Ins(2)P. Ins(l,2)P2 começa a acumular-se depois de perto de 4 horas de tempo de reacção com a fitasse de Aspergillus e depois de 1 hora de tempo de reacção com a fitasse de Peniophora. Ins(2)P observa-se depois de perto de 10 horas de reacção com a fitasse de Aspergillus e depois umas 3 horas de reacção com a fitasse de Peniophora. Depois de 24 horas de reacção a quantidade 53 ou nível de Ins(l,2)P2 é muito baixo para ambas fitasses, enquanto que a quantidade de Ins(2)P é máxima para ambas fitasses depois de 24 horas.

Como consequência disto, os perfis observados depois de 24 horas de tempo de reacçâo demonstram que ambas fitasses degradam PA a Ins(2)P.

Para ambas enzimas a mistura de reacção a 24 h inclui ademais de Ins(2)P quantidades menores de Ins(l,2)P2. Os tempos de reacção prolongados (vários dias) deram como resultado a desaparição do Ins(l,2)P2 residual, porém as espécies completamente de, inositol (Ins), não foram observadas em absoluto. A observação não é explicada através das inibição/desnaturalização irreversível da enzima, dado que as enzimas mantém suas actividades catalíticas durante períodos prolongados, como foi demonstrado na sua capacidade para digerir porções frescas de PA agregadas a tubos NMR depois de tê-las durante 5 dias a temperatura ambiente.

Observam-se as figs. 8 e 9, em estas se representam mais detalhadamente nos perfis que se desenvolvem a pH 5.5 durante as 4,5 horas iniciais. Da figura 10 se que H-3 em Ins(l,2,4,5,6)P5 (designado com A) mostra uma sinal a δ 3,66(dd), H-6 em Ins(l,2,3,4,5)P5 (B) uma sinal a 53,87(t) e H-3 em Ins(l,2,5,6)P4 (C) uma sinal a δ 3,56(dd). Agora, o composto a corresponde ao fosfato na posição 3 depois de haver sido hidrolisada, B a posição 6 e C a posição 3 e 4. E evidente que na figura 8 o composto aparece como o produto primário principal (t=5 minutos) empregando a fitasse de Aspergillus, enquanto que no composto B não aparece. No composto C aparece depois de 20-25 minutos.

Da figura 9 (a fitasse de Peniophora) deduzimos que o composto B aparece como o produto primário principal (t=5min) empregando a fitasse Peniophora. 54

Os sinais a δ 4,82 (dt, H-2), 4,38 (q, H-4/-6), 4,13(q, H-5) e 4,1 l(dt,Hl/H3) podem ser atribuídas ao substrato, ácido fítico, PA. Se compararmos as figuras 8 e 9 é evidente que estes valores máximos diminuem mais rapidamente com a fitasse de Peniophora que com a fitasse de Aspergillus.

Esta diferencia são destacadas na figura 10a, que apresenta os perfis que se observam depois de 20 minutos a pH 5.5 com os sinais diagnósticos que se indicam acima (A,B,C) marcados. A figura 10b mostra o resultado final (baixo estas condições) da hidrólise do ácido fítico a pH 5.5 (ou seja, correspondente à linha superior das figs. 6 e 7). Todos os sinais marcados, na forma de realização com a Peniophora mostradas na parte superior representam o composto Ins(2)P, ou seja, os prótons derivados, da direita a esquerda: H-5, Hl e H3, H4 e H6 e finalmente H-2. Intensidade relativa: 1:2:2:1. Os sinais correspondentes se encontram na forma de realização com o Aspergillus mostradas na parte inferior. Isto significa que o produto final se encontra em ambas formas de realização Ins(2)P. Mas, também se detecta uma quantidade menor de Ins(l,2)P2 em ambas formas de realização e os valores máximos correspondentes só são indicados na forma de realização com o Aspergillus.

Observam-se notáveis diferencias:

Aspergillus·. O produto principal inicial foi identificado como Ins(l,2,4,5,6)P5 (A) contínuo da aparição de Ins(l,2,5,6)P4 (C), e Ins(l,2,6)P3 (D) (H-3 a δ 3,49(dd) depois de 1 hora) que corresponde a extracção consecutivo dos grupos de fosfato nas posições 3, 4 e 5. A concentração de Ins(l,2)P2 (E) forma-se lentamente a partir de 4 horas e diminui de forma brusca entre 12 e 14 horas com um aumento rápido e concomitante do nível de Ins(2)P (F). Isto se observa na figura 11 que representa a concentração em relação com o tempo de Ins(l,2)P2 e Ins(2)P, respectivamente, que se determina medindo a área baixo os sinais que correspondem a H-5 em Ins(l,2)P2 (δ 3,25(t)) e Ins(2)P (δ 3,18 (t)), 55 respectivamente, com respeito à área baixo os sinais que correspondem aos substratos (t=0).

Peniophora: Com um pH 5.5 só se ataca inicialmente na posição 6. Um rasgo característico é que PA se digere em maior velocidade que a fitasse de Aspergillus. Outros rasgos característicos adicionais são que o produto final, Ins(2)P (F) aparece muito pronto (3 horas) e forma-se lentamente, a diferença do forte aumento do nível de Ins(2)P para o final da reacção onde se observa com a fitasse de Aspergillus. A figura 10c é uma linha similar àquela mostrada na figura 10a, porém com um pH 3.5. Surpreendentemente, com este pH a fitasse de Peniophora tem uma afinidade inicial muito elevada com a posição 6 assim como com a posição 3 de PA (si observam B assim como A), provavelmente com uma ligeira preferência por a posição 6.

Os dados gerados conduzem entre outras a as seguintes as conclusões:

Com um pH 5.5 assim como 3.5, a fitasse de Aspergillus ataca com um alto grau de selectividade a PA na posição 3, enquanto que a fitasse de Peniophora com um pH 5.5 ataca com um alto grau de selectividade a PA na posição 6; mas, com um pH 3.5 parece que hidrólise os grupos de fosfato nas posições 3 e 6 a índices comparáveis.

Com pH 5.5, a fitasse de Peniophora digere PA a um nível mais rápido em comparação com a fitasse de Aspergillus. O produto final é Ins(2)P (F) com pH 3.5 assim como 5.5, baixo as condições aplicadas. 56

Os índices de reacção globais (PA‘Ins(2)P) eram comparáveis aproximadamente em 20 horas (figura 11; pH 5.5).

Em consequência, se demonstrou que a fitasse de Aspergillus é uma 3-fitasse essencialmente pura, enquanto que a fitasse de Peniophora com pH 5.5 parece ser uma 6-fítasse essencialmente pura e com pH 3.5 uma fitasse de um tipo mesmo agora desconhecido, ou seja uma 3+6-fitasse. EXEMPLO 6

Ensaio comparativo, fitasse de Aspergillus e fitasse de Peniophora Liberação do fosfato inorgânico do milho O presente exemplo oferece um ensaio simples para a liberação catalisada com fitasse do fósforo de milho com pH 3.5 e 5.5. O ensaio se centrou em dois parâmetros: na velocidade e no nível de liberação de P.

Materiais e métodos: O milho foi obtido da Universidade do Estado da Carolina do Norte (mostra No. R27) e foi moída em um moinho (Biihler Universal) ao ponto 6.8.

Preparou-se uma suspensão de milho (16,7% w/w) pesando 20 g de milho moído numa garrafa de tampão azul de 250 ml e agregou-se 100 ml de tampão.

Empregou-se o seguinte tampão: pH 5.5: 0,22 M de tampão de acetato O valor de pH de 3.5 foi ajustado mediante 8N HCl/NaOH. 57

Enzimas submetidas a ensaio: foram submetidas a ensaio duas fitasses: uma fitasse comercializada de Aspergillus niger (Phytase Novo®) e uma fitasse de Peniophora da invenção, purificada como foi descrita nos exemplos 3 e 4.

Dosagem: aplicaram-se todas as enzimas a 25 FYT/20 g de milho (correspondente a 1250 FYT/kg).

As garrafas com a suspensão de milho foram fechadas com os tampões e colocadas imediatamente em um banho de água a 37°C e submetidas a uma agitação constante. Calculou-se o pH em esta fase e votaram a calcular depois de 24 horas. Depois de ter transcorrido 30 minutos de agitação se recolheu uma mostra de 5 ml. A continuação agregou-se as enzimas de fitasse a uma dosagem de 25 FYT/20 g de milho.

Ato posterior foram recolhidas as mostras 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60 e 120 minutos depois de ter agregado as fitasses e calculou-se o contido de P liberado da seguinte maneira:

As mostras que continha fitasse foram diluídas 1+4 em tampão. A continuação se centrifugou as mostras a 3000 rpm durante 5 minutos e se recolheu 1,0 ml do sobrenadante. Agregaram-se 2,0 ml de tampão e 2,0 ml de solução MoV de retenção (consulte o ensaio FYT do exemplo 6). As mostras foram colocadas em um refrigerador a 3-5°C até que todas as mostras puderam ser medidas no espectrofotómetro a 415nm. O pH foi calculado em um tempo de 0 e 20 horas.

Para os cálculos empregou-se uma solução preparada de fosfato Standard ou uma solução controlada de 50mM. Diluem-se 0,5, 1,0, 1,5 e 2,0 ml de solução controlada em um volume total de 50 ml empregando do tampão. Agregam-se 2,0 ml de solução de retenção MoV a 3,0 ml de cada solução. 58

Levaram-se a cabo duas experiências: a pH 5.5 e a pH 3.5. Os resultados do análise são mostradas nas figs. 12 e 13 (pH 5.5 e 3.5, respectivamente). Em estas figuras, o símbolo ” representa a experiência de controle, a fitasse de Peniophora e a fitasse de Aspergillus.

Resultados e discussão: A figura 12 (pH 5.5) mostra que com este pH a fitasse de Peniophora libera P de milho a uma velocidade signifícativamente melhor em comparação com a fitasse de Aspergillus.

Na figura 13 (pH 3.5) observa-se claramente que com este pH a fitasse de Peniophora libera fósforo do milho moído mais rapidamente que a fitasse de Aspergillus (0-120 minutos). O tempo que se demora em recorrer o sistema digestivo de, por exemplo, frangos / galinhas se encontram normalmente em uma margem de 30 minutos a 2 horas, com o que é certo que a diferença observada é importante, qualquer que seja o pH. Mas, o valor de pH de 3.5 é mais relevante neste aspecto que o valor pH 5.5.

Isto implica que a enzima Peniophora surpreendentemente é mais eficiente como libertadora de P no sistema digestivo de por exemplo, nos frangos que a fitasse de Aspergillus conhecida.

LISTA DA SEQUÊNCIA A SEQ ID No. 1 mostra uma sequência de ADN clonado da invenção que compreende uma sequência de ADN que codifica uma enzima com actividade fitasse. 59

(2) Informação da SEQID NO: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: LONGITUDE: 1320 pares base (B) TIPO: ácido nucléico (C) ENCADEAMENTO: único (D) TOPOLOGIA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (vi) FONTE ORIGINAL (A) ORGANISMO: Peniophora lycii (B) CEPA: CBS 686.96 (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: CDS UBICAÇÃO: 1. .1320 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 1: ATG GTT TCT TCG GCA TTC GCA CCT TCC ATC CTA CTT AGC TTG ATG TCG 48

Met Vai Ser Ser Ala Phe Ala Pro Ser Ile Leu Leu Ser Leu MetSer 15 10 15 AGT CTT GCT TTG AGC ACG CAG TTC AGC TTT GTT GCG GCG CAG CTA CCT 96

Ser Leu Ala Leu Ser Thr Gin Phe Ser Phe Vai Ala Ala Gin Leu Pro 20 25 30 ATC CCC GCA CAA AAC ACA AGT AAT TGG GGG CCT TAC GAT CCC TTC TTT 144

Ile Pro Ala Gin Asn Thr Ser Asn Trp Gly Pro Tyr Asp Pro Phe Phe 35 40 45 60 CCC GTC GAA CCG TAT GCA GCT CCG CCG GAA GGG TGC ACA GTG ACACAG 192

Pro Vai Glu Pro Tyr Ala Ala Pro Pro Glu Gly Cys Thr Vai

Thr Gin 50 55 60 GTC AAC CTG ATT CAG AGG CAC GGC GCG CGT TGG CCC ACA TCC GGC GCG 240

Vai Asn Leu Ile Gin Arg His Gly Ala Arg Trp Pro Thr Ser

Gly Ala 65 70 75 80

CGG TCG CGG CAG GTC GCC GCC GTA GCG AAG ATA CAA ATG GCG CGA CCA 288

Arg Ser Arg Gin Vai Ala Ala Vai Ala Lys Ile Gin Met Ala

Arg Pro 85 90 95 TTC ACG GAT CCC AAG TAT GAG TTC CTC AAC GAC TTC GTG TAC AAG TTC 336

Phe Thr Asp Pro Lys Tyr Glu Phe Leu Asn Asp Phe Vai Tyr Lys Phe 100 105 110 GGC GTC GCC GAT CTG CTA CCG TTC GGG GCT AAC CAA TCG CAC CAAACC 384

Gly Vai Ala Asp Leu Leu Pro Phe Gly Ala Asn Gin Ser His Gin Thr 115 120 125 GGC ACC GAT ATG TAT ACG CGC TAC AGT ACA CTA TTT GAG GGC GGG GAT 432 61

Gly Thr Asp Met Tyr Thr Arg Tyr Ser Thr Leu Phe Glu Gly Gly Asp 130 135 140 GTA CCC TTT GTG CGC GCG GCT GGT GAC CAA CGC GTC GTT GAC TCC TCG 480

Vai Pro Phe Vai Arg Ala Ala Gly Asp Gin Arg Vai Vai Asp Ser Ser 145 150 155 160 ACG AAC TGG ACG GCA GGC TTT GGC GAT GCT TCT GGC GAG ACT GTT CTC 528

Thr Asn Trp Thr Ala Gly Phe Gly Asp Ala Ser Gly Glu Thr Vai Leu 165 170 175 CCG ACG CTC CAG GTT GTG CTT CAA GAA GAG GGG AAC TGC ACG CTC TGC 576

Pro Thr Leu Gin Vai Vai Leu Gin Glu Glu Gly Asn Cys Thr Leu Cys 180 185 190 AAT AAT ATG TGC CCG AAT GAA GTG GAT GGT GAC GAA TCC ACA ACG TGG 624

Asn Asn Met Cys Pro Asn Glu Vai Asp Gly Asp Glu Ser Thr Thr Trp 195 200 205 CTG GGG GTC TTT GCG CCG AAC ATC ACC GCG CGA TTG AAC GCT GCT GCG 672 62

Leu Gly Vai Phe Ala Pro Asn Ile Thr Ala Arg Leu Asn Ala Ala Ala 210 215 220 CCG AGT GCC AAC CTC TCA GAC AGC GAC GCG CTC ACT CTC ATG GAT ATG 720

Pro Ser Ala Asn Leu Ser Asp Ser Asp Ala Leu Thr Leu Met Asp Met 225 230 235 240 TGC CCG TTC GAC ACT CTC AGC TCC GGG AAC GCC AGC CCC TTC TGT GAC 768

Cys Pro Phe Asp Thr Leu Ser Ser Gly Asn Ala Ser Pro Phe Cys Asp 245 250 255 CTA TTT ACC GCG GAG GAG TAT GTG TCG TAC GAG TAC TAC TAT GAC CTC 816

Leu Phe Thr Ala Glu Glu Tyr Vai Ser Tyr Glu Tyr Tyr Tyr Asp Leu 260 265 270 GAC AAG TAC TAT GGC ACG GGC CCC GGG AAC GCT CTC GGT CCT GTC CAG 864

Asp Lys Tyr Tyr Gly Thr Gly Pro Gly Asn Ala Leu Gly Pro Vai Gin 275 280 285 GGC GTC GGA TAC GTC AAT GAG CTG CTT GCA CGC TTG ACC GGC CAA GCC 912 63

Gly Vai Gly Tyr Vai Asn Glu Leu Leu Ala Arg Leu Thr Gly Gin Ala 290 295 300 GTT CGA GAC GAG ACG CAG ACG AAC CGC ACG CTC GAC AGC GAC CCT GCA 960

Vai Arg Asp Glu Thr Gin Thr Asn Arg Thr Leu Asp Ser Asp Pro Ala 305 310 315 320 ACA TTC CCG CTG AAC CGT ACG TTC TAC GCC GAC TTC TCG CAT GAT AAC 1008

Thr Phe Pro Leu Asn Arg Thr Phe Tyr Ala Asp Phe Ser His Asp Asn 325 330 335 ACC ATG GTG CCC ATC TTT GCG GCG CTC GGG CTC TTC AAC GCC ACCGCC 1056

Thr Met Vai Pro Ile Phe Ala Ala Leu Gly Leu Phe Asn Ala Thr Ala 340 345 350 CTC GAC CCG CTG AAG CCC GAC GAG AAC AGG TTG TGG GTG GAC TCTAAG 1104

Leu Asp Pro Leu Lys Pro Asp Glu Asn Arg Leu Trp Vai Asp Ser Lys 355 360 365 CTG GTA CCG TTC TCT GGA CAT ATG ACG GTC GAG AAG CTG GCA TGTTCT 1152 64 CÁ

Leu Vai Pro Phe Ser Gly His Met Thr Vai Glu Lys Leu Ala Cys I Ser 370 375 380 GGG AAG GAG GCG GTC AGG GTG CTC GTG AAC GAC GCG GTG CAG CCGCTG 1200

Gly Lys Glu Ala Vai Arg Vai Leu Vai Asn Asp Ala Vai Gin Pro Leu 385 390 395 400 GAG TTC TGC GGA GGT GTT GAT GGG GTG TGC GAG CTT TCG GCT TTC GTA 1248

Glu Phe Cys Gly Gly Vai Asp Gly Vai Cys Glu Leu Ser Ala Phe Vai 405 410 415 GAG AGC CAG ACG TAT GCG CGG GAG AAT GGG CAA GGC GAC TTC GCCAAG 1296

Glu Ser Gin Thr Tyr Ala Arg Glu Asn Gly Gin Gly Asp Phe Ala Lys 420 425 430 TGC GGC TTT GTT CCG TCG GAA TAG 1320

Cys Gly Phe Vai Pro Ser Glu □ 435 440 65 ASEQIDNo.2 mostra a sequência de aminoácidos da fitasse da invenção. 2) INFORMAÇÃO SOBRE A SEQID NO: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUENCIA: (A) LONGITUDE: 439 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUENCIA: SEQ ID NO: 2:

Met Vai Ser Ser Ala Phe Ala Pro Ser Ile Leu Leu Ser Leu Met Ser 1 5 10 15

Ser Leu Ala Leu Ser Thr Gin Phe Ser Phe Vai Ala Ala Gin Leu Pro 20 25 30

Ile Pro Ala Gin Asn Thr Ser Asn Trp Gly Pro Tyr Asp Pro Phe Phe 35 40 45

Pro Vai Glu Pro Tyr Ala Ala Pro Pro Glu Gly Cys Thr Vai Thr Gin 50 55 60

Vai Asn Leu Ile Gin Arg His Gly Ala Arg Trp Pro Thr Ser Gly Ala 65 70 75 80

Arg Ser Arg Gin Vai Ala Ala Vai Ala Lys Ile Gin Met Ala Arg Pro 85 90 95

Phe Thr Asp Pro Lys Tyr Glu Phe Leu Asn Asp Phe Vai Tyr Lys Phe 100 105 110

Gly Vai Ala Asp Leu Leu Pro Phe Gly Ala Asn Gin Ser His Gin Thr 115 120 125

Gly Thr Asp Met Tyr Thr Arg Tyr Ser Thr Leu Phe Glu Gly Gly Asp 130 135 140

Vai Pro Phe Vai Arg Ala Ala Gly Asp Gin Arg Vai Vai Asp Ser Ser 66 145 150 155 160

Thr Asn Trp Thr Ala Gly Phe Gly Asp Ala Ser Gly Glu Thr Vai Leu 165 170 175

Pro Thr Leu Gin Vai Vai Leu Gin Glu Glu Gly Asn Cys Thr Leu Cys 180 185 190

Asn Asn Met Cys Pro Asn Glu Vai Asp Gly Asp Glu Ser Thr Thr Trp 195 200 205

Leu Gly Vai Phe Ala Pro Asn Ile Thr Ala Arg Leu Asn Ala Ala Ala 210 215 220

Pro Ser Ala Asn Leu Ser Asp Ser Asp Ala Leu Thr Leu Met Asp Met 225 230 235 240

Cys Pro Phe Asp Thr Leu Ser Ser Gly Asn Ala Ser Pro Phe Cys Asp 245 250 255

Leu Phe Thr Ala Glu Glu Tyr Vai Ser Tyr Glu Tyr Tyr Tyr Asp Leu 260 265 270

Asp Lys Tyr Tyr Gly Thr Gly Pro Gly Asn Ala Leu Gly Pro Vai Gin 275 280 285

Gly Vai Gly Tyr Vai Asn Glu Leu Leu Ala Arg Leu Thr Gly Gin Ala 290 295 300

Vai Arg Asp Glu Thr Gin Thr Asn Arg Thr Leu Asp Ser Asp Pro Ala 305 310 315 320

Thr Phe Pro Leu Asn Arg Thr Phe Tyr Ala Asp Phe Ser His Asp Asn 325 330 335

Thr Met Vai Pro Ile Phe Ala Ala Leu Gly Leu Phe Asn Ala Thr Ala 340 345 350

Leu Asp Pro Leu Lys Pro Asp Glu Asn Arg Leu Trp Vai Asp Ser Lys 355 360 365

Leu Vai Pro Phe Ser Gly His Met Thr Vai Glu Lys Leu Ala Cys Ser 370 375 380

Gly Lys Glu Ala Vai Arg Vai Leu Vai Asn Asp Ala Vai Gin Pro Leu 385 390 395 400 67

Glu Phe Cys Gly Gly Vai Asp Gly Vai Cys Glu Leu Ser Ala Phe Vai 405 410 415

Glu Ser Gin Thr Tyr Ala Arg Glu Asn Gly Gin Gly Asp Phe Ala Lys 420 425 430

Cys Gly Phe Vai Pro Ser Glu * 435 440

Lisboa, 31 de Outubro de 2000.

Pela Requerente

Gonçelo de Cunhe Ferreira Adjunto do Agente Oficiei de Fropriedode Industrial R. D. João V, 9-2° df.°-1250 LISBOA 68

Claims (9)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Polipeptídio isolado que mostra actividade fitasse e que inclui (i) uma sequência de aminoácidos de SEQ ID No: 2 ou a sequência de aminoácidos nos. 31 a 439 derivadas; ou (ii) uma sequência de aminoácidos que é como mínimo um 70% homóloga a qualquer das sequências de (i); ou dito polipeptídio sendo codificado por (iii) a sequência de ADN de SEQ ID No: 1 ou a Sequência de ADN de nucleotídeos nos. 91-1317 derivadas; ou (iv) a Sequência de ADN clonada no plasmídeo pYES 2.0 presente em Escherichia coli DSM 11312; ou (v) uma sequência de ADN que é como mínimo um 70% homóloga a qualquer das sequências de (iii) ou (iv).
2. 2. Sequência de ADN clonado que codifica um polipeptídio que apresenta actividade fitasse e que inclui uma sequência de ADN seleccionada do grupo que si compõe de: (a) a sequência de ADN de SEQ ID No: 1; (b) a sequência de ADN clonado no plasmídeo pYES 2.0 presente em Escherichia coli DSM 11312; (c) os nucleotídeos nos. 91-1317 de qualquer das sequências de (a) ou (b); ou (d) uma sequência de ADN que é como mínimo um 70% homóloga a qualquer das sequências de (a), (b) ou (c); ou (e) uma sequência de ADN que é capaz de ficar híbrido com as sequências de ADN de (a), (b) ou (c) baixo condições de rigor médio/alto; ou 1 (f) uma sequência de ADN que codifica um polipeptídio que inclui a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID No: 2 ou a sequência de aminoácido nos. 31 a 439 derivadas.
3. 3. Vector que inclui a sequência de ADN clonado segundo a reivindicação 2.
4. 4. Célula hóspede que inclui a sequência de ADN clonado segundo a reivindicação 2 ou o vector segundo a reivindicação 3.
5. 5. Processo para preparar um polipeptídio que mostra actividade fitasse, incluído em esse processo o cultivo da célula segundo a reivindicação 4 sobre condições que permitem a produção do polipeptídio e a recuperação do polipeptídio do caldo de cultivo.
6. 6. Processo para preparar uma comida ou alimento, onde ao menos um polipeptídio da reivindicação 1 é agregado aos alimentos ou componentes do alimento.
7. 7. Composição que inclui o polipeptídio da reivindicação 1.
8. 8. A composição da reivindicação 7 que é uma comida, um alimento ou um aditivo para alimentações ou alimentos.
9. 9. Emprego do polipeptídio da reivindicação 1 para liberar o fosfato inorgânico do ácido fítico. 2

   Figuras Fig. 1 Perfil de pH da fitasse Peniophora, 5mM de fitato, 30 min. a 37°C Actividade relativa Fig.2 Estabilidade de pH da fitasse Peniophora - pré-incubação 1 h a 40°C Actividade residual Fig. 3 Perfil de temperatura da fitasse Peniophora 0,1 M de Na-Acetato, 5mM de fitato, pH 5.5, 30 min. Actividade relativa Temperatura Fig. 4 Estabilidade da temperatura da fitasse de Peniophora, pré-incubação 60 min. em 0,1 M - Na-Acetato pH 5.5 Actividade residual Temperatura Fig. 5 DSC de fitasse Peniophora em 0,1 M de acetato de sódio, pH 5.5 Temperatura Figura 11 Aspergillus e Peniophora pH 5.5 concentração/mM Tempo / horas 3 Figura 12 P liberado (mg P/g de milho) Tempo Figura 13 P liberado (mg P/g de milho) Tempo (min.) Lisboa, 31 de Outubro de 2000.

   Gonçalo de Cunha Ferreira Adjunto do Agente Oficial da Propriedade Industrial R. D. João V, 9-2° dr-1250 LISBOA 4