KR100888114B1 - 안정화된 포스파타아제 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 적어도 1종의 포스파타아제 및 아가, 알긴, 카라기난, 퍼셀레란, 가티 검, 트라가칸스 검, 카르야 검, 구아란, 로커스트 콩 검 (= 카로브 콩 검), 타마린드 씨앗 검, 아라비노갈락탄, 크산탄 (검), 적어도 1종의 동물성 단백질 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 1종의 안정화제를 포함하는, 안정화된 고체 또는 액체 효소 조성물 (단, 젤라틴을 고체 조성물로서의 과립에 유일한 안정화제로서 사용하는 경우, 후속적으로 과립을 코팅함)에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 조성물의 제조 방법, 특히 고체 조성물 (예를 들어, 과립) 및 동물 및(또는) 인간 영양원에서의 이들의 용도에 관한 것이다.
포스파타아제, 안정화제, 동물성 단백질, 효소 조성물

Description

안정화된 포스파타아제 조성물 {Stabilized Phosphatase Formulations}
본 발명은 안정화제의 첨가에 의해 얻어지는, 증가된 안정성, 바람직하게는 열 안정성을 갖는 고체 또는 액체 포스파타아제 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 포스파타아제, 바람직하게는 피타아제를 탄수화물(예, 전분-) 함유 과립 및(또는) 액체 조성물로 조제하는 것에 관한 것이고, 또한 그러한 효소-함유 과립 및 액체 조성물의 제조 방법에 관한 것이다. 이러한 (식용) 과립 및 액체 조성물은 동물 사료 및(또는) 인간 영양원으로 사용될 수 있다. 효소 함유 과립 및 액체 조성물은 향상된 저장 및 가공 안정성을 나타낸다.
인간 영양원 또는 동물(예를 들면 가축) 사료에 포스파타아제를 사용하는 것은 거의 일반적인 관행이 되었다. 상기 효소는 일반적으로 공업적 효소 생산자에 의해 작동되는 대규모 발효기에서 미생물을 배양함으로써 생산된다. 발효의 종료 시, 수득되는 "배양액"에 통상적으로 일련의 여과 단계를 수행하여 생물자원(상기 미생물)을 원하는 효소(용액 중)로부터 분리한다. 효소 용액은 그 후 액체로 판매되거나 건조 조성물로 가공된다.
포스파타아제, 바람직하게는 피타아제를 포함하는 효소 액체 및 건조 조성물은 사료 및 식품 산업에 의해 상업적 규모로 사용된다. 액체 조성물은, 펠렛화 공 정 도중 나타날 효소(들)의 열 불활성화를 피하기 위해 펠렛화 후 사료 또는 식품에 첨가될 수 있다. 그러나 최종 사료 또는 식품 조제에서의 효소의 양은 일반적으로 매우 적어, 사료 또는 식품에 효소의 균질한 분포를 달성하기 어렵게 하며, 액체는 건조 성분보다도 고르게 혼합하기가 더 어려운 것으로 알려져 있다. 뿐만 아니라, 펠렛화 후 사료에 액체를 첨가하기 위한, 대부분의 사료 제분기에서 통상적으로 사용가능하지 않은 (별도 비용으로 인하여) 특수화된 (고가의) 장비를 필요로 한다. 효소를 포함하는 액체 조성물을 적용하는 경우에도, 상기 조성물의 저장 안정성이 종종 문제이다.
한편, 포스파타아제, 특히 피타아제의 건조 조성물은 펠렛화 도중 효소의 열-불활성화의 단점을 갖는다. 사료 및 식품 산업에서 바람직한 제조 프로토콜은 증기 펠렛화를 수반하며, 여기에서 사료 또는 식품은 펠렛화 이전에 증기 주입을 받는다. 이어지는 펠렛화 단계에서, 상기 사료 또는 식품을 매트릭스 또는 다이로 강제로 밀어넣고, 얻어진 조각을 다양한 길이의 적절한 펠렛으로 절단한다. 펠렛화 직전의 습기 함량은 일반적으로 10％와 20％ 사이이다. 상기 공정 도중 온도는 60 내지 95℃까지 상승할 수 있다. 높은 습기 함량 및 높은 온도의 합쳐진 효과는 대부분의 효소에 유해하다. 이러한 단점은 또한 압출 및 팽창과 같은 여타 종류의 열 기계적 처리에서도 만날 수 있는 것들이다.
여러 효소 제조자가 펠렛화 및 저장 도중 건조 및 액체 효소 제품의 안정성을 향상시키기 위한 노력으로 대체적인 조제 방법을 개발하였다.
EP 0 758 018 A1은 무기 염을 첨가함으로써 건조 효소 제제의 가공 및 저장 안정성을 개선하는 방법을 개시하고 있다.
GB 2 167 758은 1 내지 35 중량％의 효소 및 0.5 내지 30 중량％의 합성 섬유 칩 또는 펄프를 포함하는 효소를 함유하는 효소 과립화 방법 및 과립 조성물을 개시한다.
EP 1 069 832 A1(WO 00/47060)은 수성 효소-함유 액체가 고체 담체 및 선택적으로 첨가제 성분과 혼합되고, 기계적으로 과립이 되도록 처리되고, 건조된 다음 이어서 폴리에틸렌 글리콜로 코팅되는, 효소 함유 과립의 제조 방법을 기재하고 있다.
EP 858 266(WO 97/16076)은 동물 사료 조성물의 제조에 사용하기 적합한 미립자상 효소-함유 제제를 개시하고 있다.
EP 862 623 A1(WO 97/12958)은 약 20 내지 400 미크론의 평균 입자 크기를 갖는 미세과립 효소 조성물을 개시하고 있다.
인용된 참고문헌의 어느 것도 본원에서 명시된 검 또는 동물성 단백질로 안정화된 효소 함유 조성물을 개시하고 있지 않다.
DE 1 958 104는 무기 또는 유기 산의 알칼리 염이 담체로서 사용되는 세제 및 세탁 조성물에 적합한 효소 함유 과립의 제조 방법을 기재하고 있다.
DE 2 137 043 및 DE 2 137 042는 담체가 무기 염으로 이루어진 세제 조성물에 적합한 효소 함유 조성물을 개시하고 있다.
EP 716 685는 효소 및 무기 및(또는) 유기 담체 물질을 함유하는 세제 및 세정 조성물에 도입하기 적합한 다중 효소 과립을 개시하고 있다.
WO 00/36927은 효소를 함유하며 동물 사료용으로 적합한 과립의 제조 방법을 개시하고 있다.
WO 03/059087은 선택적으로 고체 담체 및(또는) 첨가제 성분이 보강된 수성-함유 액체를 과립으로 가공하고 건조시킨 다음 폴리올레핀으로 코팅하는, 효소-함유 과립의 제조 방법을 기재하고 있다.
WO 03/059086은 선택적으로 고체 담체 및(또는) 첨가제 성분이 보강된 수성-함유 액체를 과립으로 가공하고, 건조시킨 다음 소수성 물질, 바람직하게는 폴리올레핀으로 된 입자를 함유하는 분산액으로 코팅하는 효소-함유 과립의 제조 방법을 기재하고 있다.
사료 용도를 위해서는, 순간적으로 높은 온도(80 내지 120℃에 이르는), 습기 및 전단 응력이 단백질 구조에 영향을 주어 원하지 않는 활성의 소실을 가져올 수 있는, 조제(예, 분무 건조, 과립화) 및 사료 처리 공정(예, 펠렛화, 압출, 팽창) 도중에 일어날 수 있는 문제점들을 피하기 위해 안정한, 바람직하게는 열 안정한 포스파타아제에 일반적으로 관심이 있다.
포스파타아제는 다양한 이유로 사료 및 식품에 일반적으로 첨가된다. 식품 용도에서 포스파타아제는 예를 들면 제빵 또는 양조시에 첨가된다. 사료 용도에서 포스파타아제, 특히 피타아제의 기능은, 예를 들면 소화액 점도를 감소시키거나 특정 사료 화합물의 항-자양 효과를 감소시키는 것에 의해, 종종 사료 전환율을 향상시키는 것이다. 포스파타아제, 특히 피타아제는 또한, 예를 들면 환경에 유해한 비료 중 화합물의 양을 감소시키는 데 사용될 수도 있다.
모든 다양한 용도에서, 이들 효소는 종종 열공격, 예를 들면 열, 습기 또는 온도 노출에 노출되며, 이는 부분적 또는 완전한 효소의 불활성화를 초래할 수 있다.
다량의 인산염이 사료 중에 피트산 인의 형태로 사료에 존재하지만, 돼지나 가금과 같은 위가 하나인 동물은 이러한 형태의 인산염을 사용할 능력이 없다. 피트산의 알칼리 또는 알칼리 토금속 염은 주로 곡류에 천연적으로 나타난다. 위가 하나인 동물은 이러한 형태의 인산염을 사용하지 못하므로, 동물 사료에 무기 인산염을 첨가하는 것이 일반적인 관례이다.
반면, 피타아제(미오-이노시톨 헥사키스포스페이트 포스포히드롤라아제)가 식물 및 일부 미생물에서 나타나는 것으로 알려져 있다. 피타아제는 발효에 의해 생산될 수 있으므로, 당 분야에서는 피트산(미오-이노시톨 헥사키스포스페이트)으로부터 무기 인산염의 유리에 의해 식물성 물질의 영양가를 향상시키기 위한 동물 사료 첨가제로서 피타아제를 사용하는 것이 알려져 있다. 동물 사료에 피타아제를 첨가하는 것에 의해 환경의 인 오염 수준이 감소될 수 있는데, 그 이유는 동물이 피타아제의 사용에 의해 피트산염으로부터 유리되는 인산염을 사용할 수 있기 때문이다.
국제 특허 출원 WO 93/16175(EP 626 010)(Gist-Brocades)는 피타아제의 안정화된 액체 조성물을 기재하고 있다. 안정화제로서 요소 및 수용성 폴리올을 사용하는 것이 제안되었으며, 거기에는 소르비톨, 글리세롤 및 분자량 6000을 갖는 폴리에틸렌 글리콜이 언급되어 있다.
유럽 특허 출원 EP-A1 0 969 089(Hoffmann-La Roche)는 피타아제, 및 a) 5 개의 탄소 원자를 함유하는 폴리올, 바람직하게는 5탄당, 더욱 바람직하게는 자일리톨 또는 리비톨, b) 600 내지 4000 Da의 분자량을 갖는 폴리에틸렌 글리콜, c) 말론산, 글루타르산 및 숙신산의 디소듐 염, d) 카르복실메틸셀룰로오스, 및 e) 소듐 알기네이트로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 1종의 안정화제를 포함하는 안정화된 효소 조성물을 기재하고 있다. 이는 또한 글루타르알데히드와의 화학 반응에 의한 가교; 또는 b) 소듐 피리오데이트와의 산화반응 및 이어지는 아디프산 디히드라지드의 첨가에 의해 피타아제 조성물을 안정화하는 것을 기재한다.
WO 98/54980은 피타아제 함유 과립을 기재하고 WO 98/55599는 높은 활성의 피타아제 액체 및 이를 함유하는 사료 제제를 기재하고 있다.
당업자들의 다양한 접근에도 불구하고, 인간 및(또는) 동물 영양원에 적합하고, 가공, 펠렛화 및 저장 도중 향상된 안정성을 나타내는 안정화된 포스파타아제 조성물에 대한 요구가 여전히 존재한다. 상기 조성물은 쉽게 수득가능해야 할 뿐 아니라 통상의 식품 및(또는) 사료 성분들과 쉽게 상용성이어야 한다. 뿐만 아니라, 조성물, 특히 고체 조성물은 쉽게 가공가능하여, 예를 들면 낮은 분진 성질을 제공하고, 원하는 매트릭스 내에 쉽게 분산가능하거나 혼합가능해야 한다.
본 발명의 목적은 대체의 안정화제를 제공하는 것 뿐만 아니라 포스파타아제, 특히 피타아제의 안정성, 바람직하게는 열 안정성을 향상시키는 것이다. (여기에서 안정성은 다양한 조건 하에 활성을 유지하는 능력으로 정의됨) 이러한 안정성 국면은 생산(발효, 하류 가공 및 조제), 분배 (수송 및 보관) 및 최종 용도(사 료 및(또는) 식품의 생산 및 저장)을 포함하는 효소의 전체 수명 주기에 관한다. 상업적으로 흥미있는 효소, 예를 들면 피타아제의 경우, 펠렛화, 압출 및 팽창과 같은 각종 사료 및(또는) 식품 처리 과정 도중에 도달하는 (80-120℃에 이르는) 높은 온도 및 높은 습도를 견디고, 상기 사료 및(또는) 식품에 첨가한 후 보관 도중, 특히 장기 보관 도중 안정할 것이 중요하다. 최종 조성물 중 안정화제의 양이 효소 함유 조성물에 첨가될 수 있는 추가의 성분을 제한하기 때문에, 당 분야에 공지된 안정화제보다 적은 양으로 사용될 수 있는 대체의 안정제를 제공하는 것이 본 발명의 또 다른 목적이다. 특히 효소 혼합물을 위해 사용될 수 있는 안정화제를 제공하는 것이 본 발명의 또 다른 목적이다. 효소 제제가 2종 이상의 발효 배양액으로부터 제조될 경우, 최종 조성물에 첨가될 수 있는 안정화제의 양은 제한된다. 최종 제품에 높은 효소 농도가 요구되고 따라서 최종 조성물에 첨가될 수 있는 희석제의 양이 제한되는 경우에 이는 특별히 우려된다. 본 발명의 또 다른 국면에서는, 효소 혼합물이 사용될 경우, 안정화제는 1종의 효소 뿐만 아니라 혼합물 중 모든 효소를 또한 바람직하게 안정화해야 한다.
본 발명에서 사용되는 "안정성"이라는 용어는 산업적 효소의 모든 명세에 관한 것이며, 이는 활성, 특이성, 보관-수명 안정성, 기계적 안정성, 미생물 안정성, 독성, 화학적 조성 및 밀도, 점도, 흡습성과 같은 물리적 변수 뿐만 아니라 색상, 냄새 및 분진과 같은 국면을 포함한다. 본 발명의 바람직한 국면은 조제 및 펠렛화, 압출 및 팽창과 같은 사료 및(또는) 식품 처리 공정 도중 열 불활성화에 대한 효소, 바람직하게는 포스파타아제 및(또는) 글리코시다아제의 안정성에 관한 것이 다.
포스파타아제, 특히 피타아제의 광범위한 사용에 대한 주요 장벽은 사료 및(또는) 식품 처리 공정 도중 불활성화를 견디도록 상기 효소들에 요구되는 열 안정성(80-120℃)의 제약이다. 현재 사용가능한 사료 및(또는) 식품 용도를 위한 대부분의 공업적 포스파타아제는 열 불활성화에 대한 불충분한 고유 내성을 갖는다. 분자 생물학적 접근을 대신하여 또는 그에 더하여, 본 발명은 각종 첨가제의 첨가에 의해 포스파타아제, 특히 피타아제의 안정성, 바람직하게는 열 안정성을 향상시킨다.
본 발명의 첫 번째 국면에서는 적어도 1종의 포스파타아제, 및 아가, 알긴, 카라기난, 퍼셀레란, 가티 검, 트라가칸스 검, 카르야 검, 구아란, 로커스트 콩 검 (= 카로브 콩 검), 타마린드 씨앗 검, 아라비노갈락탄, 크산탄 (검), 적어도 1종의 동물성 단백질 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 1종의 안정화제를 포함하는 안정화된 고체 또는 액체 효소 조성물 (단, 젤라틴을 고체 조성물로서의 과립에 유일한 안정화제로서 사용하는 경우, 후속적으로 과립을 코팅함)을 제공한다.
"효소 조성물"이라는 용어는 포스파타아제, 바람직하게는 피타아제가 상업화될 수 있는 모든 액체 및 고체 조성물을 포함한다. 바람직하게는, 그러한 조성물을 위한 효소(들)의 원천은 오히려 발효 배양액으로부터 수득된, 처리되지 않은 액체 제제이다. 본 발명에 따르는 액체 효소 조성물의 제조를 위해, 선택된 안정화제가 발효 배양액에 직접 첨가되거나, 상기 발효 배양액을 예를 들면 여과 또는 한외여과에 의해 정제한 다음 안정화제를 여과 단계 후에 첨가할 수 있다.
안정화된, 바람직하게는 열 안정화된 고체 조성물을 수득하기 위해서, 효소(들)는 선택된 안정화제의 존재 하에 분무-건조되거나 과립화될 수 있다. 고체 조성물은 바람직하게는 15％ (w/w) 미만, 바람직하게는 10％ (w/w) 미만, 특히 8％ (w/w) 미만의 물을 함유하는 조성물이다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 안정화된 효소 조성물은 바람직하게는 과립 형태의 고체이다.
본 발명의 또 다른 국면에서는, 적어도 1종의 포스파타아제, 적어도 15 ％ (w/w)의 식용 탄수화물 고분자를 포함하는 고체 담체, 및 아가, 알긴, 카라기난, 퍼셀레란, 가티 검, 트라가칸스 검, 카르야 검, 구아란, 로커스트 콩 검 (= 카로브 콩 검), 타마린드 씨앗 검, 아라비노갈락탄, 크산탄 (검), 적어도 1종의 동물성 단백질 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 1종의 안정화제를 가공하는 것을 포함하는 (단, 젤라틴을 유일한 안정화제로 사용하는 경우, 후속적으로 과립을 코팅함), 포스파타아제-함유 과립의 제조 방법을 제공한다. 본 발명의 추가의 측면에서는 이러한 방법에 의해 얻을 수 있는 효소-함유 과립을 제공한다.
본 발명의 또 다른 국면에서는, 적어도 1종의 포스파타아제, 적어도 15 ％ (w/w)의 식용 탄수화물 고분자를 포함하는 고체 담체, 및 아가, 알긴, 카라기난, 퍼셀레란, 가티 검, 트라가칸스 검, 카르야 검, 구아란, 로커스트 콩 검 (= 카로브 콩 검), 타마린드 씨앗 검, 아라비노갈락탄, 크산탄 (검), 적어도 1종의 동물성 단백질 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 1종의 안정화제를 포함하는 과립 (단, 젤라틴을 유일한 안정화제로서 선택하는 경우 후속적으로 과립을 코팅함)을 제공한다.
본 발명의 또 다른 국면에서는, 적어도 1종의 포스파타아제, 적어도 15 ％ (w/w)의 식용 탄수화물 고분자를 포함하는 고체 담체, 및 아가, 알긴, 카라기난, 퍼셀레란, 가티 검, 트라가칸스 검, 카르야 검, 구아란, 로커스트 콩 검 (= 카로브 콩 검), 타마린드 씨앗 검, 아라비노갈락탄, 크산탄 (검), 적어도 1종의 동물성 단백질 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 1종의 안정화제를 포함하는, 코팅된 과립을 제공한다.
본 발명의 명세서에서 사용되는 "과립" 또는 "과립(들)"이라는 용어는 둘 다 하나의 과립 뿐만 아니라 복수의 과립을 구별하지 않고 포함한다. 과립 및 입자(granulate)라는 용어는 동의어로 사용된다.
상기 공정에 의해 수득될 수 있는 포스파타아제-함유 과립(들)은 종래 기술에서 만났던 문제점들을 해결하거나 적어도 완화시킬 것을 추구한다. 본 발명은 따라서 담체로서 탄수화물을 사용하는 입자 형태의 안정화된 효소 조성물의 제조 방법을 제공할 수 있다. 담체는 미립자 또는 분말의 형태일 수도 있다.
고체 담체의 적어도 15％(w/w)는 식용 탄수화물 고분자(예, 전분)로 이루어진다. 그러나 바람직하게는 고체 담체가 적어도 30％(w/w)의 탄수화물을 포함하며, 적정하게는 적어도 40％(w/w)가 그러하다. 유리하게는 상기 고체 담체의 주 성분은 탄수화물(예, 전분), 예를 들면 50％ (w/w) 이상, 바람직하게는 적어도 60％ (w/w), 적합하게는 적어도 70％(w/w)이며, 적정하게는 적어도 80％(w/w)가 그러하다. 이러한 중량 백분율은 최종 건조 과립에서 비-효소 성분의 총 중량을 기준으로 한 것이다.
식용 탄수화물 고분자는 그를 각각 사료 또는 식품으로 동물이나 사람에 의해 섭취가능하며, 바람직하게는 적어도 일부가 또한 소화가능하도록 선택되어야 한다. 상기 고분자는 바람직하게는 포도당(예, 포도당-함유 고분자), 또는 (C6H10O5)n 단위를 포함한다. 바람직하게는 탄수화물 고분자는 α-D-글루코피라노오스 단위, 아밀로오스 (직쇄 (1->4) α-D-글루칸 고분자) 및(또는) 아밀로펙틴(α-D-(1->4) 및 α-D-(1->6) 결합을 갖는 분지쇄 D-글루칸)을 포함한다. 전분은 바람직한 탄수화물 고분자이다. 전분 대신 또는 그에 더하여 사용될 수 있는 다른 적합한 포도당-함유 고분자로서, α-글루칸, β-글루칸, 펙틴(예, 프로토-펙틴) 및 글리코겐을 들 수 있다. 이들의 에테르 및(또는) 에스테르와 같은 탄수화물 고분자의 유도체도 고려될 수 있지만, 젤라틴화된 전분은 우선적으로 배제되므로 존재하지 않을 수 있다. 적합하게는 탄수화물 고분자는 수불용성이다.
적합한 탄수화물 고분자는 옥수수-, 감자- 및 쌀-전분이다. 그러나, 타피오카, 카사바, 밀, 라이밀, 옥수수, 사고, 호밀, 귀리, 보리, 참마, 사탕수수 또는 칡과 같은 기타 (예, 야채 또는 곡물과 같은 식물) 원천으로부터 수득된 전분이 동등하게 적용될 수 있다. 유사하게 전분의 천연 그대로의 또는 개질된 (예, 덱스트린) 종류가 본 발명에 사용될 수 있다. 바람직하게는 탄수화물(예, 전분)은 단백질을 예를 들면 5％ (w/w) 미만, 예를 들면 2％ (w/w) 미만, 바람직하게는 1％ (w/w) 미만으로, 거의 또는 전혀 함유하지 않는다. 전분(또는 다른 탄수화물 고분자)의 종류와 무관하게, 이는 동물 사료에 사용되는 것이 허용되는 형태라야 하며, 달리 말하면 식용이거나 적어도 부분적으로 소화가능한 형태라야 한다.
상기 가공에 물이 첨가될 수 있다. 본 발명의 또 다른 실시양태에서, 과립은 가공에 이어 건조된다. 하나의 실시양태에서 과립은 가공에 물이 첨가되었는지 여부에 무관하게 건조될 수 있다.
효소 및 물은 바람직하게는 효소-함유 (바람직하게는 수성) 액체로서, 예를 들면 고체 담체와 혼합될 수 있고 담체 상에 흡수되도록 한 용액 또는 슬러리로서 제공된다. 혼합 도중 또는 혼합 후, 상기 효소-함유 액체 및 담체를 과립으로 가공하고, 이를 그 후 건조시킬 수 있다. 탄수화물 담체의 사용은 다량의 효소-함유 액체 (및 따라서 효소)의 흡수를 가능하게 할 수 있다. 상기 혼합물은 과립으로 쉽게 가공될 수 있는, 예를 들면 압출될 수 있는 가소성의 페이스트 또는 비-탄성 도우 (dough)의 형태로 사용될 수 있다.
본 발명의 방법에서 효소와 물은 고체 담체를 접촉시키기 전에 같은 조성물에 존재할 수 있다. 이와 관련하여, 효소-함유 수성 액체를 제공할 수도 있다. 상기 액체는 발효 공정으로부터의, 또는 그로부터 유래된 용액 또는 슬러리일 수 있다. 상기 발효 공정은 통상적으로 효소가 생산되는 공정일 것이다. 발효 공정은 미생물(원하는 효소를 생산하는) 및 수용액을 함유하는 배양액을 얻을 수 있다. 일단 미생물로부터 분리된 (예, 여과에 의해) 상기 수용액이 본 발명에 사용되는 효소-함유 수성 액체일 수 있다. 따라서 바람직한 실시양태에서 효소-함유 수성 액체는 여액, 특히 발효 공정으로부터 유래된 여액으로, 효소 생산의 결과를 가져온다. 발효 배양액으로부터 효소를 단리하는 데 사용되는 분리 방법에 따라, 효소는 또한 잔류물 중에 존재할 수도 있다.
담체 상에 흡수될 수 있는 효소-함유 액체(및 따라서 효소)의 양은 흡수될 수 있는 물의 양에 의해 통상적으로 제한된다. 바람직하게는 고체 담체에 첨가되는 액체의 양은 (수성) 액체 중 (실질적으로) 모든 물이 상기 고체 담체에 존재하는 탄수화물에 의해 흡수되도록 하는 양이다.
상승된 온도에서 전분 및 기타 탄수화물 고분자는 팽윤 하에 훨씬 더 많은 양의 물을 흡수할 수 있다. 이러한 이유로 탄수화물 고분자는 바람직하게 물(또는 효소-함유 수성 액체)을 흡수할 수 있다. 예를 들면, 옥수수 전분은 60℃에서 그 중량의 3배까지의 물을, 70℃에서는 10배까지의 물을 흡수할 수 있다. 따라서, 더 많은 양의 효소-함유 액체를 흡수하기 위해 보다 높은 온도를 사용하는 것이 본 발명에 의해 고려되며, 이는 열안정한 효소를 취급할 경우에 사실상 특히 바람직하다. 따라서 상기 효소의 경우에 고체 담체 및 액체(또는 효소와 물) 및 안정화제의 혼합은 예를 들면 30℃를 초과하는, 바람직하게는 40℃를 초과하는, 그리고 적정하게는 50℃를 초과하는 상승된 온도(예, 상온 초과)에서 수행될 수 있다. 그렇지 않으면 또는 그에 더하여, 상기 액체는 상기 온도에서 제공될 수 있다.
그러나, 일반적으로 보다 낮은(예, 상온) 온도에서의 비-팽윤 조건이 바람직하다. 이는 보다 높은 온도에서 효소의 불안정성(열 민감성)으로부터 초래되는 활성 소실을 최소화할 수 있다. 적합하게는 효소와 물의 혼합 도중의 온도는 10 내지 60℃, 예를 들면 10 내지 50℃, 바람직하게는 20 내지 40℃, 바람직하게는 20 내지 25℃이다.
효소, 선택적으로 물(예, 효소-함유 액체), 안정화제 및 고체 담체의 혼합물을 과립으로 만들기 위해 본 발명에 사용되는 기계적 공정(달리 말하면 과립화)은 식품, 사료 및 효소 조성물 가공에서 빈번하게 사용되는 공지의 기술을 사용할 수 있다. 이는 팽창, 압출, 구형화, 펠렛화, 고 전단 과립화, 드럼 과립화, 유동 베드 응집 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 상기 방법은 일반적으로 스크류의 구동, 혼합 기전의 회전, 펠렛화 장치의 회전 기구의 압력, 유동 베드 응집기의 바닥 판의 회전에 의한 입자의 움직임 또는 기류에 의한 입자의 움직임, 또는 이들의 조합과 같은 기계적 에너지의 도입으로 특징된다. 상기 방법은 상기 고체 담체(예, 분말의 형태)가 효소 및 선택적으로 물, 예를 들면 효소-함유 액체(수용액 또는 슬러리), 안정화제와 혼합되고 이어서 과립화되는 것을 가능하게 한다.
그렇지 않으면 상기 고체 담체가 효소(예, 분말 형태) 및 안정화제와 혼합된 다음, 거기에 선택적으로 물, 예를 들면 액체(또는 슬러리)가 그 후 첨가될 수 있다 (이는 과립화 액체로 작용할 수 있음).
본 발명의 또 다른 실시양태에서 과립(예, 응집물)은 상기 효소-함유 액체를 담체 상에 분무 또는 코팅함으로써 형성되며, 이는 유동 베드 응집기에서와 같이 안정화제와 미리 혼합된 것이다. 여기에서 수득되는 과립은 유동 베드 응집기에서 생성될 수 있는 것과 같은 응집물을 포함할 수 있다.
바람직하게는 효소-함유 액체, 고체 담체 및 안정화제의 혼합은 상기 혼합물의 혼련을 추가로 포함한다. 이는 과립화(예, 압출)를 촉진하기 위해 혼합물의 가소성을 향상시킬 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 과립은 압출, 바람직하게는 낮은 압력에서의 압출에 의해 형성된다. 이는 압출되는 혼합물의 온도가 증가하지 않거나 단지 약간만 증가할 것이라는 장점을 제공할 수 있다. 낮은 압력 압출은 예를 들면 후지 포달 (Fuji Paudal) 바스켓- 또는 돔- 압출기에서의 압출을 포함한다. 압출은 원래대로의 과립을 생성하거나 (과립은 다이를 통과한 후 파괴될 수 있다) 커터가 사용될 수 있다.
적합하게는, 과립은 건조하기 전에 15 내지 50％, 예를 들면 20 내지 40％, 예를 들면 25 내지 35％, 바람직하게는 33 내지 37％의 수분 함량을 가질 것이다. 과립의 효소 함량은 건조 전에 1 내지 85％, 특히 1 내지 70％, 예를 들면 2 내지 60％, 바람직하게는 2 내지 50％, 바람직하게는 2 내지 25％, 예를 들면 3 내지 15％, 예를 들면 5 내지 12％(예, 적어도 50,000 ppm)일 수 있다 (항상 과립의 총 중량을 기준으로 한 중량％로 계산됨).
수득된 과립을 예를 들면 구형화기, 예를 들면 마러머라이저(MARUMERISERTM) 기계에서 둥글게 (예, 구형화) 만들고/또는 압축할 수 있다. 수득된 과립을 건조시킬 경우, 상기 구형화는 바람직하게는 건조 이전에 수행된다. 과립은 건조 전에 구형화 될 수 있는데, 그 이유는 이것이 최종 과립에서 분진 형성을 감소시키고/또는 상기 과립의 임의 코팅을 용이하게 할 수 있기 때문이다.
과립을 그 후 유동 베드 건조기 등에서 건조시키거나, 유동 베드 응집의 경우, 즉시 건조시켜 (응집기에서) (고체 건조) 과립을 수득할 수 있다. 식품, 사료 또는 효소 산업에서 과립을 건조시키기 위한 다른 공지의 방법이 당업자에 의해 사용될 수 있다. 적합하게는 상기 입자는 유동가능하다. 건조는 바람직하게는 25 내지 60℃, 예를 들면 30 내지 50℃의 온도에서 일어난다. 여기에서 건조는 10 분 내지 몇 시간 동안 지속될 수 있다. 필요한 시간의 길이는 물론 건조될 과립의 양에 의존할 것이다.
과립을 건조시킨 후, 수득된 건조된 과립은 바람직하게는 3 내지 10％, 예를 들면 5 내지 9 중량％의 수분 함량을 갖는다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서는,
a) 효소를 함유하는 수성 액체를 고체 담체 및 안정화제와 혼합하고;
b) a)에서 수득된 혼합물을 기계적으로 가공하여 효소-함유 과립을 수득하고;
c) b)에서 수득된 효소-함유 과립을 건조시키는
것을 포함하며, 여기서, 안정화제는 아가, 알긴, 카라기난, 퍼셀레란, 가티 검, 트라가칸스 검, 카르야 검, 구아란, 로커스트 콩 검 (= 카로브 콩 검), 타마린드 씨앗 검, 아라비노갈락탄, 크산탄 (검), 적어도 1종의 동물성 단백질 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되며, 단, 젤라틴을 유일한 안정화제로서 사용하는 경우, 후속적으로 과립을 코팅힌다.
본 발명의 추가의 실시양태에서, 과립을 코팅한다. 과립에 코팅을 적용하여 낮은 분진 함량, 색상, 주위 환경으로부터 효소의 보호, 하나의 과립 또는 이들의 조합에서 상이한 효소 활성과 같은 추가의 (예를 들면 유익한) 특징 또는 성질을 부여할 수 있다. 과립은 먼저 건조하거나 건조하지 않고 코팅될 수 있다. 과립은 (두 번째) 효소 또는 그의 조합을 함유하는 지방, 왁스, 고분자, 염, 고약 및(또는) 연고 또는 코팅(예, 액체)으로 코팅될 수 있다. 필요하다면 여러 층의 (상이한) 코팅이 적용될 수 있음은 자명할 것이다. 바람직하게는, 여러 층의 (상이한) 코팅을 적용하는 것이 명백할 것이다. 과립에 코팅을 적용하기 위해, 유동 베드, 고 전단 과립화기, 믹서 과립화기 또는 노타(Nauta)-믹서의 사용을 포함하는 다수의 공지된 방법이 사용가능하다.
하나의 실시양태에서, 과립은 바람직하게는, 예를 들면 약 10 중량％ 미만의 잔류 습기까지 건조 후,
(a) 상기 과립을 유동 베드에서 유기 고분자의 용융물, 용액 또는 분산액을 이용하여 분무함으로써 또는 유동 베드에서 유기 고분자로 분말 코팅을 수행하거나; 또는
(b) 유기 고분자에서 용융시켜 믹서에서 과립을 코팅하거나, 또는 거친 입자를 유기 고분자의 용융물, 용액 또는 분산액으로 분무하거나, 유기 고분자로 분말 코팅을 수행하고;
필요하다면 각각의 수득되는 고분자-코팅된 과립을 후-건조, 냉각 및(또는) 거친 분획으로부터 유리시켜,
사료용으로 적합한 유기 고분자로 코팅된다.
본 발명의 바람직한 실시양태에 따르면, 과립을 유동 베드 내에 넣고, 수성 또는 비-수성, 바람직하게는 수성의 유기 고분자 용액 또는 분산액으로 분무에 의해 코팅한다. 이를 위해, 가능한 한 고도로 농축되었지만 여전히 분무 가능한 액체, 예를 들면 다음으로 구성되는 군에서 선택된 적어도 1종의 고분자 10 내지 50 중량％를 함유하는 수성 또는 비-수성 용액 또는 분산액이 사용된다:
a) 폴리알킬렌 글리콜, 특히 약 400 내지 15,000, 예를 들면 약 400 내지 10,000의 수 평균 분자량을 갖는 폴리에틸렌 글리콜;
b) 약 4000 내지 20,000, 예를 들면 약 7700 내지 14,600의 수 평균 분자량을 갖는 폴리알킬렌 옥사이드 중합체 또는 공중합체; 특히 폴리옥시에틸렌 및 폴리옥시프로필렌의 블럭 공중합체;
c) 약 7000 내지 1,000,000, 예를 들면 약 44,000 내지 54,000의 수 평균 분자량을 갖는 폴리비닐피롤리돈;
d) 약 30,000 내지 100,000, 예를 들면 약 45,000 내지 70,000의 수 평균 분자량을 갖는 비닐피롤리돈/비닐아세테이트 공중합체; 및
e) 약 10,000 내지 200,000, 예를 들면 약 20,000 내지 100,000의 수 평균 분자량을 갖는 폴리비닐 알코올; 및
f) 약 6000 내지 80,000, 예를 들면 약 12,000 내지 65,000의 수 평균 분자량을 갖는 히드록시프로필 메틸 셀룰로오스와 같은 셀룰로오스 유도체.
또 다른 바람직한 방법에 따르면, 분무 가능한 수성 또는 비-수성 용액 또는 분산액을 코팅하기 위한 변법이 사용되며, 이는 다음 군에서 선택된 적어도 1종의 고분자 10 내지 40 중량％, 바람직하게는 약 20 내지 35 중량％를 함유한다:
g) 약 100,000 내지 1,000,000의 수 평균 분자량을 갖는 알킬 (메트)아크릴레이트 중합체 및 공중합체; 특히 에틸 아크릴레이트/메틸 메타크릴레이트 공중합체 및 메틸 아크릴레이트/에틸 아크릴레이트 공중합체; 및
h) 가능하게는 폴리비닐피롤리돈으로 안정화된 것이 사용되는 약 250,000 내지 700,000의 수 평균 분자량을 갖는 폴리비닐 아세테이트.
일반적으로는, 용매를 후처리하거나 회수하는데 특별한 조치가 필요하지 않으며, 몇몇 코팅 물질은 우선적으로는 수용액 또는 수분산액으로서 제공된다는 이유로 인해 수용액 또는 수분산액이 바람직하다.
그러나, 특별한 경우, 비-수성 용액 또는 분산액의 사용이 또한 유리할 수 있다. 코팅 재료가 매우 쉽게 용해되거나 코팅 재료의 유리하게 높은 분량이 분산될 수 있다. 이러한 방식으로 높은 고형분 함량을 갖는 분무액이 분무될 수 있고, 이는 보다 짧은 공정 시간을 선도한다. 비-수성 용매의 증발의 보다 낮은 엔탈피가 또한 보다 짧은 공정 시간을 선도한다.
본 발명에 따라 사용될 수 있는 분산액은 상기 고분자를 수성 또는 비-수성의, 바람직하게는 수성의 액체 상에, 통상의 분산제의 존재 또는 부재 하에 분산시킴으로써 수득된다. 고분자 용액 또는 분산액은 과립을 유동-베드 장치 또는 믹서 내에 넣고 상기 내용물을 동시에 가열하면서 분무 물질을 분무하는 방식으로 바람직하게 분무된다. 상기 에너지는 가열된 건조 기체, 빈번하게는 공기와 접촉함으로써 상기 유동-베드 장치에 공급되고, 가열된 벽과의 접촉에 의해, 그리고 적절하다면 가열된 혼합 도구와의 접촉에 의해 믹서에 공급된다. 결과적으로 분무 물질이 높은 건조 물질 함량으로 분무될 수 있을 경우 상기 용액 또는 분산액을 예열하는 것이 적절할 수 있다. 유기 액체 상이 사용될 경우, 용매의 회수가 적절하다. 코팅 도중 생성물 온도는 약 35 내지 50℃의 범위여야 한다. 코팅은 원리적으로 바닥-분무 공정(노즐이 기체-분배기 판에 있고 위로 분무하는)으로 또는 상단-분무 공정(코팅이 유동 베드 내로 상단으로부터 분무됨)으로 유동-베드 장치에서 수행될 수 있다.
적합한 폴리알킬렌 글리콜 a)의 예는 폴리프로필렌 글리콜, 특히 예를 들면 바스프 아게(BASF AG)로부터 루트롤(Lutrol) E 4000 및 루트롤 E 6000이라는 상표명 하에 입수가능한 PEG 4000 또는 PEG 6000의 다양한 몰 질량의 폴리에틸렌 글리콜이다.
바람직한 실시양태에서 폴리알킬렌 글리콜 코팅은 본원에 참고문헌으로 인용되는 WO 00/47060, 제 4 면, 제 11 내지 14 행 및 제 10 면, 제 28 행 내지 제 11 면 제 9 행에 기재된 것과 같이 수행된다.
상기 중합체 b)는 폴리에틸렌 옥사이드 및 폴리프로필렌 옥사이드, 에틸렌 옥사이드/ 프로필렌 옥사이드 혼합된 중합체 및 폴리에틸렌 옥사이드 및 폴리프로필렌 옥사이드 블럭으로 구성된 블럭 공중합체, 예를 들면 바스프 아게로부터 루트롤 F 68 및 루트롤 F127이라는 상표명 하에 입수가능한 중합체이다. 중합체 a) 및 b) 중에서, 바람직하게는 용액의 총 중량을 기준으로 약 50 중량％ 이하, 예를 들면 약 30 내지 50 중량％의 고도로 농축된 용액이 유리하게 사용될 수 있다.
상기 중합체 c)의 예는 예를 들면 바스프 아게에 의해 콜리돈(Kollidon) 또는 루비스콜(Luviskol)이라는 상표명 하에 시판되는 폴리비닐피롤리돈이다. 이들 중합체 중에서, 용액의 총 중량을 기준으로 약 30 내지 40 중량％의 고형분 함량을 갖는 고도로 농축된 용액이 유리하게 사용될 수 있다.
상기 언급된 중합체 d)의 예는 바스프 AG에 의해 상표명 콜리돈 VA64 하에 시판되는 비닐피롤리돈/비닐 아세테이트 공중합체이다. 용액의 총 중량을 기준으로, 상기 공중합체의 약 30 내지 40 중량％의 고도로 농축된 용액이 특히 유리하게 사용될 수 있다.
상기 중합체 e)의 예는 예를 들면 훽스트(Hoechst)에 의해 상표명 모비올(Mowiol) 하에 시판되는 것과 같은 제품이다. 약 8 내지 20 중량％ 범위의 고형분 함량을 갖는 상기 중합체의 용액이 유리하게 사용될 수 있다.
적합한 중합체 f)의 예는 히드록시프로필메틸-셀룰로오스, 예를 들면 신 에츠(Shin Etsu)에 의해 상표명 파마코트(Pharmacoat) 하에 시판되는 것이다.
상기 언급된 중합체 g)의 예는 알킬기가 1 내지 4 개의 탄소 원자를 갖는 알킬 (메트)아크릴레이트 중합체 및 공중합체이다. 적합한 공중합체의 구체적인 예는 예를 들면 바스프 아게에 의해 콜리코트(Kollicoat) EMM 30D라는 상표명 하에 시판되거나 룀(Roehm)에 의해 유트라짓(Eutragit) NE 30 D라는 상표명 하에 시판되는 에틸 아크릴레이트/메틸 메타크릴레이트 공중합체; 또한 예를 들면 바스프 아게에 의해 콜리코트 MAE 30DP라는 상표명 또는 룀에 의해 상표명 유트라짓 30/55 하에 시판되는 메타크릴레이트/에틸 아크릴레이트 공중합체이다. 이러한 유형의 공중합체는 예를 들면 10 내지 40 중량％ 분산액으로서 본 발명에 따라 처리될 수 있다.
상기 중합체 h)의 예는 폴리비닐피롤리돈으로 안정화되고 예를 들면 바스프 아게에 의해 상표명 콜리코트 SR 30D 하에 시판되는 폴리비닐 아세테이트 분산액이다 (상기 분산액의 고형분 함량은 약 20 내지 30 중량％임).
본 발명 방법의 더욱 바람직한 실시양태에 따르면, 과립을 유동 베드 내에 넣고 분말-코팅한다. 분말-코팅은 약 6000 내지 80,000의 수 평균 분자량을 갖는 히드록시프로필 메틸 셀룰로오스 (HPMC)로 구성되는 군에서 선택된 고체 고분자의 분말을 가소제와의 혼합물로 이용하여, 바람직하게 수행된다. 분말 코팅을 위해 적합한 물질은 또한 분말 형태로 존재할 수 있고 용융물로서나 고도로 농축된 용액으로서 (예를 들면 HPMC를 이용하는 경우)가 아닌 방법으로 적용될 수 있는 모든 다른 코팅 재료이다.
바람직하게는, 분말 코팅은 코팅 재료가 유동 베드 내로 충진되는 과립에 연속적으로 첨가되도록 하는 방식으로 수행된다. 코팅 재료의 미세 입자(약 10 내지 100 ㎛ 범위의 입자 크기)가 거친 입자의 비교적 거친 표면 위에 놓인다. 가소제 용액을 분무함으로써, 상기 코팅 재료 입자가 한데 들러붙는다. 적합한 가소제의 예는 폴리에틸렌 글리콜 용액, 트리에틸 시트레이트, 소르비톨 용액, 파라핀 오일 등이다. 용매를 제거하기 위해서, 상기 코팅은 약간의 가열과 함께 수행된다. 이러한 경우의 생성물 온도는 약 60℃ 미만, 예를 들면 약 40 내지 50℃이다. 원리적으로, 분말 코팅은 믹서 내에서 수행될 수도 있다. 이러한 경우, 상기 분말 혼합물이 첨가되고 가소제가 또한 노즐을 통해 주입된다. 건조는 믹서의 벽을 통해, 그리고 적절하다면 혼합 수단을 통해 에너지를 공급함으로써 수행된다. 유동 베드에서의 코팅 및 건조에서와 같이 여기에서도, 낮은 생성물 온도가 유지되어야 한다.
본 발명의 또 다른 바람직한 실시양태에 따르면, 과립을 유동 베드 또는 믹서에 넣고 다음으로 구성되는 군에서 선택된 적어도 1종의 중합체의 용융물을 이용하여 코팅한다:
a) 폴리알킬렌 글리콜, 특히 약 1000 내지 15,000의 수 평균 분자량을 갖는 폴리에틸렌 글리콜; 및
b) 약 4000 내지 20,000의 수 평균 분자량을 갖는 폴리알킬렌 옥사이드 중합체 또는 공중합체, 특히 폴리옥시에틸렌 및 폴리옥시프로필렌의 블럭 공중합체.
바람직하게는, 용융 코팅은 코팅될 입자를 유동-베드 장치 내에 넣는 방식으로 유동 베드에서 수행된다. 코팅 재료를 외부 용기에서 용융시키고, 분무 노즐로, 예를 들면 가열가능한 라인을 통해 펌프주입한다. 노즐 기체를 가열하는 것이 적절하다. 분무 속도 및 용융 입구 온도는 상기 코팅 재료가 입자의 표면 상에서 여전히 쉽게 흘러 이를 고르게 코팅하도록 하는 방식으로 조정되어야 한다. 용융물을 분무하기 전에 상기 입자를 예열하는 것이 가능하다. 높은 융점을 갖는 코팅 재료의 경우, 효소 활성의 손실을 최소화하기 위해 생성물 온도가 너무 높게 조정되지 않아야 한다는 사실에 주의해야 한다. 생성물 온도는 약 35 내지 50℃의 범위여야 한다. 용융 코팅은 또한 원리적으로 바닥-분무 공정 또는 상단-분무 공정에 의해서도 수행될 수 있다. 용융 코팅은 두 가지 상이한 방식으로 믹서에서 수행될 수 있다. 코팅될 입자를 적합한 믹서 내에 넣고 상기 코팅 재료의 용융물을 상기 믹서 내에 분무하거나, 다른 가능성으로는, 고체 형태의 상기 코팅 재료가 상기 생성물과 함께 혼합된다. 용기 벽을 통해서 또는 혼합 수단을 통해서 에너지를 공급함으로써, 상기 코팅 재료가 용융되고 따라서 상기 거친 입자를 코팅한다. 필요하다면, 약간의 이형제가 때때로 첨가될 수 있다. 적합한 이형제는 예를 들면 살리실산, 활석, 스테아레이트 및 인산 삼칼슘이다.
코팅을 위해 사용되는 중합체 용액, 중합체 분산액 또는 중합체 용융물은 예를 들면 미세결정성 셀룰로오스, 활석 또는 카올린과 같은 기타의 첨가를 수용할 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 과립은 WO 03/059087, 제 2 면, 제 19 행에서 제 4 면 제 15 행에 기재된 것과 같은 폴리올레핀으로 코팅될 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 과립은 WO 03/059086, 제 2 면, 제 18 행에서 제 4 면 제 8 행에 기재된 것과 같은 적합한 용매에 분산된 소수성 물질의 입자를 포함하는 분산액으로 코팅될 수 있다. 상기 코팅의 바람직한 실시양태에는, 폴리올레핀, 특히 바람직하게는 폴리에틸렌 및(또는) 폴리프로필렌이 사용된다.
바람직하게는 상기 과립은 비교적 좁은 크기 분포를 갖는다 (예를 들면 이들은 모노-분산액임). 이는 동물 사료 중 과립에서 효소의 균질한 분포를 촉진할 수 있다. 본 발명의 방법은 좁은 크기 분포를 갖는 입자를 생성하는 경향이 있다. 하지만, 필요하다면 체질과 같이 과립의 크기 분포를 더욱 좁게 하기 위해서 상기 공정에 추가의 단계가 포함될 수 있다. 입자의 평균 입자 크기 분포는 적합하게는 100 ㎛ 내지 2000 ㎛ 사이, 바람직하게는 200 ㎛ 내지 1800 ㎛ 사이, 바람직하게는 300 ㎛ 내지 1600 ㎛ 사이이다. 과립은 불규칙한 (그러나 바람직하게는 규칙적인) 형태, 예를 들면 거의 구형인 것일 수 있다. 바람직한 실시양태에서 과립은 500 내지 2000 ㎛ 사이, 바람직하게는 500 내지 1800 ㎛ 사이, 바람직하게는 600 내지 1000 ㎛ 사이의 평균 입자 크기 분포를 갖는다. 평균 입자 크기 분포는 말버른 인스트루먼츠 게엠베하(Malvern Instruments GmbH)의 기계인 마스터사이저 (Mastersizer) S, 일련 번호 32784-08에 의해 결정될 수 있다. 평균 입자 크기 분포는 D(v,0.1), D(v,0.5) 및 D(v,0.9) 뿐만 아니라 분포 D(4,3)의 평균 입자 크기에 의해 특징된다. 평균 입자 크기 분포는 파. 렛츄(Fa. Retsch)에 의해 보급된 체질 기계 팁 비브로(Tip Vibro) VS 1000을 이용하여 체질함으로써 결정될 수 있다.
따라서 본 발명에 따르는 바람직한 방법은
a) (선택적으로) 물, 효소, 안정화제 및 적어도 15％(w/w)의 식용 탄수화물 고분자를 포함하는 고체 담체를 혼합하고, 예를 들면 상기 고체 담체 및 적어도 1종의 안정화제와 수성 효소-함유 액체를 혼합하고;
b) 선택적으로 상기 수득되는 혼합물을 혼련하고;
c) 예를 들면 기계적 가공에 의해, 예를 들면 과립화기 또는 압출에 의해, 상기 혼합물을 과립화하여 효소-함유 과립을 수득하고;
d) 선택적으로 상기 과립을 구형화하고;
e) 수득되는 과립을 건조시켜 효소-함유 입자를 수득하는
것을 포함하며, 여기에서 안정화제는 아가, 알긴, 카라기난, 퍼셀레란, 가티 검, 트라가칸스 검, 카르야 검, 구아란, 로커스트 콩 검 (= 카로브 콩 검), 타마린드 씨앗 검, 아라비노갈락탄, 크산탄 (검), 적어도 1종의 동물성 단백질 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되며, 단 젤라틴을 유일한 안정화제로서 사용하는 경우, 후속적으로 과립을 코팅한다.
바람직한 실시양태에서는 단계 e)에서 수득된 효소-함유 과립을 추가로 코팅한다.
바람직한 실시양태에서는, 효소(들)가 노출되는 최고 온도를 전체 공정 도중 80℃ 미만으로 유지하려고 할 것이다.
물 또는 효소-함유 액체는 포스파타아제 이외에 1종 이상의 효소(들)를 포함할 수 있다. 통상적으로, 효소 (포스파타아제 포함)는 예를 들면 미생물 발효로부터 수득되는 미생물 근원의 것이다. 통상적으로 효소는 활성의 형태일 것이다 (예를 들면 이는 촉매적 또는 생리적 활성을 가질 수 있다). 바람직하게는 상기 액체는 한외-여액(UF) 또는 잔류물과 같은 농축된 형태이며, 이는 원하는 활성 수준을 갖는 입자의 제조를 가능하게 할 수 있다.
본 발명의 추가의 측면에서는, 적어도 1종의 포스파타아제 및 적어도 1종의 안정화제를 포함하는 액체 조성물을 제공하며, 여기서 안정화제는 아가, 알긴, 카라기난, 퍼셀레란, 가티 검, 트라가칸스 검, 카르야 검, 구아란, 로커스트 콩 검 (= 카로브 콩 검), 타마린드 씨앗 검, 아라비노갈락탄, 크산탄 (검), 적어도 1종의 동물성 단백질 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된다.
액체 조성물은 식품, 사료 및 효소 조성물 공정에 통상적으로 사용되는 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 하나의 실시양태에서, 안정화제(들)는 효소가 용해 또는 분산되어 있는 액체에 직접 첨가될 수 있다. 본 발명의 또 다른 실시양태에서는, 안정화제(들)가 추가의 물에 먼저 용해되고, 수득된 용액의 pH를 선택적으로 조절하고, 그렇게 수득된 용액을 그 후 효소 또는 효소 농축물 또는 액체 효소 제제와 혼합한다. 이와 같은 수득된 혼합물의 pH 조절은 선택적이다. pH는 유기 또는 무기 염 및(또는) 산을 이용하여 조절될 수 있다.
바람직한 실시양태에서 상기 액체 조성물은 적어도 1종의 포스파타아제, 바람직하게는 적어도 1종의 피타아제를 포함한다.
안정화제는 아가, 알긴, 카라기난, 퍼셀레란, 가티 검, 트라가칸스 검, 카르야 검, 구아란, 로커스트 콩 검 (= 카로브 콩 검), 타마린드 씨앗 검, 아라비노갈락탄, 크산탄 (검), 적어도 1종의 동물성 단백질 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된다. 안정화제는 하나의 물질, 예를 들어 오직 하나의 검, 예를 들어 구아란으로부터 선택되거나, 또는 예를 들어 하나의 동물성 단백질 (예를 들어, 알부민)과 하나의 검 (예를 들어, 트라가칸스)의 혼합물, 또는 2 내지 3종 이상의 상이한 동물성 단백질 또는 검의 혼합물로 구성될 수 있다고 이해된다.
바람직한 실시양태에서, 안정화제는 아가, 알긴, 카라기난, 퍼셀레란, 가티 검, 트라가칸스 검, 카르야 검, 구아란, 로커스트 콩 검 (= 카로브 콩 검), 타마린드 씨앗 검, 아라비노갈락탄, 크산탄 (검) 또는 이들의 혼합물로부터 선택된다.
바람직한 실시양태에서, 안정화제는 트라가칸스 검, 구아란, 크산탄 및(또는) 로커스트 콩 검으로부터 선택된다.
한 실시양태에서, 안정화제는 아가이다. 아가 (또는 아가-아가)는 홍조류 (홍조강)으로부터의 이종다당류이다. CAS 제9002-18-0호로 등록되어 있다. 아가-아가는 E 406으로 식품 첨가물로서 등록되어 있다.
한 실시양태에서, 안정화제는 알긴이다. 용어 "알긴"은 알긴산 (CAS 제9005-32-7호) 및 알긴산의 염인 알기네이트를 포함한다. 알긴은 갈조류 (갈조강)로부터의 다당류이다. 알긴산은 E 400으로 등록되어 있으며, 나트륨 알기네이트는 CAS 제9005-38-5호, E 401으로, 칼륨 알기네이트는 E 402로서, 암모늄 알기네이트는 E 304로서, 칼슘 알기네이트는 E 404로서, 프로필렌글리콜알기네이트는 E 405로서 등록되어 있다.
한 실시양태에서, 안정화제는 카라기난이다. 카라기난은 홍조류 (홍조강)으로부터의 다당류이다.
한 실시양태에서, 안정화제는 퍼셀레란 (= 다니쉬 (Danish) 아가)이다. 퍼셀레란은 홍조류 퍼셀라리아 파스티기아타 (CAS 제9-000-21-9호)의 다당류이다.
한 실시양태에서, 안정화제는 가티 검이다. 가티 검은 아노제수스 라티폴리아 (Anogeissus latifolia) 나무 (콤브레타과 (Combretaceae), CAS 제9000-28-6호로 등록되어 있음)의 껍질의 삼출물로부터의 다당류이다.
한 실시양태에서, 안정화제는 트라가칸스 검이다. 트라가칸스 검은 아스트라갈루스-과 (Astragalus-Family, 콩과), 특히 아스트라갈루스 굼미페르 (Astragalus gummifer)의 관목의 뿌리 및 줄기로부터의 삼출물에 대한 명칭이다. E 413으로 식품 첨가제로 등록된, CAS 제9000-65-1호로 등록되어 있다.
한 실시양태에서, 안정화제는 카르야 검 (= 스터쿨리아 검)이다. 카르야 검은 스터쿨리아 우렌스 (Sterculia urens) 나무의 삼출물에 대한 명칭이다.
한 실시양태에서, 안정화제는 구아란이다. 구아란은 구아 콩 (사이암포시스 테트라고노볼루스 (Cyamopsis tetragonobolus))으로부터의 다당류이다.
한 실시양태에서, 안정화제는 로커스트 콩 검(= 카로브 콩 검, 카루빈)이다. 로커스트 콩 검은 로커스트 콩 나무 (캐럽 (Ceratonia siliqua))의 씨로부터의 다당류이다. 식품 첨가물 E 410으로 등록되어 있다.
한 실시양태에서, 안정화제는 타마린드 씨앗 검이다. 타마린드 씨앗 검은 타미린드 나무 (타마린두스 인디카 엘.; Tamarindus indica L.)의 열매의 내부 씨앗으로부터 추출된 다당류이다.
한 실시양태에서, 안정화제는 아라비노갈락탄이다. 아라비노갈락탄은 L-아라비노스 및 D-갈락토스로부터의 다당류이다. CAS 제9036-66-2호로 등록되어 있다.
한 실시양태에서, 안정화제는 크산탄 (검)이다. 크산탄은 미생물, 음이온성 다당류이며, 크산토모나스 캄페스트리스에 의해 분비된다. CAS 제111 38-66-2호이다. 식품 첨가물 E 415로서 등록되어 있다.
한 실시양태에서, 안정화제는 적어도 1종의 동물성 단백질이다. 바람직한 실시양태에서, 안정화제는 가금류, 소, 돼지, 어류로부터의 단백질 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 1종의 동물성 단백질이다.
본 발명에 따른 동물성 단백질은 임의의 동물, 예를 들어, 가금류, 소, 돼지 또는 어류로부터 얻을 수 있다. 동물에는 비-반추 또는 단위 동물 (돼지, 닭, 가금류, 해양 동물, 예컨대 어류), 반추 동물 (소 또는 양류, 예를 들어 소, 양, 염소, 사슴, 송아지, 어린 양)이 포함된다. 가금류에는 닭, 암탉, 칠면조, 오리 및 거위가 포함된다.
동물성 단백질은 동물의 임의의 부분, 예를 들어 또한 우유로부터 단리될 수 있다. 동물성 단백질은 항상 동물로부터 단리될 것이기 때문에, 20 중량％ 이하, 바람직하게는 15 중량％ 이하, 바람직하게는 10 중량％ 이하, 특히 5 중량％ 이하의 비-단백질 성분을 함유할 수 있다. 본 발명에 따른 동물성 단백질은 또한 동물성 단백질로부터 얻어진 완전한 또는 부분적인 가수분해물일 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 동물성 단백질은 젤라틴, 카세인, 알부민 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된다.
안정화제로서 적합한 동물성 단백질에는 카세인, 알부민, 우유 단백질, 젤라틴이 포함되나, 이에 제한되지는 않는다.
젤라틴 (CAS 제9000-70-8호, EINECS 232-554-6)은 예를 들어 100 BL A이라는 명칭으로 슈테스 (Stoess)로부터 얻을 수 있다.
카세인 (CAS 제 900-71-9, EG-Nr. 232-555-1)은 예를 들어 메르크 (Merck)로부터 얻을 수 있다.
알부민은 상이한 원료로부터의 혈청 단백질을 포함하는 용어이다. 상기에는 (우유로부터의) 락트알부민, (알로부터의) 난백알부민, 혈청 알부민, 특히 소 혈청 알부민이 포함된다.
안정화제는 (고체 조성물의 경우) 가공될 혼합물의 총 중량을 기준으로 또는 최종 액체 조성물을 기준으로 보통 0.01 내지 50％, 예를 들면 1 내지 30％, 예를 들면 1 내지 20％, 예를 들면 3 내지 10 중량％의 양으로 첨가된다. 안정화제(들)는 담체와 또는 효소와 혼합되거나 이들은 상기 액체 조성물에 직접 첨가될 수 있다.
다른 실시양태에서는, 예를 들면 펠렛화 안정성 및(또는) 보관 안정성을 더향상시키기 위해 가공 보조제와 같은 추가의 성분이 상기 효소 조성물에 도입될 수 있다. 다수의 그러한 바람직한 첨가제를 이하에 기재한다.
상기 안정화된 고체 또는 액체 효소 조성물에 염이 (예를 들면, 고체 담체 또는 물과 함께) 포함될 수 있다. 바람직하게는 (EP-A-0,758,018에 제시된 것과 같이) 무기 염(들)이 첨가될 수 있고, 이는 가공 및 보관 안정성을 향상시킬 수 있다. 바람직한 무기 염은 수용성이다. 이들은 아연(특히), 마그네슘, 및 칼슘과 같은 2가의 양이온 또는 나트륨 또는 칼륨과 같은 1가의 양이온을 포함할 수 있다. 황산염이 가장 선호되는 음이온이지만 수용성을 초래하는 다른 음이온들이 사용될 수도 있다 (예, 탄산염). 염은 고체 형태로 (예를 들면 혼합물에) 첨가될 수 있다. 그러나, 염(들)은 고체 담체와 혼합되기 전에 물 또는 효소-함유 액체에 용해될 수 있다.
액체 조성물의 경우 염(들)은 액체 효소 조성물에 직접 첨가될 수 있다. 적합하게는 염은 (최종 액체 조성물을 기준으로 한 중량％로) 0.1 내지 40 중량％, 바람직하게는 0.5 내지 30, 특히 1 내지 25, 바람직하게는 1 내지 20 중량％의 양으로 제공된다.
따라서 예를 들면 과립과 같은 고체 조성물은 (최종 고체 조성물을 기준으로 한 중량％로) 25％ (w/w) 미만의 염, 바람직하게는 12％ 미만, 예를 들면 2.5 내지 7.5％, 예를 들면 4 내지 6％의 염을 포함할 수 있다.
요소, 글리세롤, 폴리에틸렌 글리콜, 바람직하게는 6000 Da의 분자량을 갖는 폴리에틸렌 글리콜 또는 이들의 혼합물과 같은 공지의 안정화제(들)가 상기 고체 및(또는) 액체 효소 조성물에 첨가될 수 있음도 고려된다. 상기 고체 또는 액체 조성물에 첨가될 수 있는 추가의 안정화제의 또하나의 예는 5탄당, 바람직하게는 자일리톨 또는 리비톨, 또는 소르비톨, 600 내지 4000 Da, 바람직하게는 1000 내지 3350 Da의 분자량을 갖는 폴리에틸렌 글리콜, 말론산, 글루타르산 및 숙신산의 이나트륨 염, 및 카르복시메틸 셀룰로오스이다.
소수성의 겔-형성 또는 느린 용해성의 (예를 들면 물에) 화합물을 도입함으로써 펠렛 안정성이 더욱 향상될 수 있다. 이들은 1 내지 10％, 예를 들면 2 내지 8％, 바람직하게는 4 내지 6 중량％ (고체 조성물의 경우 물 및 고체 담체의 중량을 기준으로) 또는 액체 조성물의 중량을 기준으로 1 내지 20％로 제공될 수 있다. 적합한 물질로서 유도체화된 셀룰로오스, 예를 들면 HPMC (히드록시-프로필-메틸-셀룰로오스), CMC (카르복시-메틸-셀룰로오스), HEC (히드록시-에틸-셀룰로오스), 미세결정성 셀룰로오스; 폴리비닐 알코올 (PVA); 및(또는) 식용유를 들 수 있다. 대두유 또는 카놀라유와 같은 식용유가 가공 보조제로서 (예를 들면, 과립화될 혼합물에) 첨가될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "효소", "효소(들)" 및 "효소들"에는 하나의 효소 를 포함할 뿐만 아니라, 상이한 효소 (예를 들어, 피타아제 및 산 포스파타아제)의 혼합물 및 상이한 원천의 동종 효소 (예를 들어, 진균성 피타아제 및 세균성 피타아제)의 혼합물이 포함된다.
본 발명에 따른 효소 조성물에는 포스파타아제 적어도 1종을 포함한다. 포스파타아제에는 피타아제 (3-피타아제 및 6-피타아제 모두) 및(또는) 산 포스파타아제가 포함된다.
바람직한 실시양태에서 효소는 적어도 1종의 피타아제이다.
"피타아제"라는 용어는 천연에서 유래되는 피타아제 효소 뿐 아니라, 예를 들면 미오-이노시톨 포스페이트로부터 무기 인(인산염)의 제거 또는 유리를 수반하는 반응을 촉매하는 능력과 같이 피타아제 활성을 갖는 임의의 효소를 의미한다. 바람직하게는 피타아제는 EC 3.1.3.8 부류에 속할 것이다. 피타아제는 3-피타아제 및(또는) 6-피타아제일 수 있다.
피타아제 활성의 한 단위(=FTU)는 pH 5.5 및 37℃에서 소듐 피테이트 0.0051 몰/l로부터 1 분 당 1 마이크로몰의 무기 인을 유리시키는 효소의 양으로 정의된다.
분석적인 방법은 과량으로 첨가된 소듐 피테이트로부터 무기 인산염의 유리를 기준으로 한다. pH 5.5 및 37℃에서의 항온처리 시간은 60 분이다. 유리된 인산염은 황색의 몰리브덴-바나듐 착물을 통해 측정되며 415 nm의 파장에서 광도측정에 의해 평가된다. 알려진 활성의 피타아제 표준을 비교를 위해 나란히 수행한다. 생성물 시료에 대한 흡광도의 측정된 증가를 표준에 대한 비로 환산한다 (상대적 방법, 공식적 AOAC 방법).
피타아제 활성은 문헌["Determination of Phytase Activity in Feed by a Colorimetric Enzymatic Method": Collaborative Interlaboratory Study Engelen et all.: Journal of AOAC International Vol. 84, No. 3, 2001]에 따라서 결정될 수 있다.
본 발명에 따르는 피타아제는 미생물 근원의 것일 수 있고/또는 천연 유래의 피타아제의 유전자 조작에 의해 수득되고/또는 새로 구성함으로써 (유전자 공학) 수득될 수 있다.
바람직한 실시양태에서 피타아제는 식물성 피타아제, 진균 피타아제, 세균 피타아제 또는 효모에 의해 생산가능한 피타아제이다.
피타아제는 세균, 진균 및 효모와 같은 미생물 원천으로부터 바람직하게 유래되지만, 식물성 근원의 것일 수도 있다. 바람직한 실시양태에서, 피타아제는 진균 종, 특히 아스페르길루스, 예를 들면 아스페르길루스 니게르, 아스페르길루스 오리자에, 아스페르길루스 피쿰 (Aspergillus ficuum), 아스페르길루스 아와모리 (Asperigillus awamori), 아스페르길루스 푸미가투스 (Aspergillus fumigatus), 아스페르길루스 니둘란스 (Aspergillus nidulans) 및 아스페르길루스 테레우스 (Aspergillus terreus) 종으로부터 유래된다. 가장 바람직한 것은 아스페르길루스 니게르 종 또는 아스페르길루스 오리자에 종으로부터 유래된 피타아제이다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 피타아제는 세균 균주, 특히 바실루스의 균주 또는 프세우도모나스의 균주로부터 유래된다. 바람직하게는, 피타아제 효소는 바실루스 서브틸리스로부터 유래된다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 피타아제는 세균성 균주, 특히 이. 콜리 종으로부터 유래된다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 피타아제는 효모, 특히 클루베로미세스 (Kluveromyces) 종 또는 사카로미세스 (Saccharomyces) 종으로부터 유래된다. 바람직하게는 피타아제는 사카로미세스 세레비지이 (Saccharomyces cerevisiae) 종으로부터 유래된다.
본 발명의 문맥에서 "~으로부터 유래된 효소"는, 그 균주로부터 회수되었건 상기 균주로부터 단리된 DNA 서열에 의해 코드화되고 상기 DNA 서열로 변환된 숙주 생물에서 생산되었건, 특정 균주에 의해 천연으로 생산된 효소를 포함한다.
피타아제는 임의의 적합한 기술을 이용하여 문제의 미생물로부터 유래될 수 있다. 특히, 피타아제 효소는 적합한 영양 배지에서 피타아제-생산 미생물의 발효에 이어 당 분야에 공지된 방법으로 그 효소를 단리함으로써 수득될 수 있다.
배양에 사용되는 배양액 또는 배지는 문제의 숙주 세포를 성장시키기 적합한 임의의 통상의 배지일 수 있고, 종래 기술의 원리에 따라 구성될 수 있다. 배지는 바람직하게는 탄소 및 질소 원천 및 기타 무기 염을 함유한다. 적합한 배지, 예를 들면 최소의 또는 복잡한 배지가 상업적 공급원으로부터 입수가능하거나, 예를 들면 ATCC (American Type Culture Collection) 균주 카탈로그에 발행된 레시피에 따라 제조될 수 있다.
배양 후, 피타아제 효소를 배양액으로부터 단백질 단리 및 정제를 위한 공지의 방법으로 회수한다. 공지된 정제 방법은 원심분리 또는 여과에 의해 배지로부터 세포를 분리하는 것, 황산 암모늄과 같은 염을 이용하여 배지의 단백질 성분을 침전시키는 것, 그리고 예를 들면 이온 교환 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 친화성 크로마토크래피 등과 같은 크로마토그래피 방법을 포함한다.
그렇지 않으면, 피타아제 효소는 예를 들면 본원에 참고문헌으로 인용되는 EP-A1-0 420 358에 기재되어 있는 것과 같은 재조합 DNA 기술을 이용하여 대량으로 바람직하게 생산된다.
바람직하게는 아스페르길루스 피쿰(Aspergillus ficuum) 또는 아스페르길루스 니게르(Aspergillus niger) 종으로부터 수득된 피타아제-암호화 유전자로 변형된 아스페르길루스 종의 진균이 EP-A1-0 420 358에 기재된 것과 같은 피타아제-암호화의 발현에 도움이 되는 조건 하에 배양된다.
피타아제-함유 배양액은 본 발명의 조성물에 사용되기 전 여과 및 한외-여과의 양자에 의해 바람직하게 처리된다.
본 발명의 더욱 바람직한 실시양태에서는, 분자 공학에 의해 유래된 피타아제, 예를 들면 WO 94/03072 (Roehm), WO 99/49022 (Novozymes), WO 00/43503 (Novozymes) 또는 WO 03/102174(BASF AG)에 기재된 것과 같은 유전적으로 조작된 피타아제가 사용된다.
본 발명에 바람직하게 사용되는 또 다른 피타아제는 소위 컨센서스(consensus) 피타아제이다. 이는 아스페르길루스 피타아제와 비교할 때 더 높은 고유 안정성을 갖는 이론적 분자 생물학적 방법에 따라 개발된 피타아제이다 (유럽 특허 출원 제 897 985 호 참조). 본 발명의 실시에서는 실시예 3 내지 13에 구체적으로 기재된 컨센서스 피타아제가 또한 사용될 수 있다.
진균류에서 수득된 유전자가 세균(예, 이. 콜리), 효모 또는 또 다른 진균류와 같은 숙주 생물로 전이되는 유전자 공학에 의해 그러한 피타아제를 제조하는 것이 가능하다. (더 상세한 내용을 위해, 예를 들면 유럽 특허 출원 공개 제 68431 3 및 유럽 특허 출원 공개 제 897 010 호를 참조)
본 발명의 바람직한 실시양태에서는 EP-B1 420 358에 따르는 피타아제가 사용될 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 효소 조성물은 추가의 효소를 더 포함한다.
본 발명의 조성물을 위해 바람직한 추가의 효소는 식품(제빵 포함) 및 사료 산업에서 유용한 효소들을 포함한다.
그러한 효소들은 바람직하게는 중성 및(또는) 산성 pH 적정값을 갖는 프로테아제(세균성, 진균성, 산성, 중성 또는 알칼리성)를 비제한적으로 포함한다.
프로테아제(단백질 분해효소)는 미생물계 효소, 바람직하게는 세균 또는 진균의 균주로부터 유래된 프로테아제이거나 상기 프로테아제는 트립신 또는 펩신일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 단백질 분해효소는 바실루스 종, 바람직하게는 바실루스 수브틸리스 (Bacillus subtilis) 종 또는 바실루스 리케니포르미스 (Bacillus licheniformis) 종으로부터 유래된 세균성 프로테아제이다. 시판되는 바실루스 프로테아제는 알카제(AlcaseTM) 및 뉴트라제(NeutraseTM)(Novozymes, Denmark)이다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 상기 단백질 분해효소는 아스페르길루스, 바람직하게는 아스페르길루스 아쿨레아투스 (Aspergillus aculeatus) 종, 아스페르길루스 니게르 (Aspergillus niger) 종, 아스페르길루스 오리자에 (Aspergillus oryzae) 종으로부터 유래된 진균성 프로테아제이다. 시판되는 아스페르길루스 프로테아제는 플래버자임(FlavourzymeTM)(Novozymes, Denmark)이다.
상기 효소는 리파아제(진균성, 세균성, 포유류), 바람직하게는 포유류 췌장 포스포리파아제 A2 또는 임의의 트리아실글리세롤 리파아제 (E.C. 3.1.1.3)와 같은 포스포리파아제를 비제한적으로 포함한다.
상기 효소는 포도당 산화효소를 비제한적으로 포함한다.
상기 효소는 글리코시다아제 (카보하이드라아제라고도 알려진 E.C. 3.2), 예를 들면 아밀라아제 (알파 또는 베타), 셀룰라아제 (전체 셀룰라아제 또는 그의 기능성 성분), 특히 크실라나아제, 글루카나아제, 바람직하게는 β-글루카나아제, 갈락토시다아제, 펙티아나제, 및 -갈락토시다아제, 예를 들면 α- 또는 β-갈락토시다아제를 비제한적으로 포함한다.
글리코시다아제 효소는 임의의 글리코시다아제 효소(EC 3.2.1, 카보하이드라아제라고도 알려진)일 수 있다. 바람직하게는, 상기 글리코시다아제 효소는 아밀라아제, 특히 α-아밀라아제 또는 β-아밀라아제, 셀룰라아제, 글루카나아제, 특히 엔도-1,4-β-글루카나아제 (E.C. 3.2.1.4) 또는 엔도-1,3-β-글루카나아제 (E.C. 3.2.1.6), 크실라나아제, 특히 엔도-1,4-β-크실라나아제 (E.C. 3.2.1.8) 또는 크실란-엔도-1,3-β-크실로시다아제 (E.C. 3.2.1.32), α-갈락토시다아제 (E.C. 3.2.1.22), 폴리갈락투로나아제 (E.C.3.2.1.15, 펙타나아제라고도 알려진), 셀룰로오스-1,4-β-셀로비오시다아제 (E.C. 3.2.1.91, 셀로비오히드롤라아제라고도 알려진), 엔도-글루카나아제, 특히 엔도-1,6-δ-글루카나아제 (E.C. 3.2.1.75), 엔도-1,2-β-글루카나아제 (E.C. 3.2.1.71), 엔도-1,3-β-글루카나아제 (E.C. 3.2.1.39) 또는 엔도-1,3-α-글루카나아제 (E.C. 3.2.1.59)이다. 이들은 또한 β-만노시다아제 (EC 3.2.1.25) 및 만난-엔도-1,4-β-만노시다아제(EC 3.2.1.78)와 같은 만나나아제를 포함한다.
본 발명에 따르는 바람직한 엔도-1,4-β-글루카나아제(E.C. 3.2.1.4)는 본원에 참고문헌으로 인용되는 WO 01/70998(BASF AG)에 기재된 엔도-1,4-β-글루카나아제이다.
바람직한 실시양태에서, 추가의 효소는 글루코시다아제, 포스포리파아제 및 글루코스 산화효소로 구성된 군으로부터 선택된다.
바람직한 실시양태에서, 추가의 효소는 글루코시다아제로 구성된 군으로부터 선택된다.
바람직한 실시양태에서, 추가의 효소는 크실라나아제, 글루카나아제 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서 추가의 효소는 적어도 1종의 크실라나아제이다. 크실라나아제는 예를 들면 아스페르길루스 니게르 (Aspergillus niger), 클로스트리디움 테르모셀룸 (Clostridium thermocellum), 트리코데르마 레세이 (Trichoderma reesei), 페니실리움 잔티넬룸 (Penicillium janthinellum), 뿐만 아니라 바실루스 및 스트렙토미세스 종과 같은 미생물 원천으로부터 수득될 수 있다. 상기 크실라나아제는 예를 들면 EP 121 138에 기재된 것과 같이 재조합 발현에 의해 수득될 수도 있다. 바람직한 실시양태에서는 EP 0 463 706 B1 (BASF AG) 및(또는) WO 02/24926 A1 (BASF AG)에 기재된 것과 같은 크실라나아제가 본 발명에 따라 사용될 수 있다.
본 발명에 따라서 적합한 크실라나아제는 엔도-크실라나아제 및(또는) 엑소-크실라나아제, 바람직하게는 엔도-크실라나아제, 특히 엔도-β-크실라나아제일 수 있다.
적합한 추가의 효소는 애완동물 사료를 포함하는 동물 사료 및(또는) 인간 영양원에 포함되는 것들이다. 이러한 효소의 기능은 종종, 점도를 감소시킴으로써 또는 특정 사료 배합물의 반-자양 효과를 감소시킴으로써 사료 전환율을 향상시키는 것이다. 환경에 유해한 비료 중 화합물의 양을 감소시키기 위해 사료 효소가 또한 사용될 수 있다.
본 발명의 효소 조성물이 식품 용도에 사용될 경우, 효소는 식품의 품질을 가져야 한다.
적어도 1종, 바람직하게는 2종, 바람직하게는 3종 이상의 상이한 효소가 사용되는 것도 본 발명의 범위 내에 있다. 이들은 같은 부류로부터의 효소, 예를 들면 2종의 상이한 피타아제, 또는 상이한 부류로부터의 효소, 예를 들면 피타아제 및 크실라나아제일 수 있다. 특정 효소 또는 하나의 효소를 언급할 때마다, 효소의 혼합물도 그 혼합물이 단일의 발효액에서 직접 수득가능하든, 아니면 상이한 발효액에서 수득가능하든지에 관계없이 상기 용어에 포함되며; 또한 재조합 생물의 발효에 의해 수득가능한 효소를 포함하는 것이 이해되어야 한다.
포스파타아제가 피타아제인 경우, 바람직하게는 상기 고체 또는 액체 효소 조성물은 1,000 내지 80,000, 예를 들면 2,000 내지 70,000, 예를 들면 3,000 내지 60,000, 바람직하게는 4,000 내지 50,000, 예를 들면 5,000 내지 25,000, 예를 들면 5,000 내지 15,000, 예를 들면 5,000 내지 10,000, 예를 들면 6,000 내지 8,000 FTU/g의 활성을 가질 것이다.
추가의 효소가 식물 세포 벽 분해 효소, 예컨대 크실라나아제인 경우, 최종 상기 고체 또는 액체 조성물은 3,000 내지 500,000, 바람직하게는 4,000 내지 250,000, 바람직하게는 5,000 내지 100,000, 바람직하게는 6,000 내지 80,000, 적정하게는 8,000 내지 70,000 EXU/g 범위의 효소 활성을 가질 수 있다.
추가의 효소가 셀룰라아제, 예컨대 글루카나아제, 바람직하게는 β-글루카나아제인 경우, 상기 고체 또는 액체 조성물은 100 내지 150,000, 예를 들면 500 내지 100,000, 바람직하게는 750 내지 50,000, 바람직하게는 1,000 내지 10,000, 적정하게는 1,500 내지 7,000 BGU/g의 효소 활성을 가질 수 있다.
1 엔도-크실라나아제 활성(EXU)은 시험 조건 (pH 3.5 및 55℃) 하에 분당, 크실로오스 당량으로 측정할 때 1.00 마이크로몰의 환원 당을 유리시키는 효소의 양으로 정의된다.
1 베타-글루카나아제 단위 (BGU)는 시험 조건 (pH 3.5 및 40℃) 하에 분당, 포도당 당량으로 환산할 때 0.258 마이크로몰의 환원 당을 유리시키는 효소의 양으로 정의된다.
엔도-크실라나아제 활성 (EXU) 및 β-글루카나아제 활성(BGU)은 문헌[Engelen et al: Journal of AOAC International Vol. 79, No. 5, 1019 (1996)]에 따라서 결정될 수 있다.
고체 조성물, 예를 들어, 과립은 1 내지 20, 예를 들어 5 내지 20, 예를 들어 7 내지 15 중량％의 효소 (포스파타아제 + 추가 효소)를 포함할 수 있다.
액체 조성물은 0.5 내지 20, 예를 들어 5 내지 15 중량％의 효소 (포스파타아제 + 추가 효소)를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 국면은 상기 방법은 제1항 내지 제10항 및(또는) 제26항 중 어느 한 항에 정의된 것과 같은 고체 및(또는) 액체 효소 조성물을 적어도 1종의 동물 사료 물질 (예를 들어, 씨앗) 또는 성분과 혼합하는 것을 포함하는, 동물 사료, 또는 동물 사료의 프리믹스 또는 전구체의 제조 방법에 관한 것이다. 이후, 이를 예를 들어 열 처리하는 등과 같이 멸균될 수 있다. 이후, 얻어진 조성물을 펠렛으로 적절하게 가공하고, 선택적으로 건조시킬 수 있다.
효소 공급된 사료에 압출, 팽창 및 펠렛화와 같은 사료 가공의 여러 방법을 시행할 수 있으며, 여기에서 일시적으로 높은 온도가 나타날 수 있고 열안정화가 장점이다.
본 발명의 안정화된 효소 조성물은 예를 들면 사료 펠렛 위에 적용될 수 있다. 열-안정화된 액체 효소 조성물을 수도물로 희석하여 원하는 효소 활성을 갖는 용액을 생성할 수 있다. 포스파타아제가 피타아제일 경우, 상기 용액을 100 내지 1000, 바람직하게는 200 내지 700, 특히 300 내지 500 FTU/g 용액의 활성이 수득되도록 희석하는 것이 바람직하다. 사료 펠렛을 기계적 믹서로 이동하고, 첨가된 효소 활성을 가지고 균질한 제품을 생성하도록 교반하면서, 희석된 효소 조성물을 사료 펠렛 위에 분무할 수 있다. 피타아제 함유 사료 펠렛에 대한 예는 약 500 FTU/kg 사료 펠렛의 활성을 바람직하게 초래할 것이다.
그렇지 않으면, 상기 고체 또는 액체 효소 조성물을 반죽 사료와 직접 혼합한 다음, 상기 혼합물에 펠렛화, 팽창 또는 압출과 같은 처리를 이행할 수 있다.
본 발명의 또 다른 국면은 청구항 제1항 내지 제10항 및(또는) 제26항 중 어느 한 항에 정의된 것과 같은 고체 및(또는) 액체 효소 조성물을 1종 이상의 식품 물질 (들) 또는 성분(들)과 혼합하는 것을 포함하는, 인간 영양원에 적합한 조성물, 또는 프리믹스 또는 전구체의 제조 방법에 관한 것이다. 이는 그 후, 예를 들면 열 처리하는 등과 같이 멸균될 수 있다. 수득되는 조성물을 그 후 펠렛으로 적절하게 가공하고 선택적으로 건조시킬 수 있다.
바람직하게는 상기 고체 조성물, 예를 들면 과립, 및 사료 또는 식품 물질(들) 또는 성분(들)은 1 g: 1 kg 미만, 바람직하게는 0.5 g: 1 kg 미만, 특히 0.1 g: 1 kg 미만, 바람직하게는 0.05 g: 1 kg 미만의 과립: 사료 또는 식품 물질(들) 또는 성분의 비로 혼합된다.
본 발명의 또 다른 국면은 제1항 내지 제10항 및(또는) 제26항 중 어느 한 항에 정의된 것과 같은 고체 및(또는) 액체 효소 조성물의 인체 및(또는) 동물 영양을 위한 용도에 관한 것이다. 따라서 본 발명은 동물 사료 조성물 또는 인간 영양원에 적합한 조성물과 같은 조성물을 포함한다. 상기 조성물은 바람직하게는 펠렛(펠렛 당 1-5, 예를 들면 2-4 개의 건조된 과립이 있을 수 있다)의 형태이다. 상기 조성물은 8 내지 20％, 예를 들면 12 내지 15％의 수분 함량을 가질 수 있다. 효소(들)의 양은 0.0001 내지 0.005 중량％, 적합하게는 0.0005 내지 0.0012 중량％, 예를 들면 5 ppm 이상일 수 있다.
본 발명의 또 다른 국면은 동물에 본 발명에 따른 사료를 공급하며 추가의 인산염이 사료에 첨가되지 않는, 위가 하나인 동물에게 음식에서 요구되는 인을 공급하는 방법에 관한 것이다.
또 다른 국면은 제1항 내지 제10항 및(또는) 제26항 중 어느 한 항에 정의된 것과 같은 고체 및/또는 액체 효소 조성물을 포함하는 식이를 동물에 공급하는 것을 포함하는, 동물의 성장 촉진 및/또는 사료 전환율의 향상을 위한 방법에 관한 것이다.
적합하게는 상기 조성물은 0.05 내지 2.0, 예를 들면 0.3 내지 1.0, 선택적으로 0.4 내지 0.6 FTU/g의 포스파타아제, 예를 들면 피타아제를 포함한다. 크실라나아제는 0.5 내지 50, 예를 들면 1 내지 40 EXU/g, 바람직하게는 2 내지 25, 특히 2 내지 15 EXU/g으로 존재할 수 있다. 그 대신에, 또는 그에 더하여, 셀룰라아제가 0.05 내지 1.5, 예를 들면 0.1 내지 1.0, 예를 들면 0.2 내지 0.6 BGU/g으로 존재할 수 있다.
본 발명의 또 다른 국면은 제1항 내지 제10항 및(또는) 제26항 중 어느 한 항에 정의된 것과 같은 고체 및(또는) 액체 효소 조성물의 동물 사료에서의, 또는 그 성분으로서의, 또는 동물 식이에 사용하기 위한 용도에 관한 것이다.
제1항 내지 제10항 및(또는) 제26항 중 어느 한 항에 정의된 것과 같은 고체 및(또는) 액체 효소 조성물은 동물 및(또는) 인체에 공급 시, 환경 오염의 감소에 기여한다. 또한 그들은 동물에 공급 시, 제1항 내지 제10항 및(또는) 제26항 중 어느 한 항에 정의된 것과 같은 고체 및(또는) 액체 효소 조성물이 공급된 동물로부터 수득되는 동물 생산물(예, 고기, 알)의 품질을 향상시킨다.
적합한 동물로서 농장 동물(돼지, 가금, 가축), 비-반추 동물 또는 위가 하나인 동물(돼지, 닭, 가금, 물고기와 같은 바다 동물), 반추동물(소 또는 양, 예를 들면 소, 양, 염소, 사슴, 송아지, 어린 양)을 들 수 있다. 가금류는 병아리, 암탉, 칠면조, 거위 및 오리를 포함한다.
본 발명의 추가의 실시양태는 효소의 펠렛화 안정성을 개선시키기 위해 포스파타아제 함유 조성물에, 아가, 알긴 카라기난, 퍼셀레란, 가티 검, 트라가칸스 검, 카르야 검, 구아란, 로커스트 콩 검 (= 카로브 콩 검), 타마린드 씨앗 검, 아라비노갈락탄, 크산탄 (검), 적어도 1종의 동물성 단백질 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 1종의 안정화제를 사용하는 것에 관한 것이다.
본 발명의 추가의 측면은 고체 및(또는) 액체 효소 조성물의 제조, 바람직하게는 고체 효소 조성물에 대한 첨가제로서, 아가, 알긴, 카라기난, 퍼셀레란, 가티 검, 트라가칸스 검, 카르야 검, 구아란, 로커스트 콩 검 (= 카로브 콩 검), 타마린드 씨앗 검, 아라비노갈락탄, 크산탄 (검), 적어도 1종의 동물성 단백질 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 1종의 안정화제를 사용하는 것에 관한 것이다. 본 발명의 상기 실시양태에서 안정화제(들)는 고체 화합물로서 표준 과립화 혼합물에 바람직하게 첨가된다. 그러한 조성물은 유동 베드 건조기 상에서 45℃로 15 분 동안 입자를 건조시키는 단계를 포함하는 고 전단 과립화 공정 후에 측정된 예를 들면 피타아제 활성의 증가된 회복율(20％ 까지)의 결과를 가져올 수 있다. 뿐만 아니라 본 발명에 따르는 안정화제(들)를 함유하는 상기 입자는 사료 및/또는 식품과 혼합 시, 그러한 첨가제가 없는 과립에 비하여 사료 및/또는 식품 처리(예, 85℃에서의 펠렛화 공정) 후 효소 활성의 증가된 회복율을 나타낼 수 있다.
본 발명의 하나의 국면의 바람직한 성질 및 특성이 필요한 변경을 가하여 또 다른 경우에 동등하게 적용가능하다.
모든 백분율은 달리 명시되지 않는 한 중량 기준(w/w)이다.
실시예 V 1 (비교)
혼련, 압출, 구형화 및 건조에 의한 옥수수 전분-기재 효소 과립의 제조
첫 번째 단계에서는, 옥수수 전분을 실험실용 믹서(Loedige Typ M5 RMK) 내 에 충진하고 서서히 교반하였다. 피타아제를 함유하는 한외-여액, ZnSO4 x 6H2O, PVA (폴리비닐 알코올) 및 추가의 물의 혼합물을 비커 내에 붓고 용해/분산시켰다. 상기 혼합물을 뢰디게(Loedige) 믹서 내의 옥수수 전분 위에 부었다.
즉, 66％(w/w)의 옥수수 전분, 20％(w/w)의 피타아제 함유 한외-여액, 1％(w/w)의 PVA, 0.3％(w/w)의 ZnSO4 x 6 H2O 및 12.7％(w/w)의 추가의 물을 뢰디게 믹서에서 100 내지 250 rpm으로 혼합 및 혼련함으로써 효소 함유 도우를 수득하였다.
두 번째 단계에서는 상기 효소 함유 도우를 후지 포달(Fuji Paudal) 실험실용 압출기, 유형 DG-L1을 이용하여 압출하여 젖은 압출물을 수득하고, 그 후 이를 실험실용 구형화기에서 둥글게 하여 500 내지 800 ㎛의 평균 직경을 갖는 둥근 입자를 수득하였다.
상기 입자를 이어서 유동 베드 건조기(Niro-Aeromatic, 유형 MP-1)에서 약 40℃의 베드 온도로 60 내지 90 분간 건조시켰다. 약 1.5 kg의 젖은 과립을 건조시키고 이어서 식혔다. 수득된 건조 효소 과립은 8920 FTU/g의 활성을 가졌다.
실시예 V1 옥수수 전분 한외여액 PVA ZnSO4 × 6H2O 물
반죽 66.0％ 20.0％ 1.0％ 0.3％ 12.7％
과립 83.6％ 8.6％ 1.4％ 0.4％ 6.0％
실시예 1: 안정화제로서 카세인
제 1 단계에서 옥수수 전분 및 카세인 (메르크 (다름슈타트 (Darmstadt) 소재)사로부터 얻음, CAS 제900-71-9호)을 실험용 믹서 (뢰디제 타이프 M5 RMK)에 충전시키고, 서서히 진탕하였다. 피타아제, ZnSO4 × 6H2O 및 추가 물을 함유하는 한외-여액의 혼합물을 비커에 붓고, 용해/분산시켰다. 뢰디제 믹서에서 상기 혼합물 을 옥수수 전분 및 카세인에 부었다. 이에 따라, 뢰디제 믹서에서 100 내지 250 rpm으로 성분들을 혼합하고 혼련하여 피타아제 함유 반죽을 얻었다.
실시예 V1에서 기재된 것과 같이, 반죽을 압출하고, 구형화하고, 건조시키고, 냉각시켜 효소-함유 과립을 얻었다. 얻어진 건조 효소 과립은 7690 FTU/g의 활성을 갖는다.
실시예 1 옥수수 전분 한외여액 카세인 ZnSO4 × 6H2O 물
반죽 62.0％ 20.0％ 5.0％ 0.3％ 12.7％
과립 78.6％ 8.5％ 6.5％ 0.4％ 6.0％
실시예 2: 안정화제로서 카세인
실시예 1에 따라서 효소 (피타아제) 함유 과립을 얻었다. 얻어진 건조 효소 과립은 7580 FTU/g의 활성을 갖는다.
실시예 2 옥수수 전분 한외여액 카세인 ZnSO4 × 6H2O 물
반죽 47.0％ 20.0％ 20.0％ 0.3％ 12.7％
과립 59.6％ 8.6％ 25.4％ 0.4％ 6.0％
팰랫화 안정성의 비교
본 발명의 피타아제 과립을 펠렛화 시험하였으며, 이들의 펠렛화 안정성을 표준 방법 (= 실시예 V1)에 따라 제조된 과립과 비교하였다 (ex. 2). 펠렛화 시험은 1 g/kg 사료의 수준에서 상이한 효소 과립과 표준 브로일러 식이 혼합으로 구성된다. 상기 효소-함유 사료를 공기 조절 장치에서 증기 분사에 의해 처리하고, 이후 즉시 펠렛화 프레스에서 펠렛화하여 사료 펠렛을 얻고, 후속적으로 냉각하였다. 펠렛화 프레스 이후 바로 측정된 펠렛 온도는 78℃였다. 실시예 1 및 실시예 2는 실시예 V1과 비교하여 펠렛화 안정성이 10％ 이상 증가함을 나타낸다.

Claims (39)

  1. 적어도 1종의 포스파타아제 및 적어도 1종의 안정화제를 포함하며,
    여기서 상기 안정화제는 동물성 단백질, 아가, 알긴, 카라기난, 퍼셀레란, 가티 검, 트라가칸스 검, 카르야 검, 구아란, 로커스트 콩 검 (= 카로브 콩 검), 타마린드 씨앗 검, 아라비노갈락탄 및 크산탄 (검)으로 구성된 군으로부터 선택되고, 단, 젤라틴을 유일한 안정화제로서 고체 조성물인 과립에 사용하는 경우 과립은 코팅을 갖는 것인, 안정화된 고체 또는 액체 효소 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 포스파타아제가 피타아제인 효소 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 피타아제가 식물 피타아제, 진균 피타아제, 세균 피타아제, 효모에 의해 생산될 수 있는 피타아제 또는 컨센서스 (consensus) 피타아제인 효소 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 동물성 단백질이 가금류, 소, 돼지, 어류로부터의 단백질 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 것인 효소 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 동물성 단백질이 젤라틴, 카세인, 알부민 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 것인 효소 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 조성물이 액체인 것을 특징으로 하는 효소 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 조성물이 고체인 것을 특징으로 하는 효소 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 고체 조성물이 과립 형태인 것을 특징으로 하는 효소 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 과립이 적어도 1종의 포스파타아제, 식용 탄수화물 고분자 15 중량％ 이상을 포함하는 고체 담체 및 적어도 1종의 안정화제를 포함하며,
    여기서 상기 안정화제는 동물성 단백질, 아가, 알긴, 카라기난, 퍼셀레란, 가티 검, 트라가칸스 검, 카르야 검, 구아란, 로커스트 콩 검 (= 카로브 콩 검), 타마린드 씨앗 검, 아라비노갈락탄 및 크산탄 (검)으로 구성된 군으로부터 선택되고, 단, 젤라틴을 유일한 안정화제로서 사용하는 경우 과립은 코팅을 갖는 것인, 효소 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 과립이 코팅되어 있는 효소 조성물.
  11. (i) 적어도 1종의 포스파타아제,
    (ii) 식용 탄수화물 고분자 15 중량％ 이상을 포함하는 고체 담체, 및
    (iii) 동물성 단백질, 아가, 알긴, 카라기난, 퍼셀레란, 가티 검, 트라가칸스 검, 카르야 검, 구아란, 로커스트 콩 검 (= 카로브 콩 검), 타마린드 씨앗 검, 아라비노갈락탄 및 크산탄 (검)으로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 1종의 안정화제
    를 가공하는 것을 포함하며,
    단, 젤라틴을 유일한 안정화제로서 사용하는 경우 후속적으로 과립을 코팅하는 것인, 포스파타아제-함유 과립의 제조 방법.
  12. 제11항에 있어서, 물을 가공에 첨가하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 물 및 포스파타아제를 효소-함유 수성 액체로서 제공하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 액체가 포스파타아제의 생성을 유발하는 발효 공정으로부터 유래된 여액인 방법.
  15. 제11항에 있어서, 가공 이후에 과립을 건조시키는 방법.
  16. 제11항에 있어서, 동물성 단백질이 가금류, 소, 돼지, 어류로부터의 단백질 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 것인 방법.
  17. 제11항에 있어서, 동물성 단백질이 젤라틴, 카세인, 알부민 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 것인 방법.
  18. 제11항에 있어서,
    a) 효소를 함유하는 수성 액체와 고체 담체 및 안정화제를 혼합하는 단계;
    b) a)에서 얻어진 혼합물을 기계적으로 가공하여 효소-함유 과립을 얻는 단계; 및
    c) b)에서 얻어진 효소-함유 과립을 건조시키는 단계
    를 포함하는 방법.
  19. 제11항에 있어서, 가공이 기계적이며, 압출, 펠렛화, 고-전단 과립화, 팽창, 유동상 응집, 구형화, 드럼 과립화 또는 이들의 조합을 포함하는 방법.
  20. 제13항에 있어서, 효소-함유 수성 액체, 고체 담체 및 안정화제를 혼합하고, 얻어진 혼합물을 과립화 이전에 혼련하는 방법.
  21. 제11항에 있어서, 가공이 저압에서 또는 바스켓- 또는 돔-압출기로, 또는 저압에서 바스켓- 또는 돔-압출기로 수행된 압출인 방법.
  22. 제11항에 있어서, 과립을 구형화하는 방법.
  23. 제11항에 있어서, 과립을 코팅하는 방법.
  24. 삭제
  25. 삭제
  26. 제11항에서 정의된 방법에 의해 얻을 수 있는 효소-함유 과립.
  27. 제1항 내지 제10항 및 제26항 중 어느 한 항에 따른 안정화된 고체 또는 액체 조성물을 적어도 1종의 동물 사료와 혼합하는 것을 포함하는, 동물 사료 또는 그의 프리믹스 또는 전구체의 제조 방법.
  28. 삭제
  29. 제27항에 있어서, 사료와 제1항 내지 제10항 및 제26항 중 어느 한 항에 따른 안정화된 고체 또는 액체 조성물의 혼합물을 멸균하거나 증기로 처리하고, 펠렛화하는 방법.
  30. 삭제
  31. 제1항 내지 제10항 및 제26항 중 어느 한 항에 따른 안정화된 고체 또는 액체 조성물을 포함하는 식이를 동물에 공급하는 것을 포함하는, 동물의 성장을 촉진하거나 사료 전환율을 개선하는 방법.
  32. 제11항에 있어서, 포스파타아제가 피타아제인 방법.
  33. 제32항에 있어서, 피타아제가 식물 피타아제, 진균 피타아제, 세균 피타아제, 효모에 의해 생산될 수 있는 피타아제 및 컨센서스 피타아제로 구성된 군으로부터 선택된 것인 방법.
  34. 제32항에 있어서, 과립이 1,000 내지 80,000 FTU/g 범위의 피타아제 활성을 갖는 것인 방법.
  35. 제1항 내지 제10항 및 제26항 중 어느 한 항에 따른 안정화된 고체 또는 액체 조성물을 동물에게 공급하는 것을 포함하는, 동물의 급식 방법.
  36. 제29항에 있어서, 펠렛화된 혼합물을 건조시키는 것을 더 포함하는 방법.
  37. 제1항 내지 제10항 및 제26항 중 어느 한 항에 따른 안정화된 고체 또는 액체 조성물을 적어도 1종의 식품 물질 또는 성분과 혼합하는 것을 포함하는, 인간 영양원에 적합한 조성물 또는 그의 프리믹스 또는 전구체의 제조 방법.
  38. 제37항에 있어서, 식품 물질과 제1항 내지 제10항 및 제26항 중 어느 한 항에 따른 안정화된 고체 또는 액체 조성물의 혼합물을 멸균하거나 증기로 처리하고, 펠렛화하는 방법.
  39. 제38항에 있어서, 펠렛화된 혼합물을 건조시키는 것을 더 포함하는 방법.
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