CN111938031A - 一种耐高温葡萄糖氧化酶微丸及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种耐高温葡萄糖氧化酶微丸及其制备方法和应用。本发明采用固体分散技术，以葡萄糖氧化酶为原料，以微晶纤维素、硬脂酸、木薯粉、聚丙烯酸树脂乳胶液、棕榈油等为辅料，制备形成耐高温葡萄糖氧化酶微丸。本发明的耐高温葡萄糖氧化酶微丸外观圆整、粒径均匀，与饲料有很好的混合均匀度。并且，本发明的耐高温葡萄糖氧化酶微丸具有良好的耐热性能、耐酸性能、释放性能和稳定性，将其添加到饲料中，可不同程度提高动物的采食量和日增重，降低料肉比，提高饲料利用效率。

Description

一种耐高温葡萄糖氧化酶微丸及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及固体分散技术领域，具体涉及一种耐高温葡萄糖氧化酶微丸及 其制备方法和应用。
背景技术
葡萄糖氧化酶，其系统命名为β-D-葡萄糖氧化还原酶，它能高度专一性地 催化β-D-葡萄糖与空气中的氧反应，使葡萄糖氧化成为葡萄糖酸和过氧化氢。 葡萄糖氧化酶广泛地存在于动物、植物和微生物体内，微生物繁殖快，来源广 的特点使其成为葡萄糖氧酶的主要来源，主要生产菌株为黑曲霉和青霉。葡萄 糖氧化酶目前广泛应用于食品、饲料、医药等行业中，起到了去除葡萄糖、脱 氧、杀菌等作用。高纯度葡萄糖氧化酶为淡黄色粉末，易溶于水，分子量为150kDa 左右，最大光吸收波长为377nm和455nm。葡萄糖氧化酶的作用温度为30-60℃， 固体酶制剂在0℃下保存至少稳定2年，在-15℃下稳定8年。葡萄糖氧化酶稳定的pH范围为4.0-8.0，具有很好的稳定性。
葡萄糖氧化酶与生命的重要物质-葡萄糖和氧有密切关系，在动物体内发挥 着重要作用。葡萄糖氧化酶能催化肠道内的葡萄糖产生葡萄糖酸和过氧化氢。 当过氧化氢积累到一定浓度时，直接抑制大肠杆菌、沙门氏菌、巴氏杆菌、葡 萄球菌等有害菌的生长繁殖。它还能催化葡萄糖去除肠道内氧气，为厌氧有益 菌的增殖创造厌氧环境。葡萄糖氧化酶作用于葡萄糖生成的葡萄糖酸可降低胃 肠内pH值，为有益菌生长创造酸性环境，而有益菌大量增殖形成微生态竞争优 势，抑制了大肠杆菌、沙门氏菌等有害菌存活，控制感染，排除腐败物质，提 高巨噬细胞活性，从而提高机体免疫力。
葡萄糖氧化酶由于其在提高动物消化吸收、促进生长、可替代部分药物及 抗生素等方面的突出表现，作为一种新型的促生长饲料添加剂，对于我国解决 饲料资源匮乏、提高饲料品质、改善环境污染以及降低抗生素残留等问题可起 到重要的作用。
葡萄糖氧化酶，作为一种酶蛋白，只有在适宜的环境条件下才能表现出高 活性。饲料制粒是通过机械加工过程中的热、水分、压力的作用，将单一原料 或配合混合料压实并挤压出膜孔形成颗粒状饲料。一般葡萄糖氧化酶在60℃以 下的制粒过程中，经稳定载体处理的葡萄糖氧化酶可保持约20％左右的活性， 某些经特殊包被处理的葡萄糖氧化酶在70℃以下可保持约60％左右的活性；但 考虑到沙门氏菌的灭活，制粒温度一般需要达到90℃，此时一般即使含有稳定 剂的葡萄糖氧化酶也将变得无效。
目前，利用基因工程方法提高葡萄糖氧化酶的耐高温性能方面已经做了不 少工作，并取得一定的进展。然而，这种办法有一定的限制：1、菌种发酵效率 和耐高温性能不可兼得；2、葡萄糖氧化酶耐高温性能和其在动物体内生物活性 不可兼得等。同时在战略层面上，因为欧洲对进口转基因饲用酶制剂在注册、 验证、使用上要求非常高、难度非常大，所以如果想把葡萄糖氧化酶销售进入 欧洲饲用添加剂市场，能否用非转基因方法提高葡萄糖氧化酶的耐高温(≥85℃) 耐高湿(≥20％)性能是我国饲用酶制剂进一步推广的关键之一。
运用现代制药技术来改良酶制剂的性能是另一类较为实用的方法，并逐渐 成为一种趋势。此类方法主要包括三种方法，分别为包衣技术、固体分散技术 和微囊化技术。其中，包衣技术是在特定的设备中按特定的工艺将糖料或其它 能成膜的材料涂覆在固体酶原料的外表面，使其干燥后成为紧密粘附在表面的 一层或数层不同厚薄、不同弹性的多功能保护层以提高其耐热性能；固体分散 技术是将固体原料以分子、胶态、微晶或无定形态，分散在载体物质(不溶性 聚合物、肠溶性材料、脂质材料等)中形成的原料-载体的固体分散体系的技术； 微囊化技术是利用天然的或人工合成的高分子材料作为成膜材料，将固体、液 体或气体包裹成半透性或封闭性的微小囊状物的技术，微胶囊的直径一般为 1～500μm。运用包衣技术和固体分散技术都可以大大提高葡萄糖氧化酶的稳定性 和耐热性，但固体分散技术制备的耐高温葡萄糖氧化酶以其生产成本低、配方 工艺简单；所需设备价格低、使用广泛、维修方便；生产工艺简单、生产效率 高；产品稳定等原因成为了制备耐高温葡萄糖氧化酶的最佳方法。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处而提供一种耐高温葡萄糖氧化 酶微丸及其制备方法和应用。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：
一种耐高温葡萄糖氧化酶微丸，包括葡萄糖氧化酶、微晶纤维素、硬脂酸、 木薯粉、聚丙烯酸树脂乳胶液和棕榈油，所述葡萄糖氧化酶的酶活≥1000U/g， 所述葡萄糖氧化酶、微晶纤维素、硬脂酸、木薯粉、聚丙烯酸树脂乳胶液和棕 榈油的质量比为2～4:1～2:1～3:2～4:1～2:1～2。
本发明采用葡萄糖氧化酶为原料，添加一定比例的微晶纤维素、硬脂酸、 木薯粉、聚丙烯酸树脂乳胶液、棕榈油等为原料载体，形成耐高温葡萄糖氧化 酶微丸。本发明的原、辅料配方简单且材料容易获得，成本较低，且制备得到 的耐高温葡萄糖氧化酶微丸外观圆整、粒径均匀，与饲料有很好的混合均匀度。 并且，相较于现有的葡萄糖氧化酶制剂，本发明的耐高温葡萄糖氧化酶微丸具 有更好的耐热性能、耐酸性能、释放性能和稳定性。
进一步地，所述葡萄糖氧化酶、微晶纤维素、硬脂酸、木薯粉、聚丙烯酸 树脂乳胶液和棕榈油的质量比优选为3:1:1:2:1:1，在此配比范围，能够确保制备 得到的耐高温葡萄糖氧化酶微丸具有良好的耐热性能、耐酸性能、释放性能和 稳定性的同时，成本较低。
进一步地，所述聚丙烯酸树脂乳胶液为肠溶型聚丙烯酸树脂乳胶液，更进 一步地，本发明所用的聚丙烯酸树脂乳胶液的固含量为28.0～30.0％，pH为 1.0～3.0，酸值为230～270mgKOH/g，特性粘度为140～400dL/g，促使聚丙烯酸树 脂乳胶液与葡萄糖氧化酶形成的致密的耐高温固体分散体系，可以层层隔绝高 温水蒸气从而起到保护酶制剂作用，同时也可以防止因固体分散体系包裹的过 于密实而影响酶制剂的释放。
进一步地，所述葡萄糖氧化酶微丸的水分含量≤10.0％，所述葡萄糖氧化酶 微丸的水分含量更优选为≤8.0％；葡萄糖氧化酶微丸的粒径大小为18～50目占 95％以上，微丸外观圆整、粒径均匀，与饲料有很好的混合均匀度；此外，本发 明的葡萄糖氧化酶微丸利用体积浓度为80％的甘油水溶液作为溶剂，在85℃热 处理5min的条件下，葡萄糖氧化酶的酶活保留率≥70％，更优选为在90℃热处 理5min的条件下，葡萄糖氧化酶的酶活保留率≥70％，具有良好的耐高温性能。
本发明还提供了上述耐高温葡萄糖氧化酶微丸的制备方法，包括以下步骤：
(1)将葡萄糖氧化酶、微晶纤维素、硬脂酸和木薯粉搅拌混合均匀，得到 混合干料；
(2)将棕榈油和水依次加入聚丙烯酸树脂乳胶液中，边加边搅拌，直至混 合均匀，得到湿料，其中，聚丙烯酸树脂乳胶液、棕榈油和水的质量比为1～2:1～ 2:1～3；
(3)将步骤(1)的混合干料和步骤(2)的湿料混合均匀；
(4)步骤(3)混匀的物料经湿法制粒，得到湿微丸颗粒；
(5)湿微丸颗粒经滚圆、烘干、过筛，得到所述耐高温葡萄糖氧化酶微丸。
本发明采用固体分散技术，将葡萄糖氧化酶均匀分散在原料载体中，干湿 料分开配制并湿法造粒，不仅避免了葡萄糖氧化酶在微丸制备过程中因环境条 件造成的失活，同时提高了酶的耐高温性及释放度。与利用基因工程提高葡萄 糖氧化酶的耐高温性能的方法相比，本发明的制备工艺简单，性价比高，适于 大规模生产，且制备的产品中葡萄糖氧化酶的酶活高，耐高温性强。
进一步地，所述步骤(1)中，葡萄糖氧化酶的酶活≥5000U/g，以确保最终 微丸产品中葡萄糖氧化酶的酶活≥1000U/g。
进一步地，所述步骤(2)中，聚丙烯酸树脂乳胶液、棕榈油和水的质量比 为1:1:1。
进一步地，所述步骤(4)中，采用摇摆制粒机制粒，制粒过程中控制物料 温度在60℃以下，最终制备得到的葡萄糖氧化酶微丸利用体积浓度为80％的甘 油水溶液作为溶剂，在85℃热处理5min的条件下，葡萄糖氧化酶的酶活保留 率≥70％，水分含量≤10.0％。
摇摆制粒机价格便宜，使用普遍，适用范围广，所生产的颗粒均匀，在制 备耐高温葡萄糖氧化酶上具有一定优势。摇摆制粒机通过机械传动使滚筒往复 摆动，将物料从筛网中挤出制成颗粒，只要更换不同目数的筛网就制成粗细不 同的颗粒，滚筒不需拆卸，筛网容易拆卸且很轻。摇摆制粒机需清洁的部件仅 有制粒腔部分，清洗十分方便。摇摆制粒机操作方便，控制简单，使用寿命长。 不足之处在于摇摆制粒机得到的条状颗粒输送，细粉较多，用于挤出滚圆工艺 收率不高，同时由于葡萄糖氧化酶本身的热不稳定性以及和辅料形成混合湿料 的粘度较高，在挤压过筛制粒过程中产生较多热量，所以在制粒过程中需要将物料温度控制在60℃以下，以降低酶活损失。
进一步地，所述步骤(4)中，采用旋压制粒机制粒，制粒过程中控制物料 温度≤40℃。由于葡萄糖氧化酶和辅料形成混合湿料的粘度较高，在挤压过筛制 粒过程中产生较多热量，本发明在制粒过程中控制物料温度≤40℃，最终制备得 到的葡萄糖氧化酶微丸利用体积浓度为80％的甘油水溶液作为溶剂，在90℃热 处理5min的条件下，葡萄糖氧化酶的酶活保留率≥70％，水分含量≤8.0％。在原 料及配方相同的情况下，相较于摇摆制粒工艺，采用旋压挤出制粒工艺大大降 低了降低酶活损失，得到的产品密度高，并具有温升低、产量大、产品释放度 好、耐高温性能高等优点。
本发明还提供了上述的耐高温葡萄糖氧化酶微丸在饲料添加剂中的应用。 本发明制备的葡萄糖氧化酶微丸具有良好的耐热性能、耐酸性能、释放性能和 稳定性。此外，本发明的葡萄糖氧化酶微丸还具有以下功能：1)消除肠道病原 菌生存环境，减少致病菌感染，可替代部分抗生素；2)预防和缓解多种霉菌毒 素中毒；3)保持肠道菌群生态平衡，提高机体免疫力；4)保护肠道上皮细胞 完整，控制球虫爆发；5)改善胃肠道酸性消化环境，促进动物消化吸收；6) 保证饲料的品质。因此，本发明的耐高温葡萄糖氧化酶微丸可作为饲料添加剂 应用在饲料中。
本发明还提供了一种含有上述的耐高温葡萄糖氧化酶微丸的饲料，进一步 地，所述饲料中葡萄糖氧化酶微丸的添加量为80～120g/t。
为提高耐高温葡萄糖氧化酶微丸的使用效果，饲料中葡萄糖氧化酶微丸的 使用量可根据不同的动物种类及其生长阶段进行调整，比如，乳仔猪饲料中葡 萄糖氧化酶微丸的添加量为80～100g/t，乳仔猪饲料中葡萄糖氧化酶微丸的添加 量为80～100g/t，生长猪饲料中葡萄糖氧化酶微丸的添加量为100～120g/t，肉鸡 饲料中葡萄糖氧化酶微丸的添加量为80～100g/t，蛋鸡饲料中葡萄糖氧化酶微丸 的添加量为100～120g/t，其他动物饲料中葡萄糖氧化酶微丸的添加量为 80～120g/t。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明的耐高温葡萄糖氧化酶微丸耐热性能良好，利用体积浓度为 80％的甘油水溶液作为溶剂，在85℃热处理5min的条件下，酶活保留率仍能 达到70％以上。
(2)本发明的耐高温葡萄糖氧化酶微丸耐酸性能优越，在37℃，pH2.0或 pH3.0处理1小时后，酶活保留率仍能达到90％以上。
(3)本发明的耐高温葡萄糖氧化酶微丸释放度好，在37℃，1小时释放度 ≥85％，既达到了缓释的效果又能较充分的释放。
(4)本发明的耐高温葡萄糖氧化酶微丸稳定性好，在25℃常温保存12个 月，酶活损失约为3％～5％。
(5)本发明的耐高温葡萄糖氧化酶微丸添加到饲料中，可不同程度提高动 物的采食量和日增重，降低料肉比，提高饲料利用效率。
附图说明
图1为实施例1的耐高温葡萄糖氧化酶微丸的生产工艺流程图。
图2为实施例2的耐高温葡萄糖氧化酶微丸的生产工艺流程图。
图3为实施例1的耐高温葡萄糖氧化酶对体外pH环境变化影响。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对 本发明进一步说明。本领域技术人员应当理解，此处所描述的具体实施例仅用 以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例中，所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、 试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
现对本发明所用的原料做如下说明：
以下实施例选用的聚丙烯酸树脂乳胶液的含量为28.0～30.0％，pH为 1.0～3.0，酸值为230～270mg KOH/g，特性粘度为140～400dL/g。
所述聚丙烯酸树脂乳胶液的固体含量的测定方法参照GB6435-86，pH的测 定方法参照《中国药典2015版第四部通则0631》，酸值的测定采用甘油法在 80℃进行，特性粘度的测定方法参照《中国药典2015版第四部通则0633》。
对本发明的葡萄糖氧化酶活力的具体测定方法做如下说明：
在pH5.5、温度37℃的条件下，每分钟把1.0μmol的β-D-葡萄糖氧化成D- 葡萄糖酸和H2O2所需的酶量为一个酶活单位(U)。
1.原理
在葡萄糖氧化酶的作用下，葡萄糖和氧反应，生成葡萄糖酸和过氧化氢， 过氧化氢和无色的还原型邻联茴香胺在过氧化物酶的作用下，生成水和红色的 氧化型邻联茴香胺。
2.酶活力
在pH5.5、温度37℃的条件下，每分钟能催化1.0μmol的β-D-葡萄糖氧化 转化成D-葡萄糖酸和H2O2所需的酶量为一个单位。
3.试剂和溶液
3.1乙酸溶液，浓度C(CH3COOH)为0.1mol/L
吸取冰乙酸0.60mL，加水溶解，定容至100mL。
3.2乙酸钠溶液，浓度C(CH3COONa)为0.1mol/L
称取三水乙酸钠1.36g，加水溶解，定容至100mL。
3.3乙酸-乙酸钠缓冲溶液(CH3COOH-CH3COONa)为0.1mol/L，pH＝5.50
称取三水乙酸钠23.14g，加入冰乙酸1.70mL，再加水溶解，定容至2000m。 测定溶液的pH值。如果pH值偏离5.50，再用乙酸溶液或乙酸钠溶液调节至5.50。
3.4邻联茴香胺甲醇缓冲液
称取1g邻联茴香胺加在100mL甲醇中搅拌溶解备用，低温避光密封保存， 临用时现配。取0.1mL加入到上述缓冲液12mL中混匀。
3.5 180g/L葡萄糖水溶液
称取18g无水葡萄糖加在50mL蒸馏水中搅拌溶解，定容到100ml。
3.6辣根过氧化物酶溶液(90U/ml)
用万分之一天平称取5mg辣根过氧化物酶，加缓冲液稀释到酶活为90U/ml。 4℃避光保存，有效期为3天。
3.7硫酸(2mol/L)
准确称取98％浓硫酸200g或者量取108.7ml，加入预先装有约500ml水的 烧杯，冷却到室温，定容到1000ml。
3.8葡萄糖氧化酶标准品
4.仪器设备
4.1分光光度计：有10mm的比色皿，可在540nm下测定吸光度；
4.2恒温水浴锅：37℃±0.1℃；
4.3秒表：精度1/10s；
4.4磁力搅拌器；
4.5酸度计：pH精确至0.01
4.5分析天平：感量0.1mg
4.6涡流式混合器；
5.分析步骤
5.1标准曲线
将葡萄糖氧化酶标准品分别稀释成0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4U/ml，在试 管中加入2.5ml邻联茴香胺甲醇缓冲液，加入0.3mL葡萄糖溶液和0.1ml辣根过 氧物酶溶液，37℃保温5min，加入稀释好的葡萄糖氧化酶标准品，反应3min 后加入2ml的2mol/L硫酸终止反应，在540nm下测定反应液吸光值。见表1。
表1
GOD标准品酶活(U/ml) 0 0.4 0.8 1.2 1.6 2 2.4
领联茴香胺溶液(ml) 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5
18％葡萄糖溶液(ml) 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3
辣根过氧化物酶溶液(ml) 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
GOD标准品(ml) 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
2mol/ml硫酸(ml) 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0
*由于反应时间过短，也可临反应时先将邻联茴香胺甲醇缓冲液、葡萄糖溶 液和0.1ml辣根过氧物酶溶液三种溶液预热到37℃，混合均匀，再将混合溶液 一起加入试管中反应。(注意应尽量缩短三种溶液混合时间，不可超过10min)
5.2根据葡萄糖氧化酶标准品实验结果，以葡萄糖氧化酶标准品酶活力为纵 坐标，以OD540的吸光值为横坐标，做酶活力标准曲线y＝A×OD+B。
5.3空白：在一试管中加入2.5ml邻联茴香胺甲醇缓冲液，加入0.3mL葡萄 糖溶液和0.1ml辣根过氧物酶溶液，37℃保温5min，加入2ml的2mol/L硫酸。 加入稀释好的葡萄糖氧化酶样品0.1ml，在540nm下调零。
5.4样品：将酶活稀释到1.0-2.0U/ml备用。取两支洁净试管，在试管中加 入2.5ml邻联茴香胺甲醇缓冲液，加入0.3mL葡萄糖溶液和0.1ml辣根过氧物酶 溶液，37℃保温5min，加入0.1ml稀释好的葡萄糖氧化酶样品，反应3min后 加入2ml的2mol/L硫酸终止反应，在540nm下测定反应液吸光值。
6.计算
酶活力X1(U/mL)按(1)式计算：
葡萄糖氧化酶酶活性(U/ml)＝(A×OD+B)×N……………………………(1)
式子中
A：标准曲线的斜率；
B：标准曲线的截距；
N：稀释倍数；
OD：OD540吸光值，吸光值范围在为0.3～0.5。
实施例1
一种耐高温葡萄糖氧化酶微丸的制备方法，如图1所示，包括以下步骤：
(1)称量配干料：利用天平或称重显示器精确称量葡萄糖氧化酶30kg、微 晶纤维素10kg、硬脂酸10kg和木薯粉20kg，葡萄糖氧化酶的酶活为5000U/g；
(2)干法混合：通过搅拌器搅拌步骤(1)的原辅料干粉，并将此混合物 料放入槽型混合机中继续搅拌直至混合均匀，待用；
(3)称量配湿料：利用天平或称重显示器精确称量聚丙烯酸树酯乳胶液 10kg，然后将棕榈油10kg和水10kg依次加入，边加边搅拌直至混合均匀，待 用；
(4)湿法混合：将步骤(3)混合均匀的湿料加入已放入干料的槽型混合 机中混匀；
(5)湿法制粒：将步骤(4)混匀的物料放入带冷却功能旋压制粒机中制 粒，且制粒过程中控制物料温度≤40℃；
(6)滚圆和烘干：湿微丸放入滚圆机滚圆，再放入烘干机烘干直至水分含 量≤8.0％；
(7)过筛收丸：过筛、收集粒径大小在18-50目之间的微丸，且18目筛下 物＜5.0％，用防水包装袋包装保存。
经测定，本实施例制备得到的耐高温葡萄糖氧化酶的酶活≥1000U/g。
实施例2
一种耐高温葡萄糖氧化酶微丸的制备方法，如图2所示，包括以下步骤：
(1)称量配干料：利用天平或称重显示器精确称量葡萄糖氧化酶30kg、微 晶纤维素10kg、硬脂酸10kg和木薯粉20kg，葡萄糖氧化酶的酶活为5000U/g；
(2)干法混合：通过搅拌器搅拌步骤(1)的原辅料干粉，并将此混合物 料放入槽型混合机中继续搅拌直至混合均匀，待用；
(3)称量配湿料：利用天平或称重显示器精确称量聚丙烯酸树酯乳胶液 10kg，然后将棕榈油10kg和水10kg依次加入，边加边搅拌直至混合均匀，待 用；
(4)湿法混合：将步骤(3)混合均匀的湿料加入已放入干料的槽型混合 机中混匀；
(5)湿法制粒：将步骤(4)混匀的物料放入摇摆制粒机中制粒，制粒过 程中控制物料温度在40℃～50℃之间；
(6)滚圆和烘干：湿微丸放入滚圆机滚圆，再放入烘干机烘干直至水分含 量≤10.0％；
(7)过筛收丸：过筛、收集粒径大小在18-50目之间的微丸，且18目筛下 物＜5.0％，用防水包装袋包装保存。
经测定，本实施例制备得到的耐高温葡萄糖氧化酶的酶活≥1000U/g。
实施例3
一种耐高温葡萄糖氧化酶微丸的制备方法，如图2所示，包括以下步骤：
(1)称量配干料：利用天平或称重显示器精确称量葡萄糖氧化酶20kg、微 晶纤维素20kg、硬脂酸30kg和木薯粉30kg，葡萄糖氧化酶的酶活为5000U/g；
(2)干法混合：通过搅拌器搅拌步骤(1)的原辅料干粉，并将此混合物 料放入槽型混合机中继续搅拌直至混合均匀，待用；
(3)称量配湿料：利用天平或称重显示器精确称量聚丙烯酸树酯乳胶液 20kg，然后将棕榈油20kg和水10kg依次加入，边加边搅拌直至混合均匀，待 用；
(4)湿法混合：将步骤(3)混合均匀的湿料加入已放入干料的槽型混合 机中混匀；
(5)湿法制粒：将步骤(4)混匀的物料放入摇摆制粒机中制粒，制粒过 程中控制物料温度在40℃～50℃之间；
(6)滚圆和烘干：湿微丸放入滚圆机滚圆，再放入烘干机烘干直至水分含 量≤10.0％；
(7)过筛收丸：过筛、收集粒径大小在18-50目之间的微丸，且18目筛下 物＜5.0％，用防水包装袋包装保存。
经测定，本实施例制备得到的耐高温葡萄糖氧化酶的酶活≥1000U/g。
实施例4
一种耐高温葡萄糖氧化酶微丸的制备方法，如图2所示，包括以下步骤：
(1)称量配干料：利用天平或称重显示器精确称量葡萄糖氧化酶40kg、微 晶纤维素10kg、硬脂酸10kg和木薯粉40kg，葡萄糖氧化酶的酶活为5000U/g；
(2)干法混合：通过搅拌器搅拌步骤(1)的原辅料干粉，并将此混合物 料放入槽型混合机中继续搅拌直至混合均匀，待用；
(3)称量配湿料：利用天平或称重显示器精确称量聚丙烯酸树酯乳胶液 10kg，然后将棕榈油10kg和水30kg依次加入，边加边搅拌直至混合均匀，待 用；
(4)湿法混合：将步骤(3)混合均匀的湿料加入已放入干料的槽型混合 机中混匀；
(5)湿法制粒：将步骤(4)混匀的物料放入摇摆制粒机中制粒，制粒过 程中控制物料温度在40℃～50℃之间；
(6)滚圆和烘干：湿微丸放入滚圆机滚圆，再放入烘干机烘干直至水分含 量≤10.0％；
(7)过筛收丸：过筛、收集粒径大小在18-50目之间的微丸，且18目筛下 物＜5.0％，用防水包装袋包装保存。
经测定，本实施例制备得到的耐高温葡萄糖氧化酶的酶活≥1000U/g。
对比例1
市购获得的未经载体处理的葡萄糖氧化酶粉剂，且葡萄糖氧化酶的酶活为5000U/g。
(一)检测葡萄糖氧化酶的耐热性能
本发明选用体积浓度为80％的甘油水溶液作为检测葡萄糖氧化酶的溶剂， 其原理为：
(1)80％甘油溶剂保持热稳定剂的作用：酶制剂在高温下失活，但酶制剂 的固体分散体系中的热稳定剂不溶解，从而体现其对酶的热保护能力；
(2)80％甘油溶剂模拟饲料调质过程：调质过程中含量20％左右水蒸气的 环境，使热处理过程更接近真实饲料厂制粒情况，以致检测结果更接近真实值。
利用体积浓度为80％的甘油水溶液作为溶剂分别检测实施例1-4的葡萄糖 氧化酶微丸以及对比例1的普通葡萄糖氧化酶的耐热性能的方法，具体包括以 下步骤：
1)测定未经热处理的葡萄糖氧化酶酶活，步骤如下：
1.1)分别称取葡萄糖氧化酶样品1.25g于两个150ml具塞锥形瓶中，做平 行样；
1.2)在两个锥形瓶中加入体积浓度为80％的甘油水溶液5ml；
1.3)再加入94ml乙酸-乙酸钠缓冲液(pH5.5)，磁力搅拌4小时，直至将 微丸颗粒完全粉碎成粉末；
1.4)测定其平均酶活值A；
2)测定热处理过的葡萄糖氧化酶酶活，步骤如下：
2.1)分别称取葡萄糖氧化酶样品1.25g于两个150ml具塞锥形瓶中，做平 行样；
2.2)两个锥形瓶中分别加入体积浓度为80％的甘油水溶液5ml，不需震荡， 立即放入分别预热到70℃、80℃、85℃和90℃，水浴锅中处理5min；
2.3)取出锥形瓶后立刻将其至于冰水中冷却1分钟；
2.4)再加入94ml乙酸-乙酸钠缓冲液(pH5.5)，磁力搅拌4小时，直至将 微丸颗粒完全粉碎成粉末；
2.5)测定其平均酶活值B。
3)计算葡萄糖氧化酶耐热性能，步骤如下：
步骤1)和步骤2)所得热处理前后平均酶活百分比，即B/A×100％，为热 处理后的相对酶活或酶活保留率。
实施例1-4的耐高温葡萄糖氧化酶微丸以及对比例1的耐高温葡萄糖氧化酶 分别在70℃、80℃、85℃和90℃热处理5分钟后的相对酶活或酶活保留率的 结果如表2所示。其中，实施例1的耐高温葡萄糖氧化酶微丸在90℃、热处理 5分钟的条件下，其酶活保留率仍能达到72.6％，耐热性能较好。
表2葡萄糖氧化酶在70℃、80℃、85℃和90℃热处理5分钟后的相对酶活
Figure BDA0002612309600000121
Figure BDA0002612309600000131
(二)检测耐高温葡萄糖氧化酶的耐酸性能
分别对实施例1的葡萄糖氧化酶微丸以及对比例1的普通葡萄糖氧化酶的 耐酸性能进行测定，检测方法包括以下步骤：
1)测定未经酸处理的葡萄糖氧化酶酶活，步骤如下：
1.1)分别称取葡萄糖氧化酶样品1.25g于两个250ml具塞锥形瓶中，做平 行样；
1.2)加入99ml乙酸-乙酸钠缓冲液(pH5.5)，磁性搅拌至将微丸颗粒完全 粉碎成粉末；
1.3)测定其平均酶活值A。
2)测定酸处理过的葡萄糖氧化酶酶活，步骤如下：
2.1)分别称取葡萄糖氧化酶样品1.25g于两个小尼龙袋(400目)中，密封 尼龙袋，做平行样，
2.2)分别放入加有99ml乙酸-乙酸钠缓冲液(pH2.0或pH3.0)的两个250ml 具塞锥形瓶中，置恒温(37℃)水浴摇床中，摇摆(140rpm/min)1小时后， 取出两个尼龙袋；
2.3)用99ml乙酸-乙酸钠缓冲液(pH5.5)分别将尼龙袋里的样品洗入到两 个250ml具塞锥形瓶中，磁力搅拌至颗粒完全粉碎成粉末；
2.4)测定其平均酶活值B。
3)计算葡萄糖氧化酶耐酸性能，步骤如下：
步骤1)和步骤2)所得酸处理前后平均酶活百分比，即B/A×100％，为酸 处理后的相对酶活或酶活保留率。
实施例1的葡萄糖氧化酶微丸以及对比例1的普通葡萄糖氧化酶的(1小时) 耐酸性能测定结果如表3所示。对比例1的普通葡萄糖氧化酶在pH2.0时，完 全失活；pH3.0时，酶活保留率不到40％。实施例1的耐高温葡萄糖氧化酶微丸 在37℃，pH2.0或pH3.0处理1小时的条件下，酶活保留率仍能达到90％以上。 由此表明，本发明将粉状普通葡萄糖氧化酶以微晶形态，分散在高分子载体聚 丙烯酸树脂中形成的原料-载体的固体分散体系，不仅可以层层隔绝高温水蒸气， 而且也能抵抗酸性液体的侵蚀，从而起到保护酶制剂作用。
表3葡萄糖氧化酶的耐酸性能测定结果
样品 实施例1 对比例1
pH2.0，相对酶活或保留率(％) 90.4 0
pH3.0，相对酶活或保留率(％) 94.6 37.8
(三)检测耐高温葡萄糖氧化酶的释放性能
分别对实施例1-4的葡萄糖氧化酶微丸的释放性能进行测定，检测方法包括 以下步骤：
1)(完全)释放酶活：分别称取1.25g葡萄糖氧化酶微丸于两个150ml锥形 瓶中，做平行样；加入99ml乙酸-乙酸钠缓冲液(pH5.5)，磁力搅拌至完全溶解； 测定其平均酶活值A；
2)(1小时)释放酶活：分别称取1.00g葡萄糖氧化酶于两个150ml锥形瓶 中，做平行样；加入99ml乙酸-乙酸钠缓冲液(pH5.5)，置于恒温(37℃)水 浴摇床中，摇摆(140rpm/min)1小时，测定其平均酶活值B；
3)计算释放性能：步骤1)和步骤2)所得前后平均酶活百分比，即 B/A×100％，为(1小时)释放度。
高分子载体与葡萄糖氧化酶形成的致密的固体分散体系虽然可以层层隔绝 高温水蒸气和酸性液体从而起到保护酶制剂作用，但是分散体系的致密度要恰 当好处，避免包裹得过于密实而影响葡萄糖氧化酶的生物释放。实施例1-4的葡 萄糖氧化酶微丸的(1小时)释放度结果如表4所示。实施例1的耐高温葡萄糖 氧化酶微丸在37℃条件下，(1小时)释放度能达到92.3％以上，实施例2-4的 耐高温葡萄糖氧化酶微丸在37℃条件下，(1小时)释放度也能达到85％以上， 既达到了缓释的效果又能较充分的释放。
表4葡萄糖氧化酶微丸在37℃条件下，(1小时)释放度
实施例1 实施例2 实施例3 实施例4
释放度(％) 92.3 88.2 85.4 86.8
标准偏差 1.9 1.5 2.1 1.7
(四)检测耐高温葡萄糖氧化酶的稳定性
对实施例1-2的葡萄糖氧化酶微丸在常温保存12个月后酶活损失进行测定， 检测方法包括以下步骤：
1)第0个月(新鲜制备)酶活：分别称取1.25g新鲜制备的葡萄糖氧化酶 微丸于两个150ml锥形瓶中，做平行样；加入99ml乙酸-乙酸钠缓冲液(pH5.5)， 磁力搅拌至完全溶解，测定其平均酶活值A；
2)第12个月(常温保存)酶活：分别称取1.25g步骤1)中常温保存一年 后的葡萄糖氧化酶微丸于两个150ml锥形瓶中，做平行样；加入99ml乙酸-乙 酸钠缓冲液(pH5.5)，磁力搅拌至完全溶解，测定其平均酶活值B；
3)计算酶活损失，即(A-B)/A×100％。
实施例1的葡萄糖氧化酶微丸在25℃常温保存12个月，酶活损失如表5 所示，实施例1的葡萄糖氧化酶微丸的酶活损失为3％～5％。
表5实施例1的葡萄糖氧化酶微丸的酶活损失
Figure BDA0002612309600000151
实施例2的葡萄糖氧化酶微丸在25℃常温保存12个月，酶活损失如表6 所示，实施例2的葡萄糖氧化酶微丸的酶活损失为3％～5％。
表6实施例2的葡萄糖氧化酶微丸的酶活损失
Figure BDA0002612309600000152
可见，本发明制备的葡萄糖氧化酶微丸产品稳定性好，可常温下贮存，保 质期1年。
(五)体外pH环境变化实验
在100ml 5％的葡萄糖溶液中添加100U的实施例1制备的葡萄糖氧化酶， 37℃震荡反应1小时后，结果如图3所示，葡萄糖溶液pH值从6.8降到5.2，2 小时后降为4.8。表明本发明的耐高温葡萄糖氧化酶可快速氧化葡萄糖生产葡萄 糖酸，降低消化道pH值。
(六)动物试验效果
肉猪应用效果试验
空白组的肉猪饲料不添加葡萄糖氧化酶，试验组1和2的肉猪饲料分别按 80、100g/t的比例添加实施例2的耐高温葡萄糖氧化酶微丸。由表7结果可知， 日粮中添加耐高温葡萄糖氧化酶微丸可提高肉猪采食量和日增重，其中添加 80g/t试验组1的日增重提高3.31％；添加100g/t的试验组2采食量比空白组的 提高7.24％。随着耐高温葡萄糖氧化酶添加量的增加，采食量提高幅度有增大的 趋势。试验表明，日粮中分别添加不同量的耐高温葡萄糖氧化酶可不同程度提 高肉猪的采食量和日增重，降低料肉比，提高饲料利用效率。
表7中猪阶段生长性能
添加量(g/t) 日增重(g/头) 日采食(kg/头) 料肉比
空白组 —— 736.4 1.90 2.58
试验组1 80 760.8 1.94 2.55
试验组2 100 789.7 1.99 2.52
肉鸡应用效果试验
空白组的肉鸡饲料不添加葡萄糖氧化酶，试验组1和2的肉鸡饲料分别按 60、100g/t的比例添加实施例2的耐高温葡萄糖氧化酶微丸。由表8结果可知， 日粮中添加耐高温葡萄糖氧化酶可提高肉鸡采食量和日增重，其中添加60g/t试 验组的日增重提高2.34％；添加100g/t的试验组采食量比空白组提高5.27％。随 着耐高温葡萄糖氧化酶添加量的增加，采食量提高幅度有增大的趋势。试验表 明，日粮中分别添加不同量的耐高温葡萄糖氧化酶可不同程度提高肉鸡的采食 量和日增重，降低料肉比，提高饲料利用效率。
表8肉鸡全期(1-42日龄)生长性能(均只)
添加量(g/t) 日增重(g) 日采食(g) 料肉比
空白组 —— 51.2 85.4 1.67
试验组1 60 52.4 85.9 1.64
试验组2 100 53.9 86.1 1.60
由上述结果可知，本发明采用固体分散技术，以葡萄糖氧化酶为原料，以 微晶纤维素、硬脂酸、木薯粉、聚丙烯酸树脂乳胶液、棕榈油等为原料载体， 能够显著提高葡萄糖氧化酶的耐高温性能。此外，相较于摇摆制粒工艺，采用 旋压挤出制粒工艺大大降低了降低酶活损失，得到的微丸产品的耐高温性和产 品释放度更好。将本发明制备得到的葡萄糖氧化酶微丸添加到动物饲料中，可 不同程度提高动物的采食量和日增重，降低料肉比，提高饲料利用效率。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本 发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的 普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而 不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.一种耐高温葡萄糖氧化酶微丸，其特征在于，包括葡萄糖氧化酶、微晶纤维素、硬脂酸、木薯粉、聚丙烯酸树脂乳胶液和棕榈油，所述葡萄糖氧化酶的酶活≥1000U/g，所述葡萄糖氧化酶、微晶纤维素、硬脂酸、木薯粉、聚丙烯酸树脂乳胶液和棕榈油的质量比为2～4:1～2:1～3:2～4:1～2:1～2。
2.根据权利要求1所述的耐高温葡萄糖氧化酶微丸，其特征在于，所述葡萄糖氧化酶、微晶纤维素、硬脂酸、木薯粉、聚丙烯酸树脂乳胶液和棕榈油的质量比为3:1:1:2:1:1；所述聚丙烯酸树脂乳胶液优选为肠溶型聚丙烯酸树脂乳胶液。
3.根据权利要求1所述的耐高温葡萄糖氧化酶微丸，其特征在于，所述葡萄糖氧化酶微丸的水分含量≤10.0％，葡萄糖氧化酶微丸的粒径大小为18～50目占95％以上，且葡萄糖氧化酶微丸利用体积浓度为80％的甘油水溶液作为溶剂，在85℃热处理5min的条件下，葡萄糖氧化酶的酶活保留率≥70％。
4.权利要求1-3任一项所述耐高温葡萄糖氧化酶微丸的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将葡萄糖氧化酶、微晶纤维素、硬脂酸和木薯粉搅拌混合均匀，得到混合干料；
(2)将棕榈油和水依次加入聚丙烯酸树脂乳胶液中，边加边搅拌，直至混合均匀，得到湿料，其中，聚丙烯酸树脂乳胶液、棕榈油和水的质量比为1～2:1～2:1～3，优选为1:1:1；
(3)将步骤(1)的混合干料和步骤(2)的湿料混合均匀；
(4)步骤(3)混匀的物料经湿法制粒，得到湿微丸颗粒；
(5)湿微丸颗粒经滚圆、烘干、过筛，得到所述耐高温葡萄糖氧化酶微丸。
5.根据权利要求4所述的耐高温葡萄糖氧化酶微丸的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，葡萄糖氧化酶的酶活≥5000U/g。
6.根据权利要求4所述的耐高温葡萄糖氧化酶微丸的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中，采用摇摆制粒机制粒，制粒过程中控制物料温度在60℃以下，通过调节筛网的大小控制微丸颗粒的大小。
7.根据权利要求4所述的耐高温葡萄糖氧化酶微丸的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中，采用带冷却功能的旋压制粒机制粒，制粒过程中控制物料温度≤40℃，通过调节筛网的大小控制微丸颗粒的大小。
8.权利要求1-3任一项所述的耐高温葡萄糖氧化酶微丸在饲料添加剂中的应用。
9.含有权利要求1-3任一项所述的耐高温葡萄糖氧化酶微丸的饲料。
10.根据权利要求9所述的饲料，其特征在于，所述饲料中葡萄糖氧化酶微丸的添加量为80～120g/t。
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