CN107190000B - 耐高温植酸酶凝胶制剂 - Google Patents

Abstract

本发明属高分子材料技术领域，公开了一种耐高温植酸酶凝胶制剂及其制备方法。本发明用原位包埋法制得植酸酶凝胶制剂，方法如下：在改性淀粉溶液中依次加入植酸酶和交联剂，加入后混合均匀，室温下使其充分反应，得到载有植酸酶的水凝胶。将水凝胶经过切粒、干燥后，即可得到酸酶凝胶制剂。制备方法简便快速、反应条件温和，对植酸酶无伤害、酸酶负载量高、用率高，载体原料安全无毒、可生物降解、原料组成少、价格低廉、植酸酶凝胶制剂可加工成片、颗粒和微球，能满足不同领域应用的需要，有利于植酸酶的工业化生产和应用。

Description

耐高温植酸酶凝胶制剂

技术领域

本发明涉及高分子材料技术领域，涉及植酸酶凝胶制剂，尤其涉及耐

高温植酸酶凝胶制剂。

背景技术

我国是世界玉米种植大国，70％的玉米用于生产饲料。玉米中50％～80％的磷以植酸形式存在，但这种形式的磷不能被猪禽等单胃动物消化利用，随动物粪便排泄后还会严重污染环境。植酸酶是催化植酸及其盐类水解为肌醇与磷酸(盐)的一类酶的总称，可以降解饲料中含量丰富的植酸，不但可以释放出有利于动物生长发育的无机磷，同时也可以释放出与植酸结合的其它营养物质，有利于猪禽等单胃动物更好地吸收利用，降低饲料成本，减少动物粪便中磷的排泄量，减轻环境污染。因此，植酸酶是目前应用较多且前景较好的一种绿色饲料添加剂。植酸酶在应用中存在的主要问题是植酸酶的耐热性欠佳，在存放时以及饲料加工过程中造成酶活性降低甚至失活，造成酶的浪费以及使用成本的提高。在中国，颗粒饲料约占饲料总产量的70％,市场需求量巨大。通常，饲料的生产需要经过高温制粒过程，一般为75℃一80℃，植酸酶在这样的温度下很容易失去部分活力，甚至完全失活。所以获得高热稳定性的植酸酶是近年来植酸酶工业的研究热点和难点。目前，获得耐高温植酸酶可以有以下几种方法：(1)改变植酸酶的分子结构，用化学方法将植酸酶分子用糖基修饰，能在一定程度上提高植酸酶的耐热性。(2)利用生物技术和基因定点突变技术，培育新的植酸酶菌株。利用化学或生物学方法获得新的植酸酶品种，可以从根本上上提高植酸酶耐高温性能，并且取得了一些研究成果，如CN10659256A、CN106434850A、CN10638890A、106323964A、CN106260584A、CN10601102A、CN10601101A、CN10601000A、CN106119223A.。但是由于植酸酶的耐热机理仍不清楚，因此，植酸酶新品种的开发尚缺乏理论依据。另外，植酸酶新品种的开发具有投入大，时间长、筛选困难、风险高的弊端，不适合中国的国情，而且开发出的新品种由于工艺不成熟，很容易受到工艺条件的影响，产生变异，导致酶产品性能不稳定，难以大规模工业化生产。

酶的固定化是改善酶性能的另一种方法，它是用化学或物理方法将酶固定在载体上，改变酶的周围环境，以降低温度对酶的影响，提高耐热性能。与开发植酸酶的新品种相比，固定化酶具有以下优点：(1)可以采用传统的方法生产酶产品，工艺成熟，产品性能稳定，有利于实现工业化生产。另外，固定化的酶，不仅能克服自由酶的缺点，还能保留自由酶原有的活性，而且还易于与其它组份分离，重复使用率高。此外，选择组成不同的载体，还可以赋予酶载体部分所具有的独特性能。因此，固定化酶技术自20世纪60年代发展以来，已经成为国内外的研究热点，是酶工业的核心内容之一(《中国甜菜糖业》，2007(1)，29-32)。)。

酶的固定化载体包括无机材料和有机高分子材料。CN106333084A将植酸酶固定在膨润土上，以期减少高温造粒对植酸酶的影响。周建琴(《中国酿造》，2012,31(9)，110-114.)以聚乙烯醇为原料，以戊二醛为交联剂，得到交联球型聚乙烯醇，经与环氧氯丙烷反应得到固定化载体，用吸附法将植酸酶固定在载体上。王成波(《黑龙江农业科学》2014,14,5,99-102.)以壳聚糖为原料，以戊二醛为交联剂，制得固定化载体，用吸附法将植酸酶固定在载体上。有机高分子材料原料种类多，合成方法多样，并且有机高分子材料强度小，易于加工成型。因此固定化酶越来越多地使用有机高分子材料作为载体。

廖妙飞(重庆大学硕士学位论文)以壳聚糖为原料，以戊二醛为交联剂，以碳酸钙为致孔剂，用反相悬浮法制备出交联壳聚糖；以二环己基碳二亚胺为缩合剂制备交联壳聚糖-赖氨酸树脂，然后用吸附法将植酸酶固定在载体上。固定化酶的最适pH范围是5.5-6.5，最适温度范围35-45℃。唐三三(食品工业科技，2010(9)，1-4.))以海藻酸钠、明胶、琼脂、卡拉胶、壳聚糖为原料，采用琼脂包埋法制备固定化奶酪氨酸酶，固定化酶的性能得到明显改善。

由于载体的原料和制备方法不同，酶的固定化过程通常有两种方法。一种是吸附法，由于载体的制备条件复杂，反应慢，需要高温加热，为了避免破坏酶的活性，一般先通过一系列反应制备出固体载体，然后再将固体载体浸入到酶液中，将植酸酶吸附在载体上。第二种方法是包埋法。包埋法是将载体的原料或中间体配成溶液，和植酸酶混合在一起，在载体固化的同时，将植酸分子包埋在载体中。吸附法的特点是载体的制备与酶的固定化过程分别进行，对载体的原料和制备方法选择范围广，不必担心在载体制备过程中，酶的活性遭到破坏。吸附法的缺点是酶的吸附速度慢，由于受到浓度梯度的影响，酶的吸附量小，且大多数酶只吸附在载体表面，提高温度或延长吸附时间又容易造成酶的失活和浪费。吸附在载体表面的酶在贮存和加工过程中容易脱落，结果使固定化酶的有效含量降低，使用时需要增大固定化酶的用量才能达到有效浓度，实际上增加了酶的使用成本，造成酶的浪费，不利于植酸酶的推广应用。而包埋法在载体固化的同时就将植酸酶包裹在其中，因此，原位包埋法的最大优点是将酶包裹在载体内部，不易脱落，并且酶的载有量增加，能大大有效提高植酸酶和载体的利用率，是固定化植酸酶理想的方法。但是原位包埋法的特点是载体的制备和酶的固定化过程同时进行，在载体制备过程中，酶的活性遭到破坏，因此，对载体的原料选择和制备方法有较高的要求。

文献报道了以可溶性大分子藻酸钠、明胶、琼脂、卡拉胶、壳聚糖等作为固定化载体材料，将其植酸溶解在水中，不需要进一步反应，采用包埋法，直接干燥固化，就能得到固定化植酸酶。该方法以水溶性大分子为载体原料，为实现包埋法固定植酸酶创造了条件。但是这些大分子在水中的溶解性有限，不能完全溶解，因此，会造成植酸酶在固定化载体中分布不均匀，使用的时候会表现出性能不稳定。另外，虽然明胶、琼脂、卡拉胶等这些大分子都可以作为食品添加剂，但是，毕竟不是人和动物生长的必需物质，长期食用，势必会对人和动物的健康造成不良的影响。随着人们对酶的固定化载体的深入研究，以及人们对环境保护的重视，天然大分子在载体中的应用越来越引起人们的关注。天然大分子如纤维素、淀粉广泛存在于大自然中,是一种既价廉又取之不尽的可再生资源,它们安全无毒，可生物降解，具有良好的生物相容性、热稳定性和化学稳定性。因此,近年来天然多糖成为国内外研究最热门的固定化材料之一，但是天然多糖含有大量羟基，分子间作用力强，不溶于水，反应性差，难以加工成型，因此，限制了它们在很多领域的应用。目前,我国开展天然多糖在酶固定化载体材料中的应用还处于起步阶段,尤其是其实际的生产、应用基本上是空白。因此，开发出质优价廉耐高温的植酸酶制剂，促进它们在工业生产中的应用，是酶工业和食品工业的重要任务。

发明内容

本发明的目的在于提供一种安全无毒且耐高温植酸酶凝胶制剂，且合成简单、价格低廉。

考虑到醛基淀粉优良的溶解性以及活泼的反应活性，为实现本发明目的，本发明以醛基淀粉和交联剂为原料制备酶的固定化载体，同时将植酸酶包裹在其中。

所述耐高温植酸酶凝胶制剂通过如下方法制备而成：将醛基淀粉溶液和植酸酶溶于水中，混合均匀，加入植酸酶配成前体溶液。然后将交联剂溶液加到前体溶液中，室温下搅拌使各组分混合均匀。室温下静置，使其充分反应，即可得到果冻状载有植酸酶的水凝胶。将得到的水凝胶经过切粒、干燥，即可得到植酸酶凝胶制剂。可以将其制成片状和颗粒状或微球。

所述的醛基淀粉为：可溶性淀粉经氧化反应得到的醛基淀粉；

所述的醛基淀粉溶液为：将醛基淀粉溶于水形成的水溶液，其质量浓度优选5％-20％。

所述的交联剂为：赖氨酸、壳聚糖中的一种或两种。

所述的醛基淀粉与交联剂的摩尔数比优选1:2-8。

本发明创新点及优点在于：

(1)本发明的原料安全无毒，价廉易得，可生物降解。

(2)本发明选用醛基淀粉，克服了普通淀粉溶解性差、反应活性低的缺点。不仅增加了淀粉的水溶性，而且提高了淀粉的反应活性，为实现原位包埋法固定化植酸酶提供了技术支持。

(3)本发明原位包埋法固定化植酸酶，条件温和，反应快速，载体的制备和酶的固定化过程不无需加热和其它催化剂，反应快速，现象明显，反应过程容易控制。

(4)本发明的原料均能溶于水，植酸酶能溶解在固定化载体的前体溶液中，反应后得到不溶于水的果冻状水凝胶，反应前前体是透明的溶液，当醛基淀粉和交联剂反应发生交联反应后，整个体系变成成了一块不溶于水的固体凝胶，溶液中的所有物质包括水和植酸酶都被包埋在凝胶当中，酶几乎没有流失，能全部包埋在固定化载体中，酶的包埋效果好，且植酸酶在固定化载体中分布均匀，使用时制剂性能稳定，可以做到定量投料，避免造成酶和酶制剂的浪费，有利于酶制剂的工业化生产和应用。

(5)载体的制备过程可以和酶的固定化过程同时进行，在室温下反应快速，十几分钟即可完成，并且不会对酶造成破坏，真正实现原位包埋法制备植酸酶凝胶制剂。

(6)本发明利用改性醛基淀粉中的醛基和交联剂中的氨基反应形成亚胺基，这类化合物很稳定，并且通常有较好的耐热性，使得植酸酶被紧紧包埋在含亚胺基的凝胶载体内部，因此，植酸酶的耐热性得到明显的改善。在实际应用中，亚胺基团在酸性溶液中容易分解，产生原来的醛基化合物(即醛基淀粉)和氨基化合物(即赖氨酸)。本发明植酸酶凝胶制剂在酸性条件下(即在胃液中)固定化载体中亚胺基发生分解，凝胶制剂的交联结构发生解离，被包埋的植酸酶迅速游离出来，参与胃中食物的消化作用，使得植酸酶得到充分利用，而且产生的醛基淀粉和赖氨酸可以被动物消化吸收。

可以看出，本发明制备的植酸酶凝胶制剂，不仅能提高酶的耐热性，还具有在胃液中控制释放的特性，有利于动物健康。而且制备方法简便快速、反应条件温和，对植酸酶无伤害、酸酶负载量高，达50％以上，用率高，可达100％。载体原料安全无毒、可生物降解、原料组成少、价格低廉、植酸酶凝胶制剂可加工成片、颗粒和微球，能满足不同领域应用的需要，有利于植酸酶的工业化生产和应用。

附图说明

图1为本发明植酸酶凝胶制剂分别在模拟胃液和模拟肠液中对植酸酶的释放率。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明的具体实施进行更详细的描述，但所述实施例不构成对本发明的限制。

实施例1醛基淀粉的制备

取10g可溶性淀粉于250ml加入水,配制成质量分数为10％的淀粉乳,加热至80-85℃糊化30分钟。然后降温到45℃，边搅拌边加入硫酸铜溶液(Cu²⁺的用量为淀粉质量的0.02％)作为催化剂,缓慢加入质量分数为30％的双氧水(双氧水用量与淀粉用量的摩尔比为3:1),在45℃反应3小时。反应结束产物用无水乙醇沉析，得到的固体产物，用乙醚洗涤，50℃干燥，即可得到醛基淀粉，密封保存，备用。

实施例2植酸酶凝胶制剂的制备

称取2g醛基淀粉于20mL的小烧杯中，加入8g蒸馏水,另取赖氨酸1.75g和植酸酶3g加入2mL蒸馏水中，将两溶液混合均匀。室温下反应十几分钟，反应物固化，即得到柔软的载有植酸酶的水凝胶。将载有植酸酶的水凝胶小心从反应器中拿出来用刀片切成片状或颗粒状，室温下自然干燥，变硬化，即可得到片状和颗粒状植酸酶凝胶制剂。酸酶负载量54.4％。

实施例3植酸酶凝胶制剂的制备

将2g醛基淀粉溶解于20mL蒸馏水中，加入5g植酸酶，配成前体溶液。称取壳聚糖2.5g，配成溶液，加到前体溶液中，迅速搅拌使混合均匀。室温下静置，反应十几分钟，即得到载有植酸酶的水凝胶。小心取出来，用刀切成片状或颗粒状。室温下干燥硬化，即得片状和颗粒状植酸酶凝胶制剂。酸酶负载量57.1％。

对本发明植酸酶凝胶制剂的热稳定性进行测定(样品在各种温度下保温1h后，测定酶的相对活力)。结果如表1。

表1植酸酶自由酶和植酸酶凝胶制剂的温度稳定性

表1说明：自由酶的最适温度范围45-55℃，本发明的植酸酶凝胶制剂，最适温度范围45-70℃,最适温度范围明显变宽，并且80℃受热1小时，酶活力仍能保持85％以上，大大提高了植酸酶的热稳定性。

结合图1，可以看出：本发明植酸酶凝胶制剂，不管在模拟胃液中，还是在模拟肠液中，都要先有一个吸水溶胀过程，然后才能将水溶性的植酸酶释放出来，因此，前30分钟两种溶液中植酸酶的释放率都不高。但是，当达到溶胀平衡以后，胃液中植酸酶的释放率快速增加。这是由于在胃液中，酸酶不仅仅随着凝胶制剂的溶胀而释放出来，胃液中，亚胺基团解离，凝胶制剂的交联结构破坏，使包埋在里面的植酸酶迅速释放出来，很快就全部释放，参与消化过程。

Claims (3)

1.耐高温植酸酶凝胶制剂，其特征在于，通过如下方法制备而成：

将醛基淀粉溶于水中，混合均匀制备成醛基淀粉溶液，加入植酸酶，配成前体溶液；然后将交联剂溶液加到前体溶液中，室温下搅拌使各组分混合均匀，室温下静置反应，得到载有植酸酶的水凝胶；将得到的水凝胶经过切粒、干燥，得到植酸酶凝胶制剂；

所述的交联剂为：赖氨酸、壳聚糖中的一种或两种。

2.根据权利要求1所述的耐高温植酸酶凝胶制剂，其特征在于，所述的醛基淀粉与交联剂的摩尔数比为1:2-8。

3.根据权利要求1或2所述的耐高温植酸酶凝胶制剂，其特征在于，所述的醛基淀粉溶液的质量浓度为 5%-20%。

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