CN112704153B

CN112704153B - 一种免疫缺陷鼠饲料及其制备方法

Info

Publication number: CN112704153B
Application number: CN202011529337.3A
Authority: CN
Inventors: 吴小马; 程良平; 石蕊
Original assignee: Jiangsu Province Collaborative Pharmaceutical Bioengineering Co ltd
Current assignee: Jiangsu Province Collaborative Pharmaceutical Bioengineering Co ltd
Priority date: 2020-12-22
Filing date: 2020-12-22
Publication date: 2023-06-06
Anticipated expiration: 2040-12-22
Also published as: CN112704153A

Abstract

本发明公开了一种免疫缺陷鼠饲料，其包括以下重量分数的组分：玉米30‑45％、燕麦15‑20％、小麦10‑25％、麸皮5‑10％、玉米蛋白粉3‑6％、苜蓿草粉2‑5％、奶粉0.4‑0.8％、豆粕5‑10％、秘鲁鱼粉2‑6％、鸡肉粉2‑5％、复合预混料3‑6％、石粉0.5‑2％、氯化胆碱0.3‑0.6％、大豆油3‑5％，其还包括灭活粪肠球菌，灭活粪肠球菌的添加量为每吨饲料中添加50‑100g，其中粪肠球菌保藏号为CCTCC NO：M2020665；本发明还涉及上述免疫缺陷鼠饲料的制备方法。上述免疫缺陷鼠饲料采用的原料营养全面均衡，易消化吸收，尤其添加了热灭活粪肠球菌、有机锌、有机硒矿物质等，其提高了实验鼠的抵抗力，生物利用率高，使得实验鼠在保持其特有的免疫缺陷状态下延长了存活时间，提高了实验鼠的繁殖率，降低了死亡率。

Description

一种免疫缺陷鼠饲料及其制备方法

技术领域

本发明涉及实验动物饲料技术领域，尤其涉及一种免疫缺陷鼠饲料及其制备方法。

背景技术

免疫缺陷鼠是指先天性遗传突变或人工方法造成免疫系统一种或多种组成成分缺陷的小鼠，其出现已有近30年的历史，近20年来已广泛应用于医学生物学研究中，成为免疫学、肿瘤学、细胞生物学和遗传学研究的重要工具。

目前，市场上免疫缺陷鼠需求量越来越大，但免疫缺陷鼠由于本身缺乏免疫系统，动物机体抗病能力和对内外环境的适应能力非常差。在免疫缺陷鼠饲养繁殖的过程中具有较多的异常腹泻和死亡情况，国内的饲料在农残、重金属含量方面一般都超出其承受的范围，较容易导致免疫缺陷鼠死亡，所以其存活率、繁殖率和离乳率都不会太高。目前已研发出一些适合免疫缺陷鼠的饲料，例如中国专利CN201710775500.6公开了一种免疫缺陷小鼠饲料及其制备工艺，其通过优选原料，采用特殊配比及生产工艺，提供一种能够满足免疫缺陷小鼠的生长、妊娠及哺乳需求的配合鼠料，但是该饲料仍存在常腹泻导致的死亡情况、繁殖率低等问题。

因此，研发一种专门适用于免疫缺陷鼠，既可保持其特有的免疫缺陷状态又能延长其存活时间，提高繁殖率和离乳率的饲料显得尤为重要。

发明内容

为了克服现有技术中的缺陷，本发明提供一种免疫缺陷鼠饲料及其制备方法，该免疫缺陷鼠饲料在营养方面尽可能排除一切可能对其免疫造成影响的有害因素，以营养均衡、易消化吸收、低农残、低重金属含量为设计理念，从原材料、配方设计和制备工艺上进行优化改进，有效提高了免疫缺陷鼠的繁殖率和离乳率。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一个方面是提供一种免疫缺陷鼠饲料，其包括以下重量分数的组分：玉米30-45％、燕麦15-20％、小麦10-25％、麸皮5-10％、玉米蛋白粉3-6％、苜蓿草粉2-5％、奶粉0.4-0.8％、豆粕5-10％、秘鲁鱼粉2-6％、鸡肉粉2-5％、复合预混料3-6％、石粉0.5-2％、氯化胆碱0.3-0.6％、大豆油3-5％；其中，所述免疫缺陷鼠饲料还包括灭活粪肠球菌，所述灭活粪肠球菌的添加量为每吨饲料中添加50-100g。

为了进一步优化上述免疫缺陷鼠饲料，本发明采取的技术措施还包括：

进一步地，在上述免疫缺陷鼠饲料中，用于制备所述灭活粪肠球菌的菌株为XT01，其分类命名为粪肠球菌(Enterococcus faecalis)，其保藏编号为CCTCC NO：M2020665，保藏日期为2020年10月30日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏单位地址为中国，武汉，武汉大学。可选的，上述保藏的粪肠球菌可通过以下方法获得：MRS培养基，pH6.8、温度37℃，无抗生素厌氧的条件下进行培养，其他培养条件为本领域常规实验条件。上述保藏菌株具有耐酸、耐胆碱、抑菌、抗逆性好等优势，适于制备成灭活菌，并可将其应用于饲料中，尤其是免疫缺陷鼠的饲料。

进一步地，在上述免疫缺陷鼠饲料中，所述灭活粪肠球菌的有效活菌数为150～250亿CFU/g；更优选为200亿CFU/g。

进一步地，所述灭活粪肠球菌的添加量为每吨饲料中添加60-80g。

进一步地，在上述免疫缺陷鼠饲料中，所述复合预混料包括以下重量分数的组分：次粉20-50％、磷酸氢钙20-40％、蛋氨酸5-12％、赖氨酸5-12％、微量元素5-10％、食盐2-8％、复合维生素1-5％、硫酸亚铁0.1-2％、酵母硒0.01-0.1％、乳酸锌0.01-0.1％和柠檬酸锌0.01-0.1％。

进一步地，在上述免疫缺陷鼠饲料中，所述复合维生素中：维生素A 1400-2800万IU/kg；维生素D 150-430万IU/kg；维生素E 12-24万IU/kg；维生素K₃ 20-40g/kg；维生素B₁40-80g/kg；维生素B₂ 12-24g/kg；维生素B₆ 12-24g/kg；烟酸60-90g/kg；泛酸24-40g/kg；叶酸4-6g/kg；生物素200-400mg/kg；维生素B₁₂ 30-60mg/kg；抗氧化剂300-500mg/kg；水分＜8wt％。

可理解的是，上述饲料除了适用于免疫缺陷鼠外，也可适用于特殊疾病模型鼠(Ⅰ型糖尿病模型鼠、高血压模型鼠等)、特殊品系大鼠、小鼠(C57BL/6J、DBA等)，也适用于饲喂多代繁殖实验、脏器移植实验、外科手术实验等对营养需求较高的实验大鼠、小鼠等。

本发明的第二个方面是提供一种免疫缺陷鼠饲料的制备方法，所述免疫缺陷鼠饲料为本发明的第一个方面中任一所述的饲料，所述制备方法包括：

步骤1)制备灭活粪肠球菌；

步骤2)将预定量的玉米、燕麦、小麦、苜蓿草粉、豆粕、麸皮进行混合、粉碎，获得第一混合料；将预定量的秘鲁鱼粉和鸡肉粉与所述第一混合料混合，获得第二混合料；对所述第二混合料进行前熟化，冷却后粉碎；

步骤3)将步骤2)中前熟化粉碎后的所述第二混合料与复合预混料、石粉、大豆油、氯化胆碱、奶粉、玉米蛋白粉以及步骤1)中制备的灭活粪肠球菌混合，得到第三混合料；

步骤4)将步骤3)得到的所述第三混合料进行调质、制粒、烘干，制得所述免疫缺陷鼠饲料。

为了进一步优化上述制备方法，本发明采取的技术措施还包括：

进一步地，在上述制备方法中，所述步骤1)具体包括：

步骤A)菌液制备：挑取粪肠球菌(可优选保藏编号为CCTCC NO：M2020665的粪肠球菌)单菌落接种于培养基中，培养预定时间后将菌液进行高温高压处理，低温保存备用；

步骤B)固态灭活粪肠球菌的制备：将烘干载体与步骤A)中制备的灭活菌悬液以预定比例混合后，烘干，得到固态灭活粪肠球菌。

进一步地，在上述制备方法中，所述步骤A)中，以重量分数计，所述培养基包含2～4％玉米淀粉、2～4％豆粕、1～3％葡萄糖，更优选为包含2.5％玉米淀粉、3％豆粕、2％葡萄糖，其可为本领域任一合适的适于培养粪肠球菌的常规培养基，优选MRS培养基；所述粪肠球菌单菌落的接种量为5～10wt％，优选为6～8wt％，更优选7wt％；所述粪肠球菌的培养条件为：pH为5～7.5、装液量25～35mL、温度28～35℃、培养时间8～16h，优选为pH为6～7、装液量28～32mL、温度30～35℃、培养时间10～14h，更优选为pH为6.5、装液量30mL、温度32℃、培养时间12h；所述高温高压条件为115～130℃30～50min，优选为118～125℃35～45min，更优选为121℃40min；所述低温为0～10℃，更优选为4℃。

进一步地，在上述制备方法中，所述步骤B)中，所述烘干载体为虾头粉末，按重量计，所述烘干载体与灭活菌悬液的混合比例为2：1.5～4.5；所述烘干条件为40～60℃鼓风烘干4～8h，优选所述烘干载体与灭活菌悬液的混合比例为2：3；所述烘干条件为50℃鼓风烘干6h。可理解的是，上述烘干载体也可本领域常规使用的其他载体。

进一步地，在上述制备方法中，所述步骤2)具体包括：将自动称量的玉米、燕麦、小麦、苜蓿草粉、豆粕、麸皮由提升机转入初混合机混合，其中混合以混合均匀为宜，优选混合3～5分钟，混合后转入待粉碎仓，粉碎后得到第一混合料，其中粉碎以粉碎均匀、颗粒尺寸均匀为宜，优选粉碎后物料颗粒粒径为0.1-0.2mm；将自动称量的秘鲁鱼粉和鸡肉粉与所述第一混合料进行混合，其中混合以混合均匀为宜，优选混合3～5分钟，得到第二混合料；将所述第二混合料送入膨化机进行前熟化，优选前熟化时间为3-10分钟，高温高压的混合料从膨化机的出料口排出，进行冷却、粉碎。

进一步地，在上述制备方法中，所述步骤2)的前熟化步骤具体包括：将所述第二混合料送入膨化机进行前熟化，膨化机有一副螺杆和螺套，第二混合料进入膨化腔内以后，在螺杆套之间受到挤压，摩擦，剪切等作用，其内部压力不断升高，最大达4MPA，温度不断上升，最高可达140℃；在3-7分钟的时间内，温度和压力急剧升高，第二混合料的组织结构发生变化，粗纤维破坏，杀死沙门菌等有害菌；高温高压的混合料从出料口出来，其压力突然释放，水分放生部分闪蒸，冷却后物料呈疏松，多孔的结构；其中，整个前熟化过程进行10分钟。

进一步地，在上述制备方法中，所述步骤3)中的混合以混合均匀为宜，优选混合3～5分钟。

进一步地，在上述制备方法中，所述步骤4)具体包括：将所述第三混合料在110～140℃、0.1～0.7Mpa蒸汽下进行调质，料温达到50～90℃后进行环模制粒，环模模孔直径10～15mm，成型后70-120℃烘干20-50min，冷却后包装；优选，在120～130℃、0.2～0.6Mpa蒸汽下进行调质，料温达到60～80℃后进行环模制粒，环模模孔直径12mm，成型后80-100℃烘干30-40min，冷却后包装。

进一步地，饲料原料在接收前，先经过抽样质检合格，其营养含量、颜色、味道符合验收标准，无霉变等；经投料口用斗式提升机提升到原料仓，在进入原料仓前分别通过初清筛和永磁筒，除去线头、粉尘、碎石、铁屑等杂物。

进一步地，饲料原料采用不同输送线单独投料，且设置单独料仓，避免不同原料之间的交叉污染。

进一步地，上述制备方法采用的生产工艺从原料进车间到成品出车间的全部环节实行机械化、自动化生产；其中，生产工艺主要由原料接收清理、粗粉碎、配料、混合、膨胀、二次粉碎、二次混合、制粒、烘干、冷却、输送、分级、清理、成品包装等工段组成，采用先粉碎、后配合工艺。

本发明的第三个方面是提供灭活粪肠球菌在制备免疫缺陷鼠饲料中的应用，其中，用于制备所述灭活粪肠球菌的菌株为XT01，其分类命名为粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)，其保藏编号为CCTCC NO：M2020665。

在饲料领域，添加的益生菌通常采用活性益生菌，但相对于活性益生菌，热灭活益生菌具有如下优势：

(1)安全性高：益生菌活菌制剂对于免疫缺陷的小鼠可能存在潜在的危害，菌体的基因突变、非正常部位迁移和耐药性增加，都可能会增加菌体致病的危险，尤其对一些免疫力低下的实验鼠而言，活菌制剂很容易引起病理反应。WANGNER等人将乳杆菌、双歧杆菌、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus aeidophilus)在免疫缺陷的幼鼠体内增殖，结果增殖乳杆菌组部分幼鼠出现死亡，这种现象同样出现在免疫力低下的成年小鼠体内。相比而言灭活益生菌因其活性丧失处于更加稳定的状态，因而具有更高的安全性。

(2)没有菌量的限制：活性益生菌制剂对菌体的数量有严格的要求。活性益生菌含量过高或过低会影响益生菌的生理功能，甚至造成一定的潜在危险，而灭活益生菌制品则没有要求。

(3)生产保存容易，质量稳定性高：活性益生菌通常对保存条件、温度、时间都有较高的要求，目前市场中绝大多数活性益生菌制品需要在低温中保存，保质期也只有几天到十几天的时间，有的还需添加保护剂和稳定剂来降低贮存、运输过程中活性的丧失，灭活益生菌制剂由于死菌体处于相对稳定的状态且不需要维持一定的菌量，因此在运输、保存等方面较为容易，质量稳定性也比较高。

(4)吸附能力强：益生乳酸菌多是革兰氏阳性菌，其成分主要是肽聚糖以及少量的脂类物质，肽聚糖和脂蛋白使乳酸菌对动物肠道具有粘附作用，对致病性细菌具有更强的排斥作用。研究显示被灭活的乳酸菌细胞仍然可以与黄曲霉毒素接合，且比活菌的结合能力更强。

(5)抗逆性强：益生菌活菌要想顺利到达胃肠道发挥作用，必须经受唾液、胃酸、胆汁、碱性、各种消化酶的考验，它们中含有的各种杀菌物质和反应酶极易影响益生菌的活性。而灭活益生菌的细胞不受环境变化的影响，能耐受高温、胃酸、胆汁、碱性等，更易到达胃肠道发挥稳定的作用。

(6)不会导致噬菌体感染：由于噬菌体在活菌内寄生，益生菌活菌存在易被噬菌体感染的问题。当一个空间里重复大量使用某种菌的活细胞如枯草芽孢杆菌、酵母菌、乳酸菌等就会招致噬菌体的爆发。微生物活细胞太多，也会招致噬菌体的爆发。灭活的益生菌只需菌体细胞粘附在动物肠道细胞壁上就可以发挥作用，没有活性且不繁殖，便不会导致噬菌体感染。

粪肠球菌是一种兼性厌氧型革兰氏阳性乳酸菌，菌体形态为球状或链状，无荚膜，无芽孢。粪肠球菌为同型乳酸发酵菌，主要产生L-乳酸。作为肠道中的正常优势菌群，在肠黏膜具有较强的耐受和定植能力，在动物体内，粪肠球菌可以发挥显著的益生作用：作为原籍菌，可以调节肠道菌群平衡；在消化道内定植并产生大量乳酸，降低肠道pH值，减少肠道中嗜碱性细菌的含量；分泌的L-乳酸，可被动物吸收利用，并促进生素、钙、铁等矿物元素的吸收；抑制肠道腐败菌生长，减少肠道内氨、胺类及细菌毒素的产生，具体包括以下优势：1)肠道内定植能力强，粪肠球菌作为肠道原籍菌，具有较强的肠粘膜粘附能力，可在肠粘膜快速黏附繁殖，形成菌群屏障，抵御外来有害菌、毒素及抗原对肠道产生的损伤。对幼龄动物腹泻具有较好的效果；2)生长速度快：在动物体内环境中，粪肠球菌具有较快的繁殖速度，可快速形成优势菌群，抑制大肠杆菌等有害菌生长，维持肠道菌群平衡；3)产酸抑菌：粪肠球菌可在肠道中产大量的乳酸，降低肠道PH值，抑制大肠杆菌等有害菌生长，并可提高消化酶的活性，同时产生多种细菌素，对缓解幼龄动物腹泻具有良好的效果；4)应用广泛，安全性高：粪肠球菌在人用益生菌制剂中已有较多应用，例如根源C-200所用菌株来自健康动物肠道，且经过严格鉴定，安全性高。

基于上述热灭活益生菌及粪肠球菌所具有的优点，发明人利用具有特定优势的粪肠球菌CCTCC NO：M2020665制备热灭活粪肠球菌，并创新性地在免疫缺陷鼠饲料中添加了灭活粪肠球菌，以提高饲料的专用性，其生理作用主要包括：(1)调节肠道菌群平衡分泌乳酸及乳酸菌素，抑制大肠杆菌、门氏菌等；(2)增强动物免疫力和抗应激能力，提高实验鼠健康水平，降低死淘率。

在上述免疫缺陷鼠饲料中，还添加了对机体免疫功能具有重要的影响的微量元素。微量元素不仅影响机体本身，而且也影响体内微生物的生长、繁殖、代谢和毒素的产生，微量元素对机体免疫功能的影响主要表现在两个方面：一是缺乏时会直接影响机体免疫器官、免疫细胞等组织的损伤、改变或分化，导致免疫缺陷；二是通过影响机体内其他组织的营养、生长、代谢，间接使免疫功能下降，抗病力下降。而硒和锌是人和动物所必需的微量元素，硒功能包括：提高机体免疫力、抗癌、抗自由基、延缓衰老、拮抗有毒元素、防治某些地方性流行病等。锌由于其在体内广泛的生理生化功能而被称为“生命元素”，其功能包括：促进机体发育和骨骼生长、提高免疫机能、提高动物的繁殖机能、参与蛋白质和核酸代谢，调节酶的活性等。锌和硒的加入能够提高免疫缺陷鼠的繁育机能、提高机体免疫力。有机硒和有机锌与无机硒和无机锌相比有许多优势，首先其毒性较小，适口性好，此外因其吸收利用率更高，可降低饲料中硒和锌的添加量。本发明所述的饲料在复合预混料添加的柠檬锌、乳酸锌均属于有机锌，有机锌的利用率更高；酵母硒属于有机硒，有机硒更容易在体内储存，从而对免疫缺陷鼠具有更好的效果。本发明所添加的柠檬锌乳酸锌、酵母硒，提高了实验鼠的抵抗力和繁殖率，并降低了死亡率。

与现有技术相比，本发明采用上述技术方案具有以下有益效果：

本发明所述的免疫缺陷鼠饲料其采用的原料营养全面均衡，安全性高，易消化吸收，尤其添加了热灭活粪肠球菌、有机锌、有机硒矿物质等，其提高了实验鼠的抵抗力，生物利用率高，使得实验鼠在保持其特有的免疫缺陷状态下延长了存活时间，提高了实验鼠的繁殖率，降低了死亡率。

附图说明

图1是本发明一实施例中免疫缺陷鼠饲料的生产工艺流程图。

用于制备上述免疫缺陷鼠饲料中添加的灭活粪肠球菌的菌株已进行保藏，其为XT01，其分类命名为粪肠球菌(Enterococcus faecalis)，其保藏编号为CCTCC NO：M2020665，保藏日期为2020年10月30日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏单位地址为中国，武汉，武汉大学。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照国家标准测定。若没有相应的国家标准，则按照通用的国际标准、常规条件、或按照制造厂商所建议的条件进行。除非另外说明，否则所有的份数为重量份，所有的百分比为质量百分比。除非另有定义或说明，本发明中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术熟练人员所熟悉的意义相同。此外任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。

实施例1

本实施例对活性粪肠球菌CCTCC NO：M2020665的相关性能进行验证。

保藏的粪肠球菌CCTCC NO：M2020665为自然分离而来，该粪肠球菌的培养过程如下：将菌株种子液(10⁹CFU/mL)5ml接种于300ml MRS培养基进行发酵培养，培养条件为：pH6.8、温度37℃、无抗生素厌氧条件下进行培养10h，采用菌落平板计数法调整菌液浓度至2×10¹⁰CFU/mL，将粪肠球菌菌液于4℃保存备用。

上述活性粪肠球菌CCTCC NO：M2020665的相关性能的验证具体如下：

(1)耐胆盐性实验

将50μl上述发酵获得的粪肠球菌菌液分别接种在含有不同浓度的胆盐(0.1％、0.3％、0.5％、1.0％、1.5％、2.0％、2.5％、3.0％、3.5％、4.0％)的10ml MRS液体培养基中；并以不接菌的MRS液体培养基作为对照，37℃培养24h后，稀释10⁴倍后取0.1mL涂MRS固体琼脂平板，观察菌体的生长情况，以检测其耐胆盐性质。实验结果显示，粪肠球菌CCTCC NO：M2020665的最高耐受胆盐浓度为3％，远高于小鼠肠内胆盐的浓度范围。

(2)耐酸性实验

取0.5ml上述发酵获得的粪肠球菌菌液分别接种至pH 1.5、pH 2.0、pH 2.5、pH3.0的100ml MRS液体培养基中，并以不接菌的MRS液体培养基作为对照，37℃培养2-4h后，分别在1h、2h、3h、4h的时候取出培养液并立即计数残存活菌数，与原活菌数进行比较。实验结果显示，粪肠球菌CCTCC NO：M2020665在pH值为3.0的液体培养基活菌存活率大于90％，在pH值为2.5的液体培养基活菌存活率仍大于68％。

(3)益生性(抑菌性)实验

配制LB固体培养基，121℃灭菌30min。将浓度为10⁹CFU/mL的病原菌(金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌、绿脓杆菌)分别接种于培养基，37℃培养24h备用。用无菌棉签将0.1mL病原菌培养液均匀涂抹在固体LB培养基上，用无菌镊子将孔内琼脂块挑出放入10ml小管中。取0.5ml上述发酵获得的粪肠球菌菌液加入各小管中，37℃培养24h，观察有无抑菌环。结果表明粪肠球菌CCTCC NO：M2020665菌液对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌、绿脓杆菌均有良好的抑制作用，其对沙门氏菌的抑制作用更强。

(4)抗逆性验证

将50μl上述发酵获得的粪肠球菌菌液接种在10ml MRS液体培养基中，37℃下培养24h。取另外的50μl上述发酵获得的粪肠球菌菌液在水浴锅中加热20-30min，接种在10mlMRS液体培养基中，37℃下培养24h，计算粪肠球菌加热前后的活菌数量。实验结果表明，加热后活菌存活率达到了约96％。

由上述实验结果可知，活性粪肠球菌CCTCC NO：M2020665其具有优异的耐胆盐性、耐酸性、抗菌能力以及抗逆性，特别适于制备灭活粪肠球菌，并添加至动物饲料中。

实施例2

本实施例为一较佳的免疫缺陷鼠饲料，其组成(重量百分数)包括：玉米42％、燕麦15％、小麦10％、麸皮6％、玉米蛋白粉4％、苜蓿草粉3％、奶粉0.7％、豆粕8％、秘鲁鱼粉2％、鸡肉粉2％、复合预混料3％、石粉1％、氯化胆碱0.3％和大豆油3％，上述饲料还包括灭活粪肠球菌(热灭活)，200亿CFU/g产品每吨全价配合饲料中添加100g；其中，上述复合预混料的组成(重量百分数)包括：次粉28％、磷酸氢钙30％、蛋氨酸5％、赖氨酸12％、微量元素10％、食盐8％、复合维生素4.8％、硫酸亚铁2％、酵母硒0.09％、乳酸锌0.1％和柠檬酸锌0.01％；以及其中复合维生素中各成分的指标达到以下标准：维生素A 1400-2800万IU/kg；维生素D 150-430万IU/kg；维生素E 12-24万IU/kg；维生素K₃ 20-40g/kg；维生素B₁ 40-80g/kg；维生素B₂ 12-24g/kg；维生素B₆ 12-24g/kg；烟酸60-90g/kg；泛酸24-40g/kg；叶酸4-6g/kg；生物素200-400mg/kg；维生素B₁₂ 30-60mg/kg；抗氧化剂300-500mg/kg；水分＜8wt％。

上述饲料的一较佳制备工艺包括如下步骤：

(1)制备灭活粪肠球菌

A)菌液制备

挑取7wt％粪肠球菌(保藏编号CCTCC NO：M2020665)单菌落接种于包含2.5％玉米淀粉、3％豆粕、2％葡萄糖的培养基中，在初始pH为6.5、装液量30mL，温度32℃条件下培养粪肠球菌，培养12h后采用菌落平板计数法调整菌液浓度。将菌液高温高压(121℃40min)处理后接种于培养基中验证灭活情况，4℃保存备用，

B)固态灭活粪肠球菌的制备

以虾头粉末作为烘干载体，将载体与灭活的菌悬液以2:3的比例混合后，于50℃鼓风烘干6h，得到固态灭活粪肠球菌菌剂。

(2)饲料的制备，如图1所示，上述免疫缺陷鼠饲料的生产工艺主要由原料接收清理、粗粉碎、配料、混合、膨胀、二次粉碎、二次混合、制粒、烘干、冷却、输送、分级、清理、成品包装等工段组成，采用先粉碎、后配合工艺，其从原料进车间到成品出车间的全部环节实行机械化、自动化生产。

饲料原料在接收前，先经过抽样质检合格，其营养含量、颜色、味道符合验收标准，无霉变等。经投料口用斗式提升机提升到原料仓，在进入原料仓前分别通过初清筛和永磁筒，除去线头、粉尘、碎石、铁屑等杂物。可理解的是，饲料的制备总量可根据实际设备的产能进行调整，但各组分的重量分数不变。

将自动称量的玉米、燕麦、小麦、苜蓿草粉、豆粕、麸皮由提升机转入初混合机混合5分钟，然后转入待粉碎仓，准备粉碎。粉碎后物料颗粒粒径为0.1-0.2mm，得到第一混合料。小料秘鲁鱼粉和鸡肉粉进行称量，与第一混合料进行混合，配料，得到第二混合料。此道工艺中原材料采用不同输送线单独投料，且设置单独料仓，避免不同原材料的交叉污染。

将第二混合料送入膨化机进行前熟化，膨化机有一副螺杆和螺套，第二混合料进入膨化腔内以后，在螺杆套之间受到挤压，摩擦，剪切等作用，其内部压力不断升高，最大达4MPA,温度不断上升，最高可达140℃。在3-7分钟的时间内，温度和压力急剧升高，第二混合料的组织结构发生变化，粗纤维破坏，杀死沙门菌等有害菌。高温高压的混合料从出料口出来，其压力突然释放，水分放生部分闪蒸，冷却后物料呈疏松，多孔的结构。整个前熟化过程进行10分钟。

熟化后的原料再进行二次粉碎，添加其余原料组分复合预混料、石粉、大豆油、氯化胆碱、奶粉、玉米蛋白粉和灭活的粪肠球菌，进行二次混合，混合5min得到第三混合料；将第三混合料在130℃、0.5Mpa蒸汽下进行调质，料温达到80℃后进行环模制粒，环模模孔直径12mm，成型后100℃烘干40min，冷却后包装。

实施例3

本实施例为一较佳的免疫缺陷鼠饲料，其组成(重量百分数)包括：玉米35％、燕麦20％、小麦12％、麸皮5％、玉米蛋白粉3％、苜蓿草粉2％、奶粉0.4％、豆粕5％、秘鲁鱼粉4％、鸡肉粉3％、复合预混料4％、石粉2％、氯化胆碱0.6％和大豆油4％，上述饲料还包括灭活粪肠球菌(热灭活)，150亿CFU/g产品每吨全价配合饲料中添加80g；其中，上述复合预混料的组成(重量百分数)包括：次粉20％、磷酸氢钙35％、蛋氨酸12％、赖氨酸10％、微量元素10％、食盐6％、复合维生素5％、硫酸亚铁1％、酵母硒0.01％、乳酸锌0.09％和柠檬酸锌0.9％；以及其中复合维生素中各成分的指标达到的标准与实施例1相同。

上述饲料的一较佳制备工艺(除了下述步骤不同，其余均与实施例2相同)包括如下步骤：

(1)制备灭活粪肠球菌

A)菌液制备

挑取5wt％粪肠球菌(保藏编号CCTCC NO：M2020665)单菌落接种于包含4％玉米淀粉、2％豆粕、3％葡萄糖的培养基中，在初始pH为7、装液量35mL，温度30℃条件下培养粪肠球菌，培养12h后采用菌落平板计数法调整菌液浓度。将菌液高温高压(118℃45min)处理后接种于培养基中验证灭活情况，6℃保存备用，

B)固态灭活粪肠球菌的制备

以虾头粉末作为烘干载体，将载体与灭活的菌悬液以2:4.5的比例混合后，于60℃鼓风烘干4h，得到固态灭活粪肠球菌菌剂。

(2)将自动称量的玉米、燕麦、小麦、苜蓿草粉、豆粕、麸皮由提升机转入初混合机混合3分钟，然后转入待粉碎仓，准备粉碎。粉碎后物料颗粒粒径为0.1-0.2mm，得到第一混合料。小料秘鲁鱼粉和鸡肉粉进行称量，与第一混合料进行混合，配料，得到第二混合料。将第二混合料送入膨化机进行前熟化，熟化后的原料再进行二次粉碎，添加其余原料组分复合预混料、石粉、大豆油、氯化胆碱、奶粉、玉米蛋白粉及灭活的粪肠球菌，进行二次混合，混合3min得到第三混合料；将第三混合料在120℃、0.35Mpa蒸汽下进行调质，料温达到60℃后进行环模制粒，环模模孔直径12mm，成型后80℃烘干40min，冷却后包装。

实施例4

本实施例为一较佳的免疫缺陷鼠饲料，其组成(重量百分数)包括：玉米30％、燕麦18％、小麦15％、麸皮8％、玉米蛋白粉6％、苜蓿草粉4％、奶粉0.8％、豆粕5％、秘鲁鱼粉2％、鸡肉粉4％、复合预混料3％、石粉0.8％、氯化胆碱0.4％和大豆油3％，上述饲料还包括灭活粪肠球菌(热灭活)，250亿CFU/g产品每吨全价配合饲料中添加50g；其中，上述复合预混料的组成(重量百分数)包括：次粉35％、磷酸氢钙40％、蛋氨酸8％、赖氨酸5％、微量元素7％、食盐3.8％、复合维生素1％、硫酸亚铁0.1％、酵母硒0.04％、乳酸锌0.01％和柠檬酸锌0.05％；以及其中复合维生素中各成分的指标达到的标准与实施例1相同。

(1)制备灭活粪肠球菌

A)菌液制备

挑取10wt％粪肠球菌(保藏编号CCTCC NO：M2020665)单菌落接种于包含2％玉米淀粉、2％豆粕、2％葡萄糖的培养基中，在初始pH为6、装液量30mL，温度32℃条件下培养粪肠球菌，培养10h后采用菌落平板计数法调整菌液浓度。将菌液高温高压(128℃30min)处理后接种于培养基中验证灭活情况，4℃保存备用，

B)固态灭活粪肠球菌的制备

以虾头粉末作为烘干载体，将载体与灭活的菌悬液以1:1的比例混合后，于50℃鼓风烘干6h，得到固态灭活粪肠球菌菌剂。

实施例5

本实施例为一较佳的免疫缺陷鼠饲料，其组成(重量百分数)包括：玉米45％、燕麦15％、小麦13％、麸皮5％、玉米蛋白粉3％、苜蓿草粉2％、奶粉0.4％、豆粕5％、秘鲁鱼粉2％、鸡肉粉2％、复合预混料3％、石粉1.3％、氯化胆碱0.3％和大豆油3％，上述饲料还包括灭活粪肠球菌(热灭活)，200亿CFU/g产品每吨全价配合饲料中添加70g；其中，上述复合预混料的组成(重量百分数)包括：次粉50％、磷酸氢钙20％、蛋氨酸12％、赖氨酸6.8％、微量元素5％、食盐2％、复合维生素2.6％、硫酸亚铁0.5％、酵母硒0.05％、乳酸锌0.05％和柠檬酸锌1％；以及其中复合维生素中各成分的指标达到的标准与实施例1相同。上述免疫缺陷鼠饲料的制备工艺与实施例2相同。

(1)制备灭活粪肠球菌

A)菌液制备

挑取8wt％粪肠球菌(保藏编号CCTCC NO：M2020665)单菌落接种于包含1％玉米淀粉、4％豆粕、3％葡萄糖的培养基中，在初始pH为5.5、装液量35mL，温度28℃条件下培养粪肠球菌，培养16h后采用菌落平板计数法调整菌液浓度。将菌液高温高压(121℃45min)处理后接种于培养基中验证灭活情况，4℃保存备用，

B)固态灭活粪肠球菌的制备

以虾头粉末作为烘干载体，将载体与灭活的菌悬液以2:3.5的比例混合后，于45℃鼓风烘干8h，得到固态灭活粪肠球菌菌剂。

实施例6

本实施例采用实施例2～5中所述的制备工艺制得的饲料对灭活和非灭活粪肠球菌的效果进行对比验证，其研究灭活和非灭活粪肠球菌对小鼠感染沙门氏菌的作用研究，采用的粪肠球菌为已保藏的粪肠球菌CCTCC NO：M2020665，其研究结果如下：

(1)粪肠球菌对小鼠单核巨噬细胞系统的影响结果；

检测饲喂含有粪肠球菌的饲料对沙门氏菌感染小鼠的防治作用。将体重为18-22g的清洁级昆明种小白鼠分为6组，日粮分为即对照组(不添加粪肠球菌)、添加活性粪肠球菌组和添加灭活粪肠球菌组(实施例2-5)，每组30只小鼠，雌雄各半。试喂一周后，对照组，活性粪肠球菌组和灭活粪肠球菌组的小鼠分别尾静脉注射1.5×10⁸CFU/mL的肠炎沙门氏菌0.2ml，连续观察15d，记录小鼠每天的死亡数。

数据处理：采用SPSS19.0统计学软件进行差异显著性检验，实验结果用x±s表示；两个样本均数比较用t检验，多个样本均数分析用F检验。采用碳粒廓清试验方法检测活性粪肠球菌及灭活粪肠球菌对小鼠单核-巨噬细胞吞噬功能的影响，实验结果如下表1所示：

表1-灭活屎肠球菌对小鼠单核-巨噬细胞吞噬功能的影响结果(n＝10)

组别	碳廓清指数K×10³
		对照组	8.146±1.254
活性粪肠球菌组	9.125±0.788*
		灭活屎肠球菌组-实施例2	11.369±1.268**
灭活屎肠球菌组-实施例3	10.246±0.994**
		灭活屎肠球菌组-实施例4	11.586±1.143**
灭活屎肠球菌组-实施例5	10.982±1.087**

注：*：与正常对照组比较差异显著P＜0.05；**：与正常对照组比较差异极显著P＜0.01。

上述实验结果表明，与对照组相比较，活性粪肠菌群组和灭活粪肠菌群组都能够提高小鼠的碳廓清指数K值(P＜0.05)，且灭活粪肠球菌组(实施例2-实施例5)均能够极显著地提高小鼠的碳廓清指数K值(P＜0.01)。以上说明，活性粪肠球菌可以提高小鼠的非特异性免疫功能，灭活的粪肠球菌效果则更好。

(2)灭活粪肠球菌对小鼠抗菌作用的结果

检测粪肠球菌和灭活粪肠球菌对感染沙门氏菌小鼠致死作用的影响，结果见表2。

表2-灭活粪肠球菌对感染沙门氏菌小鼠致死数的影响结果(n＝10)

组别	小鼠只数	死亡总数
			正常对照组	30	30
活性粪肠球菌组	30	20*
			灭活屎肠球菌组-实施例2	30	10**
灭活屎肠球菌组-实施例3	30	11**
			灭活屎肠球菌组-实施例4	30	13**
灭活屎肠球菌组-实施例5	30	12**

上述结果表明，与沙门氏菌组相比较活性粪肠球菌组和灭活粪肠球菌组均能够显著地降低小鼠的死亡数(P＜0.05)；其中灭活粪肠球菌组(实施例2-实施例5)均能够极显著地降低小鼠的死亡数(P＜0.01)。说明灭活粪肠球菌对感染沙门氏菌小鼠具有良好的保护作用，显著降低死亡率。

实施例7

本实施例采用实施例2～5制备的饲料、对照组1(以MF-008506表示)以及对照组2(以普通饲料表示)进行免疫缺陷鼠的饲喂，在饲喂期间对免疫缺陷鼠进行生长曲线和繁育情况进行评估；其中，对照组1为含有常规的灭活的粪肠球菌(购自信阳市沐凡生物科技有限公司，产品编号MF-008506，粉末)的饲料，其将粪肠球菌MF-008506高温高压(121℃40min)处理后，与虾头粉末以2:3的质量比例混合制得灭活菌，对照组1饲料的其余组分及制备方法均与实施例2相同，对照组2为市售的普通高压饲料。

动物分组及饲养：本实施例通过饲喂免疫缺陷鼠粮和普通饲料来评价其对小鼠生长和繁育的影响。NODSC品系小鼠每种饲料各测试50只(雌雄各25只)(初始体重8-13g)，每个笼盒5只，测试的周期为3-6w，饲料称重只计算在饲料槽中的量。

(1)小鼠的采食量的对比如下表3所示。

表3-免疫缺陷料和普通高压料饲料消耗情况

由上述的采食量结果分析可知，总体消耗量是普通饲料的采食量大于免疫缺陷MF-008506饲料大于实施例2-5饲料；雄性小鼠的在5w前普通饲料多采食20g左右，MF-008506饲料多采食10g左右，6周差别不大；雌性小鼠在5w之前采食量差别不大，在6w左右普通饲料多采食20g左右，MF-008506饲料多采食10g左右。

(2)小鼠的体重对比如下表4所示。

表4-免疫缺陷料和普通料饲料体重对比,表

饲料类型	3W(g)	4W(g)	5W(g)
				实施例2♂	12.5	20.1	22.3
实施例2♀	11.2	18.3	19.6
				实施例3♂	11.5	18.9	20.8
实施例3♀	9.1	15.9	18.2
				实施例4♂	12.1	19.5	21.5
实施例4♀	10.3	16.4	19.7
				实施例5♂	11.9	19.3	21.7
实施例5♀	10.5	16.8	19.2
				MF-008506♂	11.8	19.0	21.6
MF-008506♀	10.3	17.4	19.5
				普通饲料♂	11.9	19.2	21.5
普通饲料♀	10.1	16.7	18.8

由上述体重结果分析可知，免疫缺陷饲料实施例2-5、MF-008506和普通高压饲料对雌雄鼠生长体重影响的差异不明显；免疫缺陷鼠对免疫缺陷饲料实施例2-5的采食量低，生长体重处于正常范围，表明免疫缺陷鼠粮实施例2-5的饲料转化率较饲料MF-008506及普通高压饲料高，吃的少，长得多，在免疫缺陷鼠生长曲线正常的情况下，可以降低饲料成本。

(3)APOE小鼠一个月后与之前使用实施例2～5制备的饲料、对照组1(以MF-008506表示)以及对照组2(以普通饲料表示)在吃仔率和胎产数上的对比，1个月后统计吃仔率和胎产数，其对比结果如下表5所示。

表5-在不同的克隆级别使用免疫缺陷饲料，对繁殖主要数据的统计对比

饲料类型	克隆级别	繁殖对	平均胎产数
				普通饲料	PEC	50	4.0
MF-008506	PEC	50	6.4
				实施例2	PEC	50	8.2
实施例3	PEC	50	6.9
				实施例4	PEC	50	7.1
实施例5	PEC	50	7.5
				普通饲料	EC	36	4.6
MF-008506	EC	36	6.7
				实施例2	EC	36	8.3
实施例3	EC	36	7.8
				实施例4	EC	36	7.0
实施例5	EC	36	7.5

由上述结果分析可知，使用免疫缺陷饲料EC种群(1：2)及PEC种群(1：1)对胎产数的增加比较明显，MF-008506能每胎增加约2只小鼠，实施例2-5饲料能每胎增加约3～4只小鼠，这表明实施例2-5制备的免疫缺陷鼠饲料能够明显提高免疫小鼠的繁殖性能。

实施例7

本实施例采用实施例2制备的饲料、对照组1(以MF-008506表示)以及对照组2(以普通饲料表示)对免疫缺陷鼠饲喂4周后，检测血常规及血清生化指标。采用杂合雌鼠和雄性裸鼠各10只(初始体重8-13g)，测试的周期为6w。对照组1为含有常规的灭活的粪肠球菌(购自信阳市沐凡生物科技有限公司，产品编号MF-008506，粉末)的饲料，其将粪肠球菌MF-008506高温高压(121℃40min)处理后，与虾头粉末以2:3的质量比例混合制得灭活菌，对照组1饲料的其余组分及制备方法均与实施例2相同，对照组2为市售的普通高压饲料，实验结果如下表6-9所示：

表6-免疫缺陷料和普通料饲料喂养杂合雌鼠的血常规比较

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表7-免疫缺陷料和普通料饲料喂养雄性裸鼠的血常规比较

表8-免疫缺陷料和普通料饲料喂养杂合雌鼠的血清生化指标比较

表9-免疫缺陷料和普通料饲料喂养雄性裸鼠的血清生化指标比较

由上述实验结果可知，实施例2制备的含有灭活粪肠球菌(CCTCC NO：M2020665)的饲料与其他饲料组相比，各实验鼠的血常规及血清生化指标均差异不显著，即其并不会引起免疫缺陷鼠的相关正常血液理化指标的变化，安全性能高。

由上述实施例可知，本发明首次使用性能优异的粪肠球菌CCTCC NO：M2020665制备灭活粪肠球菌，上述灭活粪肠球菌安全性好，抑菌效果好，更适于添加至免疫缺陷鼠饲料中；本发明对免疫缺陷鼠饲料各原料组分及其配比均进行优化，以使得饲料组分营养均衡全面，热灭活粪肠球菌与有机锌、有机硒矿物质等原料配伍，其生物利用率高，提高了实验鼠的抵抗力和繁殖率、延长了存活时间、降低了死亡率。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims

1.一种免疫缺陷鼠饲料，其特征在于，包括以下重量百分数的组分：玉米 30-45％、燕麦 15-20％、小麦 10-25％、麸皮5-10％、玉米蛋白粉 3-6％、苜蓿草粉 2-5％、奶粉 0.4-0.8％、豆粕 5-10％、秘鲁鱼粉 2-6％、鸡肉粉 2-5％、复合预混料 3-6％、石粉0.5-2％、氯化胆碱 0.3-0.6%、大豆油3-5％；

其中，所述免疫缺陷鼠饲料还包括灭活粪肠球菌（Enterococcus faecalis），所述灭活粪肠球菌的添加量为每吨饲料中添加50-100g；用于制备所述灭活粪肠球菌的菌株为XT01，保藏编号为：CCTCC NO：M2020665；

所述复合预混料包括以下重量百分数的组分：次粉 20-50％、磷酸氢钙 20-40％、蛋氨酸 5-12％、赖氨酸 5-12％、微量元素 5-10％、食盐 2-8％、复合维生素 1-5％、硫酸亚铁0.1-2％、酵母硒 0.01-0.1％、乳酸锌 0.01-0.1％和柠檬酸锌 0.01-0.1％。

2.根据权利要求1所述的一种免疫缺陷鼠饲料，其特征在于，所述灭活粪肠球菌的有效活菌数为150~250亿CFU/g。

3.根据权利要求1所述的一种免疫缺陷鼠饲料，其特征在于，所述复合维生素中：维生素A 1400-2800万 IU/kg；维生素D 150-430万 IU/kg；维生素E 12-24万 IU/kg；维生素K₃20-40g/kg；维生素B₁ 40-80g/kg；维生素B₂ 12-24g/kg；维生素B₆ 12-24g/kg；烟酸 60-90g/kg；泛酸 24-40g/kg；叶酸 4-6g/kg；生物素 200-400mg/kg；维生素B₁₂ 30-60mg/kg；抗氧化剂 300-500mg/kg；水分＜8 wt％。

4.一种如权利要求1~3中任一项所述的免疫缺陷鼠饲料的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：

步骤1）制备灭活粪肠球菌；

步骤2）将预定量的玉米、燕麦、小麦、苜蓿草粉、豆粕、麸皮进行混合、粉碎，获得第一混合料；将预定量的秘鲁鱼粉和鸡肉粉与所述第一混合料混合，获得第二混合料；对所述第二混合料进行前熟化，冷却后粉碎；

步骤3）将步骤2）中前熟化粉碎后的所述第二混合料与复合预混料、石粉、大豆油、氯化胆碱、奶粉、玉米蛋白粉以及步骤1）中制备的灭活粪肠球菌混合，得到第三混合料；

步骤4）将步骤3）得到的所述第三混合料进行调质、制粒、烘干，制得所述免疫缺陷鼠饲料。

5.根据权利要求4所述的免疫缺陷鼠饲料的制备方法，其特征在于，所述步骤1）具体包括：

步骤A）菌液制备：挑取粪肠球菌单菌落接种于培养基中，培养预定时间后将菌液进行高温高压处理，低温保存备用；

步骤B）固态灭活粪肠球菌的制备：将烘干载体与步骤A）中制备的灭活菌悬液以预定比例混合后，烘干，得到固态灭活粪肠球菌。

6.根据权利要求5所述的免疫缺陷鼠饲料的制备方法，其特征在于，

所述步骤A）中，以重量分数计，所述培养基包含2~4%玉米淀粉、2~4%豆粕、1~3%葡萄糖；所述粪肠球菌单菌落的接种量为5~10 wt%；所述粪肠球菌的培养条件为：pH 为 5~7.5、装液量25~35 mL、温度 28~35 ℃、培养时间8~16h；所述高温高压条件为115~130℃ 30~50min；所述低温为0~10℃；

所述步骤B）中，所述烘干载体为虾头粉末，按重量计，所述烘干载体与灭活菌悬液的混合比例为2：1.5~4.5；所述烘干条件为40~60℃鼓风烘干 4~8h。

7.根据权利要求4所述的免疫缺陷鼠饲料的制备方法，其特征在于，所述步骤4）具体包括：将所述第三混合料在 110~140℃、0.1~0.7Mpa 蒸汽下进行调质，料温达到50~90℃后进行环模制粒，环模模孔直径 10~15mm，成型后 70-120℃烘干 20-50min，冷却后包装。

8.灭活粪肠球菌（Enterococcus faecalis）在制备免疫缺陷鼠饲料中的应用，其特征在于，用于制备所述灭活粪肠球菌的菌株为XT01，其保藏编号为CCTCC NO：M2020665。